Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של מחלת ליים ספירוכטה בורליה בורגדורפרי

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

היכולת של בקטריופאג' להעביר דנ"א בין תאי חיידקים הופכת אותם לכלים יעילים למניפולציה גנטית של החיידקים המארחים שלהם. מוצגת כאן מתודולוגיה לגרום, לשקם ולהשתמש ב-φBB-1, בקטריופאג' של בורליה בורגדורפרי, כדי להמיר דנ"א הטרולוגי בין זנים שונים של ספירוצ'טה של מחלת ליים.

Abstract

החדרת דנ"א זר לתוך הספירוכטה Borrelia burgdorferi הושגה כמעט אך ורק על ידי טרנספורמציה באמצעות אלקטרופורציה. לתהליך זה יש יעילות נמוכה יותר באופן ניכר במחלת ליים ספירוצ'ט בהשוואה לחיידקים גראם שליליים אחרים, המאופיינים טוב יותר. אחוזי ההצלחה של הטרנספורמציה תלויים מאוד בכך שיש כמויות מרוכזות של דנ"א באיכות גבוהה מרקעים ספציפיים וכפופים לשונות משמעותית מזן לזן. אמצעים חלופיים להחדרת דנ"א זר (כלומר, וקטורים של מעבורת, כתבים פלואורסצנטיים וסמני עמידות לאנטיביוטיקה) לתוך B. burgdorferi יכולים להיות תוספת חשובה לחימוש של כלים שימושיים למניפולציה גנטית של ספירוכט מחלת ליים. בקטריופאג' הוכר היטב כמנגנונים טבעיים לתנועת דנ"א בין חיידקים בתהליך שנקרא טרנסדוקציה. במחקר זה פותחה שיטה לשימוש בפאג' הבורליאלי φBB-1 הנמצא בכל מקום כדי להמיר דנ"א בין תאי B. burgdorferi מרקע גנטי זהה ושונה. הדנ"א המתמר כולל גם דנ"א בורליאלי וגם דנ"א הטרולוגי בצורה של וקטורים קטנים. הדגמה זו מציעה שימוש אפשרי בהתמרה בתיווך פאגים כהשלמה לאלקטרופורציה למניפולציה הגנטית של מחלת ליים ספירוכט. דו"ח זה מתאר שיטות לאינדוקציה וטיהור של פאג φBB-1 מ - B. burgdorferi, השימוש בפאג זה במבחני טרנסדוקציה, ובחירה וסינון של מתמרים פוטנציאליים.

Introduction

פיתוח כלים למניפולציה גנטית של החיידק הספירוכטלי Borrelia burgdorferi הוסיף ערך לאין שיעור להבנת טבעה של מחלת ליים 1,2,3,4. ל-B. burgdorferi יש גנום מורכב במיוחד המורכב מכרומוזום ליניארי קטן ופלסמידים ליניאריים ומעגליים 5,6. אובדן פלסמיד ספונטני, סידור מחדש תוך-גני (תנועה של גנים מפלסמיד אחד למשנהו בתוך אותו אורגניזם) והעברת גנים אופקית (HGT, תנועת הדנ"א בין שני אורגניזמים) הולידו כמות מסחררת של הטרוגניות גנטית בקרב B. burgdorferi (לדוגמה, ראו Schutzer et al.7). הגנוטיפים המתקבלים (או "זנים") הם כולם בני אותו המין, אך יש הבדלים גנטיים המשפיעים על יכולתם להעביר ולהדביק פונדקאים שונים שליונקים 8,9,10,11. בדו"ח זה, המונח "זן" ישמש להתייחסות ל- B. burgdorferi בעל רקע גנטי טבעי מסוים; המונח "שיבוט" ישמש להתייחסות לזן שעבר הנדסה גנטית למטרה מסוימת או כתוצאה ממניפולציה ניסיונית.

ארגז הכלים המולקולרי הזמין לשימוש ב- B. burgdorferi כולל סמנים הניתנים לבחירה, כתבי גנים, וקטורים של מעבורת, מוטגנזה טרנספוזונית, מקדמים אינדוקטיביים וסמנים הניתנים לבחירה נגדית (לסקירה, ראו Drektrah ו- Samuels12). השימוש היעיל במתודולוגיות אלה מחייב החדרה מלאכותית של דנ"א הטרולוגי (זר) לתוך זן עניין של B. burgdorferi. ב- B. burgdorferi, הכנסת דנ"א הטרולוגי מושגת כמעט אך ורק באמצעות אלקטרופורציה, שיטה המשתמשת בפולס של חשמל כדי להפוך קרום חיידקי לחדיר באופן זמני לפיסות דנ"א קטנות שהוכנסו למדיה1. רוב התאים (הנאמדים ב-≥99.5%) נהרגים על ידי הדופק, אך לתאים הנותרים יש תדירות גבוהה של שמירה על הדנ"א ההטרולוגי13. למרות שנחשב לאחת השיטות היעילות ביותר להחדרת דנ"א לחיידקים, תדירות האלקטרופורציה לתוך B. burgdorferi נמוכה מאוד (החל מטרנספורמציה אחת ב-5 × 104 עד 5 × 106 תאים)13. נראה כי המחסומים להשגת תדרים גבוהים יותר של טרנספורמציה הם טכניים וביולוגיים כאחד. מחסומים טכניים לאלקטרופורציה מוצלחת של B. burgdorferi כוללים הן את כמות הדנ"א (>10 מיקרוגרם) הדרושה והן את הדרישה של הספירוכטים להיות בדיוק בשלב הגדילה הנכון (אמצע יומן, בין 2 × 10 7 תאים·mL−1 ו-7× 107 תאים·mL−1) בעת הכנת תאים אלקטרו-מוכשרים12,13. עם זאת, מחסומים טכניים אלה עשויים להיות קלים יותר להתגבר מאשר על המחסומים הביולוגיים.

חוקרי מחלת ליים מכירים בכך שניתן לחלק את שיבוטי B. burgdorferi לשתי קטגוריות רחבות ביחס ליכולתם להיות מניפולציה גנטית13,14. מבודדים בעלי מעבר גבוה ומותאמים למעבדה משתנים לעתים קרובות בקלות, אך בדרך כלל איבדו את הפלסמידים החיוניים להדבקה, מתנהגים בצורה סוטה מבחינה פיזיולוגית, ואינם מסוגלים להדביק פונדקאי יונק או להתמיד בתוך וקטור קרציות12,13. בעוד ששיבוטים אלה היו שימושיים לניתוח הביולוגיה המולקולרית של הספירוצ'ט בתוך המעבדה, הם בעלי ערך מועט לחקר הספירוצ'ט בהקשר הביולוגי של המחזור האנזוטי. מבודדים זיהומיים בעלי מעבר נמוך, לעומת זאת, מתנהגים באופן פיזיולוגי המשקף מצב זיהומי ויכולים להשלים את מחזור ההדבקה אך בדרך כלל הם סרבנים להכנסת דנ"א הטרולוגי ולכן קשה לתמרן אותם למחקר12,13. הקושי בהתמרת מבודדים בעלי מעבר נמוך קשור לפחות לשני גורמים שונים: (1) מבודדים בעלי מעבר נמוך לעיתים קרובות מתגבשים זה לזה בחוזקה, במיוחד בתנאי הצפיפות הגבוהה הנדרשים לאלקטרופורציה, ובכך חוסמים תאים רבים מיישום מלא של המטען החשמלי או מגישה לדנ"א במדיה13,15; ו-(ii) B. burgdorferi מקודד לפחות שתי מערכות שונות לשינוי הגבלה (R-M) המועברות על ידי פלסמידים, שעלולות ללכת לאיבוד במבודדים בעלי מעבר גבוה14,16. מערכות R-M התפתחו כדי לאפשר לחיידקים לזהות ולחסל דנ"אזר 17. ואכן, מספר מחקרים ב- B. burgdorferi הראו כי יעילות הטרנספורמציה עולה כאשר מקור הדנ"א הוא B. burgdorferi ולא Escherichia coli13,16. למרבה הצער, רכישת הריכוז הגבוה הנדרש של דנ"א לאלקטרופורציה מ- B. burgdorferi היא אפשרות יקרה וגוזלת זמן. חשש פוטנציאלי נוסף בעת אלקטרופולציה ובחירה במבודדים בעלי מעבר נמוך הוא שנראה שהתהליך מעדיף טרנספורמטורים שאיבדו את הפלסמיד הקריטי הקשור לווירולנציה, lp2514,18,19; לפיכך, עצם הפעולה של מניפולציה גנטית של מבודדי B. burgdorferi במעבר נמוך באמצעות אלקטרופורציה עשויה לבחור עבור שיבוטים שאינם מתאימים לניתוח רלוונטי ביולוגית בתוך המחזור האנזואטי20. בהתחשב בבעיות אלה, מערכת שבה דנ"א הטרולוגי יכול לעבור אלקטרופורמציה לשיבוטים של B. burgdorferi בעלי מעבר גבוה ולאחר מכן להעביר אותם למבודדים זיהומיים בעלי מעבר נמוך בשיטה שאינה אלקטרופורציה יכולה להיות תוספת מבורכת לאוסף ההולך וגדל של כלים מולקולריים הזמינים לשימוש בספירוכטה של מחלת ליים.

