Summary
Dit protocol beschrijft hoe contractiliteit in volwassen menselijke primaire cardiomyocyten van donorharten kan worden gemeten met het MyoBLAZER-systeem, een betrouwbaar platform voor het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in contractiliteit tijdens preklinische ontwikkeling.
Abstract
De evaluatie van veranderingen in de contractiliteit van het hart is essentieel tijdens de preklinische ontwikkeling van nieuwe cardiale en niet-cardiaalgerichte verbindingen. Dit artikel beschrijft een protocol voor het beoordelen van veranderingen in contractiliteit bij volwassen menselijke primaire ventriculaire cardiomyocyten met behulp van de MyoBLAZER, een niet-invasieve optische methode die de normale fysiologie en farmacologie van de cellen behoudt. Deze optische registratiemethode meet continu contractiliteitstransiënten van meerdere cellen parallel, wat zowel een gemiddelde doorvoer als waardevolle informatie oplevert voor elke individuele cel in het gezichtsveld, waardoor de effecten van geneesmiddelen in realtime kunnen worden gevolgd. De samentrekkingen van cardiomyocyten worden geïnduceerd door stimulatie van het elektrische veld en de verkregen helderveldbeelden worden naar een beeldverwerkingssoftware gestuurd die de sarcomeerverkorting over meerdere cardiomyocyten meet. Deze methode genereert snel verschillende eindpunten met betrekking tot de kinetiek van contractie- en relaxatiefasen, en de resulterende gegevens kunnen vervolgens worden geïnterpreteerd in relatie tot verschillende concentraties van een testartikel. Deze methode wordt ook gebruikt in de late stadia van preklinische ontwikkeling om mechanistische vervolgstudies uit te voeren ter ondersteuning van lopende klinische studies. Het op primaire cardiomyocyten gebaseerde model voor volwassenen in combinatie met het optische systeem voor continue contractiliteitsmonitoring heeft dus het potentieel om bij te dragen aan een nieuw tijdperk van vertaalbaarheid van in-vitrocardale gegevens bij de ontwikkeling van preklinische medische therapieën.
Introduction
Myocardiale contractiliteit (inotropie), die het natuurlijke vermogen van de hartspier vertegenwoordigt om samen te trekken, is een belangrijke eigenschap van de hartfunctie en hangt af van de dynamiek van de elektromechanische koppeling. Door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in myocardiale contractiliteit zijn gewenst voor de behandeling van hartaandoeningen (bijv. hartfalen) en ongewenst in de context van cardiotoxiciteit (bijv. vermindering van de linkerventrikel-ejectiefractie). Daarom moeten preklinische contractiliteitsmodellen worden geassocieerd met nauwkeurige voorspelbaarheid om ervoor te zorgen dat nieuwe geneesmiddelen kunnen slagen tijdens de klinische ontwikkeling. De huidige preklinische strategieën, die gebaseerd zijn op reductionistische kunstmatige cellulaire modellen (bijv. genetisch gemanipuleerde onsterfelijke cellijnen die specifieke cardiale doelen van belang tot overexpressie brengen) en niet-menselijke diermodellen, hebben echter aanzienlijke beperkingen aangetoond en blijken geassocieerd te zijn met hoge uitvalpercentages van geneesmiddelen (d.w.z. een hoog percentage valse signalen)1,2,3,4 . Dienovereenkomstig is het absoluut noodzakelijk om nieuwe en betrouwbare menselijke cellulaire hartcontractiliteitsmodellen op te stellen die geassocieerd zijn met een hoog vermogen (d.w.z. een hoge snelheid van echte signalen) om de uitkomsten van geneesmiddelen bij mensen te voorspellen en zo de lancering van nieuwe therapieën te versnellen5.
De baanbrekende methoden die onlangs zijn vastgesteld voor het herstel van menselijke donorharten voor onderzoek 6,7,8,9,10 en in cardiomyocytenisolatietechnieken 11,12,13,14,15 hebben een unieke kans geboden voor het uitvoeren van op mensen gebaseerde studies tijdens de preklinische ontwikkeling. Daartoe hebben volwassen menselijke primaire cardiomyocyten al nut getoond bij het beoordelen van door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in de contractiliteit van het menselijk hart11,12,13,14. Het huidige artikel beschrijft het protocol voor het onderzoeken van de contractiliteitseffecten van nieuwe verbindingen in volwassen menselijke cardiomyocyten.
