Summary
يظهر هنا بروتوكول لتحديد وظيفة البطين الأيمن والأيسر لقلوب المتبرعين بشكل موثوق بعد الحفاظ على البرد باستخدام نظام التروية خارج الجسم الحي .
Abstract
لا يزال خلل الكسب غير المشروع الأولي (PGD) هو السبب الرئيسي للوفاة المبكرة بعد زرع القلب. يعد الوقت الإقفاري المطول أثناء الحفظ البارد عامل خطر مهم ل PGD ، والتقييم الموثوق لوظيفة القلب ضروري لدراسة الاستجابات الوظيفية لقلب المتبرع بعد الحفاظ على البرد. يصف الفيديو المصاحب تقنية لتقييم وظيفة البطين الأيمن والأيسر للفأر باستخدام التروية خارج الجسم الحي القائمة على نموذج Langendorff بعد الحفاظ على البرد لفترات مختلفة. باختصار ، يتم عزل القلب وتخزينه في محلول هيستيدين - تريبتوفان - كيتوغلوتارات بارد (HTK). بعد ذلك ، يتم تخلل القلب بمخزن كريب المؤقت في نموذج Langendorff لمدة 60 دقيقة. يتم إدخال بالون سيليكون في البطين الأيسر والأيمن ، ويتم تسجيل المعلمات الوظيفية للقلب (dP / dt ، علاقات الضغط والحجم). يسمح هذا البروتوكول بالتقييم الموثوق لوظيفة القلب بعد بروتوكولات الحفاظ على القلب المختلفة. الأهم من ذلك ، تسمح هذه التقنية بدراسة استجابات الحفاظ على القلب على وجه التحديد في خلايا القلب الأصلية. يسمح استخدام قلوب الفئران الصغيرة جدا بالوصول إلى مجموعة هائلة من الفئران المعدلة وراثيا للتحقيق في آليات التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD).
Introduction
زرع القلب يحسن البقاء على قيد الحياة ونوعية الحياة في المرضى الذين يعانون من قصور القلب في نهاية المرحلة1. لسوء الحظ ، فإن النقص في المتبرعين بالقلب يحد من عدد المرضى الذين يمكنهم الاستفادة من هذا العلاج ويحد من قدرة الأطباء على مطابقة المتبرعين على النحو الأمثل مع المتلقين2،3،4. علاوة على ذلك ، ساهم نظام التخصيص الجديد في إطالة أوقات نقص تروية الدم وزيادة استخدام المانحين الهامشيين بشكل كبير منذ عام 20185. وبالتالي ، فإن متوسط عمر المتبرعين بالقلب والوقت الإقفاري يتزايد بمرور الوقت ، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل خلل الكسب غير المشروع الأولي (PGD) على الرغم من التحسينات الكبيرة في استراتيجيات الحفاظ على القلب 6.
يمكن أن يؤثر التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) على البطينين الأيسر أو الأيمن أو كليهما، ويظل من المضاعفات المهددة للحياة ويمثل السبب الرئيسي للوفيات المبكرة بعد زراعة القلب. يعد التحقيق في آليات PDG وتطوير استراتيجيات للحفاظ على القلب بشكل أفضل من الاعتبارات المهمة ، نظرا للتأثير المحتمل لإنقاذ الحياة على متلقي القلب. لذلك، فإن النماذج التجريبية التي تسمح بإجراء تقييم قوي وموثوق لوظيفة قلب المتبرع بعد وقت تخزين طويل ضرورية لزيادة فهمنا للتشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) وتسهيل تطوير علاجات جديدة. تتيح القدرة على تقييم وظيفة القلب بدقة في قلب الفأر الوصول إلى ذخيرة واسعة من نماذج الفئران المعدلة وراثيا التي يمكنها تحديد آليات التشخيص الوراثي قبل الزرع بدقة.