בנוסף לטרנספורמציה (קליטת דנ"א עירום), ישנם שני מנגנונים נוספים שבאמצעותם חיידקים תופסים באופן קבוע דנ"א הטרולוגי: הצמדה, שהיא חילופי דנ"א בין חיידקים במגע פיזי ישיר זה עם זה, והתמרת, שהיא חילופי דנ"א בתיווך בקטריופאג'21. ואכן, היכולת של בקטריופאג' לתווך HGT שימשה ככלי ניסיוני לניתוח התהליכים המולקולריים בתוך מספר מערכות חיידקים22,23,24. B. burgdorferi אינו כשיר באופן טבעי לקליטת דנ"א עירום, ויש מעט ראיות לכך ש- B. burgdorferi מקודד את המנגנון הדרוש לקידום הצמדה מוצלחת. דוחות קודמים תיארו, עם זאת, זיהוי ואפיון ראשוני של φBB-1, בקטריופאג' ממוזג של B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 חבילות משפחה של פלסמידים של 30 קילובייט שנמצאו בתוך B. burgdorferi25; בני משפחה זו נקראו CP32S. בהתאם לתפקידו של φBB-1 בהשתתפות ב-HGT בקרב זני B. burgdorferi, סטיבנסון ואחרים דיווחו על cp32 זהה שנמצא בשני זנים עם cp32s שונים זה מזה, מה שמרמז על שיתוף לאחרונה של cp32 זה בין שני זנים אלה, ככל הנראה באמצעות התמרה29. יש גם עדויות לרקומבינציה משמעותית באמצעות HGT בקרב cp32s בגנום יציב יחסית 30,31,32,33. לבסוף, היכולת של φBB-1 לתמר גם cp32s וגם דנ"א וקטורי הטרולוגי בין תאים מאותו זן ובין תאים של שני זנים שונים הוכחה בעבר27,28. לאור ממצאים אלה, φBB-1 הוצע ככלי נוסף שיש לפתח לניתוח הביולוגיה המולקולרית של B. burgdorferi.

מטרת דו"ח זה היא לפרט שיטה לגרימה וטיהור של פאג φBB-1 מ- B. burgdorferi, כמו גם לספק פרוטוקול לביצוע בדיקת התמרה בין שיבוטים של B. burgdorferi ובחירה וסינון של מתמרים פוטנציאליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים המשתמשים בדנ"א רקומביננטי ובאורגניזמים BSL-2 נבדקו ואושרו על ידי הוועדה הביולוגית המוסדית של אוניברסיטת קוויניפיאק.

1. הכנת תרבות B. burgdorferi לייצור φBB-1

  1. הכינו את סרום הארנב הרגיל (BSK) של ברבור-סטונר-קלי בתוספת של 6.6% סרום ארנבת רגיל (BSK) המומת בחום15. עבור 1 ליטר של 1x BSK, שלב את הרכיבים המפורטים בטבלה 1 ב-900 מ"ל מים, התאם את ה- pH ל- 7.6 באמצעות 1 N נתרן הידרוקסיד, וערבב באיטיות ב- 4 °C למשך 2-4 שעות. לאחר השלמת הערבוב, בדוק והתאם מחדש את ה- pH ל -7.6 במידת הצורך, והגדל את הנפח ל -1 ליטר עם מים. יש לעקר את המדיום על ידי מעבר דרך מסנן של 0.22 μM (ראו טבלת חומרים) ולהשתמש בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך ≤2 חודשים.
  2. שלושה עד חמישה ימים לפני תחילת פרוטוקול הטרנסדוקציה, יש לחסן 150 μL של שיבוט B. burgdorferi המתאים ל-15 מ"ל של 1x BSK בצינורות צנטריפוגה חרוטיים סטריליים מכוסים היטב (ראו טבלת חומרים). השלימו את המדיום עם הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה או שילוב של אנטיביוטיקה לבחירה ותחזוקה של דנ"א הטרולוגי בתוך השיבוט של B. burgdorferi (טבלה 2).
    הערה: B. burgdorferi הוא אורגניזם ברמה ביולוגית 2. קח את כל אמצעי הזהירות המתאימים בעת עבודה עם אורגניזם זה. בצע את כל העבודות עם תרבויות חיות של B. burgdorferi בארון בטיחות ביולוגית מוסמך ומחוטא כראוי מסוג II. יש להיפטר כראוי מכל החומר שבא במגע עם B. burgdorferi והאורגניזמים עצמם בהתבסס על הנחיות CDC34.
  3. דגירה של התרביות בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד עד שהתרביות מגיעות לצפיפות של ≥5 × 107 ספירוצ'טים·mL−1, שנמשכת כ-3-5 ימים.

2. לקבוע את צפיפותן של תרביות B. burgdorferi (שונה מסמואלס)15

  1. עבור צפיפויות הצפויות להיות מעל 5 × 106 תאים·mL−1, לקבוע את צפיפות התא באמצעות ספקטרוסקופיה.
    1. העבר 1 מ"ל של תרבית לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 8,000 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. יש להשליך את ה-supernatant ולהשהות מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של תמיסת מלח חצוצרה בפוספט (PBS; 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 ו-1.8 mM KH2PO4). העבירו את כל תרחיף התא לקובט שקוף חצי-מיקרו-UV.
    3. קבע את הצפיפות האופטית של הדגימה המחודשת באורך גל של 600 ננומטר (A600). אפס את הספקטרופוטומטר (ראו טבלת חומרים) כנגד PBS.
    4. כדי לחשב את ריכוז הספירוצ'טים·mL−1 בתרבית המקורית, הכפל את הצפיפות האופטית ב- A600 ב- 1.4 × 109.
  2. עבור צפיפויות הצפויות להיות בין 5 × 104 תאים·mL−1 ו-5 × 106 תאים·mL−1, קבע את צפיפות התאים באמצעות תא ספירה של פטרוף-האוזר (ראו טבלת חומרים) כדי לספור ישירות את מספר הספירוצ'טים. שיטה זו יכולה לשמש גם לצפיפויות גבוהות יותר לאחר דילול מתאים.
    הערה: ההדמיה של ספירוצ'טים חיים דורשת מיקרוסקופ שעבר שינוי עם מעבה שדה כהה.
    1. יש למרוח 10 μL של דגימה על תא הספירה ולכסות בזכוכית כיסוי מתאימה. עבור צפיפויות גבוהות מ-1 × 107, דילל את הדגימה ב-PBS כדי להניב 50-100 ספירוצ'טים לכל שדה.
    2. ספירת התאים באמצעות מיקרוסקופ שדה כהה בהגדלה של 200x-400x. סופרים את כל השדה של 25 קבוצות של 16 ריבועים קטנים בכל המישורים.
    3. הכפל את המספר שנספר במקדם הדילול (אם קיים) וב- 5 × 104 כדי להניב תאים·mL−1 של התרבית המקורית.

3. אינדוקציה של B . burgdorferi phage φBB-1

הערה: לעקר את כל כלי הזכוכית וכלי הפלסטיק על ידי autoclaving; לעקר את כל הפתרונות על ידי autoclaving או סינון באמצעות מסנן 0.22 μM. השלבים שלהלן מוצגים על בסיס נפחים של 15 מ"ל, אך השיטה ניתנת להרחבה לנפחים קטנים או גדולים יותר בהתאם לצרכים האישיים של הניסוי.