Protocol
Alle methoden zijn uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Alle menselijke harten die voor de onderzoeken werden gebruikt, waren niet-transplanteerbaar en ethisch verkregen door geïnformeerde wettelijke toestemming (eerste persoon of naaste verwanten) van kadaverorgaandonoren in de Verenigde Staten (VS). De herstelprotocollen en in-vitro-experimenten werden vooraf goedgekeurd door Institutional Review Boards (IRB's) in transplantatiecentra binnen het US Organ Procurement Transplant Network (OPTN). Bovendien zijn alle overdrachten van de donorharten volledig traceerbaar en periodiek gecontroleerd door de Amerikaanse federale autoriteiten.
NOTITIE: Pas alle noodzakelijke veiligheidsprocedures toe tijdens de uitvoering van dit protocol, inclusief het dragen van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (bijv. laboratoriumjassen, veiligheidsbrillen, handschoenen).
1. Isolatie van cardiomyocyten (1 dag voor het meten van contractiliteit)
- Onmiddellijk na aankomst in het laboratorium donorharten opnieuw perfuseren met ijskoude gepatenteerde cardioplegische oplossing6 en enzymatisch volwassen menselijke primaire myocyten isoleren uit de ventrikels 11,12,13,14,15.
- Houd vervolgens de cardiomyocyten in suspensie en bewaar ze met 10 ml oplossing A (110 mM sucrose, 0,005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM lactobionzuur, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurine, 20 mM L-histidine, 20 mM HEPES, 2 mM L-glutaminezuur, 2 mM L-(-)-appelzuur, pH 7,4 met KOH) in 20 ml Wheaton-injectieflacons (materiaaltabel) bij een gekoelde temperatuur totdat ze experimenteel worden ondervraagd.
OPMERKING: Bewaar 200.000 cellen per injectieflacon.
2. Voorbereiding van lamininecoating (1 dag voor het meten van contractiliteit)
- Plaats een enkel glazen dekglaasje (25 mm x 25 mm vierkant, Tabel met materialen) in elk putje van een kweekplaat met acht putjes (Tabel met materialen).
- Smeer vervolgens de dekglaasjes in met laminine in een concentratie van 5 μg/ml. Voeg hiervoor 800 μL van de humane recombinante laminine 521-voorraad (materiaaltabel, bewaard bij -20 °C) toe aan 7,2 ml oplossing B (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glucose en 10 mM HEPES, pH 7,4 met NaOH) en meng goed.
- Laat 200 μL van de verdunde laminineoplossing in het midden van elk dekglaasje vallen. Dek het bord vervolgens af en stapel het in een koelkast van 4 °C.
NOTITIE: Bereid meerdere kweekplaten met acht putjes voor om ervoor te zorgen dat er voldoende gelamineerde dekglaasjes zijn.
3. Bereiding van Ca2+-tolerante cardiomyocyten (op de dag van het meten van contractiliteit)
- Haal een injectieflacon met cellen uit de koelkast, zuig oplossing A op uit de injectieflacon en voeg een gekoelde 10 ml oplossing B toe.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen niet worden afgezogen en dispergeer oplossing B in de injectieflacon door de pipet aan de binnenkant van de bovenkant van de injectieflaconwand te plaatsen. - Sluit de injectieflacon met cellen af en draai deze voorzichtig rond om ervoor te zorgen dat de cellen door oplossing B worden verspreid. Laat de cellen ten slotte 1 uur bezinken bij kamertemperatuur (RT).
4. Voorbereiding van het registratiesysteem (op de dag van de meting van de contractiliteit)
OPMERKING: Het registratiesysteem omvat een temperatuurregelkast, stimulator, computergestuurde drukgestuurde perfusie, drukgestuurde perfusieflessen, interne acquisitiesoftware die de selectie van interessegebieden (ROI's) en weergave van contractiliteitstransiënten mogelijk maakt, omgekeerde microscoop, celkamer en camera (Figuur 1).
- Schakel het zuigvacuümsysteem in. Verwijder vervolgens het deksel van de microscoop, zet het aan, sluit de camera aan (Tabel met materialen, Figuur 1) en controleer ten slotte of de ventilator is ingeschakeld om ervoor te zorgen dat de camera niet oververhit raakt.
- Schakel vervolgens de microscoopverwarmingsplaat (Tabel met materialen) en de temperatuurregelkast (Tabel met materialen, Figuur 1) in en stel ze in op de juiste bedrijfstemperatuur. Schakel vervolgens de veldstimulator (Tabel met materialen, Figuur 1) en het druksysteem in. Sluit ten slotte de slang van de oplossing (Tabel met materialen) aan op de opnamekamer (Tabel met materialen, Figuur 1).
5. Bereiding van de testverbindingen (op de dag van de meting van de contractiliteit)
- Verdund dimethylsulfoxide (DMSO; Tabel met materialen) 1.000-voudig in oplossing C (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11,1 mM glucose en 10 mM HEPES, pH 7,4 met NaOH) om een 0,1% DMSO-voertuigoplossing te maken.