في الدراسات الفسيولوجية والدوائية ، يستخدم نموذج التروية الرجعية Langendorff على نطاق واسع لتقييم وظائف القلب7. على وجه التحديد ، يتم الكشف عن أداء القلب بواسطة بالون سيليكون متصل بمحول ضغط داخل تجويف البطين الأيسر (LV). من السمات الرئيسية للتشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) عدم كفاية انقباض العضلات البطينية وانبساطها. ركزت دراسات Langendorff السابقة على استخدام بالون الجهد المنخفض لإنتاج نتائج موثوقة وقابلة للتكرار في التقييم الوظيفيللجهد المنخفض 8،9،10. ومع ذلك ، فإن استخدام البالون داخل الأجواف لتقييم وظيفة البطين الأيمن (RV) باستخدام نظام البالون أقل إدراكا.
بالنظر إلى معدل PGD الكبير الذي يتضمن RV بعد الزرع11 ، فإن الطرق التجريبية لدراسة كل من وظيفة LV و RV ستساعد في تحديد الآليات الجزيئية والفسيولوجية التي تساهم في RV PGD. يوضح هذا البروتوكول أن بالونات السيليكون داخل الأجواف يمكن أن توفر تقييمات موثوقة لوظيفة LV و RV في نفس قلب الفئران12. لتقييم الاستخدام المحتمل لنظام Langendorff في دراسة التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD)، فحصنا وظائف القلب مع فترات تخزين مختلفة ووجدنا انخفاضا في وظائف القلب في الانقباض والاسترخاء مع التخزين البارد لفترات طويلة لقلوب الفئران. ومن المثير للاهتمام ، أن LV لديه انخفاض وظيفي أعلى من عربة سكن متنقلة. باختصار ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لتقييم تأثير الدواء المرشح والمسارات الجزيئية على كل من وظيفة LV و RV. القدرة على استخدام هذه الطريقة على قلوب الفئران ستسهل أداء الدراسات الميكانيكية التفصيلية.
Protocol
تمت الموافقة على جميع التجارب على في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة ميشيغان ، آن أربور. تم إيواء جميع الفئران في دورة ضوئية 12:12 في غرف خالية من مسببات الأمراض. انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. بناء قسطرة بالون السيليكون
ملاحظة: بالون السيليكون مصنوع كما هو موضح سابقا13.
- أضف 9.5 مل من الماء المقطر، و14.2 مل من شراب الذرة الخفيف، و33.8 جم من السكروز إلى كأس زجاجية سعة 100 مل. سخني المحلول وحركيه حتى يذوب السكر تماما.
- تحضير العجين عن طريق خلط 10 غرام من دقيق القمح و 5 غرام من الماء حتى يتحقق الاتساق والسماح لها بالراحة لمدة 10 دقائق.
- شكلي قطعة صغيرة من العجين على شكل بيضاوي - "الرأس" - وأرفقيها بنهاية خصلة السباغيتي الجافة. ثم ، اغمس هذا الرأس في محلول السكر وقم بإزالته ببطء من المحلول ، حيث أصبح الرأس الآن مطليا بالكامل.
ملاحظة: يجب أن تكون العجينة ناعمة وذات قوام متساو. يمكن أن تختلف أحجام العجين لتوليد أحجام مختلفة من البالونات ، من 5 مم (قطر قصير) إلى 7 مم (قطر طويل). حاول تغطيتها بطبقة رقيقة من محلول السكر. - خصلة السباغيتي على كتلة رغوة البوليسترين ، أو حوامل أخرى ، لتشكيل غطاء لامع بالتساوي فوق الرأس وجفف طوال الليل.
- اغمس القالب في تشتت السيليكون (مطاط السيليكون مشتت في الزيلين). ضع خصلة السباغيتي مرة أخرى في كتلة رغوة البوليسترين على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة أو حتى تجف. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
ملاحظة: من الضروري منع هلام تشتت السيليكون من التأكسد بسبب التعرض للهواء ، لأن هذا سيولد سماكة بالون غير متساوية. - ضع القالب في الماء لفصل البالون وجمعه. قم بتخزين البالون في 0.02٪ من أزيد الصوديوم.