  1. עבור תרבית B. burgdorferi שממנה יופקו פאגים (התורם), השתמש בריכוז המחושב על ידי כל אחת מהשיטות בשלב 2 כדי לקבוע את נפח התרבית ההתחלתית הדרושה כדי להניב 4 מ"ל של 2 × 108 ספירוצ'טים·mL−1. זה יניב ריכוז סופי של 5 × 107 ספירוצ'טים·mL−1 ב-15 מ"ל בשלב ההחלמה (שלב 3.6 להלן).
  2. צנטריפוגה נפח התרבות מחושב בשלב 3.1 ב 6,000 x גרם במשך 10 דקות. הורידו את ה-supernatant והניחו מחדש את הכדור ב-4 מ"ל של BSK טרי. העבירו את הדגימה לצינור הסטרילי הקטן ביותר הזמין כדי להחזיק את הדגימה עם שטח ראש מינימלי.
  3. הוסף את הכמות המתאימה של חומר משרה לריכוז המומלץ (טבלה 3) בהתבסס על נפח תרבית של 4 מ"ל כדי לגרום לייצור פאגים. מכסים את השפופרת היטב ומערבבים היטב.
  4. לדגום את הדגימה ב 33 מעלות צלזיוס במשך 2-4 שעות.
  5. לאחר הדגירה, העבר את הדגימה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הדגימה ב 6,000 x גרם במשך 10 דקות. דקאנט הסופרנטנט.
  6. השהה את כדור התא ב 15 מ"ל של 1x BSK.
    הערה: לאחר אינדוקציה של הפאג', ישנן שתי דרכים שונות להמשיך בבדיקת ההתמרות. שיטות אלה מוצגות באיור 1 ובשלב 4 ושלב 6.

4. התמרה במהלך תרבית משותפת לאחר חשיפת התורם לגורם המשרה (איור 1A)

הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול זה רק כאשר לזן המייצר פאגים (תורם) יש עמידות לאנטיביוטיקה מסוימת ולזן שיש לתמר (מושתל) יש עמידות לאנטיביוטיקה אחרת.

  1. הכן תרבית B. burgdorferi שתשמש כמקבל במבחני התמרת, כפי שתואר עבור זן התורם בשלב 1 לעיל. בהתבסס על הצפיפות שנקבעה כמו בשלב 2, חשב את הנפח הדרוש כדי להניב 15 מ"ל של 1 × 107 ספירוצ'טים·mL−1.
  2. צנטריפוגה נפח התרבות מחושב בשלב 4.1 ב 6,000 x גרם במשך 10 דקות. דקאנט הסופרנטנט.
  3. יש להשעות את הכדור ב-1 מ"ל של תרבית החל משלב 3.6 (תורם פאגים שעבר החייאה). הוסף את המקבל המחודש בחזרה לתרבות עם התורם. אין ליטול תוסף עם אנטיביוטיקה. הנפח הכולל המכיל את שתי התרבויות הוא 15 מ"ל.
  4. דגירה ב-33 מעלות צלזיוס למשך 72-96 שעות.
  5. בצע בחירה של מתמרים על ידי ציפוי פאזה מוצקה לאחר תרבית משותפת כמתואר בשלב 7.

5. פוליאתילן גליקול (PEG) משקעים כדי לשחזר פאג לשימוש בבדיקת התמרה

הערה: ניתן להשתמש בפרוטוקול זה במקרים שבהם לזן המייצר פאגים (תורם) יש עמידות לאנטיביוטיקה מסוימת ולזן שיש להמיר (מושתל) אין עמידות לאנטיביוטיקה או עמידות לאנטיביוטיקה אחרת.

  1. השלימו את התרבית משלב 3.6 עם האנטיביוטיקה המתאימה בריכוז המצוין בטבלה 2. לדגום את הדגימה ב 33 מעלות צלזיוס במשך 72-96 שעות.
  2. הכן פתרונות למשקעי PEG.
    1. הכן 500 מ"ל של 5 M NaCl. יש לעקר על ידי אוטוקלבינג ולהתקרר לפני השימוש. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
    2. להכין 500 מ"ל של 40% PEG על ידי המסת 200 גרם של PEG8000 ב 400 מ"ל של מים; מחממים בעדינות תוך כדי ערבוב עד שהתמיסה מעורבבת היטב. להביא את נפח עד 500 מ"ל עם מים. כדי להמיס לחלוטין את ה-PEG8000 ולחטא את התמיסה, יש לבצע אוטוקלאב של התמיסה ולקרר לפני השימוש. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
    3. הכן 100 מ"ל של מדיום מתלה (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, ו- 50 mM Tris-HCl [pH 7.5]). לעקר על ידי autoclaving. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. עבור משקעי PEG של פאג מהתורם B. burgdorferi שיבוט (משלב 3.6), לאחר 72-96 שעות של דגירה, צנטריפוגה את הדגימות ב 8,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (60 °F).
  4. דקנט את supernatant לתוך צינור חרוטי נקי 50 מ"ל; להשליך את כדור התא. הוסיפו 5 M NaCl לריכוז סופי של 1 M. ערבבו היטב. התנדנדו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  5. צנטריפוגה את הדגימות ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. דקנט את supernatant לתוך צינור חרוטי נקי 50 מ"ל; הכדור עשוי להיות קטן או נעדר. הוסף תמיסת PEG8000 של 40% לתמיסת העל לריכוז סופי של 10%. מערבבים היטב ומניחים על הקרח למשך יותר משעה עד לילה.
    הערה: נראה כי זמנים ארוכים יותר אינם מתואמים עם התאוששות מוגברת באופן משמעותי של פאגים.
  6. צנטריפוגה את הדגימות ב 8,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופר-נטנט והסירו כמה שיותר נוזלים עודפים מבלי לאבד כדור, המכיל את חלקיקי הפאגים.
  7. יש להשעות את הכדור בנפח מינימלי של SM, תוך שימוש ב-SM כדי לשטוף את דופן הבקבוק ולאסוף חלקיקי פאגים פוטנציאליים. היחס המומלץ הוא 400 μL של SM לכל 10 מ"ל של supernatant המקורי, אבל בהתאם לגודל של גלולה, פחות או יותר SM עשוי להידרש עבור resuspensionant מלא.
  8. טפלו בדגימת הפאגים המשוחזרת בנפח שווה של כלורופורם בהתבסס על נפח ההדחה. מערבבים היטב את הדגימה ואז צנטריפוגה בגודל 8,000 x גרם למשך 10 דקות. הסר את השכבה המימית (העליונה) לצינור נקי, תוך הימנעות משכבת ממשק עבה.
    הערה: φBB-1 הוא בקטריופאג' שאינו עטוף ואינו רגיש לטיפול בכלורופורם25. צעד זה נעשה כדי לשבש עוד יותר את כל המבנים הקשורים לממברנה (כלומר, תאים או blebs) ולהרוג כל מזהמים תאיים פוטנציאליים. כלורופורם הוא אורגני נדיף ויש להשתמש בו רק במכסה אדים מאוורר היטב; להשליך חומר המכיל כלורופורם כפסולת אורגנית.
  9. קבע את הנפח שהתאושש לאחר הטיפול הראשון בכלורופורם וטפל שוב בדגימה עם כמות כלורופורם השווה ל -10% מנפח זה. מערבבים היטב צנטריפוגה בגודל 8,000 x גרם במשך 10 דקות. הסר את השכבה המימית (העליונה), תוך הקפדה להימנע מכל ממשק או שכבה אורגנית. מעבירים את השכבה המימית לצינור נקי.
  10. השתמש בפאג באופן מיידי (כמתואר בשלב 6) או אחסן בטמפרטורה של 4 °C.
    הערה: הקפאה של דגימות פאג' φBB-1 אינה מומלצת. למרות שהיציבות של φBB-1 ב-4 מעלות צלזיוס לא נחקרה בקפדנות, דגימות שאוחסנו ב-4 מעלות צלזיוס במשך עד חודש לאחר ההתאוששות שימשו בהצלחה במבחני התמרות.

6. בדיקת התמרה בעקבות משקעי PEG של φBB-1 (איור 1B)

  1. הכן תרביות B. burgdorferi שישמשו כמקבל במבחני התמרת, כפי שתואר עבור זן התורם בשלב 1 לעיל. בהתבסס על הצפיפות שנקבעה כמו בשלב 2, חשב את נפח התרבית של הנמען הדרושה כדי להניב 15 מ"ל של 1 × 107 ספירוצ'טים·mL−1.
  2. צנטריפוגה נפח התרבות מחושב בשלב 6.1 ב 6,000 x גרם במשך 10 דקות. לנטרל את הסופרנטנט ולהשהות את הכדור ב-14.5 מ"ל של BSK טרי.
  3. הוסף ≤500 μL של דגימת פאג'ים עם זרזים של PEG (משלב 5) לתרבית של השיבוט של המקבל. מערבבים היטב ודוגרים בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס במשך 72-96 שעות.
    הערה: כמות הפאגים שהתאוששה במהלך משקעי PEG יכולה להיות משתנה, בהתאם למספר גורמים. עם זאת, מתרבית של 15 מ"ל של זן B. burgdorferi המושרה CA-11.2A, 500 μL מכיל בדרך כלל 50-1,000 פאגים בני קיימא28. נפחים של התאוששות פאגים ≥500 μL משפיעים לרעה על צמיחת B. burgdorferi , ככל הנראה בשל היחס המוגבר של SM ל- BSK.
  4. בצע את בחירת המתמרים על-ידי ציפוי פאזה מוצקה לאחר ערבוב עם פאג' עם זרזים מסוג PEG כמתואר בשלב 7.

