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Medicine

पृथक वयस्क मानव प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स में हृदय संकुचन का माप

Published: August 9, 2022 doi: 10.3791/64394
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1AnaBios Corporation

Summary

यह प्रोटोकॉल बताता है कि मायोब्लेज़र प्रणाली के साथ दाता दिलों से वयस्क मानव प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स में अनुबंध को कैसे मापना है, जो प्रीक्लिनिकल विकास के दौरान अनुबंध में दवा-प्रेरित परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक विश्वसनीय मंच है।

Abstract

नए कार्डियक- और गैर-कार्डियक-लक्षित यौगिकों के लिए प्रीक्लिनिकल विकास के दौरान हृदय संकुचन में परिवर्तन का मूल्यांकन आवश्यक है। यह पेपर मायोब्लेज़र का उपयोग करके वयस्क मानव प्राथमिक वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स में संकुचन में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, एक गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल विधि जो कोशिकाओं के सामान्य शरीर विज्ञान और फार्माकोलॉजी को संरक्षित करती है। यह ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग विधि लगातार समानांतर में कई कोशिकाओं से अनुबंध क्षणिक ता को मापती है, जो दृश्य के क्षेत्र में प्रत्येक व्यक्तिगत सेल के लिए मध्यम-थ्रूपुट और मूल्यवान जानकारी दोनों प्रदान करती है, जिससे दवा प्रभावों की वास्तविक समय ट्रैकिंग सक्षम होती है। कार्डियोमायोसाइट्स संकुचन को तेज विद्युत क्षेत्र उत्तेजना द्वारा प्रेरित किया जाता है, और अधिग्रहित उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को एक छवि-प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में खिलाया जाता है जो कई कार्डियोमायोसाइट्स में सरकोमेरे शॉर्टनिंग को मापता है। यह विधि तेजी से संकुचन और विश्राम चरणों के कैनेटीक्स से संबंधित विभिन्न समापन बिंदु उत्पन्न करती है, और परिणामस्वरूप डेटा को तब एक परीक्षण लेख की विभिन्न सांद्रता के संबंध में व्याख्या की जा सकती है। चल रहे नैदानिक अध्ययनों का समर्थन करने के लिए अनुवर्ती यांत्रिक अध्ययन करने के लिए प्रीक्लिनिकल विकास के अंतिम चरणों में भी इस पद्धति को नियोजित किया जाता है। इस प्रकार, वयस्क मानव प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट-आधारित मॉडल निरंतर अनुबंध निगरानी के लिए ऑप्टिकल सिस्टम के साथ संयुक्त है जो प्रीक्लिनिकल चिकित्सा चिकित्सा विकास में इन विट्रो कार्डियक डेटा ट्रांसलेटेबिलिटी के एक नए युग में योगदान करने की क्षमता रखता है।

Introduction

मायोकार्डियल कॉन्ट्रैक्टिलिटी (इनोट्रोपी), जो हृदय की मांसपेशियों की प्राकृतिक क्षमता का प्रतिनिधित्व करती है, हृदय समारोह की एक प्रमुख संपत्ति है और इलेक्ट्रो-मैकेनिकल युग्मन की गतिशीलता पर निर्भर करती है। मायोकार्डियल सिकुड़न में दवा-प्रेरित परिवर्तन हृदय रोग (जैसे, दिल की विफलता) और कार्डियोटॉक्सिसिटी (जैसे, बाएं वेंट्रिकुलर इजेक्शन अंश में कमी) के संदर्भ में अवांछित है। इसलिए, प्रीक्लिनिकल कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉडल को सटीक भविष्यवाणी के साथ जोड़ा जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नैदानिक विकास के दौरान नई दवाएं सफल हो सकती हैं। हालांकि, वर्तमान प्रीक्लिनिकल रणनीतियों, जो न्यूनीकरणवादी कृत्रिम सेलुलर मॉडल (उदाहरण के लिए, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर अमर सेल लाइनें जो रुचि के विशिष्ट हृदय लक्ष्यों को अतिरंजित करती हैं) और गैर-मानव पशु मॉडल पर निर्भर करती हैं, ने महत्वपूर्ण सीमाएं दिखाई हैं और उच्च दवा एट्रिशन दर (यानी, झूठे संकेतों की उच्च दर) 1,2,3,4 से जुड़ी हुई पाई गई हैं।. तदनुसार, नए और विश्वसनीय मानव सेलुलर हृदय अनुबंध मॉडल स्थापित करना अनिवार्य है जो मनुष्यों में दवा के परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए उच्च शक्ति (यानी, सच्चे संकेतों की उच्च दर) से जुड़े हैं और इसलिए, नए उपचारों के लॉन्च में तेजी लाने में मदद करतेहैं।

6,7,8,9,10 और कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव तकनीकों 11,12,13,14,15 के लिए मानव दाता दिलों की वसूली के लिए हाल ही में स्थापित ग्राउंडब्रैकिंग विधियों ने प्रीक्लिनिकल विकास के दौरान मानव-आधारित अध्ययन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान किया है। इसके लिए, वयस्क मानव प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स ने पहले से ही मानव हृदय संकुचन 11,12,13,14 में दवा-प्रेरित परिवर्तनों का आकलन करने में उपयोगिता दिखाई है। वर्तमान लेख वयस्क मानव कार्डियोमायोसाइट्स में उपन्यास यौगिकों के संकुचन प्रभावों की जांच के लिए प्रोटोकॉल का विवरण देता है।

Protocol

सभी तरीकों को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किया गया था। अध्ययन के लिए उपयोग किए गए सभी मानव दिल गैर-प्रत्यारोपण योग्य थे और नैतिक रूप से संयुक्त राज्य अमेरिका (यूएस) में कैडवेरिक अंग दाताओं से सूचित कानूनी सहमति (पहले व्यक्ति या निकटतम रिश्तेदार) द्वारा प्राप्त किए गए थे। रिकवरी प्रोटोकॉल और इन विट्रो प्रयोग को यूएस ऑर्गन प्रोक्योरमेंट ट्रांसप्लांट नेटवर्क (ओपीटीएन) के भीतर प्रत्यारोपण केंद्रों में संस्थागत समीक्षा बोर्डों (आईआरबी) द्वारा पूर्व-अनुमोदित किया गया था। इसके अलावा, दाता के दिलों के सभी हस्तांतरण पूरी तरह से पता लगाने योग्य हैं और समय-समय पर अमेरिकी संघीय अधिकारियों द्वारा समीक्षा की जाती है।

