Summary
여기에서는 높고, 장기적이며, 안정적이며, 표적 침묵 효율이 높고 게놈 전체, 표적 외 활성이 낮은 조작된 전사 억제제(ETR)의 시험관 내 선택을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 워크플로우를 통해 후보 ETR의 초기 복잡한 레퍼토리를 짧은 목록으로 줄일 수 있으며, 이는 치료적으로 관련된 환경에서 추가 평가에 적합합니다.
Abstract
유전자 불활성화는 유전자 기능을 연구하는 데 중요한 역할을 하며 광범위한 질병 치료를 위한 유망한 전략입니다. 기존 기술 중 RNA 간섭은 부분적인 표적 폐기와 평생 치료가 필요하다는 문제가 있습니다. 대조적으로, 인공 뉴클레아제는 DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 유도를 통해 안정적인 유전자 불활성화를 부과할 수 있지만, 최근 연구에서는 이 접근법의 안전성에 의문을 제기하고 있습니다. 특정 ETR 조합의 단일 투여로 DNA 절단을 유도하지 않고 지속적인 침묵을 유도할 수 있기 때문에 조작된 전사 억제제(ETR)를 통한 표적 후성유전학적 편집이 해결책이 될 수 있습니다.
ETR은 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인(DBD)과 자연적으로 발생하는 전사 억제제의 효과기를 포함하는 단백질입니다. 구체적으로, 인간 DNMT3A 및 인간 DNMT3L의 촉매 도메인인 인간 ZNF10의 KRAB 도메인이 장착된 3개의 ETR의 조합은 ETR-표적 유전자에 유전성 억제 후성유전학적 상태를 유도하는 것으로 나타났습니다. 이 플랫폼의 히트 앤 런 특성, 표적의 DNA 염기서열에 대한 영향 부족, 필요에 따라 DNA 탈메틸화에 의해 억압 상태로 되돌릴 수 있는 가능성으로 인해 후성유전학적 침묵은 판도를 바꾸는 도구입니다. 중요한 단계는 표적 유전자에서 적절한 ETR의 위치를 식별하여 on-target을 최대화하고 off-target 침묵을 최소화하는 것입니다. 최종 ex vivo 또는 in vivo 전임상 환경에서 이 단계를 수행하는 것은 번거로울 수 있습니다.
이 논문에서는 CRISPR/촉매적으로 죽은 Cas9 시스템을 ETR의 패러다임 DBD로 사용하여 효율적인 표적 침묵을 위해 트리플 ETR 조합에 결합된 가이드 RNA(gRNA)의 시험관 내 스크리닝으로 구성된 프로토콜을 설명한 후 상위 히트의 게놈 전체 특이성 프로파일을 평가합니다. 이를 통해 후보 gRNA의 초기 레퍼토리를 유망한 gRNA의 짧은 목록으로 줄일 수 있으며, 그 복잡성은 치료와 관련된 관심 환경에서 최종 평가에 적합합니다.
Introduction
유전자 불활성화는 전통적으로 세포 및 동물 모델 모두에서 유전자 기능을 연구하는 데 중요한 역할을 해왔습니다. 더욱이, 지난 20년 동안 유전자 치료의 등장과 함께, 유전자 치료는 기능 획득 돌연변이(gain-of-function mutations)1, 전염병(infectious diseases)2 또는 한 유전자의 침묵이 다른 유전자3의 유전적 결함을 보상할 수 있는 병리학(pathology)에 의해 야기된 질병을 치료하기 위한 잠재적으로 판도를 바꿀 수 있는 접근법으로 제안되었다. 마지막으로, 암 면역 요법4 및재생 의학5을 위한 세포 산물의 효율성을 향상시키기 위해 세포 적합성 및 기능 조절의 주요 조절인자의 유전자 불활성화가 제안되었다.
유전자 불활성화를 달성하기 위한 다양한 기술 중에서 가장 유망한 기술 중 하나는 표적 후성유전학적 침묵 6,7입니다. 이 기술의 핵심은 후성유전학적 억제 기능을 가진 프로그래밍 가능한 DNA 결합 도메인(DBD)과 효과기 도메인(ED)으로 구성된 키메라 단백질인 소위 조작된 전사 억제자(ETR)입니다. 징크 핑거 단백질(ZFP)8, 전사 활성제 유사 이펙터(TALE)9 또는 CRISPR/dCas910 기반 DBD는 ED를 침묵시킬 표적 유전자의 프로모터/인핸서 서열에 선택적으로 연결하도록 설계할 수 있습니다. 일단 거기에서 ETR의 ED는 사용된 억압 도메인에 따라 히스톤 변형(H3K9 11,12 또는 H3K27 13 메틸화, H3 또는 H4 탈아세틸화14) 및 CpG DNA 메틸화 15와 같은 헤테로크로마틴 유도 억제 후성유전학적 표시를 부과하여 침묵 활동을 수행합니다.
특히, 착상 전 배아(16)에서 발생하는 내인성 레트로바이러스의 영구적인 전사 억제의 분자 과정에 의해 영감을 받아, 다음과 같은 ED를 이용하기 위해 3개의 ETR의 조합이 생성되었다: i) 인간 ZNF10의 KRAB(Krüppel-associated box) 도메인; ii) 인간 de novo DNA 메틸전이효소 3A(DNMT3A)의 촉매 도메인; iii) 전장 인간 DNA 메틸전이효소 3-유사(DNMT3L). KRAB는 고등 척추동물(17,18)에서 여러 ZFP가 공유하는 보존된 억압 영역이며, 이의 침묵 활성은 주로 KAP119-뉴클레오솜 리모델링 및 탈아세틸화(NuRD) 복합체(21), H3K9 히스톤 메틸전이효소 SETDB1(22) 및 H3K9 메틸화 리더 HP1(23)을 포함하는 여러 다른 헤테로크로마틴 유도제(20)와 상호 작용하는 스캐폴드 단백질을 모집하는 능력에 기초한다. 24개 등.
DNMT3A는 CpG 서열25에서 DNA의 메틸기를 활발하게 전달합니다. DNMT3A의 촉매 활성은 메틸기 전달을 담당하는 촉매 도메인이 없는 DNMT3A의 배아 및 생식 세포 제한 패러로그인 DNMT3L과의 물리적 연관성에 의해 향상됩니다(26,27). 포유류 유전자의 프로모터/인핸서 요소에 내포된 CpG-풍부한 영역에서의 DNA 메틸화는 일반적으로 전사 침묵(transcription silencing)과 관련이 있다28. 중요한 것은, 일단 증착되면, CpG 메틸화는 UHRF1-DNMT1 기반 분자 복합체에 의해 유사분열 전반에 걸쳐 안정적으로 유전될 수 있다는 것이다29.