7. בחירת מתמרים

הערה: ציפוי פאזה מוצקה של מתמרים פוטנציאליים מבוצע באמצעות שינוי שכבה אחת של הפרוטוקול שתואר לראשונה על ידי סמואלס15. B. מושבות בורגדורפרי גדלות בתוך האגר, ולכן לבחירת מתמרים על ידי ציפוי פאזה מוצקה, יש להוסיף את הדגימות למדיה בזמן שהלוחות מוזגים. שיטה חלופית לבחירת טרנספורמטורים בשיטת דילול בלוחות 96 בארות תוארה גם היא בעבר35. טכניקה זו עשויה להיות יעילה גם לבחירת מתמרים אך טרם נוסתה למטרה זו.

  1. קבע את מספר הלוחות הדרושים לבחירת המתמרים בהתבסס על מספר הדגימות ממבחני ההתמרה והבקרות שיש לצפות.
    הערה: בדרך כלל, שתי צלחות מוזגות לכל דגימה, אחת שוות ערך לכ-10% מנפח התרבית ואחת הכוללת את שארית התרבית. בנוסף, יש לשפוך צלחות המשמשות כבקרות שליליות כדי לבדוק בנפרד כי תכשיר הפאג'ים ו/או שיבוטי ההורה המשמשים כתורם והמקבל אינם גדלים בנוכחות האנטיביוטיקה המשמשת במהלך הבחירה. מומלץ גם להכין חומר ציפוי לפחות לשתי צלחות נוספות. לדוגמה, אם מספר הדגימות והפקדים שיש לצלוח הוא שמונה, הכינו מספיק תערובת ציפוי עבור 10 צלחות.
  2. הכן פתרונות לציפוי כמתואר להלן.
    הערה: כל צלחת תהיה 30 מ"ל, המורכבת מ-20 מ"ל של 1.5x BSK לציפוי ו-10 מ"ל של 2.1% אגרוז (יחס של 2:1). זה יניב צלחת עם ריכוזים סופיים של 1x BSK ו 0.7% agarose. לדוגמה, עבור 10 צלחות, להכין תערובת ציפוי כוללת של 300 מ"ל, המורכב 200 מ"ל של 1.5x BSK ו 100 מ"ל של 2.1% agarose.
    1. הכן 1 ליטר של 1.5x BSK כמתואר עבור 1x BSK בשלב 1.1 באמצעות הכמויות של כל רכיב המפורטות עבור 1.5x BSK בטבלה 1. אחסן כמתואר עבור BSK אחד.
    2. הכינו 2.1% אגרוז במים ובאוטוקלב. יש להשתמש בתמיסת האגרוז טרייה או לאחסן בטמפרטורת החדר. במקרה של אחסון בטמפרטורת החדר, יש לחמם במיקרוגל עם המכסה באופן רופף עד לריתוך מלא לפני הציפוי.
    3. קבע את נפח האנטיביוטיקה הדרושה כדי להשיג את הריכוז המתאים (טבלה 2) בהתבסס על כל תערובת הציפוי.
      הערה: אם הנפח הכולל של תמיסת הציפוי הסופית הוא 300 מ"ל, יש לערבב 200 מ"ל של 1.5x BSK ומספיק אנטיביוטיקה כדי להבטיח שריכוז האנטיביוטיקה הסופי הנכון בכל 300 המ"ל יהיה הנכון. אם גם לתורם וגם למקבל בבדיקת ההתמרות יש גנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה, תערובת הציפוי צריכה להכיל את שתי האנטיביוטיקה. אם הפאג' בעל מקדם ה-PEG מהתורם (כפי שהוכן בשלב 5) מקודד סמן עמידות לאנטיביוטיקה ולמקבל אין כזה, תערובת הציפוי צריכה להכיל רק אנטיביוטיקה אחת.
  3. בהתבסס על מספר הצלחות שיש למזוג, העבירו את הכמות המתאימה של 1.5x BSK ואנטיביוטיקה לבקבוק סטרילי גדול מספיק כדי להכיל את כל תערובת הציפוי. שיווי משקל באמבט מים בטמפרטורה של 56°C למשך ≥15 דקות.
  4. שיווי משקל מותך agarose מן autoclave או מיקרוגל באמבט מים 56 מעלות צלזיוס במשך ≥15 דקות.
  5. לאחר שיווי משקל, מוסיפים את הכמות הנחושה של 2.1% אגרוז לבקבוק עם 1.5x BSK (עם אנטיביוטיקה) ומחזירים את תמיסת הציפוי לאמבטיית המים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
    הערה: טמפרטורות גבוהות יותר עלולות להזיק או להרוג את הספירוצ'טים36. אם אתם משתמשים באותה אמבטיית מים כמו לעיל, קררו את אמבט המים לטמפרטורה של 42-45 מעלות צלזיוס לפני הפעלת הטיימר לשיווי המשקל. אל תתנו לתמיסת הציפוי להתאזן בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס למשך יותר מ-20 דקות, אחרת היא תתחיל להתמצק תוך כדי מזיגת הצלחות.
  6. במהלך שיווי המשקל, הכינו את דגימות B. burgdorferi לציפוי. מעבירים את הכמות המצופה לצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי של 50 מ"ל (ראו טבלת חומרים).
    1. אם ציפוי כמות קטנה מ-1.5 מ"ל (<5% מנפח הלוח הסופי של 30 מ"ל), העבר את הדגימה לצינור החדש והוסף את תערובת הציפוי ישירות לדגימה במהלך הציפוי.
    2. עבור נפחים גדולים יותר, העבר את נפח התרבית הרצוי לצינור החדש ולאחר מכן צנטריפוגה ב 6,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. יש לנטרל את כל הכדורים פרט ל-100-500 μL של הסופר-נטנט ולהשתמש בשארית כדי להשהות את הכדור לחלוטין לפני הציפוי.
    3. עבור לוחות בקרה לאחר תרבית משותפת, הוסף ≥107 תאים של שיבוטים של התורם או המקבל לצינורות צנטריפוגה חרוטיים סטריליים של 50 מ"ל. אם הנפח הוא מעל 1.5 מ"ל, צנטריפוגה לתלות את הכדור כמו בשלב 7.6.2. אם בדיקת התמרה בוצעה באמצעות פאג' מזורז PEG, בנוסף לשיבוט המקבל, הוסף 100-250 μL מדגימת הפאגים לתוך צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל לציפוי.
  7. לאחר שתמיסת הציפוי התאזנה ב 42-45 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות, העבר 30 מ"ל של תמיסת הציפוי לצינור עם הדגימה המתאימה; יש לפזר מיד את תערובת הציפוי ולדגום לתוך צלחת מסומנת. חוזרים על הפעולה עם פיפטה טרייה כדי שכל דגימה תהיה מצופה.
  8. אפשרו לצלחות להתמצק במשך 15-20 דקות ולאחר מכן הניחו אותן באינקובטור של 33 מעלות צלזיוס בתוספת 5% CO2. אין להפוך את הצלחות לפחות 48 שעות לאחר המזיגה.
  9. בהתאם לרקע של שיבוט הנמען, בדוק כי המושבות מופיעות בתוך agarose על לוחות הבחירה לאחר 10-21 ימים של דגירה. בחרו לפחות 5-10 מושבות שגדלות על הצלחת בנוכחות שתי האנטיביוטיקה באמצעות 5.75 פיפטה בורוסיליקט מחוברת כותנה מעוקרת (ראו טבלת חומרים) וחסנו אותן ל-1.5 מ"ל של 1x BSK עם האנטיביוטיקה(ות) המתאימה.
  10. לגדל את המושבות המחוסנות בטמפרטורה של 33 מעלות צלזיוס כמו בשלב 1.3 במשך 3-5 ימים או עד שהן מגיעות לצפיפות של כ-20-40 ספירוצ'טים לכל שדה בהגדלה של פי 200 באמצעות מיקרוסקופיית שדה כהה.
    הערה: לאחר ההקרנה (ראה שלב 8), ניתן להקפיא את הספירוצ'טים לאחסון לטווח ארוך בטמפרטורה של 80°C- על ידי ערבוב נפח שווה של תרבית עם תערובת של 60% גליצרול ו-40% 1x BSK מעוקרים על ידי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.