नोट: इस प्रोटोकॉल के निष्पादन के दौरान सभी आवश्यक सुरक्षा प्रक्रियाओं को लागू करें, जिसमें उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (जैसे, प्रयोगशाला कोट, सुरक्षा चश्मा, दस्ताने) पहनना शामिल है।

1. कार्डियोमायोसाइट्स का अलगाव (संकुचन को मापने से 1 दिन पहले)

  1. बर्फ-ठंडे मालिकाना कार्डियोप्लेजिक समाधान6 के साथ प्रयोगशाला में पहुंचने पर दाता के दिल को फिर से संक्रमित करें और वेंट्रिकल्स 11,12,13,14,15 से एंजाइमेटिक रूप से वयस्क मानव प्राथमिक मायोसाइट्स को अलग करें।
  2. फिर, कार्डियोमायोसाइट्स को निलंबन में बनाए रखें और उन्हें 10 एमएल समाधान ए (110 एमएम सुक्रोज, 0.005 एमएम सीएसीएल 2, 3 एमएम एमजीसीएल 2, 70 एमएम कोएच, 60 एमएम लैक्टोबियोनिक एसिड, 10 एमएम केएच 2 पीओ4, 20 एमएम टॉरिन, 20 एमएम एल-हिस्टिडाइन, 20 एमएम एचईपीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामिक एसिड, 2 एमएम एल-ग्लूटामिक एसिड, 2 एमएम एल-(-) के साथ स्टोर करें। पीएच 7.4 के साथ केओएच) 20 एमएल व्हीटन शीशियों (सामग्री की तालिका) में एक प्रशीतित तापमान पर जब तक कि उनसे प्रयोगात्मक रूप से पूछताछ नहीं की जाती है।
    नोट: प्रति शीशी 200,000 कोशिकाओं को स्टोर करें।

2. लैमिनिन कोटिंग तैयारी (अनुबंध को मापने से 1 दिन पहले)

  1. आठ-वेल कल्चर प्लेट (सामग्री की तालिका) के प्रत्येक कुएं में एक ग्लास कवरस्लिप (25 मिमी x 25 मिमी वर्ग, सामग्री की तालिका) रखें।
  2. फिर, 5 μg / mL एकाग्रता पर लैमिनिन के साथ कवरलिप्स को कोट करें। ऐसा करने के लिए, 800 μL मानव पुनः संयोजक लैमिनिन 521 स्टॉक (सामग्री की तालिका, -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) को 7.2 mL समाधान B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM ग्लूकोज, और 10 mM HEPES, pH 7.4 NaOH के साथ) में जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
  3. प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में पतला लैमिनिन समाधान के 200 μL गिराएं। फिर, प्लेट को कवर करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में स्टैक करें।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कई आठ-अच्छी संस्कृति प्लेटें तैयार करें कि पर्याप्त लैमिनिन-लेपित कवरलिप्स हैं।

3. सीए2 + -सहिष्णु कार्डियोमायोसाइट्स की तैयारी (संकुचन को मापने के दिन)

  1. फ्रिज से कोशिकाओं की एक शीशी निकालें, शीशी से घोल ए को एस्पिरेट करें और घोल बी का प्रशीतित 10 एमएल जोड़ें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को चूषण नहीं किया गया है और शीशी की दीवार के शीर्ष के अंदर पिपेट रखकर समाधान बी को शीशी में फैलाएं।
  2. कोशिकाओं की शीशी को कैप करें और फिर धीरे से घुमाएं ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कोशिकाएं पूरे समाधान बी में फैली हुई हैं। अंत में, कोशिकाओं को कमरे के तापमान (आरटी) पर 1 घंटे के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।

4. रिकॉर्डिंग सिस्टम की तैयारी (अनुबंध को मापने के दिन)

नोट: रिकॉर्डिंग सिस्टम में एक तापमान नियंत्रण बॉक्स, उत्तेजक, कंप्यूटर-नियंत्रित दबाव-संचालित छिड़काव, दबाव-संचालित छिड़काव बोतलें, इन-हाउस अधिग्रहण सॉफ्टवेयर शामिल हैं जो रुचि के क्षेत्रों (आरओआई) के चयन की अनुमति देते हैं और अनुबंध क्षणिक, उल्टे माइक्रोस्कोप, सेल कक्ष और कैमरा प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 1)।

  1. सक्शन वैक्यूम सिस्टम चालू करें। फिर, माइक्रोस्कोप कवर को हटा दें, इसे चालू करें, कैमरे को कनेक्ट करें (सामग्री की तालिका, चित्रा 1), और अंत में, पुष्टि करें कि पंखे को चालू किया गया है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कैमरा अधिक गर्म न हो।
  2. फिर, माइक्रोस्कोप हीटिंग प्लेट (सामग्री की तालिका) और तापमान नियंत्रण बॉक्स (सामग्री की तालिका, चित्रा 1) चालू करें, और उन्हें उचित ऑपरेटिंग तापमान पर सेट करें। इसके बाद, फील्ड उत्तेजक (सामग्री की तालिका, चित्रा 1) और दबाव प्रणाली चालू करें। अंत में, समाधान की टयूबिंग (सामग्री की तालिका) को रिकॉर्डिंग कक्ष (सामग्री की तालिका, चित्रा 1) से कनेक्ट करें।

5. परीक्षण यौगिकों की तैयारी (अनुबंध को मापने के दिन)