표적 세포에서 ETR의 안정적인 과발현은 문제가 될 수 있는데, 이는 시간이 지남에 따라 생리적 표적 부위에서 내인성 상호작용자의 비표적 활성과 스퀠칭(subqueching)의 위험이 증가하기 때문일 수 있습니다. 그러나, 단일-ETR 부분의 일시적인 발현은 고효율(30)로 장기간의 침묵을 유도하지 못하여, 이들의 치료적 응용을 방해할 수 있다. 따라서 이 분야의 획기적인 돌파구는 세 가지 KRAB-, DNMT3A- 및 DNMT3L 기반 ETR의 조합이 시너지 효과를 낼 수 있으며, 일시적으로만 함께 전달되는 경우에도 표적 유전자 H3K9 및 CpG 메틸화의 프로모터 서열을 부과할 수 있다는 증거였습니다. 이어서, 이들은 유사분열 전반에 걸쳐 세포에 의해 판독되고 증식되어, 다수의 인간 및 쥐 세포주뿐만 아니라 생체외 배양된 일차 세포(30)에서 유전성 침묵을 유도한다.
주목할 점은, ETR에 의해 부과된 후성유전학적 침묵은 표적(예: 침묵된 유전자좌에서 CRISPR/dCas9 기반 TET1 DNA 탈메틸화효소의 모집) 또는 약리학적(DNA 메틸전이효소 억제제 5-Aza의 투여) DNA 탈메틸화(30)에 의해 필요에 따라 되돌릴 수 있으며, 이는 ETR 관련 부작용의 경우 잠재적인 해독제입니다. 3개의 KRAB-, DNMT3A- 및 DNMT3L-기반 ED를 함유하는 일체형 ETR도 설명되었으며, 대다수의 단백질 코딩 유전자에 대해 세포주31,32에서 상당한 침묵 효율을 보여주었습니다. 또한, ETR을 사용한 여러 연구에서 de novo CpG 메틸화 또는 염색질 접근성 변화 측면에서 주요 off-target 활성이 없는 높은 안전성 프로파일을 보고했습니다30,31,32. 그러나 임상 적용 전에 새로 설계된 DBD가 장착된 ETR의 특이성 프로파일에 대한 전용 분석이 권장됩니다.
임상적 관점에서, 표적 후성유전학적 침묵은 RNA 간섭(RNAi) 기반 knockdown33 및 인공 뉴클레아제 기반 유전자 파괴8 모두에 중요한 이점을 제공할 수 있다. RNAi와 달리 표적 후성유전학적 침묵은 세포당 표적의 완전한 폐기를 유도할 수 있으며 장기적인 침묵을 보장하기 위해 주기적인 치료가 필요하지 않습니다. 유전자 파괴와 달리 DNA 염기서열을 변경하지 않고 그대로 두어 DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 생성을 방지합니다. 그런 다음 DSB는 세포사멸 및 세포주기 정지를 유도할 수 있으며, 잠재적으로 기능적 p53 경로(34,35)를 갖는 세포에 대한 선택으로 이어질 수 있으며, 특히 다중 유전자 편집 설정에서 염색체 재배열(35)을 유도할 수 있다. 더욱이, 비상동성-말단-결합-매개 DNA DSB 복구(36)의 비가역적 모자이크 결과를 중계함으로써, 유전자 파괴는 최종 결과의 하나로서 기능적 코딩 서열로의 표적의 프레임 내 복구를 피할 수 없으며, 후성유전학적 침묵과는 대조적으로, 필요에 따라 지워질 수 없다.
마지막으로, 후성유전학적 침묵은 표적화 가능한 유전 요소의 범위를 비전사된 조절 요소 및 비암호화 RNA와 같은 RNAi 및 유전자 파괴에 완전히 또는 적어도 부분적으로 불응하는 클래스로 확장할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다30,32. 표적 후성유전학적 침묵 응용 분야의 첫 번째 중요한 단계는 표적 유전자의 다양한 조절 서열을 포괄하는 ETR 패널을 설계하고 가장 성능이 좋은 것을 식별하는 것입니다. 지속적으로 개발되고 있는 프로그래밍 가능한 DNA 결합 기술에 의해 표적화될 수 있는 게놈의 증가하는 부분을 고려할 때, 테스트할 ETR의 수는 매우 중요할 수 있다37. 표적 유전자를 치료적으로 침묵시키기 위해 세포 유형에 직접 ETR 스크리닝을 수행하는 것이 가장 관련성이 높은 옵션입니다. 그러나 고처리량 스크리닝은 배양 시 생존이 제한되고 종종 최적이 아닌 엔지니어링 용량으로 인해 일차 세포에서 기술적으로 번거로울 수 있습니다. 대형 스크린은 생체 내에서 훨씬 더 실현 불가능할 수 있습니다.
보다 실용적인 대안은 처음에 쉽게 조작할 수 있는 세포주에서 대규모 ETR 패널의 초기 스크리닝을 수행한 다음 치료적으로 관련된 세포 유형에서 가장 유망한 ETR만 검증하는 것입니다. 이와 유사한 문제는 ETR의 침묵 효율성을 측정하기 위한 적절한 판독값을 선택하는 것입니다. RT-qPCR, 웨스턴 블롯 또는 ELISA로 표적 유전자의 전사체 또는 단백질 수준을 직접 평가하는 것은 비용과 시간이 많이 소요될 수 있으며 충분한 감도가 부족할 수 있으므로 고처리량 스케일에서 적용이 제한될 수 있습니다. 형광단이 표적 유전자의 조절 염기서열의 전사 제어 하에 배치되는 ad hoc engineered reporter 세포주를 생성하면 유세포 분석 기반 접근법을 활용하여 단일 세포 수준 및 고처리량 속도로 후성유전학적 침묵을 판독할 수 있습니다.
이러한 일반적인 고려 사항에 따라 이 논문에서는 on-target silencing 효율성을 위한 ETR의 in vitro arrayed screen으로 구성된 프로토콜에 대해 설명한 후 상위 히트의 게놈 전체 off-target 활성을 평가합니다. 이 워크플로우를 통해 후보 ETR의 초기 레퍼토리를 유망한 ETR의 짧은 목록으로 줄일 수 있으며, 그 복잡성은 치료적으로 관련된 관심 세포 유형에서 최종 평가에 적합합니다.
ETR을 생성하는 데 활용할 수 있는 다양한 프로그래밍 가능한 DBD 중에서 이 프로토콜은 고처리량 규모로 표적 유전자 프로모터에 걸쳐 있는 gRNA를 쉽게 설계할 수 있기 때문에 CRISPR/dCas9 기반 기술에 중점을 둘 것입니다. 그러나 다른 DBD가 장착된 ETR의 효율성과 특이성을 평가하기 위해 아래에 설명된 것과 동일한 개념적 워크플로를 채택할 수 있습니다.
Protocol
1. 유세포 분석을 통해 표적 유전자의 전사 활성을 모니터링하기 위한 형광 기반 리포터 세포주 엔지니어링
- 침묵시킬 표적 유전자를 발현하는 세포주를 식별합니다. Human Protein Atlas38에서 침묵시킬 표적 유전자를 탐색하고 "세포주" 섹션을 탐색하여 관심 체세포를 대표하는 세포주를 식별합니다(예: 최종 표적이 간 간세포인 경우 간 세포주). 또는 공개적으로 사용 가능한 RNA 염기서열분석(RNA-Seq) 데이터베이스(예: NCBI GEO)를 조사합니다.
- 후보 물질 중에서 효율적인 일시적 유전자 전달 프로토콜(ETR 전달에 중요한 도구)을 사용할 수 있는 세포주를 우선시합니다.