- Om een verbinding te testen op 1-voudig, 10-voudig, 100-voudig en 1000-voudig van de therapeutische blootstelling van 0,001 μM, lost u de testverbinding op in DMSO met een concentratie van 1 mM.
- Verdun deze oplossing serieel met DMSO om nog drie DMSO-voorraden te produceren (bijv. 0,001 mM, 0,01 mM en 0,1 mM). Verdun ten slotte elke testmassa 1,000-voudig in 100 ml oplossing C om de uiteindelijke testconcentraties te verkrijgen (0,001 μM, 0,01 μM, 0,1 μM en 1 μM).
- Voeg de mediumoplossing en oplossingen van de uiteindelijke micromolaire concentraties van de verbinding toe aan glazen flessen van 100 ml (Materiaaltabel, Figuur 1) en sluit de flessen vervolgens aan op het drukgestuurde perfusiesysteem (Materiaaltabel, Figuur 1).
- Vul vervolgens het perfusiesysteem met een computergestuurd programma (Tabel met materialen) met een druk van 200-300 mbar om een constante perfusiestroom te leveren met een snelheid van 1.8 ml/min.
OPMERKING: Voer het experiment niet uit als blijkt dat de teststof verband houdt met een probleem met de oplosbaarheid. Formuleer ook de samengestelde testoplossingen uit voorraadoplossingen binnen 30 minuten voorafgaand aan de experimentele toepassing op de cellen.
6. Plateren van cardiomyocyten (op de dag van het meten van contractiliteit)
- Neem een bord met acht putjes met gelamineerde dekglaasjes uit de koelkast van 4 °C en plaats voorzichtig een dekglaasje in een zeer goed gereinigde opnamekamer (Figuur 1). Zet de plaat met acht putjes vervolgens terug in de koelkast van 4 °C tot de volgende plaat.
NOTITIE: Gebruik een pluisvrij doekje (Tabel met materialen) om het gecoate dekglaasje op te vegen terwijl u het dekglaasje bedekt houdt met een dunne laag laminine. Zorg er ook voor dat u gebruikte dekglaasjes in een naaldencontainer gooit. - Neem vervolgens een geëscaleerde injectieflacon met cellen (stap 3.2) en zuig oplossing B uit de injectieflacon om een zo klein mogelijk volume te bereiken zonder cellen te verliezen (~200 μL). Doseer vervolgens de 200 μL cellen in de opnamemicroscoopkamer die op de tafel van een omgekeerde microscoop is gemonteerd (Tabel met materialen).
- Laat de cellen 5 minuten op het dekglaasje bezinken. Terwijl u wacht tot de cellen volledig tot rust zijn gekomen, opent u het gezichtsveld op de microscoop en bepaalt u of de celdichtheid voldoende is (~70%) om de experimentele run te starten.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de afzuiging niet alle cellen wegzuigt als er meer dan 200 μL wordt afgegeven.
7. Registratie van contractiliteit van cardiomyocyten
- Nadat het uitplateren is voltooid, brengt u de cellen gedurende 5 minuten in evenwicht door ze continu te perfunderen met oplossing C met behulp van het drukgestuurde perfusiesysteem (materiaaltabel). Stel de zuigkracht correct af, zet zowel de temperatuurregelkast als de verwarmingsplaat aan en stel ze in op ~35 °C.
- Stimuleer vervolgens de cellen met een bovendrempelspanning met een stimulatiefrequentie van 1 Hz (bipolaire puls van 3 ms) op een veldstimulator met een paar platinadraden aan weerszijden van de kamer die is aangesloten op een veldstimulator.
- Stel de amplitude van de stimulerende puls in op 1 V en verhoog deze totdat de cardiomyocyten contractie-ontspanningscycli beginnen te genereren. Gebruik tijdens het experiment een waarde van 1,5x de drempelwaarde.
OPMERKING: Selecteer gezonde cellen met staafvormige morfologie en duidelijke strepen. Pas vervolgens het gezichtsveld aan en concentreer u op het in beeld brengen van zoveel mogelijk samentrekkende cellen (Figuur 2A). - Geef vervolgens de gedigitaliseerde beelden van de cellen weer in de acquisitiesoftware van het optische contractiliteitsregistratiesysteem. Deze software maakt gebruik van een camera met hoge resolutie en hoge framesnelheid met een snelheid van 150 FPS (Tabel met materialen, Figuur 1) om een videostream op te nemen met meerdere myocyten in hetzelfde frame.