  1. डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) को पतला करें; सामग्री की तालिका) 0.1% डीएमएसओ वाहन समाधान बनाने के लिए समाधान सी (145 एमएम एनएसीएल, 4 एमएम केसीएल, 1.8 एमएम सीएसीएल 2, 1 एमएम एमजीसीएल2, 11.1 एमएम ग्लूकोज, और 10 एमएम एचईपीईएस, एनएओएच के साथ पीएच 7.4) में 1,000 गुना है।
  2. 0.001 μM के चिकित्सीय जोखिम के 1-गुना, 10-गुना, 100-गुना और 1000-गुना पर एक यौगिक का परीक्षण करने के लिए, DMSO में परीक्षण यौगिक को 1 mM की एकाग्रता पर भंग करें।
  3. तीन और डीएमएसओ स्टॉक (जैसे, 0.001 एमएम, 0.01 एमएम और 0.1 एमएम) का उत्पादन करने के लिए डीएमएसओ के साथ इस समाधान को क्रमिक रूप से पतला करें। अंत में, अंतिम परीक्षण सांद्रता (0.001 μM, 0.01 μM, 0.1 μM, और 1 μM) प्राप्त करने के लिए समाधान C के 100 मिलीलीटर में प्रत्येक परीक्षण यौगिक स्टॉक को 1,000 गुना पतला करें।
  4. यौगिक के अंतिम माइक्रोमोलर सांद्रता के वाहन समाधान और समाधान को 100 एमएल ग्लास बोतलों (सामग्री की तालिका, चित्रा 1) में जोड़ें और फिर बोतलों को दबाव-संचालित छिड़काव प्रणाली (सामग्री की तालिका, चित्रा 1) से कनेक्ट करें।
  5. फिर, 1.8 एमएल / मिनट की दर से निरंतर छिड़काव प्रवाह देने के लिए 200-300 मिलीलीटर के दबाव का उपयोग करके एक कंप्यूटर-संचालित प्रोग्राम (सामग्री की तालिका) के साथ छिड़काव प्रणाली को प्राइम करें।
    नोट: यदि परीक्षण यौगिक एक घुलनशीलता समस्या से जुड़ा हुआ पाया जाता है तो प्रयोग का संचालन न करें। इसके अलावा, कोशिकाओं में प्रयोगात्मक आवेदन से पहले 30 मिनट के भीतर स्टॉक समाधान से यौगिक परीक्षण समाधान तैयार करें।

6. कार्डियोमायोसाइट्स की प्लेटिंग (सिकुड़न को मापने के दिन)

  1. 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज से लैमिनिन-लेपित कवरलिप्स युक्त आठ-वेल प्लेट लें और सावधानी से एक कवरस्लिप को बहुत अच्छी तरह से साफ किए गए रिकॉर्डिंग कक्ष में रखें (चित्रा 1)। फिर, आठ-अच्छी प्लेट को अगली चढ़ाना तक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में वापस कर दें।
    नोट: लेमिनिन की एक पतली परत में लेपित कवरस्लिप को रखते हुए लेपित कवरस्लिप को पोंछने के लिए लिंट-फ्री वाइप (सामग्री की तालिका) का उपयोग करें। इसके अलावा, एक शार्प्स कंटेनर में इस्तेमाल किए गए कवरलिप्स का निपटान करना सुनिश्चित करें।
  2. फिर, कोशिकाओं की बढ़ी हुई शीशी (चरण 3.2) लें और शीशी से एस्पिरेट समाधान बी लें ताकि कोशिकाओं को खोए बिना जितना संभव हो उतना कम मात्रा तक पहुंच सकें (~ 200 μL)। इसके बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका) के चरण पर लगाए गए रिकॉर्डिंग माइक्रोस्कोप कक्ष में 200 μL कोशिकाओं को वितरित करें।
  3. कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए कवरस्लिप पर व्यवस्थित होने दें। कोशिकाओं को पूरी तरह से व्यवस्थित करने की प्रतीक्षा करते समय, माइक्रोस्कोप पर दृश्य के क्षेत्र को खोलें और निर्धारित करें कि प्रयोगात्मक रन शुरू करने के लिए सेल घनत्व पर्याप्त (~ 70%) है या नहीं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चूषण सभी कोशिकाओं को दूर नहीं करता है यदि 200 μL से अधिक वितरित किए जाते हैं।