참고: 다양한 양식 중에서 nucleofection은 높은 transfection 효율을 보장하기 때문에 최상의 옵션 중 하나입니다. 여기서, 인간 적혈구 백혈병 K-562 세포는 베타-2-마이크로글로불린(B2M) 유전자(이하, B2M TdTomato K-562 세포로 지칭됨)의 전사 활성을 보고하는 세포주를 생성하기 위해 선택되었다. - 표적 유전자가 세포 생존에 필수적인 세포주를 피하기 위해 후보 물질의 우선순위를 정해야 하는데, 이는 배양 시 표적 유전자의 안정적인 침묵으로 세포의 유지를 저해하기 때문입니다. 이전에 보고되지 않은 경우, 선택한 세포 유형에서 표적 유전자의 본질성을 파악하기 위해 Cas9 뉴클레아제와 유전자의 첫 번째 코딩 엑손 중 하나를 표적으로 하는 gRNA로 세포를 transfection하여 유전자 파괴 제어를 생성합니다.
참고: 유전적 붕괴는 정의상 안정적인 사건입니다. 시간이 지남에 따라 파괴된 세포의 역선택은 표적 유전자가 선택된 세포의 생리학에 필수적임을 나타냅니다.- 선택된 세포주에서 우선적으로 사용되는 표적 스플라이싱 동형을 식별합니다(이 프로토콜에서는 B2M 유전자의 동형 NM_004048.4가 표적화됨).
- 표적 동형의 첫 번째 코딩 엑손에서 효과적이고 특이적으로 절단할 수 있는 gRNA를 식별합니다(예: 유효하고 사용자 친화적인 온라인 gRNA 선택 도구인 Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39).
- K-562 세포의 경우, 뉴클레오펙션을 통해 5 × 105 세포당 1μg의 sp Cas9 인코딩 플라스미드(hCas9, 재료 표 참조) 및 250 ng의 gRNA 인코딩 플라스미드(phU6-gRNA, 재료 표 참조)를 transfection합니다(제조업체의 지침에 따름).
- 세포(37°C에서 10% 소 태아 혈청[FBS], L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신[100U/mL]가 보충된 RPMI-1640의 5% CO2 미만에서 K-562 세포)를 배양하고 돌연변이 검출 키트를 활용하여 시간 경과에 따른 유전자 파괴 수준을 모니터링합니다(제조업체의 지침 준수).
- 관심 표적 유전자의 전사 제어 하에 형광 리포터의 상동 재조합 매개 통합을 위한 기증자 템플릿을 복제합니다(그림 1).
- 형광단 발현 카세트를 통합하기 위해 표적 유전자의 영역을 식별합니다.
참고: H3K27 아세틸화(활성 프로모터 및 인핸서의 마커)를 위해 농축된 CpG 섬 및 영역과 같은 전사 관련 요소를 표적으로 삼지 마십시오. 이러한 조절 요소(후성유전학적 침묵을 지시하기 위해 ETR에 의해 표적화되는 것이 잠재적으로 중요함)를 변경하면 리포터 세포주가 표적 유전자의 생리학적 조절을 덜 예측할 수 있습니다.- 표적 유전자가 분비된 단백질을 암호화하지 않는 경우, 2A 자가 절단 펩타이드를 통해 리포터를 표적 유전자의 마지막 코돈에 융합시켜 표적 유전자의 기능을 유지합니다.
- 표적 유전자가 분비된 단백질을 암호화하는 경우, 리포터의 잠재적인 분비를 피하기 위해 리포터를 표적 유전자의 intronic 영역에 배치합니다. 스플라이스 수용체 부위(SA)를 통한 스플라이싱된 전사체에서 리포터의 강제 통합과 내부 리보솜 진입 서열(IRES)을 통한 후속 번역은 표적 유전자의 기능을 손상시킵니다.
- Chopchop을 사용하여 표적 영역에서 gRNA 절단을 선택합니다(여기서는 B2M 유전자의 첫 번째 인트론의 서열 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′를 표적화하기 위해 gRNA를 선택합니다).
- 다음으로 구성된 gRNA 절단 부위에 대한 donor 템플릿을 설계합니다: i) 왼쪽 상동성 암(gRNA 절단 부위의 바로 상류 영역과 일치하는 n 염기쌍[bp]); ii) 프로모터-프리 전이유전자 발현 카세트(본 도시된 경우, B2M 유전자의 제1 인트론과의 스플라이싱을 선호하는 SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly(A); iii) 우측 상동성 암(gRNA 절단 부위의 다운스트림 영역과 일치하는 n bp).
참고: 상동 재조합을 효과적으로 유도하는 데 필요한 상동성 암의 길이는 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다(100-500bp는 K-562 세포의 적절한 범위임).
- 형광단 발현 카세트를 통합하기 위해 표적 유전자의 영역을 식별합니다.
- CRISPR/Cas9 뉴클레아제 시스템과 donor template을 표적 세포주 내에 전달합니다. K-562 세포의 경우, 1 μg의 spCas9 인코딩 플라스미드(hCas9, 재료 표 참조), 250 ng의 gRNA 인코딩 플라스미드(phU6-gRNA, 재료 표 참조) 및 1 μg의 donor template-encoding plasmid를 nucleofection을 통해 5 × 105 세포로 transfection합니다(제조업체의 지침에 따름).
- 최소 14일 동안(K-562 세포의 경우) 세포를 배양하고 유세포 분석기를 사용하여 시간 경과에 따른 형광 리포터의 발현 수준을 모니터링합니다(tdTomato 리포터의 형광 강도를 측정하기 위해 피코에리트린(PE) 채널을 활성화하고 제조업체의 지침에 따라 유세포 분석을 수행).
참고: donor template(특히 플라스미드 기반인 경우)은 비밀스러운 promoter 서열을 포함할 수 있으며, 이는 통합되지 않은 donor 사본에서 형광 리포터의 발현으로 이어질 수 있습니다. 세포를 배양하면 세포 분열에 의해 이러한 통합되지 않은 사본을 희석하고 최종적으로 표적 게놈에 통합된 기증자 사본에서만 리포터의 발현을 유지할 수 있습니다. - 단일 세포 수준에서 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 리포터 양성 세포를 복제합니다. 이 프로토콜의 경우 PE 채널을 활성화하여 tdTomato 리포터의 형광 강도를 측정하고 제조업체의 지침에 따라 96웰 플레이트의 웰당 단일 tdTomato-positive K-562 세포를 분류합니다.
- 배양에서 세포 증식 시(일반적으로 K-562 세포의 경우 20-30일) PCR로 리포터 양성 클론을 스크리닝하여 표적 유전자좌 내에서 리포터 카세트의 이중 대립유전자 통합을 포함하는 클론을 선택합니다.
참고: 이는 리포터 발현을 극대화하고 ETR 처리 시 유세포 분석을 통해 리포터 발현 세포와 리포터 침묵 세포 간의 추가 분리를 촉진합니다.- DNA 추출 키트를 사용하여 리포터 양성 클론당 1 × 105 개의 세포에서 게놈 DNA를 추출합니다(제조업체의 지침에 따름).