OPMERKING: Dit biedt voldoende temporele en ruimtelijke resolutie om de sarcomeerdynamiek van meerdere gezonde myocyten tegelijkertijd vast te leggen en te meten. Moderne processors met een hoog aantal kernen worden gebruikt om de parallelle berekening van veranderingen in sarcomeerlengte van de videostream in realtime mogelijk te maken (optische dichtheidsgegevens worden verzameld uit door de gebruiker gedefinieerde interessegebieden [ROI] die over de beelden van gezonde cardiomyocyten worden geplaatst en evenwijdig aan de as van contractie, Figuur 2B). De optische intensiteitsgegevens tonen heldere en donkere banden die overeenkomen met de Z-lijnen van de cardiomyocyten (Figuur 1, Figuur 2C). Ten slotte worden deze gegevens voor controledoeleinden aan de gebruiker getoond en op een schijf opgeslagen voor latere analyse (Figuur 2C).- Vermijd delen van de cellen die niet scherp zijn. Plaats de ROI's ook niet dicht bij de rand van de cellen, omdat de veranderingen in de samentrekking van de cellen tijdens het aanbrengen van medicijnen ervoor kunnen zorgen dat de ROI's de samentrekking van de cellen niet kunnen lezen.
- Wanneer de selectie van ROI's is voltooid en de contracties voldoen aan de noodzakelijke gebruiksnormen (bijv. sarcomeerverkorting >1%; ritmische contractie bij toepassing van een stimulatiefrequentie van 1 Hz, afwezigheid van aritmische gebeurtenissen), start u het experiment om de effecten van een verbinding te beoordelen. Het stimulatieprotocol en de volgorde van de toepassing van de testconcentraties door de verbinding zijn weergegeven in tabel 1. De acquisitiesoftware zal op geautomatiseerde wijze de acquisitie en weergave van gegevens en de etikettering van testconcentraties en behandelingstijd beheren.
OPMERKING: Pas testconcentraties toe als de contractie gedurende de gehele basisperiode van het voertuig op een stabiele amplitude blijft. Diskwalificeer cellen met een aanloop of afloop. Zorg er ook voor dat de perfusie tijdens het experiment wordt overgeschakeld naar de verschillende testconcentraties.
- Na voltooiing van het experiment en de gegevensopslag op de server, schakelt u de perfusie en verwarming uit, stopt u de stimulatie, reinigt u de microscoopkamer met gedestilleerd water, verwijdert u vervolgens het glazen dekglaasje en droogt u de kamer grondig af.
NOTITIE: Reinig de kamer grondig, aangezien dit van cruciaal belang is om te voorkomen dat de volgende set cellen voortijdig wordt blootgesteld aan een verbinding, waardoor alle verzamelde gegevens ongeldig worden. - Voer vervolgens een nieuwe beplating van cardiomyocyten uit en voer een aanvullend experiment uit om voldoende gegevens te verkrijgen voor het voltooien van het testen van de verbinding of het testen van een nieuwe verbinding.
8. Het registratiesysteem voor optische contractiliteit uitschakelen
- Wanneer het dagelijks testen van de verbinding(en) is voltooid, schakelt u eerst alle apparatuur uit die niet nodig is om het systeem te reinigen en kopieert u de gegevens voor offline analyse.
- Verwijder vervolgens de glazen flessen van 100 ml (materiaaltabel) met oplossingen van de uiteindelijke testconcentraties en vervang ze door glazen flessen die voor de helft gevuld zijn met RBS 25-concentraatoplossing (materiaaltabel). Perfuseer de RBS-oplossing gedurende 5 minuten door de microscoopkamer, koppel vervolgens de perfusieslang los van de kamer, reinig deze met gedestilleerd water en droog deze ten slotte grondig af.
NOTITIE: Zorg ervoor dat het vacuüm goed werkt om mogelijke overstromingen te voorkomen. - Sluit vervolgens de perfusieslang aan op de afvoerslang. Gebruik de software van het drukgestuurde perfusiesysteem (materiaaltabel) om de RBS-oplossing 10 minuten te laten draaien en ervoor te zorgen dat de druk en het debiet adequaat zijn ingesteld. Perfuseer vervolgens 1% DMSO gedurende 5 minuten en destilleer vervolgens water gedurende 15-20 minuten om de reiniging van het perfusiesysteem te voltooien.
- Doe het microscooplicht uit en plaats het deksel. Koppel vervolgens de cameradraden los van de doos aan de zijkant van de microscoop en zet de ventilator uit. Zorg ervoor dat alle gebruikte flessen worden opgestuurd voor reiniging en autoclaaf. Zorg er ten slotte voor dat alle afvoeremmers voor 1/4 of minder vol zijn.