7. कार्डियोमायोसाइट्स सिकुड़न की रिकॉर्डिंग

  1. चढ़ाना पूरा होने के बाद, दबाव-संचालित छिड़काव प्रणाली (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके समाधान सी के साथ लगातार छिड़काव करके कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए समतुल्य करें। सक्शन को सही ढंग से समायोजित करें, तापमान नियंत्रण बॉक्स और हीटिंग प्लेट दोनों को चालू करें, और उन्हें ~ 35 डिग्री सेल्सियस वितरित करने के लिए सेट करें।
  2. फिर, एक फील्ड स्टिमुलेटर पर 1 हर्ट्ज पेसिंग आवृत्ति (3 एमएस अवधि की द्विध्रुवीय नाड़ी) पर सुप्रा-थ्रेशोल्ड वोल्टेज के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें, जिसमें प्लैटिनम तारों की एक जोड़ी एक फील्ड उत्तेजक से जुड़ी चैंबर के विपरीत किनारों पर रखी गई है।
  3. उत्तेजक नाड़ी के आयाम को 1 वी पर सेट करें, और फिर इसे तब तक बढ़ाएं जब तक कार्डियोमायोसाइट्स संकुचन-विश्राम चक्र उत्पन्न करना शुरू न कर दें। प्रयोग के दौरान 1.5x सीमा के मान का उपयोग करें।
    नोट: रॉड के आकार की आकृति विज्ञान और स्पष्ट धारीदार के साथ स्वस्थ कोशिकाओं का चयन करें। फिर, दृश्य के क्षेत्र को समायोजित करें और जितना संभव हो उतने अनुबंध कक्षों को दृश्य में लाने पर ध्यान केंद्रित करें (चित्रा 2 ए)।
  4. इसके बाद, ऑप्टिकल कॉन्ट्रैक्टिलिटी रिकॉर्डिंग सिस्टम के अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के भीतर कोशिकाओं की डिजिटाइज्ड छवियों को प्रदर्शित करें। यह सॉफ्टवेयर एक ही फ्रेम में कई मायोसाइट्स युक्त वीडियो स्ट्रीम रिकॉर्ड करने के लिए 150 एफपीएस (सामग्री की तालिका, चित्रा 1) की दर के साथ एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन, उच्च-फ्रेम दर कैमरे का उपयोग करता है।
    नोट: यह एक साथ कई स्वस्थ मायोसाइट्स की सरकोमेरे गतिशीलता को पकड़ने और मापने के लिए पर्याप्त अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है। आधुनिक उच्च-कोर-काउंट प्रोसेसर का उपयोग वास्तविक समय में वीडियो स्ट्रीम से सरकोमेरे लंबाई में परिवर्तन की समानांतर गणना को सक्षम करने के लिए किया जाता है (ऑप्टिकल घनत्व डेटा स्वस्थ कार्डियोमायोसाइट्स की छवियों पर और संकुचन की धुरी के समानांतर रखे गए उपयोगकर्ता-परिभाषित क्षेत्रों [आरओआई] से एकत्र किया जाता है, चित्रा 2 बी)। ऑप्टिकल तीव्रता डेटा कार्डियोमायोसाइट्स की जेड-लाइनों के अनुरूप उज्ज्वल और अंधेरे बैंड दिखाते हैं (चित्रा 1, चित्रा 2 सी)। अंत में, इन डेटा को निगरानी उद्देश्यों के लिए उपयोगकर्ता को प्रदर्शित किया जाता है और बाद के विश्लेषण के लिए डिस्क पर सहेजा जाता है (चित्रा 2 सी)।
    1. कोशिकाओं के उन क्षेत्रों से बचें जो फोकस में नहीं हैं। इसके अलावा, आरओआई को कोशिकाओं के किनारे के करीब न रखें, क्योंकि दवाओं के आवेदन के दौरान कोशिकाओं के संकुचन में परिवर्तन से आरओआई कोशिकाओं के संकुचन को पढ़ने में असमर्थ हो सकते हैं।
  5. जब आरओआई का चयन पूरा हो जाता है और संकुचन उपयोग के लिए आवश्यक मानकों को पूरा करते हैं (उदाहरण के लिए, सरकोमेरे शॉर्टनिंग >1%; 1 हर्ट्ज पेसिंग आवृत्ति के आवेदन पर लयबद्ध संकुचन, लयबद्ध घटनाओं की अनुपस्थिति), एक यौगिक के प्रभावों का आकलन करने के लिए प्रयोग शुरू करें। उत्तेजना प्रोटोकॉल और यौगिक के परीक्षण सांद्रता के आवेदन का अनुक्रम तालिका 1 में दिखाया गया है। अधिग्रहण सॉफ्टवेयर एक स्वचालित तरीके से, डेटा के अधिग्रहण और प्रदर्शन और परीक्षण सांद्रता और उपचार समय के लेबलिंग का प्रबंधन करेगा।
    नोट: परीक्षण सांद्रता लागू करें यदि संकुचन बेसलाइन वाहन अवधि की संपूर्णता में स्थिर आयाम पर रहता है। रन-अप या रन-डाउन प्रदर्शित करने वाले कक्षों को अयोग्य घोषित करें.
    6. इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि छिड़काव पूरे प्रयोग में विभिन्न परीक्षण सांद्रता में बदल दिया गया है।
  6. सर्वर पर प्रयोग और डेटा भंडारण के पूरा होने पर, छिड़काव और हीटर को बंद करें, उत्तेजना को रोकें, आसुत पानी के साथ माइक्रोस्कोप कक्ष को साफ करें, फिर ग्लास कवरस्लिप को हटा दें, और कक्ष को अच्छी तरह से सुखाएं।
    नोट: कक्ष को अच्छी तरह से साफ करें क्योंकि यह कोशिकाओं के अगले सेट को समय से पहले किसी भी यौगिक में उजागर करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, इस प्रकार एकत्र किए गए किसी भी डेटा को अमान्य करता है।
  7. इसके बाद, कार्डियोमायोसाइट्स की एक नई प्लेटिंग करें और यौगिक के परीक्षण को पूरा करने या एक नए यौगिक का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त डेटा प्राप्त करने के लिए एक अतिरिक्त प्रयोग करें।

8. ऑप्टिकल कॉन्ट्रैक्टिलिटी रिकॉर्डिंग सिस्टम को बंद करना

  1. जब यौगिक (ओं) का दैनिक परीक्षण पूरा हो जाता है, तो पहले उन सभी उपकरणों को बंद कर दें जो सिस्टम को साफ करने और ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए डेटा की प्रतिलिपि बनाने के लिए आवश्यक नहीं हैं।
  2. इसके बाद, अंतिम परीक्षण सांद्रता के समाधान वाले 100 एमएल ग्लास बोतलों (सामग्री की तालिका) को हटा दें और उन्हें आरबीएस 25 कंसंट्रेट समाधान (सामग्री की तालिका) से भरे कांच की बोतलों के साथ बदलें। 5 मिनट के लिए माइक्रोस्कोप कक्ष के माध्यम से आरबीएस समाधान को परफ्यूज करें, फिर कक्ष से छिड़काव ट्यूबिंग को डिस्कनेक्ट करें, इसे आसुत पानी से साफ करें, और अंत में, इसे अच्छी तरह से सुखाएं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि वैक्यूम किसी भी संभावित बाढ़ को रोकने के लिए अच्छी तरह से काम कर रहा है।
  3. इसके बाद, छिड़काव ट्यूबिंग को जल निकासी ट्यूबिंग से कनेक्ट करें। दबाव-संचालित छिड़काव प्रणाली (सामग्री की तालिका) के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, दबाव और प्रवाह दर को पर्याप्त रूप से सेट करते हुए 10 मिनट के लिए आरबीएस समाधान चलाएं। फिर, छिड़काव प्रणाली की सफाई को पूरा करने के लिए 5 मिनट के लिए 1% डीएमएसओ और फिर 15-20 मिनट के लिए आसुत जल का छिड़काव करें।
  4. माइक्रोस्कोप लाइट को बंद करें और इसका कवर लगाएं। फिर, माइक्रोस्कोप के किनारे बॉक्स से कैमरे के तारों को अनप्लग करें और पंखे को बंद कर दें। सुनिश्चित करें कि सभी उपयोग की गई बोतलें सफाई और आटोक्लेव के लिए भेजी जाती हैं। अंत में, सुनिश्चित करें कि सभी जल निकासी बाल्टी 1/4 भरी हुई या उससे कम हैं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि अगले दिन उपयोग के लिए पर्याप्त लैमिनिन-लेपित कवरलिप्स हैं।
  5. अंत में, प्रत्येक रिकॉर्डिंग सिस्टम पर किए गए सभी प्रयोगों के अधिग्रहण फ़ोल्डर में फ़ाइलों की प्रतिलिपि बनाएं और उन्हें अतिरिक्त ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए एक सुरक्षित बैकअप सर्वर में पेस्ट करें। इसके बाद, अधिग्रहण फ़ोल्डर से सभी डेटा फ़ाइलों को हटा दें।