- PCR 증폭 키트의 지침에 따라 정방향(5'-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3') 및 역방향(5'-AATGGTTGAGTTGGAC-3') 프라이머로 B2M 표적 영역을 증폭합니다. 이 한 쌍의 프라이머의 어닐링 온도는 Taq 기반 DNA 중합효소 및 0.5μM 프라이머 농도로 47.7°C입니다.
- 1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 PCR 산물을 분석합니다(제조업체의 지침에 따름). 야생형 표적 유전자좌(1,027bp)와 관련된 띠 없이 B2M 표적 유전자좌(3,413bp)에서 tdTomato의 통합과 관련된 밴드를 보여주는 클론에 대한 스크리닝.
2. 표적 유전자의 CRISPR/dCas 9 기반 후성유전학적 침묵을 위한 gRNA 설계
- UCSC 게놈 브라우저(40)에서 표적 유전자를 탐색하고, H3K27 아세틸화(활성 프로모터 및 인핸서의 마커)를 위해 농축된 CpG 섬 및 부위와 같이 이의 전사 활성을 잠재적으로 조절하는 영역의 뉴클레오티드 서열을 추출한다.
참고: 최근 연구에 따르면, 가장 좋은 표적 영역은 표적 유전자32의 전사 시작 부위를 중심으로 하는 1킬로베이스(kb) 창입니다. - 선택한 염기서열을 Chopchop 온라인 도구에 붙여넣고 회수할 gRNA의 목적으로 repression 을 선택합니다. Chopchop이 관심 유전자 염기서열에 매핑된 gRNA 목록을 제공할 때까지 기다렸다가 off-target match의 수와 예측된 on-target 효율을 모두 고려한 점수에 따라 나열됩니다(그림 2).
- 타겟 염기서열당 최소 10개의 gRNA를 선택합니다. 가능하면 게놈 전체의 다른 유전자 내 염기서열과 완전히 일치하지 않는 전체 영역에 걸쳐 있는 gRNA를 선택하여 조사하십시오.
3. 리포터 세포주에서 CRISPR/dCas 9 기반 ETR의 배열된 일시적 전달
- 표적 세포주에 대해 이전에 보고된 전이유전자 전달 시스템 중에서 일시적인 전이유전자 발현만 허용하여 전달 효율을 극대화하고 세포 조작 관련 독성을 최소화하는 전달 시스템을 선택하십시오. K-562 세포의 경우 플라스미드와 mRNA 뉴클레펙션 모두 적극 권장되며, 플라스미드 생산은 기술적으로 더 쉽고 저렴한 대안입니다.
- 섹션 2에서 선택한 gRNA와 선택한 전이유전자 전달 시스템에서 CRISPR/dCas9 기반 ETR을 모두 클로닝합니다. 플라스미드 DNA에서 ETR을 클로닝하기 위한 프로토콜은 다음 단계를 참조하십시오.
참고: dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L30을 별도로 인코딩하는 플라스미드는 Addgene에서 사용할 수 없습니다. 플라스미드 pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41( 재료 표 참조)의 VP160 trans-activator를 KRAB, DNMT3A 또는 DNMT3L 도메인 코딩 서열(30)로 대체하여 클로닝했습니다. CRISPRoff-v2.132라고 하는 올인원 ETR을 위한 플라스미드 인코딩을 사용할 수 있습니다( 재료 표 참조).- 화학적으로 유능한 E. coli 세포에서 ETR에 대한 플라스미드 인코딩을 형질전환합니다(제조업체의 지침에 따름). 제한 효소 분해 및 Sanger 염기서열분석을 통해 ETR 함유 플라스미드의 존재 여부를 콜로니를 스크리닝하고, 마지막으로 플라스미드 DNA Midiprep 생산을 위한 양성 콜로니 중 하나를 선택합니다(제조업체의 지침에 따름).
- phU6-gRNA 백본 내부의 gRNA를 클로닝합니다(그림 3).
- 분자 생물학 설계 소프트웨어를 사용하여 protospacer(선택한 gRNA의 첫 번째 변수 20 뉴클레오티드[nt])의 업스트림에 5'-CACCG-3' 서열을 추가하여 SGfw라고 하는 25nt 길이의 올리고를 인실리코(silico)에 생성합니다.
- 마찬가지로, 선택된 gRNA의 protospacer의 reverse complement 업스트림에 5'-AAAC-3' 서열을 추가하고 그 다운스트림에 5'-C-3' 서열을 추가하여 SGrv라고 하는 25 nt-long oligo를 생성합니다.
- SGfw 및 SGrv 염기서열을 모두 100μM의 물에 재현탁된 무염 단일 가닥 DNA 올리고로 주문할 수 있습니다.
- 각 올리고 1μL를 2μL의 어닐링 완충액(10mM Tris[pH 7.5-8.0], 50mM NaCl, 1mM EDTA)과 16μL의 물에 추가합니다.
- 95°C에서 10분 동안 시작하도록 프로그래밍된 열순환기에 용액을 넣어 올리고 어닐링을 수행합니다. 그런 다음 45분에 걸쳐 25°C로 서서히 식힙니다.
- 어닐링된 올리고 1μL를 뉴클레아제가 없는 물 99μL로 희석한 다음, 이 희석액 1μL를 BsaI 제한 효소로 미리 절단한 phU6-gRNA 플라스미드 50ng로 결찰합니다(분해 및 연결 절차는 BsaI 및 리가아제 키트 공급업체의 지침을 따름).
- 2μL의 결찰 산물로 화학적으로 유능한 대장균 세포 20μL를 형질전환시킵니다(형질전환 절차에 대한 제조업체의 지침을 따름).
- 플라스미드 DNA Miniprep 생산을 위해 여러 콜로니를 선택하고(공급업체의 지시에 따름) U6 promoter 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3'에 일치하는 다음 프라이머를 사용하여 Sanger 염기서열분석을 통해 protospacer의 성공적인 클로닝을 제어합니다.
- 플라스미드 DNA Midiprep 생산을 위한 양성 콜로니 중 하나를 선택합니다(제조업체의 지침에 따름).
- 선택한 gRNA 및 CRISPR/dCas9 기반 ETR을 리포터 세포주에서 배열로 전달합니다(조건당 하나의 특정 gRNA)(그림 3).
NOTE: 대표적인 사례로, B2MTdTomato K-562 세포에서 B2M CpG 섬을 표적으로 하는 dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L 및 gRNA를 암호화하는 플라스미드의 nucleofection 워크플로우를 다음 단계로 보여줍니다.- dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- 및 dCas9:DNMT3L-인코딩 플라스미드 각각을 500ng씩 포함하되 검사할 gRNA에 따라 다르지만(튜브당 gRNA 인코딩 플라스미드 125ng) 별도의 튜브를 준비합니다. gRNA 및 ETR이 없는 뉴클레오펙션 조건을 모의 처리 샘플로 포함합니다. 샘플당 최소 3회의 기술 반복실험으로 화면을 수행합니다.
- 튜브당 5 × 105 B2M TdTomato K-562 세포를 펠렛으로 만들고 플라스미드 혼합물로 핵을 생성합니다(제조업체의 지침에 따름).
- 이전에 데워진 RPMI-1640 포유류 세포 배양 배지 200μL에 세포를 재현탁시키고 인큐베이터에 다시 넣습니다.