NOTITIE: Zorg ervoor dat er voldoende gelamineerde dekglaasjes zijn voor gebruik de volgende dag. - Kopieer ten slotte de bestanden in de acquisitiemap van alle experimenten die op elk opnamesysteem zijn uitgevoerd en plak ze in een beveiligde back-upserver voor aanvullende offline analyse. Verwijder vervolgens alle gegevensbestanden uit de acquisitiemap.
9. Analyse van contractiliteitsgegevens
- Voer offline analyses uit met behulp van de analysesoftware en een op maat gemaakte macro om het gemiddelde van de gegevens te nemen. De analysesoftware berekent en rapporteert verschillende statistieken op basis van de sarcomeerdynamiekgegevens die door de acquisitiesoftware worden geproduceerd. Een gedetailleerde lijst van deze parameters is weergegeven in figuur 2D.
OPMERKING: De toepassing van low-level softwaretechnieken maakt het mogelijk om veel runs van opnames in 5 s te analyseren. De belangrijkste parameter om door geneesmiddelen geïnduceerde veranderingen in contractiliteit te beoordelen, is de contractiliteitsamplitude (sarcomeerverkorting % = verandering in sarcomeerlengte). Het wordt berekend als de sarcomeerlengte bij piekcontractie/rustlengte van het sarcomeer en gemiddeld over de laatste 20 contractiliteitstransiënten voor elke testconcentratie. - Kwantificeer de effecten van de testverbinding op de gemiddelde contractiliteitsamplitude ten opzichte van de specifieke uitgangstoestand van het vehiculumcontrolemiddel van elke cardiomyocyt.
- Druk de gemiddelde resultaten uit als gemiddelde ± SEM en maak een grafiek waarin het concentratie-effect van de teststof op de contractiliteitsamplitude wordt uitgezet. Pas vervolgens de concentratie-responscurve aan de Hill-vergelijking aan met behulp van analysesoftware (tabel met materialen) om IC50 (concentratie die een remming van 50% van de contractiliteitsamplitude veroorzaakt) en EC50 (concentratie die een toename van 50% in contractiliteitsamplitude veroorzaakt) waarden af te leiden.
- Naast de contractiliteitsamplitude kunt u ook andere parameters berekenen:
- Nacontractie: Identificeer nacontractie als een spontane secundaire contractie van voorbijgaande aard van de cardiomyocyt die optreedt vóór de volgende reguliere contractie en een abnormale en niet-gesynchroniseerde contractie veroorzaakt.
- Contractiefout: Identificeer contractiefalen als het onvermogen van de elektrische stimulus om een contractie te induceren.
- Kortetermijnvariabiliteit (STV) en alternanen: Visualiseer deze twee parameters in Poincaré-grafieken van contractieamplitudevariabiliteit.
- Bereken de STV (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) met de laatste 20 transiënten van elke concentratieperiode van elk controle- en testartikel. Identificeer alternanen als repetitieve afwisselende korte en lange contractiliteitsamplitudetransiënten.
- Om de incidentie van pro-aritmie te berekenen, normaliseert u de STV-waarden naar de voertuigcontrolewaarde van elke cel, plott u nacontractie, contractiefalen, STV en alternanen en drukt u ze uit als % van de incidentie van cellen die elk van de signalen vertonen.
- Voltooi de multiparametrische mechanistische profilering met de berekening van de tijd Ato-piek, verval tot 30% ontspanning (verval 30), verval tot 90% ontspanning (verval 90), tijd tot 90% ontspanning (TR90) (Figuur 2D), basislijnlengte van sarcomeren, tijd tot 50% piek, piekhoogte, sarcomeerlengte bij piekcontractiliteit, maximale contractiesnelheid en maximale relaxatiesnelheid12. Net als de contractiliteitsamplitude, drukt u deze parameters uit ten opzichte van de specifieke basislijncontroleconditie van elke cardiomyocyt en zet u ze in grafieken in concentratie-responsgrafieken.
Representative Results
In dit protocol wordt een procedure beschreven voor het meten van contractiliteit in geïsoleerde volwassen menselijke primaire cardiomyocyten van orgaandonoren en het evalueren van acute veranderingen in contractiliteitsparameters die worden veroorzaakt door een testmiddel. De meting van de contractiliteitstransiënt wordt bereikt met behulp van een op video gebaseerd celgeometriesysteem, de MyoBLAZER, dat de dynamiek van sarcomeren meet, en de hartaandoening bij volwassenen wordt nagebootst door contractiliteit te induceren met elektrische stimulatie op de fysiologische stimulatiefrequentie (1 Hz). De functionele levensvatbaarheid van de cardiomyocyten wordt bevestigd door hun excitatie-contractiekoppeling te beoordelen (d.w.z. cellulaire verwerking die elektrische excitatie [de sarcolemmale actiepotentiaal] koppelt aan contractie). Er zijn geen spontane contractiliteitstransiënten in menselijke cardiomyocyten, en de cardiomyocyten reageren op externe elektrische stimulatie met contractiliteits-/relaxatiecycli (Figuur 2C, E), evenals op isoproterenol, een β-adrenerge agonist (Figuur 2F,G). Isoproterenol veroorzaakt een concentratie-afhankelijke toename van de contractiliteit (Figuur 2G), en de effecten ervan op de kinetiek van contractiliteit van voorbijgaande aard kunnen ook worden gekarakteriseerd (Figuur 2D)12.