9. अनुबंध डेटा का विश्लेषण

  1. डेटा को औसत करने के लिए विश्लेषण सॉफ़्टवेयर और कस्टम-निर्मित मैक्रो का उपयोग करके ऑफ़लाइन विश्लेषण करें. विश्लेषण सॉफ्टवेयर अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पादित सरकोमेरे डायनामिक्स डेटा से विभिन्न मैट्रिक्स की गणना और रिपोर्ट करता है। इन मापदंडों की एक विस्तृत सूची चित्रा 2 डी में प्रदान की गई है।
    नोट: निम्न-स्तरीय सॉफ़्टवेयर तकनीकों का अनुप्रयोग रिकॉर्डिंग के कई रन को 5 सेकंड में विश्लेषण करने की अनुमति देता है। अनुबंध में दवा-प्रेरित परिवर्तनों का आकलन करने के लिए प्रमुख पैरामीटर सिकुड़न आयाम है (सरकोमेरे शॉर्टनिंग % = सरकोमेरे लंबाई में परिवर्तन)। इसकी गणना चरम संकुचन/आराम करने वाले सार्कोमेरे की लंबाई के रूप में की जाती है और प्रत्येक परीक्षण एकाग्रता के लिए पिछले 20 संकुचन क्षणिकों में औसत होता है।
  2. प्रत्येक कार्डियोमायोसाइट की विशिष्ट आधारभूत वाहन नियंत्रण स्थिति के सापेक्ष औसत संकुचन आयाम पर परीक्षण यौगिक प्रभावों की मात्रा निर्धारित करें।
  3. औसत परिणामों को एसईएम ± माध्य के रूप में व्यक्त करें और अनुबंध आयाम पर परीक्षण यौगिक के एकाग्रता प्रभाव को दर्शाते हुए एक ग्राफ का उत्पादन करें। इसके बाद, आईसी 50 (अनुबंध आयाम के 50% अवरोध का उत्पादन करने वाली एकाग्रता) और ईसी 50 (अनुबंधआयाम में 50% वृद्धि का उत्पादन करने वाली एकाग्रता) मूल्यों को प्राप्त करने के लिए विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके हिल समीकरण में एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र फिट करें।
  4. अनुबंध आयाम के अलावा, आप अन्य मापदंडों की गणना भी कर सकते हैं:
    1. आफ्टरकॉन्ट्रैक्शन: आफ्टरकॉन्ट्रैक्शन को कार्डियोमायोसाइट्स के एक सहज द्वितीयक संकुचन क्षणिक के रूप में पहचानें जो अगले नियमित संकुचन से पहले होता है और एक असामान्य और असिंक्रनाइज़ संकुचन पैदा करता है।
    2. संकुचन विफलता: संकुचन को प्रेरित करने के लिए विद्युत उत्तेजना की अक्षमता के रूप में संकुचन विफलता की पहचान करें।
    3. अल्पकालिक परिवर्तनशीलता (एसटीवी) और अल्टरनेटन्स: संकुचन आयाम परिवर्तनशीलता के पॉइनकेरे भूखंडों में इन दो मापदंडों की कल्पना करें।
      1. एसटीवी की गणना करें (∑|CAn + 1 − CAn | (20 × √2) -1) प्रत्येक नियंत्रण और परीक्षण लेख एकाग्रता अवधि के अंतिम 20 क्षणिकों के साथ। अल्टरनेटर्स को दोहराए जाने वाले वैकल्पिक छोटे और लंबे संकुचन आयाम क्षणिक के रूप में पहचानें।
      2. प्रो-एरिथमिया की घटनाओं की गणना करने के लिए, प्रत्येक सेल के वाहन नियंत्रण मूल्य के लिए एसटीवी मूल्यों को सामान्य करें, प्लॉट आफ्टरकॉन्ट्रेक्शन, संकुचन विफलता, एसटीवी, और अल्टरनेटन, और उन्हें प्रत्येक सिग्नल को प्रदर्शित करने वाली कोशिकाओं की घटनाओं के % के रूप में व्यक्त करें।
    4. समय एटो पीक, क्षय से 30% छूट (क्षय 30), क्षय से 90% विश्राम (क्षय 90), समय से 90% विश्राम (टीआर 90) (चित्रा 2 डी), बेसलाइन सार्कोमेरे लंबाई, समय से 50% पीक, पीक ऊंचाई, पीक सिकुड़न पर सरकोमेरे की लंबाई, अधिकतम संकुचन वेग, और अधिकतम विश्राम वेग12 की गणना के साथ मल्टीपैरामीट्रिक यंत्रवत प्रोफाइलिंग को पूरा करें।. अनुबंध आयाम की तरह, प्रत्येक कार्डियोमायोसाइट की विशिष्ट आधारभूत नियंत्रण स्थिति के सापेक्ष इन मापदंडों को व्यक्त करें और उन्हें एकाग्रता-प्रतिक्रिया भूखंडों में ग्राफ करें।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में वर्णित अंग दाताओं से पृथक वयस्क मानव प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स में सिकुड़न को मापने और एक परीक्षण यौगिक द्वारा प्रेरित अनुबंध मापदंडों में तीव्र परिवर्तन ों का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रक्रिया है। अनुबंध क्षणिक का माप एक वीडियो-आधारित सेल ज्यामिति प्रणाली, मायोब्लेज़र का उपयोग करके पूरा किया जाता है, जो सार्कोमेरे गतिशीलता को मापता है, और वयस्क हृदय की स्थिति को शारीरिक पेसिंग आवृत्ति (1 हर्ट्ज) पर विद्युत उत्तेजना के साथ संकुचन को प्रेरित करके अनुकरण किया जाता है। कार्डियोमायोसाइट्स की कार्यात्मक व्यवहार्यता की पुष्टि उनके उत्तेजना-संकुचन युग्मन (यानी, संकुचन के साथ विद्युत उत्तेजना [सरकोलेममल एक्शन पोटेंशियल] को जोड़ने वाले सेलुलर प्रोसेसिंग) का आकलन करके की जाती है। मानव कार्डियोमायोसाइट्स में कोई सहज संकुचन क्षणिक नहीं है, और कार्डियोमायोसाइट्स अनुबंध / विश्राम चक्र (चित्रा 2 सी, ई) के साथ-साथ आइसोप्रोटेनॉल, एक β-एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट (चित्रा 2 एफ, जी) के साथ बाहरी विद्युत उत्तेजना का जवाब देते हैं। आइसोप्रोटेनॉल अनुबंध में एकाग्रता-निर्भर वृद्धि का कारण बनता है (चित्रा 2 जी), और अनुबंध क्षणिक के कैनेटीक्स पर इसके प्रभाव को भी चित्रित किया जा सकता है (चित्रा 2 डी)12।