8. אימות של מתמרים פוטנציאליים

הערה: סנן את השיבוטים שגדלים על צלחות בנוכחות שתי אנטיביוטיקות כדי לוודא שהן מייצגות מתמרים אמיתיים ברקע הצפוי (הנמען). שיטות אלה מבוססות על הגברה, ואולי ריצוף, של אזורים ספציפיים על ידי תגובת שרשרת פולימראז. פרוטוקולים ופרקטיקות מפורטים של ביצוע PCR ב - B. burgdorferi מתוארים במקום אחר (לדוגמה עדכנית, ראו Seshu et al.37). בחר את הפריימרים המשמשים לסינון המתמרים בהתבסס על הזנים שבהם נעשה שימוש. כמה הצעות כיצד לגשת לסינון המתמרים מתוארות להלן.

  1. הכינו ב. בורגדורפרי לבדיקת PCR.
    הערה: הפרוטוקול הבא משמש לייצור ליזטים שטופים של B. burgdorferi מתאים בתרבית שגודלו כמו בשלב 7.9 לניתוח מיידי של הדנ"א על ידי PCR. שיטה זו נועדה למזער את ההפרעה של מעכבים פוטנציאליים ב- BSK אך אינה מומלצת לייצור DNA באיכות גבוהה לריצוף או אחסון. לשם כך, השתמש בפרוטוקול או בערכה לחילוץ גנום כולל (ראה טבלת חומרים). מומלץ מאוד להכין בו זמנית גם ליזטים משיבוטי ההורה (הן זנים של תורמים והן של מקבלים) כדי לכלול בכל ניתוח.
    1. העבר 500 μL מכל מתמר פוטנציאלי שנבחר ותורבית כמו בשלב 7.10 לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי.
    2. צנטריפוגה את התרביות במשך 10 דקות ב 8,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
    3. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש כל כדור ב-500 μL של TE (10 mM Tris Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA, pH 8.0). צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 8,000 x גרם בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש כל כדור ב-50 μL של מים באיכות PCR. מרתיחים את הדגימות במשך 10 דקות. תן להם להתקרר לזמן קצר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    5. עבור כל PCR, מיד להשתמש 2 μL מהחלק העליון של מדגם צנטריפוגה; להימנע מלהפריע לכדור.
  2. סנן את המתמרים הפוטנציאליים עבור הגנים הספציפיים המקודדים עמידות לאנטיביוטיקה באמצעות PCR. ראה טבלה 4 עבור הפריימרים לבדיקת סמני עמידות לאנטיביוטיקה המשמשים בדרך כלל במבחני התמרות.
    הערה: למרות שהיא נדירה מניסיוננו, מוטציה ספונטנית לאנטיביוטיקה אמינוגליקוזידית המשמשת לבחירת דנ"א הטרולוגי ב - B. burgdorferi יכולה להתרחש.
  3. סנן את המתמרים הפוטנציאליים גם באמצעות זן אחר או סמן שיבוט כדי לאשר שהרקע הוא של הנמען. כלול גם שיבוטים של התורם וגם של ההורה המקבל בניתוחים אלה. מסך עבור סמנים ספציפיים לזן באמצעות רצפים המבוססים על הזנים המשמשים ופרוטוקולי מעבדה בודדים לקביעת שלמות הזן.
  4. אם מנסים להתמר לשיבוטים ארסיים לשימוש בתוך וקטור הקרצייה או מארח היונקים או להשוואה ישירה עם שיבוט אחר, קבעו את תכולת הפלסמיד המלאה של המתמרים ושל שיבוטי האב. זה נעשה כדי להבטיח את אותה תכולת פלסמיד כמו זו של הזן ההשוואתי או נוכחות של האלמנטים הגנטיים הדרושים להתפשטות בתוך המחזור האנזוטי, כפי שמתואר במקום אחר 18,19,37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השימוש בבקטריופאג' כדי להעביר דנ"א בין זנים של B. burgdorferi הניתנים לשינוי בקלות רבה יותר או שיבוטים שהם סרבנים לאלקטרו-טרנספורמציה מייצג כלי נוסף להמשך החקירה המולקולרית של הגורמים המשפיעים על מחלת ליים. ניתן לשנות את בדיקת ההתמרה המתוארת כאן לפי הצורך כדי להקל על תנועת הדנ"א בין כל שיבוט מעניין באמצעות אנטיביוטיקה אחת או שתיים לבחירת מתמרים פוטנציאליים. ההתמרות של דנ"א נבואי ושל וקטורים הטרולוגיים E. coli/B. burgdorferi בין שיבוט זן CA-11.2A בעל מעבר גבוה לבין שיבוט זן B31 בעל מעבר גבוה ושיבוט ארסי בעל מעבר נמוך של זן 297 הודגמו בעבר28. התוצאות המוצגות להלן מדגימות את תנועת הדנ"א של הנבואה בין שני שיבוטים בעלי מעבר גבוה ועוקצניים. שיבוט התורם, c1673, הוא שיבוט זן B. burgdorferi CA-11.2A המקודד גן עמידות לקנאמיצין בדנ"א של הנבואה27,28. המקבל הוא שיבוט של זן B. burgdorferi B31, המכונה c1706, המקודד סמן התנגדות גנטמיצין על כרומוזום28. בדיקת ההתמרה בוצעה כפי שמודגם באיור 1B; הפאג'ים בעלי זירוז PEG שהתאוששו מהסופרנטנטים של c1673 שנחשפו ל-5% אתנול היו מעורבבים עם c1706 כמתואר בשלב 6 של הפרוטוקול.

לאחר ערבוב של כ-20% מהפאג'ים שהתאוששו על ידי משקעי PEG מהסופרנטנטים של c1673 שנחשפו לאתנול (קידוד עמידות לקנמיצין) עם c1706 (קידוד עמידות לגנטמיצין), התערובת צופתה בנוכחות שתי האנטיביוטיקות; יחידות יוצרות מושבה (CFUs) שמסוגלות לגדול בנוכחות קנאמיצין וגנטמיצין מעידות על אירועי טרנסדוקציה (איור 2)27,28. מספר יחידות ה- CFU מדווח כתדירות ההתמרות לכל תא מקבל ראשוני. בניסוי מייצג זה, כ-275 מתמרים התאוששו לאחר דגירה של הפאג' עם 1 × 10 7 תאים מקבלים, מה שהניב תדר התמרה של 2.75 × 10−5 יחידות יוצרות מושבה לכלתא מקבל.

לאחר ההתאוששות של המתמרים הפוטנציאליים, בוצעה הגברה PCR של הגנים המקודדים עמידות לקנאמיצין וגנטמיצין ב-10 מהשיבוטים, כאשר שתי דגימות מייצגות הוצגו באיור 3. ניתן להגביר את הגן העמיד לקנאמיצין מהתורם (c1673) ומהמתמרים הפוטנציאליים אך לא מהמקבלים (c1706). באופן דומה, ניתן להגביר את הגן המתנגד לגנטמיצין מהמקבל (c1706) ומהמתמרים הפוטנציאליים, אך לא מהתורם. לפיכך, השיבוטים המשוחזרים מקודדים באופן ספציפי הן גנים של עמידות לאנטיביוטיקה והן מייצגים אירועי התמרת, ולא מוטנטים ספונטניים.

כדי להדגים כי קלטת התנגדות הקנאמיצין הותמרה על ידי φBB-1 מהתורם למקבל, הרקע של המתמרים נקבע באמצעות סמנים ספציפיים לזן, כפי שתואר קודםלכן 28. זה חשוב במיוחד אם המתמרים נוצרו על ידי שיטת התרבות המשותפת של טרנסדוקציה. בקצרה, פריימרים28 שפורסמו בעבר שימשו להגברת אזורים ספציפיים של פלסמידים בורליאליים שונים, ויצרו פרופיל שניתן להשתמש בו כדי לזהות את הרקע של השיבוט (איור 4). השיבוט c1673 ברקע CA-11.2A מקודד אמפליקונים ספציפיים 4, 5 ו-6, ואילו c1706, בעל רקע B31 בעל מעבר גבוה, אינו עושה זאת. באופן דומה, שני המתמרים חסרים אמפליקונים 4, 5 ו-6; לפיכך, שיבוטים אלה הם בעלי רקע C1706 ורכשו את הגן עמידות לקנאמיצין מ- C1673.

רכיב 1x BSK (לתרבות) (1 L) 1.5x BSK (לציפוי) (1 ליטר)
אלבומין בסרום בקר (שבר V) 35 גרם 52.5 גרם
10x CMRL-1066 (ללא L-גלוטמין) 8 גרם 12 גרם
ניאופטון 4 גר' 6 גרם
שמרים 1.6 גרם 2.4 גרם
האפס 4.8 גרם 7.2 גרם
גלוקוז 4 גר' 6 גרם
סודיום ציטראט 0.56 גרם 0.84 גרם
סודיום פירובט 0.64 גרם 0.96 גרם
N-אצטיל-גלוקוזאמין 0.32 גרם 0.48 גרם
סודיום ביקרבונט 1.76 גרם 2.64 גרם
סרום ארנבת רגיל מומת בחום (INRS) 66 מ"ל 99 מ"ל

טבלה 1: BSK לטיפוח ובחירה של שיבוטים של B. burgdorferi למבחני התמרות. הניסוח וההכנה של 1x BSK לגידול B. burgdorferi ו-1.5x BSK לבחירה בפאזה מוצקה של שיבוטים של B. burgdorferi המתוארים כאן מבוססים על סמואלס15. ניסוחים שונים של BSK (או MKP)37,40,41 התומכים בצמיחה של B. burgdorferi עדיין לא נבדקו באמצעות מבחן ההתמרות.