Figuur 1: Experimentele opstelling van het optische contractiliteitsregistratiesysteem. Helderveldcontractiliteitsopnames worden gemaakt van volwassen menselijke primaire cardiomyocyten, zoals eerder beschreven 11,12,13,14. De opstelling omvat een (A) temperatuurregelkast, (B) veldstimulator, (C,D) drukgestuurd perfusiesysteem, (E) computerdrukgestuurd programma, (F) druk plus flessen, (G) acquisitiesoftware, (H) selectie van ROI's met acquisitiesoftware, (I) weergave van contractiliteitstransiënten met acquisitiesoftware, (J) omgekeerde microscoop, (K) microscoopkamer en ( L) camera. Alle kenmerken van de apparatuur worden gegeven in de materiaaltabel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Validatie van de contractiliteitsmeting van menselijke cardiomyocyten en het effect van β-adrenerge stimulatie. (A) Fasecontrastmicroscopiebeeld van een representatieve volwassen menselijke primaire cardiomyocyt, (B) door de gebruiker gedefinieerde interessegebieden (ROI) geplaatst over de beelden van gezonde cardiomyocyten en evenwijdig aan de contractie-as, (C) weergave van contractiliteitstransiënten verkregen uit dezelfde ROI's in (B) met de acquisitiesoftware, (D) parameters met betrekking tot de contractiliteitstransiënt gemeten met de acquisitiesoftware: contractiliteitsamplitude, tijd tot piek, verval 30, verval 90, TR90. Aanvullende parameters kunnen ook worden gemeten: baseline sarcomeerlengte, tijd tot 50% piek, piekhoogte, sarcomeerlengte bij piekcontractiliteit, maximale contractiesnelheid en maximale ontspanningssnelheid. (E) Typische contractiliteitstransiënten geregistreerd van een volwassen humaan primair ventrikelmyocyt met een stimulatiefrequentie van 1 Hz in aanwezigheid van mediumcontrole (F) en na blootstelling aan 30 nM isoproterenol, een niet-selectieve β-adrenerge agonist. De contractiliteitstransiënten die in panels E en F werden aangetoond, werden verzameld uit dezelfde cardiomyocyt. Isoproterenol van menselijke cardiomyocyten met een pacingfrequentie van 1 Hz werd gebruikt om de potentie-informatie te genereren. (G) Typische cumulatieve concentratie-responscurve gegenereerd door meting van de contractiliteit van menselijke cardiomyocyten met isoproterenol (n = 8 cellen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Perfusie sequentie | Voertuig oplossing | Concentratie 1 (μM) | Concentratie 2 (μM) | Concentratie 3 (μM) | Concentratie 4 (μM) | Wassen |
| Behandeltijd | 120 seconden | 300 seconden | 300 seconden | 300 seconden | 300 seconden | 300 seconden |
| Stimulatie Frequentie | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz | 1 Hz |
Tabel 1: Stimulatieprotocol en volgorde van toepassing van het testmiddel. De stabiliteit van contractiliteitstransiënten wordt beoordeeld door continue registratie gedurende 120 s in oplossing C, waarbij de voertuigcontrole wordt vastgesteld (meestal in 0,1% DMSO). Vervolgens wordt de concentratie van het testartikel gedurende ten minste 300 s toegepast of totdat een stationair effect is bereikt. Er worden vier oplopende concentraties van testartikelen gebruikt, die cumulatieve concentratie-effectcurven (C-E) opleveren. Aan het einde van de cumulatieve toevoegingen van het testartikel kan een wash-outperiode van 300 seconden worden geïmplementeerd.
Discussion
Dit manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor het op contractiliteit gebaseerde optische systeem voor volwassenen met menselijke cardiomyocyten voor een vereenvoudigde medium-doorvoermethode die het testen van de acute werkzaamheid en cardiotoxiciteit van nieuwe verbindingen mogelijk maakt. Dit optische contractiliteitsregistratiesysteem is gebruiksvriendelijk, maakt opnames van meerdere cellen parallel mogelijk, maakt de gelijktijdige beoordeling van celgezondheid, fysiologie en farmacologie mogelijk, wordt geleverd met geautomatiseerde en snelle gegevensanalyse (een run van meerdere cellen wordt geanalyseerd in 5 s) en maakt snelle gegevensverzameling mogelijk (concentratie-responscurve elke 30 min/verbinding/apparaat). Rekening houdend met deze kenmerken, kan het registratiesysteem niet alleen worden gebruikt om de effecten van geneesmiddelen op de contractiliteit van cardiomyocyten te detecteren, maar ook om structuur-activiteitsrelatiegegevens te verstrekken ter ondersteuning van medicinale chemie-inspanningen tijdens de vroege fasen van de ontdekking van geneesmiddelen16. Aangezien tientallen miljoenen cellen kunnen worden verkregen uit een cardiomyocytenisolatieprotocol, wordt momenteel de toepassing van het optische contractiliteitsregistratiesysteem-cardiomyocytenplatform onderzocht om een grotere testcapaciteit te bereiken (met behulp van goed gefundeerde platen) tegen lagere kosten. Bovendien kan de beoordeling van de effecten van geneesmiddelen op de systolische en relaxatieparameters die met het registratiesysteem worden gemeten, multiparametrische mechanistische profilering van inotrope geneesmiddelen opleveren12. Bovendien kunnen contractiliteitsgegevens van cardiomyocyten worden gebruikt om nieuwe geneesmiddelen te rangschikken van meest naar minst cardiotoxisch (bijv. veiligheidsmarge) en van minst naar meest effectief (bijv. potentiemarge). Follow-up cardiomyocytencontractiliteitsstudies kunnen ook worden uitgevoerd ter ondersteuning van ontwikkelingsprogramma's die in verband zijn gebracht met een klinische afname van myocardcontractiliteit12.
Een ander belangrijk voordeel van het gebruik van het optische registratiesysteem voor contractiliteit van menselijke cardiomyocyten is de afstemming ervan op het 3V-concept (vervanging, reductie en verfijning)17 , aangezien het kan worden beschouwd als een alternatieve methode die het gebruik van dieren voor het genereren van gegevens binnen de farmaceutische industrie vermijdt of vervangt. Dit 3V-voordeel kan ook worden uitgebreid naar academisch hartonderzoek. Het geheel van de huidige kennis van de fysiologie en farmacologie van cardiomyocyten is afkomstig van academische onderzoeken die zijn uitgevoerd met cellen die zijn geïsoleerd uit dierenharten18. Het optische contractiliteitsmodel van menselijke cardiomyocyten opent dus de mogelijkheid om kritische translationele studies uit te voeren. Om deze studies uit te voeren, moeten protocollen voor het behoud en de verzending van menselijke volwassen cardiomyocyten worden ontwikkeld (momenteel geëvalueerd in het laboratorium van AnaBios), en het contractiliteitssysteem moet in staat zijn om veranderingen in de lengte van sarcomeren van niet-menselijke cardiomyocyten te registreren (dit is het geval met het optische contractiliteitsregistratiesysteem, aangezien sarcomeren goed bewaard blijven tussen soorten).
Het contractiliteitssysteem van de menselijke cardiomyocyten kan verschillende fysiologische omstandigheden nabootsen (bijv. elektromechanische koppeling, pacingfrequentie die hartslag nabootst, lichaamstemperatuur, de integratie van alle menselijke cardiale doelen) en heeft translationele waarde aangetoond als een sleutelcomponent bij de ontdekking van geneesmiddelen11,12,13,14, hoewel het de veranderingen in mechanische belasting en schuifspanning die worden waargenomen tijdens de cardiale contractiele cyclus niet kan nabootsen. De structuur en functie van cardiale extracellulaire matrices worden nu beter begrepen19, de ontwikkeling van dergelijke matrices kan mogelijk helpen de mechanische belastingsbeperking te overwinnen, en matrices met verschillende hartachtige stijfheden worden momenteel geëvalueerd in het laboratorium van AnaBios. Een andere beperking van het optische contractiliteitssysteem van de menselijke cardiomyocyten is de afwezigheid van het netwerk van zenuwen dat het hart voedt (bijv. sympathische en parasympathische vezels)20. Dit neuro-cardiale contact kan worden hersteld door gelijktijdige toepassing van neurotransmitters (bijv. isoproterenol, een agonist van β-adrenoceptorreceptoren; acetylcholine, een agonist van M2-muscarinereceptoren), waarbij de verbinding wordt beoordeeld op zijn mogelijke effecten op de contractiliteit van cardiomyocyten. Bovendien worden de contractiliteitstransiënten geregistreerd zonder gelijktijdige metingen van actiepotentialen en Ca 2+-transiënten, die ook essentieel zijn bij het evalueren van geneesmiddeleffecten op het elektrocardiogram en de behandeling van Ca2+. Hoewel deze omissie als een beperking van het systeem kan worden beschouwd, is het niet al te kritisch om te hebben, aangezien de registratie van actiepotentiaalsignalen (met de stroomklemmethode of spanningsgevoelige kleurstoffen) en Ca 2+ transiënten (met Ca2+ indicatoren/kleurstoffen) in verband kan worden gebracht met cytotoxiciteit. Dergelijke cytotoxische effecten kunnen van invloed zijn op de beoordeling van nieuwe geneesmiddelen om de contractiliteit van het hart te moduleren. Integendeel, het gebruik van een niet-invasieve optische methode die de gezondheid, fysiologie en farmacologie van de cardiomyocyten behoudt, zoals het registratiesysteem dat in dit protocol wordt beschreven, zou er niet alleen voor zorgen dat contractiliteitsgegevens van de hoogste kwaliteit worden verkregen, maar ook gegevens opleveren die de contractiele effecten van nieuwe geneesmiddelen bij mensen goed kunnen voorspellen.