Figure 1
चित्रा 1: ऑप्टिकल कॉन्ट्रैक्टिलिटी रिकॉर्डिंग सिस्टम का प्रयोगात्मक सेटअप। उज्ज्वल-क्षेत्र संकुचन रिकॉर्डिंग वयस्क मानव प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स से बनाई जाती है जैसा कि पहले वर्णित11,12,13,14 था। सेटअप में एक (ए) तापमान नियंत्रण बॉक्स, (बी) फील्ड उत्तेजक, (सी, डी) दबाव-संचालित छिड़काव प्रणाली, (ई) कंप्यूटर दबाव-संचालित प्रोग्राम, (एफ) दबाव प्लस बोतलें, (जी) अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, (एच) अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ आरओआई का चयन, (आई) अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ अनुबंध क्षणिक का प्रदर्शन, (जे) उल्टे माइक्रोस्कोप, (के) माइक्रोस्कोप कक्ष, और ( एल) कैमरा। उपकरण की सभी विशेषताएं सामग्री की तालिका में दी गई हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मानव कार्डियोमायोसाइट्स संकुचन माप का सत्यापन और β-एड्रीनर्जिक उत्तेजना का प्रभाव। (ए) एक प्रतिनिधि वयस्क मानव प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स की फेज कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी छवि, (बी) स्वस्थ कार्डियोमायोसाइट्स की छवियों पर और संकुचन की धुरी के समानांतर रखे गए उपयोगकर्ता-परिभाषित क्षेत्र (आरओआई), (सी) (बी) (बी) में एक ही आरओआई से प्राप्त सिकुड़न क्षणिकता का प्रदर्शन (बी)) अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ, (डी) अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ मापा गया अनुबंध क्षणिक से संबंधित पैरामीटर: अनुबंध आयाम, शिखर का समय, क्षय 30, क्षय 90, टीआर 90। अतिरिक्त मापदंडों को भी मापा जा सकता है: बेसलाइन सरकोमेरे की लंबाई, समय से 50% पीक, चोटी की ऊंचाई, चरम संकुचन पर सरकोमेरे की लंबाई, अधिकतम संकुचन वेग और अधिकतम विश्राम वेग। (ई) वाहन नियंत्रण (एफ) की उपस्थिति में 1 हर्ट्ज की पेसिंग आवृत्ति पर एक वयस्क मानव प्राथमिक वेंट्रिकुलर मायोसाइट से और 30 एनएम आइसोप्रोटेनॉल, एक गैर-चयनात्मक β-एड्रीनर्जिक एगोनिस्ट के संपर्क में आने के बाद विशिष्ट संकुचन क्षणिक दर्ज किया गया। पैनल ई और एफ में प्रदर्शित संकुचन क्षणिक ों को एक ही कार्डियोमायोसाइट से एकत्र किया गया था। मानव कार्डियोमायोसाइट्स से आइसोप्रोटेनॉल 1 हर्ट्ज पेसिंग आवृत्ति पर शक्ति की जानकारी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया था। (जी) आइसोप्रोटेनॉल (एन = 8 कोशिकाओं) के साथ मानव कार्डियोमायोसाइट्स सिकुड़न माप द्वारा उत्पन्न विशिष्ट संचयी एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

छिड़काव अनुक्रम वाहन समाधान एकाग्रता 1 (μM) एकाग्रता 2 (μM) एकाग्रता 3 (μM) एकाग्रता 4 (μM) धोना
उपचार का समय 120 s 300 s 300 s 300 s 300 s 300 s
उत्तेजना आवृत्ति 1 Hz 1 Hz 1 Hz 1 Hz 1 Hz 1 Hz

तालिका 1: उत्तेजना प्रोटोकॉल और परीक्षण यौगिक अनुप्रयोग अनुक्रम। अनुबंध क्षणिक की स्थिरता का मूल्यांकन समाधान सी में 120 सेकंड के लिए निरंतर रिकॉर्डिंग द्वारा किया जाता है, वाहन नियंत्रण स्थापित करता है (आमतौर पर 0.1% डीएमएसओ में)। इसके बाद, परीक्षण लेख एकाग्रता को न्यूनतम 300 सेकंड के लिए या स्थिर-अवस्था प्रभाव प्राप्त होने तक लागू किया जाता है। चार आरोही परीक्षण लेख सांद्रता का उपयोग किया जाता है, जो संचयी एकाग्रता-प्रभाव (सी-ई) वक्र प्रदान करता है। परीक्षण लेख के संचयी परिवर्धन के अंत में, 300-s वॉशआउट अवधि लागू की जा सकती है।

Discussion

यह पांडुलिपि एक सरलीकृत मध्यम-थ्रूपुट विधि के लिए वयस्क मानव कार्डियोमायोसाइट्स अनुबंध-आधारित ऑप्टिकल सिस्टम के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करती है जो नए यौगिकों की तीव्र प्रभावकारिता और कार्डियोटॉक्सिसिटी के परीक्षण को सक्षम बनाती है। यह ऑप्टिकल कॉन्ट्रैक्टिलिटी रिकॉर्डिंग सिस्टम उपयोग करना आसान है, समानांतर में कई कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है, सेल स्वास्थ्य, शरीर विज्ञान और फार्माकोलॉजी के एक साथ मूल्यांकन को सक्षम बनाता है, स्वचालित और तेजी से डेटा विश्लेषण के साथ आता है (कई कोशिकाओं का एक रन 5 सेकंड में विश्लेषण किया जाता है), और तेजी से डेटा संग्रह (एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र हर 30 मिनट / यौगिक / डिवाइस) की अनुमति देता है। इन विशेषताओं को ध्यान में रखते हुए, रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग न केवल कार्डियोमायोसाइट्स सिकुड़न पर दवाओं के प्रभाव का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, बल्किदवा की खोज के शुरुआती चरणों के दौरान औषधीय रसायन विज्ञान के प्रयासों का समर्थन करने के लिए संरचना-गतिविधि संबंध डेटा प्रदान करने के लिए भी किया जा सकता है। चूंकि कार्डियोमायोसाइट्स अलगाव प्रोटोकॉल से लाखों कोशिकाओं को प्राप्त किया जा सकता है, इसलिए ऑप्टिकल कॉन्ट्रैक्टिलिटी रिकॉर्डिंग सिस्टम-कार्डियोमायोसाइट्स प्लेटफॉर्म के आवेदन को वर्तमान में कम लागत के साथ बढ़ी हुई परीक्षण क्षमता (अच्छी तरह से आधारित प्लेटों के उपयोग के साथ) प्राप्त करने के लिए खोजा जा रहा है। इसके अलावा, रिकॉर्डिंग सिस्टम के साथ मापा गया सिस्टोलिक और विश्राम मापदंडों पर दवा के प्रभाव का आकलन इनोट्रोपिकदवाओं की मल्टीपैरामीट्रिक यांत्रिक प्रोफाइलिंग प्रदान कर सकता है। इसके अतिरिक्त, कार्डियोमायोसाइट्स कॉन्ट्रैक्टिलिटी डेटा का उपयोग नई दवाओं को सबसे कम से कम कार्डियोटॉक्सिक (जैसे, सुरक्षा मार्जिन) और कम से कम सबसे प्रभावी (जैसे, शक्ति मार्जिन) से रैंक करने के लिए किया जा सकता है। विकास कार्यक्रमों का समर्थन करने के लिए अनुवर्ती कार्डियोमायोसाइट्स अनुबंध अध्ययन भी आयोजित किए जा सकते हैं जो मायोकार्डियल सिकुड़न12 में नैदानिक कमी से जुड़े हैं।

मानव कार्डियोमायोसाइट्स कॉन्ट्रैक्टिलिटी ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग सिस्टम का उपयोग करने का एक और महत्वपूर्ण लाभ 3आर अवधारणा (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) 17 के साथ इसका संरेखण है क्योंकि इसे एक वैकल्पिक विधि के रूप में माना जा सकता है जो दवा उद्योग के भीतर डेटा उत्पादन के लिए जानवरों के उपयोग से बचता है या प्रतिस्थापित करता है। यह 3आर लाभ अकादमिक कार्डियक रिसर्च के लिए भी बढ़ाया जा सकता है। कार्डियोमायोसाइट्स फिजियोलॉजी और फार्माकोलॉजी के वर्तमान ज्ञान की संपूर्णता जानवरोंके दिल से अलग कोशिकाओं के साथ किए गए अकादमिक शोध अध्ययनों से आती है। इस प्रकार, मानव कार्डियोमायोसाइट्स ऑप्टिकल कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉडल महत्वपूर्ण ट्रांसलेशनल अध्ययन किए जाने की संभावना खोलता है। इन अध्ययनों को करने के लिए, मानव वयस्क कार्डियोमायोसाइट्स के संरक्षण और शिपमेंट के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए जाने चाहिए (वर्तमान में एनाबायोस की प्रयोगशाला में मूल्यांकन के तहत), और अनुबंध प्रणाली में गैर-मानव कार्डियोमायोसाइट्स से सरकोमेरे लंबाई में परिवर्तन को रिकॉर्ड करने की क्षमता होनी चाहिए (यह ऑप्टिकल कॉन्ट्रैक्टिलिटी रिकॉर्डिंग सिस्टम के साथ मामला है क्योंकि सार्कोमेरेस प्रजातियों के बीच अच्छी तरह से संरक्षित हैं)।