אנטיביוטי ריכוז מניות ריכוז סופי בתרבות של Bb
קנאמיצין 100 mg.mL-1 (במים) 200-400 μ g.mL-1
גנטמיצין 50 mg.mL-1 (במים) 50 μ g.mL-1
סטרפטומיצין 50 mg.mL-1 (במים) 50 μ g.mL-1
אריתרומיצין 2 mg.mL-1 (ב-EtOH) 0.06 μ g.mL-1

טבלה 2: אנטיביוטיקה וריכוזים פוטנציאליים שישמשו לבחירה ולתחזוקה של דנ"א הטרולוגי ב- B. burgdorferi. רשימה זו מבוססת על סמנים עמידים לאנטיביוטיקה הנפוצים בשימוש בבורליה בורגדורפרי42,43,44,45. קנאמיצין, גנטמיצין וסטרפטומיצין מוכנים במים, מעוקרים בסינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר, ומאוחסנים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. אריתרומיצין מוכן ב 95% אתנול ומאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס. מעבדות רבות מדווחות על שימוש מוצלח בקנאמיצין לבחירה בריכוז של 200 מיקרוגרם·mL−1; כאשר משתמשים הן בגנטמיצין והן בקנאמיצין לבחירה במבחני טרנסדוקציה, נעשה שימוש ב-400 מיקרוגרם·mL−1 קנאמיצין. הגן aadA מקנה עמידות הן לסטרפטומיצין והן לספקטינומיצין44. לבחירת מבנים המכילים את הגן aadA ב- E. coli, 100 מיקרוגרם·mL−1 ספקטינומיצין משמש. שים לב כי אמינוגליקוזידים (kanamycin, gentamicin, ו streptomycin) אינם רלוונטיים מבחינה קלינית לטיפול במחלת ליים; עם זאת, אריתרומיצין משמש קלינית במצבים מסוימים46. למרות שדווח על עמידות טבעית לאנטיביוטיקה זו ב- B. burgdorferi 47, סמן התנגדות זה לא שימש עד כה במבחני ההתמרה שדווחו כאן.

סוכן משרה ריכוז מלאי (ממס) ריכוז סופי במדגם
אתנול 100% (אין) 5%
מיטומיצין C 2 mg.mL-1 (מים) 20 μ g.mL-1
1-מתיל-3-ניטרוסו-ניטרוגואנידין (MNNG) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 μ g.mL-1

טבלה 3: חומרים וריכוזים פוטנציאליים המשמשים להשראת φBB-1 מ- B. burgdorferi. N-מתיל-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), מיטומיצין C ואתנול, כמו גם מתנול ואיזופרופנול, הוכחו כולם כגורמים ל-φBB-1 מעל הרמות המרכיבות בזן B. burgdorferi CA.11-2A25,26,28. MNNG הוא חשוד כמסרטן ומפגע סביבתי; יש להשתמש בזהירות, להתמוסס בממס דליק ולהישרף לסילוק. מיטומיצין C הוא חשוד כמסרטן ומפגע סביבתי פוטנציאלי; יש להשתמש בזהירות מתחת למכסה אדים כימי ולהשליך כראוי. בעוד שנתונים שפורסמו מצביעים על כך ש- MNNG הוא הסוכן היעיל ביותר לגרימת φBB-126, הסכנות בעבודה עם כימיקל זה והקשיים ברכישתו הופכים את השימוש בו למסובך48, במיוחד עם סטודנטים. אינדוקציה עם אתנול טובה יותר באופן עקבי מאשר עם מתנול או איזופרופנול28 והייתה בשימוש הנפוץ ביותר בבדיקת ההתמרות.

שם הגן או ייעודו עמידות לאנטיביוטיקה הפניה שם פריימר רצף פריימרים (5 ́ עד 3 ́)
kanR מ- Tn903 קנאמיצין 42 kanR 382F CGGTTGCATTCGATTCCTGT
kanR 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
aacC1 גנטמיצין 43 aacC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
aacC1 497R TCTTCCCGTATGCCCAACTT
aadA סטרפטומיצין 44 aadA 273F TGTGCACGACGACATCATTC
aadA 594R TACTGCGCTGTACCAAATGC

טבלה 4: פריימרים המשמשים לניתוח ראשוני של התמרה של סמני עמידות לאנטיביוטיקה. הפריימרים המצוינים כאן מיועדים לזיהוי גנים עמידים לאנטיביוטיקה המשמשים בדרך כלל במבחני התמרת. פריימרים אלה משמשים ב-PCR כאשר התנאים הבאים חוזרים על עצמם במשך 28 מחזורים: דנטורציה ב-92 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול פריימר ב-56 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, והרחבת דנ"א מטרה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות.