Disclosures
Alle auteurs zijn werknemers van de AnaBios Corporation en verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de AnaBios Corporation en een NIH Small Business Innovation Research (SBIR)-subsidie (1R44TR003162-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100–1000 µL Filtered, Wide Orifice, Sterile tips | Pipette | UF-1000W | |
| 100 mL, Duran pressure plus bottles | DWK Life Sciences | 218102406 | |
| 1 L, 0.22 µm Vacuum Filter system | VWR | 567-0020 | |
| 290 mmol/kg Osmolarity Standard | Wescor | OA-029 | |
| Benchtop pH Meter | Mettler Toledo | https://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html | |
| Calcium Chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Optronis GmbH | Cyclone-25-150-M | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ |
| Corning 25 mm x25 mm Square #1 Cover Glass | Corning | 2845-25 | |
| Cyclone-25-150 | Optronis | https://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/ | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Digital Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Eight-well rectangular polystyrene sterile culture plate | Thermo Fisher Scientific | 73521-426 | https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific |
| FHD Microscope Chamber System | IonOptix | ||
| Flow EZ, Modular pressure-based flow controller with a computer driven program version 1.1.0.0. | Fluigent OxyGEN | ||
| Heavy Duty Vacuum Bottles | VWR | 16211-080 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LM521-05 | |
| Idex Chromatography Tubing, Natural FEP, 1/16" OD x 0.030" ID | Cole-Palmer | 1520L | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| L-(-)-Malic acid | Sigma-Aldrich | 112577 | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 49449 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Microscope Temperature Control Stage Warmer | AmScope | TCS-100 | |
| MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | ||
| Nunc Rectangular Dishes | Thermo Scientific | 267062 | |
| Olympus IX83P1ZF Ixplore Standard microscope | Olympus | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid =116963199831&keyword=ix73%20 microscope&gclid=EAIaIQobChMIl qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA YASAAEgLp3fD_BwE |
|
| pH 4.01, 7.00, and 10.01 Standards | Oakton | WD-05942-10 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | 746436 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P4494 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
| Prism Software | GraphPad Software - Dotmatics | https://www.graphpad.com/ | |
| RBS 25 Liquid Detergent | Sigma-Aldrich | 83460 | |
| Sharps Container | Uline | S-15307 | |
| SigmaPlot analysis software | Systat Software Inc. | https://systatsoftware.com/ | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Temperature Control Box | Warner Insturments | TC-324C | |
| Vapor Pressure Osmometer | ELITechGroup | Model 5600 | |
| Wheaton 20 mL Vials | DWK Life Sciences | 225288 |
References
- Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences. Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806 (2020).
- Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
- Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease. Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).
- Piccini, J. P., et al. Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative. American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).
- Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
- Page, G., et al. Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).
- Britton, O. J., et al. Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability. Frontiers in Physiology. 8, 597 (2017).
- Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 8, 1109 (2017).
- Trovato, C., et al. Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).
- Otsomaa, L., et al. Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity. British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).
- Nguyen, N., et al. Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk. Frontiers in Physiology. 8, 1073 (2017).
- Abi-Gerges, N., et al. Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes. Scientific Reports. 10, 7692 (2020).
- Jordaan, P., et al. Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).
- Ton, A. T., et al. Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart. Scientific Reports. 11, 12014 (2021).
- Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes. Cells. 10 (12), 3370 (2021).
- Guha, R. On exploring structure activity relationships. Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).
- Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
- Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M.
- Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S.
- Zaglia, T., Mongillo, M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view. Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).