- قطع طرف اثنين من نهاية حادة من إبرة 22 غرام ؛ قم بتركيب نهاية حادة واحدة لبالون السيليكون ونهاية حادة أخرى لأنابيب PE. استخدم 4-0 حرير لربط البالون في مكانه على الإبرة.
ملاحظة: اختبر سلامة البالون عن طريق حقن الماء فيه. بمجرد ملء البالون ، اضغط على البالون برفق لاختبار ما إذا كان البالون يحافظ على التوتر بالداخل. استخدم بالونا جديدا إذا كان يتسرب. يمكن تخزين البالونات المركبة للاستخدام في المستقبل.
2. إعداد نظام نضح القلب
- اصنع 1 لتر من محلول التروية Krebs-Henseleit (KH) وانقله إلى خزان المياه نظام Langendorff.
- قم بتوصيل أنبوب الهواء بخزان المياه وقم بتشغيل تدفق الهواء لموازنة المخزن المؤقت KH مع 5٪ CO 2 و 95٪ O2 لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- اضبط الحمام المائي على 41.5 درجة مئوية وقم بتدوير الماء في الطبقة الخارجية لنظام Langendorff لتسخين النظام ومخزن KH المؤقت.
ملاحظة: تتطلب درجة حرارة حمام الماء تحسينا لكل نظام. بالنسبة لهذا النظام ، ستحافظ درجة حرارة حمام الماء على KH عند 37-37.5 درجة مئوية عند الترشيح في القلب.
3. عزل وتركيب وقنية قلب الفأر
- لمضادات التخثر ، adminster 200 وحدة من الهيبارين في محلول ملحي عن طريق الحقن داخل الصفاق (i.p.) في الربع الأيمن من بطن الفأر C57 / B6. نضح المحقنة قبل الحقن للتأكد من أن شطبة الإبر ليست في المثانة أو تجويف الجهاز الهضمي. استخدم أربعة فئران على الأقل في كل حالة تجريبية (ولكن ضع في اعتبارك أيضا حجم تأثير العلاج).
- بعد 30 دقيقة، يتم تطبيق 80 ملغ/ كغ من الكيتامين و10 ملغ/كغ من زيلازين آي بي لتخدير الفأر. تحقق مما إذا كان الفأر المخدر فاقدا للوعي عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم والتأكد من عدم ملاحظة أي استجابة. يمكن إضافة أسيبرومازين 2 مجم / كجم إلى كوكتيل كيت / إكسيل إذا لم تصل سلالة الفئران المستخدمة إلى مستوى مناسب من التخدير باستخدام كيت / زيل فقط.
- قم بعمل شق أسفل القص مباشرة. استخدم المقص لفتح الصدر عن طريق قطع الحجاب الحاجز والأضلاع. قم بطي جدار الصدر الأمامي لكشف الصدر بالكامل. قطع عند الشريان الأورطي الهابط (مغلق إلى قوس الشريان الأورطي). انقل القلب والرئتين والغدة الصعترية للفأر إلى المخزن المؤقت البارد للهيستيدين - التربتوفان - كيتوغلوتارات (HTK). عزل الأعضاء تحت العازلة HTK الجليد الباردة. كشف الشريان الأورطي عن طريق إزالة أي أنسجة ضامة.
ملاحظة: قم بزيادة طول الشريان الأورطي إلى أقصى حد عن طريق تضمين كل من الشريان الأورطي الصاعد ومنطقة قوس الأبهر في الاستئصال للسماح بمساحة كافية للاتصال بإبرة.
- قم بتوصيل نهاية الشريان الأورطي بإبرة 22 جم ، واربطها بخياطة حريرية 6-0. تأكد من أن القنية فوق جذر الأبهر حتى لا تتداخل مع الصمام الأبهري. قم بلف الشريان الأورطي ب 10 مل من المخزن المؤقت HTK البارد (4 درجات مئوية) على مدار 10 دقائق تقريبا.