4. 시간 경과에 따른 표적 유전자의 전사 활성 분석
- 유세포 분석을 사용하여 ETR 전달 후 서로 다른 시점에서 침묵하는 세포의 비율을 측정합니다(그림 4). 형광단 코딩 서열을 갖지 않는 야생형(WT) 세포를 사용하여 리포터 음성 세포의 임계값을 설정합니다. 모의 처리된 샘플을 사용하여 리포터 양성 세포에 대한 게이트를 설정합니다.
참고: 1.3단계에서 제안한 대로 실험에 유전자 파괴 제어를 포함합니다. 이는 CRISPR 전달 효율과 표적 유전자가 결핍된 세포의 적합성을 모니터링하는 데 유용할 수 있습니다. 시간이 지남에 따라 전사 침묵과 유전적 파괴의 손실은 선택한 세포 유형에서 표적 유전자의 본질성에 기인할 수 있습니다. 단기(3일, 7일, 10일) 및 장기(21일, 35일) 시점을 모두 포함하여 침묵의 급성 및 장기 효율성을 모두 나타냅니다. - 장기 침묵 효율 측면에서 상위 3개의 gRNA를 식별합니다. FACS를 사용하여 해당 표본에서 안정적으로 유지되는 보고자 음성 부분모집단을 선택합니다. 또한 벌크 모의 처리 샘플의 FACS를 수행하여 테스트 샘플과 동일한 처리 하에 유지하여 후속 분석에서 적절한 비교를 허용합니다.
5. RNA-seq 및 MeDIP(methylated DNA immunoprecipitation)-seq에 의한 ETR 처리의 특이성 평가
- RNA-seq를 사용하여 ETR 전달 시 최종 게놈 전체 전사 조절 해제를 평가합니다.
- 성능이 가장 우수한 3개의 gRNA로 처리한 샘플의 리포터 침묵 하위 집단과 모의 처리된 세포 모두에 대해 시판되는 키트를 사용하여 RNA를 추출합니다. 시판되는 키트를 사용하여 RNA의 품질과 농도를 평가합니다.
- RNA-seq 라이브러리 준비를 위해 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 RNA 단편화, 역전사 및 라이브러리 준비를 수행합니다(제조업체의 지침에 따름).
- 차세대 염기서열분석 및 디지털 전기영동과 호환되는 품질 관리 기기를 사용하여 라이브러리 정량화 및 품질 관리를 수행합니다.
- 제조업체의 지시에 따라 차세대 시퀀서의 염기서열 라이브러리는 100bp paired-end 프로토콜을 사용하며 평균 45M 판독/시료를 목표로 합니다.
- 판독 태그를 적절한 참조 게놈에 정렬하고 전사체 발현을 정량화합니다. tdTomato 염기서열에 대해 정렬을 수행하고 별도로 정량화합니다.
참고: 여기서, 기본 매개변수가 있는 STAR aligner (v 2.3.0)43이 Rsubread 패키지44에 결합되어 사용됩니다. - 발표된 모범 사례45에 따라 RNA-seq 데이터 분석을 수행합니다.
참고: R/Bioconductor 패키지 edgeR46이 여기에 사용되며, 최소 3개의 샘플에 백만당 최소 1cpm(카운트 1개)의 필터를 적용하여 저발현 유전자를 폐기합니다. 또는 edgeR의 filterByExpr 함수를 사용할 수 있습니다. - edgeR(함수 glmFit)47을 구현한 음성 이항 일반화 로그 선형 모델을 사용하여 차등 유전자 발현을 평가합니다. 차등적으로 조절된 유전자를 유지하기 위해 조정된 p 값(Benjamini-Hochberg [BH] 보정)에 임계값을 0.01로 설정합니다.
- MeDIP-seq에 의해 ETR의 최종 off-target CpG 메틸화 활성을 평가합니다.
- 상위 3개의 gRNA로 처리된 샘플의 리포터 침묵 하위 집단과 모의 처리된 세포 모두에 대해 시판되는 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출합니다(제조업체의 지침에 따름).
- 초음파와 다음 매개 변수를 사용하여 게놈 DNA 500ng를 초음파 처리합니다. 의무 : 20 %; 핍: 175; 버스트당 사이클: 200; 시간 : 40 초.
- MeDIP-seq용 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 염기서열분석 라이브러리를 준비합니다(제조업체의 지침에 따름).
- 어댑터 연결 단계 후 형광 분석으로 라이브러리를 정량화하고 시중에서 판매되는 라이브러리 정량 분석 키트를 사용하여 qPCR로 연결 효율을 확인합니다(제조업체의 지침에 따름).
- 기술적 편향을 줄이기 위해 무작위로 선택된 라이브러리를 혼합하여 라이브러리 풀을 얻습니다. 각 라이브러리에 대해 동일한 라이브러리 양(ng)을 사용하여 풀의 균형을 맞춥니다. 각 풀에 키트에 제공된 메틸화 및 비메틸화 스파이크인 대조군 DNA를 추가합니다. 통제를 위해 라이브러리의 10% 부피를 "입력"으로 표시하고 면역침전되지 않도록 유지하십시오. MeDIP-seq 키트에 제공된 5-methylcytosine에 대한 단클론 항체를 사용하여 라이브러리의 나머지 90%에 대해 면역침전을 수행합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 5-methylcytosine immunoprecipitation product의 정제를 위한 키트를 사용하여 농축 및 입력 라이브러리를 정제합니다.
- 키트와 함께 제공된 프라이머를 사용하여 대조군의 내부 스파이크에 대해 정량적 Real-Time PCR을 수행하여 농축 효율을 평가합니다. 각 면역침전(IP)에 대해 MeDIP의 사이클 역치(Ct) 값과 qPCR 반응에서 얻은 입력 분획을 사용하여 메틸화 및 비메틸화 DNA의 회수에서 농축 특이성을 계산합니다(방정식 1 및 2 참조).
(1)
(2)
참고: 특이성 값이 ≥0.95인 경우 IP 라이브러리가 성공한 것으로 간주합니다. - 제조업체의 지침에 따라 MeDIP-seq 라이브러리 준비 키트를 사용하여 라이브러리를 증폭하고 제품의 정량화 및 라이브러리 크기 분포 분석을 수행합니다.
- 차세대 시퀀서에서 라이브러리 시퀀싱을 수행합니다. 평균 30M 판독/시료를 목표로 판독 길이가 100bp인 paired-end sequencing을 사용합니다.
- bwa (v 0.7.5 이상)48를 사용하여 염기서열분석 판독 태그를 적절한 참조 게놈(예: hg38)에 정렬한 다음 MACS(v 2.0.10 이상)49를 사용하여 피크를 식별하여 넓은 피크(-slocal = 0,-llocal = 500000)를 식별할 수 있습니다.
- BEDTools의 다중교차 도구(50)를 사용하여 상이한 샘플로부터 공통 영역 세트를 생성하고, 클러스터링 옵션을 가능하게 한다.
- BEDTools의 multicov를 사용하여 최종 영역 목록에 대한 샘플당 커버리지를 계산하고 중복된 읽기를 삭제합니다.
- edgeR을 사용하여 행렬 개수 분석을 수행합니다. 3개 이상의 샘플에 백만당 1개 이상의 카운트(cpm) 필터를 적용하여 저농축 영역을 삭제합니다.