मानव कार्डियोमायोसाइट्स सिकुड़न प्रणाली कई शारीरिक स्थितियों (जैसे, इलेक्ट्रोमैकेनिकल युग्मन, हृदय गति, शरीर के तापमान, सभी मानव हृदय लक्ष्यों के एकीकरण की नकल करने वाली पेसिंग आवृत्ति) का अनुकरण कर सकती है और दवा की खोज 11,12,13,14 में एक प्रमुख घटक के रूप में ट्रांसलेशनल मूल्य का प्रदर्शन किया है।, हालांकि यह कार्डियक सिकुड़ा हुआ चक्र के दौरान देखे गए यांत्रिक भार और कतरनी तनाव में परिवर्तन की नकल नहीं कर सकता है। कार्डियक एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिसेस की संरचना और कार्य अब बेहतर ढंग से समझा जाता है19, ऐसे मैट्रिक्स का विकास संभावित रूप से यांत्रिक भार सीमा को दूर करने में मदद कर सकता है, और विभिन्न हृदय जैसी कठोरता वाले मैट्रिसेस का मूल्यांकन वर्तमान में एनाबायोस की प्रयोगशाला में किया जा रहा है। मानव कार्डियोमायोसाइट्स ऑप्टिकल सिकुड़न प्रणाली की एक और सीमा नसों के नेटवर्क की अनुपस्थिति है जो हृदय की आपूर्ति करती है (जैसे, सहानुभूति और पैरासिम्पेथेटिक फाइबर)20। इस न्यूरो-कार्डियक संपर्क को न्यूरोट्रांसमीटर (जैसे, आइसोप्रोटेनॉल, β-एड्रेनोसेप्टर रिसेप्टर्स का एक एगोनिस्ट; एसिटाइलकोलाइन, एम 2 मस्करिनिक रिसेप्टर्स का एक एगोनिस्ट) के सह-आवेदन के साथ फिर से स्थापित किया जा सकता है, यौगिक को कार्डियोमायोसाइट्स संकुचन पर इसके संभावित प्रभावों के लिए मूल्यांकन किया जा रहा है। इसके अलावा, अनुबंध क्षणिक ों को कार्रवाई क्षमता और सीए2 + क्षणिकता के एक साथ माप के साथ दर्ज किया जाता है, जो इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम और सीए2 + हैंडलिंग पर दवा के प्रभाव का मूल्यांकन करते समय भी आवश्यक हैं। यद्यपि इस चूक को सिस्टम की सीमा माना जा सकता है, लेकिन यह बहुत महत्वपूर्ण नहीं है क्योंकि कार्रवाई संभावित संकेतों (वर्तमान-क्लैंप विधि या वोल्टेज-संवेदनशील रंगों के साथ) और सीए 2 + क्षणिक (सीए2 + संकेतक / रंजक के साथ) की रिकॉर्डिंग साइटोटॉक्सिसिटी से जुड़ी हो सकती है। इस तरह के साइटोटोक्सिक प्रभाव दिल की सिकुड़न को नियंत्रित करने के लिए नई दवाओं के मूल्यांकन को प्रभावित कर सकते हैं। इसके विपरीत, एक गैर-इनवेसिव ऑप्टिकल विधि का उपयोग जो कार्डियोमायोसाइट्स के स्वास्थ्य, शरीर विज्ञान और फार्माकोलॉजी को संरक्षित करता है, जैसे कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित रिकॉर्डिंग सिस्टम, न केवल यह सुनिश्चित करेगा कि अनुबंध डेटा की उच्चतम गुणवत्ता प्राप्त की जाए, बल्कि डेटा भी प्रदान किया जाए जो मनुष्यों में नई दवाओं के सिकुड़ा हुआ प्रभावों की अच्छी तरह से भविष्यवाणी कर सके।

Disclosures

सभी लेखक एनाबायोस कॉर्पोरेशन के कर्मचारी हैं और कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को एनाबायोस कॉर्पोरेशन और एनआईएच स्मॉल बिजनेस इनोवेशन रिसर्च (एसबीआईआर) अनुदान (1आर 44टीआर003162-01) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100–1000 µL Filtered, Wide Orifice, Sterile tips Pipette UF-1000W
100 mL, Duran pressure plus bottles DWK Life Sciences 218102406
1 L, 0.22 µm Vacuum Filter system VWR 567-0020
290 mmol/kg Osmolarity Standard Wescor OA-029
Benchtop pH Meter Mettler Toledo https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html
Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C3881
Camera  Optronis GmbH Cyclone-25-150-M https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/
Corning 25 mm x25 mm Square #1 Cover Glass Corning 2845-25
Cyclone-25-150 Optronis https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Digital Timer/Stopwatch Fisher Scientific 14-649-17
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Eight-well rectangular polystyrene sterile culture plate Thermo Fisher Scientific 73521-426 https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific
FHD Microscope Chamber System IonOptix
Flow EZ, Modular pressure-based flow controller with a computer driven program version 1.1.0.0. Fluigent OxyGEN
Heavy Duty Vacuum Bottles VWR 16211-080
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Human Recombinant Laminin 521 BioLamina LM521-05
Idex Chromatography Tubing, Natural FEP, 1/16" OD x 0.030" ID Cole-Palmer 1520L
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Fisher Scientific 06-666
L-(-)-Malic acid Sigma-Aldrich 112577
Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
L-Glutamic acid Sigma-Aldrich 49449
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) Sigma-Aldrich M9272
Microscope Temperature Control Stage Warmer AmScope TCS-100
MyoPacer Field Stimulator IonOptix
Nunc Rectangular Dishes Thermo Scientific 267062
Olympus IX83P1ZF Ixplore Standard microscope Olympus https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid
=116963199831&keyword=ix73%20
microscope&gclid=EAIaIQobChMIl
qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA
YASAAEgLp3fD_BwE
pH 4.01, 7.00, and 10.01 Standards Oakton WD-05942-10
Potassium Chloride (KCl) Sigma-Aldrich 746436
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P4494
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 795488
Prism Software GraphPad Software - Dotmatics https://www.graphpad.com/
RBS 25 Liquid Detergent Sigma-Aldrich 83460
Sharps Container Uline S-15307
SigmaPlot analysis software Systat Software Inc. https://systatsoftware.com/
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich 221465
Student Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 91150-20
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Temperature Control Box Warner Insturments TC-324C
Vapor Pressure Osmometer ELITechGroup Model 5600
Wheaton 20 mL Vials DWK Life Sciences 225288

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References

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Abi Gerges, N., Stafford, A., Truong, K., Miron, Y., Winrow, B., Krause, B., Page, G., Ghetti, A. Measurement of Heart Contractility in Isolated Adult Human Primary Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64394, doi:10.3791/64394 (2022).

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