ملاحظة: يستغرق أقل من 15 دقيقة من إزالة القلب إلى قنية الشريان الأورطي. ومع ذلك ، من المهم الحفاظ على سرعة التروية عند المستوى المناسب. يمكن أن تولد الحقن السريعة والقوية ضغوطا عالية وتسبب تلفا في الأوعية الدموية / القلب. - قم بتخزين القلب في أنبوب سعة 50 مل مع HTK المثلج لمدة 8 ساعات أو قم بإجراء التروية على الفور (لا تقم بتخزين عنصر التحكم) وتجنب الاتصال المباشر بالثلج.
ملاحظة: قد يؤدي الاتصال المباشر لأنسجة القلب بالثلج إلى إصابة البرد. - قم بتوصيل القلب المثبت على الإبرة بالقنية في جهاز Langendorff واربطه بخيط حريري.
ملاحظة: لتوحيد الإجراء ، انتظر ما مجموعه 3 دقائق لعملية القنية قبل التروية. - بدء التروية بوضع تدفق ثابت عند 3 مل / دقيقة ؛ ثم ، قم بالتغيير إلى وضع الضغط المستمر عند 70-80 مم زئبق واضبط القلب على ~ 6 مل / دقيقة.
ملاحظة: يمكن أن يساعد جس القلب بهدوء في تسريع تنشيط القلب. إذا كان معدل تدفق التروية أعلى بكثير من 6 مل / دقيقة في وضع الضغط الثابت ، فقد يكون هناك تسرب في القنية أو قد لا يعمل صمام الشريان الأورطي بشكل صحيح. اضبط التوصيلات لإصلاح التسرب. يتجاوز وضع التدفق المستمر التنظيم الذاتي لنغمة الأوعية الدموية للقلب. يسمح وضع الضغط المستمر للقلب بتنظيم تدفق التروية التاجية. لذلك ، فإن وضع الضغط المستمر سيقيس بدقة وظيفة القلب وجودة الحفاظ على القلب. - قم بتوصيل بالون مفرغ مملوء بالماء بمحول ضغط ومحقنة مملوءة بالماء بصنبور ثلاثي الاتجاهات. بعد فترة توازن 15-20 دقيقة ، اقطع الأذين الأيمن (RA) وأدخل البالون في عربة سكن متنقلة من خلال RA. استخدم الشريط اللاصق لتثبيت البالون داخل عربة سكن متنقلة. قم بتصغير المنطقة المفتوحة من التهاب المفاصل الروماتويدي للمساعدة في تقييد البالون في البطين (انظر الشكل 1 للإعداد).
ملاحظة: من الضروري وجود فترة من التوازن ، حيث أن انقباض القلب وانبساطه غير مستقرين في البداية ، ويكون المقياس أقل دقة وتمثيلا. في حالة تلف العقدة الأذينية البطينية أثناء فتح التهاب المفاصل الروماتويدي ، سيظهر القلب عدم انتظام ضربات القلب المتكرر. - بعد 20 دقيقة من جمع البيانات الوظيفية RV ، اقطع الأذين الأيسر (LA) وأدخل بالونا مملوءا بالماء المفرغ إلى LV عبر LA. استخدم شريطا لاصقا لتثبيت البالون داخل الجهد المنخفض.
ملاحظة: يجب أن يحافظ القلب على ديناميكا دم مستقرة لأكثر من 1.5 ساعة.
4. تسجيل البيانات الوظيفية
- معايرة محول الضغط
- املأ حقنة سعة 10 مل بمحلول ملحي دافئ وقم بتوصيل المحقنة بالقبة من خلال صنبور ثلاثي الاتجاهات. افتح الصنبور واملأ القبة ببطء بالمحلول الملحي ، ثم أغلق جميع الصنابير وأزل المحقنة. نعلق القبة المملوءة بمحول الطاقة ؛ قم بتوصيل مقياس الضغط بالطرف الثالث من الصنبور ثلاثي الاتجاهات.
- في برنامج التسجيل ، حدد Bridge Amp من القائمة المنسدلة للقناة المتصلة بمحول الطاقة. أعد تسمية القناة باسم الضغط المطبق. انقر فوق صفر إلى صفر محول الطاقة.
- ابدأ التسجيل بالنقر فوق ابدأ بحيث يقرأ محول الطاقة الآن 0 مم زئبق. بعد عدة ثوان من التسجيل ، ادفع المحقنة ببطء وقم بزيادة الضغط إلى 100. انقر فوق إيقاف لإيقاف التسجيل.
- في مربع حوار تحويل الوحدات ، حدد منطقة تسجيل ل 0 مم زئبق وانقر فوق السهم إلى النقطة 1 واكتب 0 مم زئبق. حدد منطقة التسجيل ل 100 مم زئبق ، وانقر فوق السهم إلى النقطة 2 ، واكتب 100 مم زئبق. انقر فوق موافق لمعايرة محول الطاقة.
- أعد تسمية القناة المقابلة لمحول الضغط مع البالون باسم ضغط البطين. ابدأ التسجيل عندما يكون القلب متصلا بالنظام. بعد إدخال البالون في البطين ، اضبط حجم الماء في البالون باستخدام حقنة ميكرومتر من خلال الصنبور ثلاثي الاتجاهات للحفاظ على الضغط الانبساطي النهائي عند 5-10 مم زئبق.
ملاحظة: يمكن أن ينخفض مقياس نهاية الانبساطي أثناء القياس ، ويفضل أن يبدأ من ما يقرب من 10 مم زئبق. - إعادة تسمية قناة فارغة ك dP/dt. من القائمة المنسدلة ، حدد قناة المصدر المشتقة | كضغط البطين. ستسجل القناة نسبة تغير الضغط في تجويف البطين خلال فترة الانكماش.
- حدد فترة قياس ثابتة ، ثم انقر فوق إعداد في وحدة ضغط الدم.
- حدد ضغط البطين كقناة إدخال وانقر فوق التحديد لفترة حسابية | حسنا.
- انقر فوق عرض المصنف لإزالة الدورة القلبية المتطرفة (على سبيل المثال ، وقت الدورة غير الطبيعي أو الضغط).
- انقر فوق عرض الجدول لإنشاء جداول متوسط الحد الأقصى للديسيبل/الديسيبل (الانكماش) والحد الأدنى للديسيبل/الديسيبل (الاسترخاء) للفترة المحددة.
ملاحظة: قم بتخزين ملف التسجيل لكل عينة واحفظ جدول متوسط وظائف القلب للتحليل الإحصائي.
Representative Results
تم حصاد قلوب الفئران البالغة C57Bl / 6 ، التي يبلغ عمرها 3 أشهر ، وتركيبها على نظام Langendorff. تم تخزين قلب المتبرع في HTK لمدة 0 و 8 ساعات ، ثم تم تعطيره بمحلول KH المؤكسج. تم استخدام بالون سيليكون متصل بمحول ضغط لقياس تقلص وانحلال وظيفة الجهد المنخفض و RV.
تم الحفاظ على ضغوط الأبهر في نطاق 70-80 مم زئبق. كان معدل ضربات القلب قابلا للمقارنة في قلوب الفئران مع 0 و 8 ساعات من التخزين. تم فحص وظيفة الجهد المنخفض و RV عن طريق قياس الضغط الانقباضي والانبساطي. تم حساب dP / dt ، وهو مشتق لحساب نسبة تغير الضغط ، لتحديد ديناميكيات الضغط. يمكن أن يمثل العدد المطلق ل max dP / dt و min dP / dt مستوى تقلص العضلات وانبساطها. عند 0 ساعة من التخزين ، كان للجهد المنخفض ضغط انقباضي أعلى مقارنة بعربة سكن متنقلة (الشكل 2C والشكل 3A). أظهر الجهد المنخفض تقلصا واسترخاء عضليا أكثر من عربة سكن متنقلة بعد نضح تخزين 0 ساعة (الشكل 2C والشكل 3B ، C). ومع ذلك ، بعد 8 ساعات من التخزين البارد ، أظهر كل من LV و RV انخفاضا وظيفيا كبيرا مقارنة بخط الأساس 0 h (الشكل 2A-D والشكل 3B ، C). كان الانخفاض في انقباض القلب أكثر حدة في LV. بعد 8 ساعات من التخزين ، كان انكماش وانحلال الجهد المنخفض 25.1٪ و 30.7٪ من خط الأساس 0 ساعة ، بينما كان لدى RV 32.5٪ و 29.1٪ من الوظيفة مقارنة بخط الأساس 0 h (الشكل 3B ، C). أظهرت هذه النتائج أن التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) للجهد المنخفض بعد التخزين المطول كان له انخفاض أكبر في تقلص القلب من RV.
الشكل 1: تركيب قلب الفأر وقرعه . (أ) الإعداد العام لإعداد التروية. 1. خزان التروية. 2. غرفة الأكسجين. 3. غرفة مصيدة الهواء. 4. غرفة القلب. 5. مفتاح القيمة للتدفق والضغط المستمر. 6 و 7. تدفق الأكسجين. (ب) قلوب مقننة مع عربة سكن متنقلة في المقدمة. (ج) موضع عربة سكن متنقلة لقطعها لفتح تجويفها. د: اضغط على أنبوب البالون بالقنية. اختصار: RV = البطين الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مقارنة وظيفة الجهد المنخفض مقابل الجهد المنخفض مقابل عربة سكن متنقلة . (أ) سجل تتبع الحد الأقصى والحد الأدنى dP / dt في RV و LV في قلب المتبرع مع 0 ساعة من التخزين. (ب) سجل الحد الأقصى والأدنى dP / dt في RV و LV في قلب المتبرع مع 8 ساعات من التخزين. (ج، د) تفاصيل dP / dt وضغط LV ومعدل ضربات القلب وضغط التروية في LV و RV عند 0 ساعة و 8 ساعات. الاختصارات: RV = البطين الأيمن. LV = البطين الأيسر. dP / dt = علاقة الضغط والوقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة وظيفة الجهد المنخفض مقابل الجهد المنخفض بعد التخزين والتروية . (أ) الضغط الانقباضي والانبساطي للجهد المنخفض والجهد المتردد بعد 0 ساعات و8 ساعات من التخزين. (B) الحد الأقصى dP / dt و (C) الحد الأدنى dP / dt للجهد المنخفض و RV بعد التروية مع 0 ساعة و 8 ساعات من التخزين. هذا الرقم مأخوذ من Lei et al.12. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة التروية الرجعية Langendorff عن طريق قنية الأبهر. يمكن استخدام هذه التقنية لتقييم وظيفة LV و RV لقلوب الفئران بعد التخزين البارد. تظهر النتائج أن التخزين البارد لفترات طويلة لقلوب المتبرعين يؤدي إلى انخفاض وظائف القلب في كل من LV و RV باستخدام هذا البروتوكول.
تركز دراسات الرفض الحاد والمزمن بعد زراعة القلب على نطاق واسع على علم المناعة14. يتم فحص آثار الخلايا الأصلية على التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) أثناء التخزين البارد بشكل أقل دقة. يحدث التشخيص الوراثي قبل الزرع في ~ 10٪ -20٪ من عمليات زرع القلب ويمثل 66٪ من الوفاة المبكرة في غضون 30 يوما بعد الزرع. على وجه الخصوص ، يختلف حدوث PGD الذي يؤثر على LV مقابل RV بعد الزرع11. بدون مساهمة الاستجابات الخلوية المتلقية ، تركز هذه الطريقة خارج الجسم الحي على مساهمات خلايا القلب الأصلية في التشخيص الوراثي قبل الزرع (PGD) بعد الحفاظ البارد على قلوب المتبرعين. قد تتضمن الدراسات الإضافية استجابات المتلقي في نموذج زراعة قلب الفئران.
في هذا البروتوكول ، ركز نضح لانجيندورف لقلوب المتبرعين المحفوظة على البارد على الاستجابات القلبية الأصلية للنضح البلوري الدافئ دون التسلل إلى المناعة الخلوية. لتحقيق نتائج قابلة للتكرار ، تم توحيد العديد من الخطوات الحاسمة. تم القبض على قلوب الفئران باستخدام محلول HTK وتخزينها في HTK المثلج ، على غرار الممارسة السريرية. تمت مراقبة حجم التروية ووقت التسريب لمحلول HTK لكل قلب عن كثب باستخدام جهاز توقيت. تم الاحتفاظ بقلب المتبرع في أنابيب مبردة مسبقا على ثلج يحتوي على HTK في غرفة 4 درجات مئوية. وقت القنية waas موحدة إلى ~ 3 دقائق قبل التروية. كل هذه الخطوات ضمنت أن مدة الحفظ البارد كانت المتغير الرئيسي في الدراسة.
شوهدت فترة من انقباض القلب غير المنتظم لمدة ~ 20 دقيقة بشكل شائع في بداية التروية. تم تسهيل فترة التوازن والتعافي هذه عن طريق الاحترار التدريجي وأكسجة أنسجة القلب. كان من المتوقع فترة مستقرة نسبيا بعد 20 دقيقة الأولية. تم إدخال البالون في تجويف البطين في ~ 18 دقيقة بعد فترة التوازن الأولية. بدأنا في تسجيل ديناميكا الدم بعد أن كان القلب مستقرا لمدة ~ 25 دقيقة ، بمجرد إدخال البالون. حافظ التروية مع المخزن المؤقت KH على أداء قلبي مستقر لمدة ~ 1.5-2 ساعة. لذلك اخترنا تسجيل ديناميكا الدم لمدة 20 دقيقة في كل من البطينين الأيسر والأيمن.
هناك العديد من القيود على التروية الرجعية لدراسة التشخيص الوراثي قبل الزرع للقلوب بعد التخزين البارد. أولا ، نظرا لحجم البالون ونقص المساحة في كل تجويف بطيني (على وجه الخصوص ، RV) ، فإن الإدخال المتزامن لبالونين في كل من LV و RV يمثل تحديا كبيرا. وبالتالي ، فإننا نقيس وظيفة RV و LV بالتتابع. من المهم أن نلاحظ أن الحاجز بين البطينين يساهم بشكل كبير في وظيفة البطين الأيسر والأيمن. يساهم الحاجز في ~ 50٪ من وظيفة البطين الأيمن ، لذلك هناك اعتماد بين البطينين15. من المهم أيضا ملاحظة أنه في حين أن إجراءات إعادة ضخ قلب الفئران في جهاز Langendorff تستغرق ~ 3 دقائق ، فإن الزرع الجراحي لقلب الإنسان في المجال الجراحي الدافئ نسبيا يستغرق ~ 45 دقيقة. وبالمقارنة ، فإن قلب الفئران في نظام Langendorff هذا يتحمل وقتا أقل لنقص تروية. يجب أن يؤخذ ذلك في الاعتبار عند التفكير في الترجمة السريرية.
نظرا لأننا استخدمنا المخزن المؤقت KH لتغذية القلب بدون دم ، فقد يكون لهذا أيضا كفاءة أقل في توصيل الأكسجين. ومع ذلك ، فإن وظيفة القلب مستقرة نسبيا من خلال 1.5-2 ساعة من التروية الأولية ، مما يسمح بقياسات الدورة الدموية الموثوقة. لسوء الحظ ، لا توجد حاليا نماذج قابلة للتطبيق لنضح القلب العامل لقلوب الفئران الأصغر هذه ، ولا يمكن تقييم تأثير تحميل البطين في هذا النظام. على الرغم من ذلك ، فإن نظام التروية قابل للتكرار بدرجة كبيرة وأقل كثافة في العمل ويستغرق وقتا طويلا من نماذج الزرع. كما أنها أقل تكلفة من دراسات الزرع ، مما قد يجعلها أكثر ملاءمة لفحص الخيارات العلاجية المختلفة والمسارات الجزيئية المختلفة. مع التعديلات على حلول الحفظ عن طريق إضافة الأدوية المرشحة ، يمكن استخدام هذه المنصة لتقييم آثار العوامل الدوائية على تقليل التشخيص الوراثي قبل الزرع في كل من LV و RV.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 silk suture | Braintree Scientific | SUTS108 | |
| 6-0 Silk suture | Braintree Scientific | SUTS104 | |
| All purpose flour | Kroger | ||
| BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles 22 G | Fisher scientific | 14-826-5A | |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips (Without Needle) | Fisher scientific | 14-823-16E | |
| Corn Syrup | Kroger | ||
| Custodiol HTK Solution | Essential Pharmaceuticals LLC | ||
| Dissecting Scissors | World Precision Instruments | 14393/14394 | |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher scientific | 14-959-49A | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma | H4784 | |
| Krebs Henseleit buffer | Sigma | K3753 | |
| Nusil silicone dispersions | Avantor | ||
| Perfusion system | Radnoti | 130101BEZ | |
| PowerLab | ADInstruments | PL3508 | |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Xylazine | Sigma | X1126 |
References
- Kim, I. C., Youn, J. C., Kobashigawa, J. A. The past, present and future of heart transplantation. Korean Circulation Journal. 48 (7), 565-590 (2018).
- Gaffey, A. C., et al. Transplantation of "high-risk" donor hearts: Implications for infection. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 152 (1), 213-220 (2016).
- Hsich, E. M. Matching the market for heart transplantation. Circulation: Heart Failure. 9 (4), 002679 (2016).
- Piperata, A., et al. Heart transplantation in the new era of extended donor criteria. Journal of Cardiac Surgery. 36 (12), 4828-4829 (2021).
- Huckaby, L. V., Hickey, G., Sultan, I., Kilic, A. Trends in the utilization of marginal donors for orthotopic heart transplantation. Journal of Cardiac Surgery. 36 (4), 1270-1276 (2021).
- Singh, S. S. A., Dalzell, J. R., Berry, C., Al-Attar, N. Primary graft dysfunction after heart transplantation: a thorn amongst the roses. Heart Failure Reviews. 24 (5), 805-820 (2019).
- Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).
- Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. Journal of Cardiovascular Pharmacology and Therapeutics. 21 (3), 286-295 (2016).
- Matsuura, H., et al. Positive inotropic effects of ATP released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion. Frontiers in Cell Development Biology. 9, 597997 (2021).
- Tse, G., Hothi, S. S., Grace, A. A., Huang, C. L. Ventricular arrhythmogenesis following slowed conduction in heptanol-treated, Langendorff-perfused mouse hearts. The Journal of Physiological Sciences. 62 (2), 79-92 (2012).
- Kobashigawa, J., et al. Report from a consensus conference on primary graft dysfunction after cardiac transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 33 (4), 327-340 (2014).
- Lei, I., et al. Differential inflammatory responses of the native left and right ventricle associated with donor heart preservation. Physiological Reports. 9 (17), 15004 (2021).
- Miller, A., Wright, G. L. Fabrication of murine ventricular balloons for the Langendorff heart preparation. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 1 (101), (2011).
- Madsen, J. C.
- Voelkel, N. F., et al. Right ventricular function and failure: report of a National Heart, Lung, and Blood Institute working group on cellular and molecular mechanisms of right heart failure. Circulation. 114 (17), 1883-1891 (2006).