참고: 또는 edgeR의 filterByExpr 함수를 사용할 수 있습니다. - edgeR(함수 glmFit)에 구현된 일반화된 로그-선형 모델을 채택하고 조건부 분위수 정규화51을 사용하여 정규화하여 영역별 GC 함량을 보정하여 차등 메틸화를 식별합니다. BH 조정 p 값에 임계값 0.01을 적용하여 차등 메틸화 영역을 선택합니다. 다음과 같이 반복되는 시퀀스의 분석을 수행합니다.
알림: 옵션 및 매개변수(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html)의 전체 목록은 edgeR 사용 설명서를 참조하십시오.- 공칭 p 값 <0.01에 대해 MeDIP 염기서열 분석 결과를 필터링하고 첫 번째 집합에서 logFC >1을 갖는 영역과 두 번째 집합에서 logFC <-1을 갖는 영역을 선택하는 두 개의 영역 집합을 만듭니다.
- 선택한 게놈에 대한 RepeatMasker 주석을 베드 파일로 검색하고 각 세트의 요소 수를 계산합니다. 개수를 각 데이터 집합의 지역 수에 대한 비율로 변환합니다.
- 각 반복 클래스와 겹치는 메틸롬의 비율을 추출하고 카이 제곱 검정을 수행하여 유의한 농축을 감지합니다.
- ETR 및 모의 처리된 샘플 간의 차등 전사 또는 차등 메틸화 영역이 in silico-predicted off-target gRNA 결합에 매핑되는지 평가합니다.
- CRISPR design suite52를 off-target gRNA 결합 예측 도구로 사용할 수 있습니다.
- 모든 추정 off-target 영역에 대해 가장 가까운 전사 시작 부위(TSS)와 가장 가까운 메틸화 영역을 살펴봅니다. FDR <0.01로 조절되고 TSS까지의 거리가 10Kb 미만인 유전자와 관련된 영역 또는 FDR <0.01로 조절되고 거리가 1Kb 미만인 메틸화 영역을 진정한 off-target 효과로 간주합니다.
- 모의 처리된 샘플과 비교하여 3가지 최고 성능의 gRNA로 처리된 샘플에서 전사적으로 변경되거나 과메틸화된 영역의 수와 특징을 식별하여(그림 5) gRNA 중 가장 특이적인 영역을 식별합니다. 표적 세포의 생리학에 대한 off-target 부위의 잠재적 영향의 순위를 다음 순서로 지정합니다(가장 영향을 미치는 것부터 덜 영향을 미치는 것까지).
i) 유전자 내 조절 영역 생리학적으로 발현되는 유전자
ii) 유전자 내 엑손 영역 생리학적으로 발현되는 유전자
iii) 인트라인제닉(intragenic), 인트로닉 영역(intronic region) 생리학적으로 발현되는 유전자
iv) 유전자 내 조절 영역-발현되지 않은 유전자
v) 유전자 내 엑손 영역 발현되지 않은 유전자
vi) 유전자 내, intronic region-발현되지 않은 유전자
vii) 유전자 간 영역
(1)
(2)Representative Results
CRISPR/Cas9 시스템과 결합된 표적 자리에서 형광 리포터의 상동 재조합 매개 통합을 위한 donor 템플릿을 전달하면(예: K-562 세포의 경우 플라스미드 핵에 의해) 보고자 양성 세포가 처리된 샘플에 나타납니다(그림 1, 하단). 그렇지 않은 경우 donor template과 CRISPR/Cas9 시약의 설계 및 클로닝의 정확성을 다시 확인하십시오. 확인되면 시약의 용량과 전달 프로토콜 자체를 최적화하십시오.
리포터 세포주를 얻은 후 표적 유전자의 promoter/enhancer 염기서열을 선택하고 일치하는 gRNA 패널을 설계합니다. Chopchop과 같은 인실리코(in silico) 예측 도구를 사용하여 gRNA 염기서열을 식별하고 예측된 효율성 및 특이성 측면에서 순위를 매길 수 있습니다(그림 2). gRNA가 회수되지 않으면 표적 염기서열에서 canonical Cas9 protospacer adjacent motif (PAM) (5'-NGG-3')의 존재를 제어합니다. PAM 염기서열이 존재하지 않는 경우, 대체 PAM 독립적 Cas9 변이체를 기반으로 하는 ETR로 전환하거나(이러한 변이체로 발표된 ETR은 아직 없음) ZFP53 또는 TALEs30과 같은 대체 DNA 결합 도메인 플랫폼으로 전환하는 것을 고려하십시오. 그러나 예측된 효능/특이도가 낮은 gRNA만 회수하는 경우 1) 이러한 저품질 gRNA를 테스트하거나 2) 더 나은 gRNA를 찾기 위해 표적 DNA 염기서열을 확장하는 것을 고려하십시오. gRNA와 함께 삼중 ETR 조합(또는 CRISPRoff; v2.1)의 일시적인 전달 시, 형광 리포터의 발현에 대한 종방향 유세포 분석 분석을 수행하고, 종종 급성 분석에서 리포터 억제의 피크를 관찰한 다음, 시간이 지남에 따라 ETR 인코딩 플라스미드의 유사분열 희석으로 인해 적어도 부분적으로 재흡수됩니다(그림 4C).). ETRs/gRNA 조합이 표적 유전자좌에 CpG 메틸화를 효과적으로 증착하는 경우, 처리된 세포의 상당 부분에서 리포터의 영구적인 억제가 발생합니다(그림 4C). 다양한 gRNA는 다양한 장기 침묵 효율을 보일 수 있습니다(그림 4B,C).
게놈 전반의 특이성 평가의 경우, MeDIP-seq를 사용하여 표적이 장기간 침묵된 세포와 처리되지 않은 세포 간의 차등 메틸화 영역을 식별합니다. 이상적으로, 매우 특이적인 gRNA는 표적 부위에서 de novo CpG 메틸화의 피크만 유도합니다(그림 5). 그렇지 않은 경우, on-target 효율 목록에서 더 낮은 위치에 랭크된 gRNA의 off-target 활성을 특성화하는 것을 고려할 수 있습니다.
그림 1: 상동성 유도 복구(homology-directed repair)에 의한 인간 B2M 유전자의 조절 요소 하에서 tdTomato 리포터의 통합. 위: CRISPR/Cas9 유도 상동성 유도 복구에 의해 인간 B2M 유전자의 첫 번째 인트론에 tdTomato 형광 리포터를 통합하기 위한 전략의 개략도. 아래: B2M 유전자의 첫 번째 인트론에서 tdTomato 리포터의 통합 전후 K-562 세포의 대표적인 점도표. 약어: HA = 상동성 암; HDR = 상동성 지향 복구; IRES = 내부 리보솜 진입 부위; pa = BGH 폴리(A); SA = 스플라이스 수용체 사이트; WT = 와일드 타입; 3XSTOP = 3개의 연속 정지 코돈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: B2M 유전자의 CpG 섬을 표적으로 하는 gRNA의 인실리코(in silico) 식별, 예측 효율 및 특이성 순위. B2M 유전자의 promoter sequence에 embedded CpG island를 표적으로 하는 gRNA를 보여주는 Chopchop의 출력 인터페이스는 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) 또는 3 (MM3) 불일치가 있는 off-target 염기서열의 수와 예측된 on-target 효율 모두에 대해 순위가 매겨졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: dCas9 ETR 매개 후성유전학적 침묵을 위한 gRNA의 클로닝 및 배열된 핵검사. 위: 플라스미드를 발현하는 인간 U6-gRNA에서 올리고 매개 프로토스페이서 클로닝. 아래: K-562B2M/tdTomato 세포에서 플라스미드 핵에 의한 CRISPR/dCas9 기반 후성유전학적 침묵을 위한 B2M 표적 gRNA의 배열된 화면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: B2M 유전자의 장기 침묵을 효과적으로 유도하는 gRNA 스크리닝. (A) 위: 확대된 영역에 묘사된 B2M tdTomato 유전자의 개략도, gRNA와 복합체된 dCas9 기반 ETR의 상대적 순서 및 결합 방향. 아래: ETR 침묵 전(왼쪽) 또는 후(오른쪽)의 B2MtdTomato K-562 세포의 대표적인 점도표. gRNA와 트리플 dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L 조합에 대해 인코딩하는 플라스미드를 사용한 transfection 후 30일 후 분석. (B) 형질주입 후 30일째에 K-562B2M tdTomato 세포에서 B2M의 CpG 섬을 표적으로 하는 표시된 gRNA(풀 또는 개별 gRNA)의 침묵 활성(상단 회로도의 빨간색 화살표는 gRNA의 방향을 나타냄). 데이터는 tdTomato-음성 세포의 비율을 보여줍니다(평균 ± SEM; n = 각 치료 조건에 대한 4개의 독립적인 transfection). (C) 삼중 ETR 조합 및 지시된 B2M CpG 섬 표적 gRNA 또는 모의(gRNA 및 ETR-free transfection)를 발현하는 플라스미드를 사용한 transfection 시 B2M tdTomato K-562 세포의 시간 경과 분석. 데이터는 td토마토 음성 세포의 비율을 보여줍니다(평균 ± SEM; n = 각 치료 조건에 대한 3개의 독립적인 transfection). 게시되지 않은 데이터. 패널 A와 B는 Amabile et al.30에서 발췌했습니다. 약어: CGI = CpG island; IRES = 내부 리보솜 진입 부위; pa = BGH 폴리(A); SA = 스플라이스 수용체 사이트; SD = 스플 라이스 기증자 부위; TSS = 전사 시작 부위; UT = 형질주입되지 않음; 3XSTOP = 3개의 연속 정지 코돈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: RNA-seq 및 MeDIP-seq에 의한 ETR 특이성의 게놈 전체 분석. 왼쪽: 모의 처리된 B2MtdTomato K-562 세포와 삼중 dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR 조합 및 B2M 유전자의 CpG 섬을 표적으로 하는 gRNA로 처리된 세포의 발현 수준 비교. 값은 매핑된 읽기의 RPKM(킬로베이스/백만)당 읽기 수 log2로 표현됩니다. 검은 점은 모든 조건에서 비슷한 수준으로 발현되는 유전자를 나타냅니다. 노란색 원은 FDR <0.01에 따라 차등적으로 조절되는 유전자를 나타냅니다. 빨간색 원은 B2M-IRES-tdTomato 대본을 나타냅니다. 오른쪽 상단: 모의 처리된 B2MtdTomato K-562 세포(파란색) 또는 삼중 dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR 조합 및 B2M 유전자의 CpG 섬(CGI)을 표적으로 하는 gRNA(녹색)로 처리된 세포의 전체 게놈 MeDIP-seq 프로파일을 보여주는 circos 플롯. 오른쪽 하단: 표시된 샘플에서 B2MtdTomato 유전자좌의 메틸화 상태가 표시됩니다. 각 더미에는 세 개의 반복실험이 표시됩니다. 정렬된 읽기의 스택은 가우스 창을 사용하여 평활화되었습니다. 이 그림은 Amabile et al.30에서 발췌한 것입니다. 약어: TSS = 전사 시작 사이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
표적 후성유전학적 침묵은 기능적 이득 돌연변이(gain-of-function mutations)1, 감염성 질환(infectious diseases)2 및 한 유전자의 침묵이 다른 유전자의 유전적 결함을 보상하거나3 입양 세포 치료제(adoptive cell therapy)4의 잠재력을 최대한 발휘할 수 있는 병리학(pathology)을 포함하여 영구적인 유전자 불활성화의 혜택을 받을 수 있는 장애를 치료하기 위한 유망한 솔루션이 될 수 있다. 5. 염색질 수준에서 작용하고 세포에 의해 자가-증식됨으로써(7,30,32), 후성유전학적 침묵은 표적 유전자의 DNA 서열의 독성 변경(예를 들어, 염색체 재배열)과 표적의 부분적이고 일시적인 침묵을 피할 수 있는데, 이는 각각 인공 뉴클레아제 기반 유전자 파괴 8,34,35 및 RNAi-기반 넉다운(knockdown) 33의 한계이다.
모든 후성유전학적 침묵 프로토콜의 주요 예비 단계 중 하나는 표적의 전사 활성을 끄는 데 필요한 억제성 후성유전학적 표지를 침착할 ETR을 지시하기 위해 표적 유전자의 적절한 위치를 식별하는 것입니다. 상이한 전사 시작 부위-근위 및 원위 조절 요소들은 주어진 인간 유전자(54)의 전사 출력을 지지하기 위해 일치할 수 있다. 또한, 특정 조절 요소에 따라 서로 다른 표적 부위를 식별할 수 있게 된 것은 프로그래밍 가능한 DNA 결합 기술의 증가 덕분이다6. 따라서 엔지니어링된 세포주에서 설명된 것과 같은 프로토콜은 최종 치료 환경에서 최상의 후보 물질에 대한 번거롭고 시간이 많이 걸리는 평가 노력에 착수하기 전에 ETR 매개 후성유전학적 침묵에 적합한 개별 표적 부위 및/또는 게놈 영역을 지정하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 몇 가지 중요한 측면은 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
최종 치료 표적을 예측하는 리포터 세포주 엔지니어링
표적 유전자에 형광 리포터에 대한 카세트 코딩을 삽입하고 ETR을 전달하기 위해 필요한 세포 공학 프로토콜의 지속적인 최적화에도 불구하고 최종 치료 표적과 가장 유사한 세포주에 이미 사용할 수 있다는 사실을 당연하게 여길 수 없습니다. 이 경우, 상이한 완화 전략이 적용될 수 있습니다: a) 표적 세포주에 대한 transfection 프로토콜을 사내에서 최적화하기 위해 공급업체가 제공하는 최적화 키트를 활용; b) 여전히 표적 유전자를 발현하지만 엔지니어링 프로토콜이 광범위하게 최적화된 최종 치료 표적이 아닌 다른 조직에 속하는 다른 세포주로 전환. 이러한 옵션을 사용할 수 없는 경우 최종 표적을 나타내는 일차 세포 유형 또는 오가노이드로 전환하는 것을 고려할 수 있습니다. ETR 기반 후성유전학적 침묵의 전임상 연구 및 치료 응용 모두에 대한 일반적인 고려 사항으로, 표적 유전자가 표적 세포 유형에 필수적인 시나리오는 폐기되어야 합니다. ETR에 의해 부과된 필수 유전자의 완전하고 장기적인 침묵은 시간이 지남에 따라 표적 세포의 역선택(및 잠재적으로 치료의 독성)으로 이어질 것입니다. 이러한 경우 RNAi33과 같은 부분 표적 폐기를 제공하는 대체 기술이 선호됩니다.
ETR의 표적 침묵 활동 평가
KRAB, DNMT3A 및 DNMT3L effector domains의 조합에 기초한 ETR은 전사 시작 부위(32)를 중심으로 약 1킬로베이스의 넓은 긴 허용 표적 창을 갖는 대다수의 단백질 코딩 유전자에 대해 효과적인 것으로 입증되었습니다. 잘 수행된 후성유전학적 침묵 실험이 어떻게 보이는지 이해하기 위해 K-562 세포에서 B2M 유전자를 침묵시키는 기술적 세부 사항과 결과가 여기에 제공됩니다. 이는 K-562 세포를 연구하는 연구자뿐만 아니라 ETR 기반 기술에 처음 접근하는 연구자들에게도 포함되어야 할 중요한 양성 대조군으로 간주될 수 있습니다. 프로토콜에 명시된 바와 같이, 인공 뉴클레아제(예: CRISPR/Cas9) 기반 유전자 파괴는 관심 세포 유형에서 유전자 전달의 효율성과 표적 유전자가 박탈된 세포의 표현형을 추가로 제어하기 위해 권장됩니다. CRISPR/dCas9 기반 ETR과 결합할 gRNA의 초기 스크리닝 후, 테스트된 gRNA 중 어느 것도 표적 유전자를 영구적으로 침묵시킬 수 없는 경우 다음 순서로 고려해야 합니다: 1) 전달되는 gRNA 및 ETR의 양을 증가; 2) 상위 gRNA의 풀을 테스트하여 이들 간의 시너지 효과를 찾습니다. 장기 침묵이 여전히 달성되지 않으면 다음을 고려해야 합니다: 3) 후성유전학적 침묵을 지시하는 데 더 관련성이 높은 부위를 표적으로 할 수 있는 추가 gRNA 테스트; 4) 표적 염색질에 대한 결합 능력이 향상될 수 있는 ZFP8 또는 TALE9 기반 DBD 플랫폼으로 전환; 5) 일시적에서 안정형으로 전환 - 예를 들어, ETR의 바이러스 벡터 기반 발현 통합(CRISPR/dCas9 기술 채택 시 gRNA 또는 dCas9 융합 구조 또는 둘 다). 우리 그룹은 세 개의 개별 ETR(30)의 공동 전달을 개발하고 강력한 경험을 가지고 있기 때문에 여기에 표시된 프로토콜과 결과는 이 접근 방식을 기반으로 합니다. 그러나, 유사한 개념적 워크플로우가 일체형 CRISPR-기반 시스템(32)에 적용될 수 있을 것이다.
ETR의 off-target 활동 평가
여러 연구에서 KRAB, DNMT3A 및 DNMT3L 이펙터 도메인30,31,32의 조합을 기반으로 ETR의 특이성에 대한 예비 시험관 내 적응증을 보여주었습니다. 그러나 테스트된 gRNA 중 전사 조절 및/또는 de novo DNA 메틸화 측면에서 만족스러운 특이성 프로파일을 보여주지 않는 경우 a) ETR의 투여량을 줄이거나 대체 전달 시스템을 테스트하여 세포 내 ETR의 체류 시간(및 결과적으로 잠재적인 표적 외 활성)을 줄이는 두 가지 비상호 배타적 전략을 추구할 수 있습니다. 예를 들어, 플라스미드와 비교하여, mRNA 및 단백질 전달은 모두 ETR에 대한 세포-노출 시간을 감소시킬 것으로 예상되며, 결과적으로, off-target 활성의 가능성을 감소시킬 것으로 예상된다(55); b) 플랫폼(56)의 off-target 결합을 감소시키도록 최적화된 보다 최근의 Cas9 변이체로의 전환, 또는 대안적인 ZFP8- 또는 TALE9-기반 DNA 결합 기술로의 전환. 모의 처리된 샘플과 비교했을 때, 유전자 침묵의 on-target 및 off-target 활성은 DBD와 표적 염기서열의 결합뿐만 아니라 자연적인 내인성 보조 인자에 의해 다른 유전자좌에 모집될 수 있는 후성유전학적 효과기 도메인의 잠재적 능력에 의해서도 영향을 받는다는 점을 고려하는 것이 중요합니다. 따라서, 표적 세포에서 ETR의 체류 시간을 줄이면 DBD가 off-target 부위에 결합할 가능성뿐만 아니라 ETR이 내인성 보조인자와 상호작용할 가능성도 감소할 수 있으며, 특이성 측면에서는 잠재적 이점과 표적 활성의 측면에서는 단점이 있습니다. 마지막으로, 모의 처리된 샘플과 비교하여, 침묵된 세포에서 측정된 전사 및 가능성이 적은 CpG 메틸화 변화의 일부는 표적 유전자의 박탈에 의해 간단히 유도될 수 있습니다. 이는 침묵 기술의 대상에서 벗어난 것으로 간주되지 않습니다. 이들을 식별하기 위해서는 실험 패널 8,9,10에 인공 뉴클레아제에 의한 유전자 파괴도 포함해야 합니다. 표적 유전자의 기능적 손실로 인한 생물학적 변화는 후성유전학적 침묵과 이 대체 기술 간에 공유될 것입니다.
Disclosures
AL은 Chroma Medicine, Inc.의 공동 창립자, 할당량 보유자 및 컨설턴트입니다.
Acknowledgments
저자는 수년 동안 후성유전학적 침묵 기술을 개발하기 위한 공동 노력에 대해 Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica 및 Deborah Cipria에게 감사의 뜻을 전합니다. Dejan Lazarevic 및 Francesca Giannese는 프로토콜에 설명된 RNA-seq 및 MeDIP-seq 분석에 대한 비판적 검토를 담당했습니다. 이 작업은 Telethon Foundation(TIGET 보조금 번호 F1)과 EU Horizon 2020 프로그램(UPGRADE)의 A.L. 보조금으로 지원되었습니다. 일러스트는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
저자 기여
A.M, M.A.C., F.G. 및 A.C.는 프로토콜 설계와 원고 작성에 기여했습니다. S.V., I.M. 및 D.C.는 프로토콜의 생물정보학 섹션을 설계하고 원고를 수정했습니다. A.M.과 A.L.은 프로토콜을 설계하고, 모든 저자의 의견을 수렴하여 원고를 구상하고 작성했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
| 4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
| B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
| B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
| B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
| BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
| bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
| bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
| Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
| Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
| cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
| CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
| CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
| CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
| Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
| E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
| edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
| EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
| Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
| Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
| Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
| gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
| hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
| High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
| High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
| High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
| High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
| IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
| K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
| KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
| MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
| MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
| NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
| NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
| NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
| One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
| pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
| pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
| pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
| pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
| phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
| PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
| Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
| Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
| Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
| Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
| Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
| Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
| Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
| SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
| SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
| STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
| T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
| TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
| TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
| UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |
References
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