Figure 1
איור 1: בדיקת התמרה לניטור התנועה בתיווך פאגים (טרנסדוקציה) של דנ"א. בדיקת ההתמרה יכולה להתבצע באמצעות (A) שיטת התרבית המשותפת או (B) פאג'ים שהתאוששו מתרבית על ידי משקעי PEG. עבור שיטת התרבית המשותפת (A), שיבוט B. burgdorferi המושרה (התורם) המקודד גן עמידות לאנטיביוטיקה על הדנ"א כדי להיות מומר על ידי φBB-1 (עיגול ירוק) הוא תרבית עם שיבוט B. burgdorferi שאינו מושרה (המקבל), אשר מקודד גן עמידות לאנטיביוטיקה שנייה על הכרומוזום או אלמנט גנטי יציב אחר (עיגול אדום). שיטה זו דורשת שימוש בשני סמנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה (בדוגמה זו, גנים המקודדים עמידות לקנאמיצין וגנטמיצין). כדי להשתמש בפאג' המטוהר במבחן ההתמרה (B), חלקיקי פאגים שהתאוששו על ידי משקעי PEG של הסופרנטנט מהתורם המושרה מעורבבים עם המקבל. בעוד שהוצגה כאן באמצעות שתי אנטיביוטיקות שונות, ניתן לבצע שיטה זו תוך שימוש בסמן עמידות לאנטיביוטיקה אחד בלבד המקודד בדנ"א של נבואת φBB-1, כפי שהוכח בעבר27. לאחר הדגירה, מתמרים נבחרים על ידי ציפוי פאזה מוצקה בנוכחות שתי האנטיביוטיקה; אם נעשה שימוש בשיטה B עם סמן עמידות לאנטיביוטיקה אחד בלבד המקודד על הדנ"א של הפאגים, הבחירה נעשית באמצעות אנטיביוטיקה זו בלבד במהלך ציפוי פאזה מוצקה. המתמרים יכילו גם סמני עמידות לאנטיביוטיקה וגם יהיו בעלי הרקע של המקבל. נתון זה נדפס מחדש מתוך Eggers et al.28 באישור הוצאת אוניברסיטת אוקספורד. בניסוי המודל, c1673 ו- c1650 מייצגים שני שיבוטים שונים של CA-11.2A; c1673 נושא את ה-φBB-1 המקודד עמידות לקנאמיצין, ו-c1650 מקודד סמן התנגדות גנטמיצין במיקום שאינו פאג'ים28. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: יחידות יוצרות מושבה שנבחרו על-ידי ציפוי פאזה מוצקה לאחר בדיקת הטרנסדוקציה. מושבות שגדלות בנוכחות שתי האנטיביוטיקות בעקבות ערבוב של הפאג' מ-c1673 עם c1706 מייצגות מתמרים פוטנציאליים. אף מושבה לא צריכה לגדול על לוחות בקרה המכילים את שיבוטי התורם והמקבל הבודדים או דגימה של הכנת פאגים (לא מוצגת). ניתן לקבוע את המספר המינימלי של פאגים פרודוקטיביים בדגימה המקורית על ידי ספירת מספר יחידות ה- CFU והכפלתו בגורם הדילול. במקרה זה, 20% מדגימת הפאג'ים שנלקחו מתרבית של 15 מ"ל של התורם הניבו כ-275 מושבות. לפיכך, הריכוז המקורי של פאגים פרודוקטיביים שהתאוששו על ידי משקעי PEG היה ≥1.3 × 103 virions. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הגברת PCR של הגנים המעניקים עמידות לקנאמיצין ועמידות לגנטמיצין משני מתמרים פוטנציאליים. PCR באמצעות פריימרים עבור הגנים עמידות לקנאמיצין וגנטמיצין (טבלה 4) בוצע כדי לסנן את הליזטים שנוצרו משתי מושבות (מתמר 1 ומתמר 2). מושבות אלה נבחרו על צלחת המכילה גם קנאמיצין וגם גנטמיצין בעקבות ערבוב של c1673 (תורם) ו- c1706 (מקבל). האמפליקונים נפתרו על ג'ל אגרוז 1% שעבר אלקטרופורזה במשך 60 דקות ב-120 וולט בחיץ טריס-אצטט-EDTA (TAE) אחד והוכתם ב-0.5 מיקרוגרם·mL−1 אתידיום ברומיד. המספרים מציינים סמני גודל בזוגות קילו-בסיסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: אישור הרקע של המתמרים. אזורים של אלמנטים גנטיים ספציפיים הוגברו מ- c1673, c1706, ושני המתמרים, כפי שתואר קודם לכן28, כדי לאשר שהרקע של המתמרים היה זה של השיבוט המקבל, c1706. האזורים שנבחרו התבססו על רצפי הגנים על פלסמידים ליניאריים או מעגליים ספציפיים (lp או cp, בהתאמה) בתוך הזן מסוג B. burgdorferi , B316. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) ו- 8 = גן fla (כרומוזום). האמפליקונים נפתרו על אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% במשך 60 דקות ב-120 וולט בחיץ TAE 1x והוכתמו ב-0.5 מיקרוגרם·mL−1 אתידיום ברומיד. המספרים מציינים סמני גודל בזוגות קילו-בסיסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השימוש בהתמרה יכול לייצג שיטה אחת להתגבר לפחות על חלק מהמחסומים הביולוגיים והטכניים הקשורים לאלקטרו-טרנספורמציה של B. burgdorferi 1,4,13,37. במערכות רבות, בקטריופאג' יכול להעביר דנ"א מארח (שאינו נבוא) בין תאי חיידקים על ידי התמרה כללית או מיוחדת של 22,23,24,49,50. בהתמרה מיוחדת, כמה גנים מארחים ארוזים תמיד בתוך קפסיד הפאגים יחד עם הדנ"א של הנבואה49,50. לדוגמה, φBB-1 תמיד אורז את אותם חלקים של cp32 שהם חיידקים במקור, מכיוון שהם קשורים קשר בל יינתק על הפלסמיד לחלקים של cp32 שהם הגנום של הפאגים. בהתמרה כללית, מאמינים שמנגנון האריזה של הבקטריופאג' נצמד לרצפים הומולוגיים שאינם פאג'ים ואורז "בטעות" דנ"א מארח אקראי במקום דנ"א של פאגים; פיסות הדנ"א האלה מסוגלות להיות מוכנסות לתא אחר49,50. מעט מאוד ידוע עדיין על טרנסדוקציה כללית על ידי פאג' ב- B. burgdorferi; עם זאת, במערכות חיידקים המאופיינות טוב יותר, עד 1% מהבקטריופאג' המשתחרר מתא יכול להכיל גנים חיידקיים אקראיים במקום דנ"אפאג 51. עד כה, לא נצפו סמנים כרומוזומליים המתמרים בין שיבוטים שונים של B. burgdorferi, אך ההדגמה הקודמת לכך שגם cp32s וגם וקטורים קטנים של מעבורת הטרולוגית יכולים להיות ארוזים ומתמרים על ידי φBB-1 מצביעה על כך שפאג זה יכול להשתתף הן בהתמרה מיוחדת והן בהתמרה כללית28. לכן, מוצע מקרה שימוש להתמרה במעבדה, שבו אלקטרוטרנספורמציה המייצרת מוטציה כרומוזומלית עדיין נעשית על רקע העניין; עם זאת, הכנסת וקטורים של מעבורת להשלמה בטרנס או למחקרי הבעה באמצעות מבנים מדווחים לזנים סרבנים לאלקטרו-טרנספורמציה יכולה להיעשות באמצעות התמרה בין שיבוט מעבר גבוה יותר הניתן לשינוי לבין זנים פחות ניתנים לשינוי. אם מחקרים עתידיים יוכיחו את היכולת של φBB-1 גם לארוז ולהזיז לוקים כרומוזומליים, אז השיטות המתוארות כאן עשויות גם להיות שימושיות בהעברת דנ"א כרומוזומלי מותאם בין זנים וזנים הניתנים לשינוי בקלות רבה יותר וזנים שאחרת קשה לבצע אלקטרו-טרנספורמציה. הפלסמידים דמויי cp32 נפוצים בקרב כל זני B. burgdorferi והרוב המכריע של מחלות ליים האחרות ספירוצ'טים52,53; יש גם עדויות להומולוגים במינים אחרים של בורליה, כולל B. mayonii, B. miyamotoi, ואלה הגורמים לקדחת חוזרת54,55,56. עדיין לא ידוע אם ההומולוגים במינים אחרים של בורליה הם נבואה, אך אם כן, אז התמרה יכולה להיות גם כלי לניתוח מולקולרי של מינים אלה, שחלקם עדיין לא עברו מניפולציה גנטית מוצלחת.

שתי שיטות להתמרת דנ"א הוצגו כאן: שילוב של שיבוטים של התורם והמקבל יחד לפני הבחירה (איור 1A) או זירוז PEG מהתורם וערבוב רק של הפאג הזה עם המקבל (איור 1B). מספר אירועי ההתמרה לכל תא מקבל גבוה יותר בעקבות תרבית משותפת מאשר שימוש בפאג28 עם זרזים PEG, אך תרבית משותפת דורשת שגם התורם וגם המקבל יישאו סמנים שונים של עמידות לאנטיביוטיקה ושהרקע של כל מתמרים פוטנציאליים ייבדק בקפידה. מכיוון שנבואת φBB-1 נמצאת בכל מקום בקרב הבורליה52,53, קיים סיכוי תיאורטי שכאשר מערבבים שיבוטים שגדלים באופן פעיל, סמן עמידות לאנטיביוטיקה או דנ"א הטרולוגי אחר יכול לעבור מהמקבל לתורם (ולא מהתורם למקבל, כמתוכנן). שימוש בפאג' עם זרזים של PEG בבדיקת ההתמרות מבטל אפשרות זו, מכיוון שהתורם אינו נמצא בתערובת הפאגים/מקבלים. בנוסף, משקעי PEG של הפאג' נדרשים אם הפאג' ותכולתו הגנומית ישמשו הן לניתוח (כלומר, ניתוח מבני, כימות, זיהוי חומר ארוז וכו') והן להתמרת. למרות היתרונות הללו, לשימוש בפאג'ים עם זרזים מסוג PEG יש חסרונות פוטנציאליים; בנוסף לכך שהם לא מניבים כל כך הרבה מתמרים כמו בתרבית משותפת, משקעי PEG יכולים לגזול זמן רב, עלולים להוביל לאובדן פאגים משמעותי, ולגרום לדגימות שיש בהן מזהמים שיכולים להפריע ליישומים במורד הזרם57,58.

עד כה הודגמה טרנסדוקציה משלושה זנים של B. burgdorferi: CA-11.2A, שיבוט B31 בעל מעבר גבוה, ושיבוט297 בעל מעבר נמוך 28. מבין שלושת אלה, זן B. burgdorferi CA-11.2A מייצר את הכמות הגבוהה ביותר של פאגים לאחר אינדוקציה25,26,28; עם זאת, גם לאחר האינדוקציה, מספר הפאגים שהתאוששו מ-B. burgdorferi עדיין נמוך בסדרי גודל מהפאג' שהתאושש במערכות בעלות מאפיינים טובים יותר, כמו זה של קוליפג' λ25,28,59. לפיכך, בעיה אחת שעשויה להתעורר בשימוש בהתמרה באמצעות תרבית משותפת או ערבוב של פאגים בעקבות משקעי PEG היא המספר הקטן של בקטריופאג'ים המשתחררים מ- B. burgdorferi, גם כאשר הם נחשפים לחומרים מעוררים. בנוסף, השונות בין אצווה לאצווה בייצור פאגים היא משמעותית, גם כאשר נראה שכל התנאים, רכיבי המדיה והשיטות עקביים בין הניסויים. מסיבה זו, חשוב לקבוע שלפחות מספר מינימלי של פאגים מיוצרים משיבוט נתון או בתנאי נתון. בדיקות מסורתיות כדי לקבוע את מספר הפאגים בדגימה דורשות ערבוב כמות קטנה של דגימה המכילה פאג עם פונדקאי חיידקי מתירני שבו הבקטריופאג' הוא ליטי; מספר חלקיקי הפאגים היצרניים במדגם נקבע על ידי מספר האירועים הליטיים המתרחשים ברקע זה, וכתוצאה מכך היווצרות פלאקים על מדשאה של החיידק60,61. מספר הפאגים מדווח כיחידות יוצרות פלאק (PFUs)61. כימות מספר φBB-1 היצרני המשתחררים לאחר אינדוקציה באמצעות בדיקת רובד טרשתי מופרע על ידי חוסר היכולת לגדל בורליה בורגדורפרי במדשאה צפופה וחוסר הבנה נוכחי של המנגנונים השולטים במעבר בין מחזורי השכפול הליזוגניים והליטיים של φBB-1. ואכן, בעוד שדיווחים אנקדוטליים על תרבויות ליזה של B. burgdorferi הם רבים, עד כה לא פורסמו מחקרים הקושרים את התצפית של תזה של תרבות שלמה עם ייצור של פאגים. מניסיון, נראה כי רק מספר קטן של תאים בתרבית נתונה מייצרים פאג'ים באופן ספונטני, ככל הנראה על ידי תזה, וניתן להגדיל את הייצור הזה רק באופן צנוע עם חשיפה לחומרים הגורמים הידועים25,28,62. לפיכך, בדיקת רובד אינה אפשרית כיום לכימות φBB-1 מ- B. burgdorferi.

כדי לכמת את מספר הפאגים היצרניים המיוצרים בעקבות האינדוקציה של B. burgdorferi, ניתן לבצע את בדיקת ההתמרה כמתואר בדו"ח זה באמצעות שיבוט מתירני של B. burgdorferi עם אנטיביוטיקה שונה מזו הנארזת על ידי הבקטריופאג'. בדיקה זו יוצרת מושבות הנובעות מהתמרת, כאשר כל מושבה מייצגת פאג' מאושר. לפיכך, ניתן לדווח על המספר המינימלי של פאגים בדגימה כ-CFU ולא כ-PFU. סביר להניח שמספר זה נמוך (בהרבה) מהמספר הכולל של הפאגים המיוצרים בפועל בשל חוסר היעילות הטמון בהתאוששות של פאגים על ידי משקעי PEG (אם נעשה בהם שימוש), הצמדה והזרקה של דנ"א על ידי פאגים, וציפוי פאזה מוצקה של B. burgdorferi.

שיטה אפשרית אחת לקביעת הכמות הכוללת של דנ"א נבואה בתוך סופרנטנטים של תרביות B. burgdorferi היא PCR כמותי (qPCR), אך פרוטוקולי qPCR עבור דנ"א cp32 מ- B. burgdorferi אינם מיוצגים היטב בספרות, ו- qPCR עדיין אינה מתודולוגיה בשימוש נרחב למטרה זו. כדי לקבוע באופן איכותי שיש לפחות רמה מתונה של דנ"א פאג'ים בדגימה נתונה, ניתן להפיק את הדנ"א הכולל מהסופרנטנטים המואצים PEG של תרביות B. burgdorferi לאחר טיפול ב- DNase לפני המיצוי; הדנ"א של הפאגים יהיה מוגן על ידי קפסיד פאג25 שלם. הדנ"א המשוחזר נפתר לאחר מכן בג'ל אגרוז וממחיש אותו עם כתם דנ"א; פרוטוקול זה מניב בדרך כלל פס קלוש של 30 קילובייט המייצג את הדנ"א הליניארי הארוז בתוך ראש הפאג'ים25. בהתבסס על רגישות הכתם ועוצמת רצועת הדנ"א של הפאגים בגודל הנכון ביחס לסמן, ניתן לקבוע את המספר המשוער של הפאגים הכוללים שנמצאו25,27. מתאם חיובי חזק של רמות הדנ"א הכולל של פאגים שהתאוששו מהסופר-נטנט עם מספר המתמרים שהתאוששו לאחר בדיקת ההתמרות הוכח בעבר28.

הבחירה בזנים התורמים והמקבלים היא קריטית להצלחת השימוש בהתמרה ככלי מולקולרי. ההבנה שלנו של cp32s כנבואה של φBB-1 מסובכת הן על ידי התפשטות של cp32s במחלת ליים spirochetes52,53 והן על ידי העובדה כי תא B. burgdorferi בודד יכול להכיל הומולוגים מרובים של פלסמידים אלה. נראה כי כל ה-cp32s בתוך תא ארוזים בתוך ראשי פאגים בזנים המייצרים פאגים שנבדקו27. עם זאת, לא ברור אם כל זני B. burgdorferi המכילים cp32s יכולים לייצר בקטריופאג', ויש לבדוק את יכולתם של זנים אלה לפני השימוש. באופן דומה, לא ידוע דבר על הקולטנים המאפשרים לזן מסוים להתמר על ידי φBB-1, אם כי הימצאותו של פלסמיד הנבואה בכל הסוג מרמזת על סבירות גבוהה שניתן להתמר זן מסוים. כפי שניתן להסיק מנוכחותם של פלסמידים מרובים מסוג cp32 בתוך תא B. burgdorferi בודד, לא נראה שיש חסינות פאג'ים63 המוענקת על ידי נוכחות של נבואה קיימת; זנים CA.11-2A, B31 ו- 297 שימשו במבחני התמרה ושניהם מייצרים וניתן לתמר אותם על ידי φBB-127,28. בעוד שדיווחים קודמים הצביעו על כך שהתמרה התאפשרה רק למספר מוגבל של זנים באמצעות פאג27 עם זרזים PEG, ייתכן שהדבר נבע מקשיים טכניים בשיטה זו, שכן כל הזנים שנבדקו עד כה היו ניתנים לתמרון בהצלחה בשיטת התרבית המשותפת28.

כאשר מתכננים ניסוי לשימוש במבחן ההתמרת, השיקולים העיקריים לבחירת הזן התורם צריכים להיות הרקע הגנטי, יכולתו להשתנות בקלות באמצעות אלקטרופורציה, ויכולתו לייצר פאגים. אף על פי שלא נעשה סקר ממצה של שיבוטים בעלי מעבר גבוה של כל זן, הזן CA-11.2A מייצר פאגים ברמות הניתנות לזיהוי גם בהיעדר אינדוקציה. באופן דומה, שיבוטים בעלי מעבר גבוה של B31, זן B. burgdorferi הראשון שרצף לחלוטין5 וזן נפוץ במחקרים מולקולריים, מייצרים גם הם כמויות ניתנות לזיהוי של φBB-1 ובדרך כלל ניתנים לשינוי גבוה 1,4,25,27,37,64 . אם החקירות דורשות זנים אחרים, מומלץ כי שיבוטים בעלי מעבר גבוה של זן זה ייבדקו תחילה ליכולת הטרנספורמציה שלהם על ידי החדרת פלסמיד המכיל סמן עמידות לאנטיביוטיקה באמצעות אלקטרופורציה ולאחר מכן יוערכו על יכולתם להתמר על ידי ביצוע בדיקת טרנסדוקציה עם מושתל מתירני, כגון CA-11.2A או B31, המקודדים סמן עמידות לאנטיביוטיקה אחר. באופן דומה, כדי להבטיח שזן או שיבוט של מושתל יהיה מתירני להתמרת, ניתן לערבב זן המייצר פאגים, כגון CA-11.2A הנושא עמידות לקידוד נבואה לאנטיביוטיקה, עם השיבוט המעניין כדי להבטיח שתתבצע התמרת.

נותר להבין הרבה על הביולוגיה המולקולרית של φBB-1 ותפקידו ב-HGT בתוך B. burgdorferi, במיוחד כשהוא עובר את המחזור האנזוטי. עם זאת, היכולת של φBB-1 לתמר באופן ניסיוני הן פאגים והן דנ"א הטרולוגי בתוך המעבדה, מהווה הזדמנות להוסיף כלי נוסף לניתוח מולקולרי של B. burgdorferi ותפקידו בפתוגנזה של מחלת ליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחבר אין מה לחשוף.

Acknowledgments

המחבר מבקש להודות לשאונה ריד, ד. סקוט סמואלס ופטריק סקור על הדיון המועיל שלהם ולווריון (פאם) צ'ונוואראוונג על עזרתם הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המחלקה למדעים ביו-רפואיים ומענקי מחקר מהפקולטה לכריסטיאן ה. אגרס מבית הספר למדעי הבריאות באוניברסיטת קוויניפיאק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 187 בורליה בורגדורפרי בקטריופאג' העברת גנים אופקית טרנסדוקציה
מניפולציה גנטית בתיווך פאגים של מחלת ליים ספירוכטה <em>בורליה בורגדורפרי</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter