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Immunology and Infection

Manipolazione genetica mediata dai fagi della malattia di Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64408
Automatic Translation
1
1Department of Biomedical Sciences, Quinnipiac University

Summary

La capacità dei batteriofagi di spostare il DNA tra le cellule batteriche li rende strumenti efficaci per la manipolazione genetica dei loro ospiti batterici. Presentata qui è una metodologia per indurre, recuperare e utilizzare φBB-1, un batteriofago di Borrelia burgdorferi, per trasdurre DNA eterologo tra diversi ceppi della spirocheta della malattia di Lyme.

Abstract

L'introduzione di DNA estraneo nella spirocheta Borrelia burgdorferi è stata ottenuta quasi esclusivamente mediante trasformazione mediante elettroporazione. Questo processo ha efficienze notevolmente inferiori nella spirocheta della malattia di Lyme rispetto ad altri batteri Gram-negativi meglio caratterizzati. Il tasso di successo della trasformazione dipende fortemente dall'avere quantità concentrate di DNA di alta qualità da background specifici ed è soggetto a una significativa variabilità da ceppo a ceppo. Mezzi alternativi per introdurre DNA estraneo (cioè vettori navetta, reporter fluorescenti e marcatori di resistenza agli antibiotici) in B. burgdorferi potrebbero essere un'importante aggiunta all'armamentario di strumenti utili per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. I batteriofagi sono stati ben riconosciuti come meccanismi naturali per il movimento del DNA tra i batteri in un processo chiamato trasduzione. In questo studio, è stato sviluppato un metodo per utilizzare l'onnipresente fago borreliale φBB-1 per trasdurre il DNA tra cellule di B. burgdorferi dello stesso background genetico e di diversi background genetici. Il DNA trasdotto include sia DNA borreliale che DNA eterologo sotto forma di piccoli vettori navetta. Questa dimostrazione suggerisce un potenziale uso della trasduzione mediata dai fagi come complemento all'elettroporazione per la manipolazione genetica della spirocheta della malattia di Lyme. Questo rapporto descrive i metodi per l'induzione e la purificazione del fago φBB-1 da B. burgdorferi, l'uso di questo fago nei saggi di trasduzione e la selezione e lo screening di potenziali trasduttori.

Introduction

Lo sviluppo di strumenti per la manipolazione genetica del batterio spirochetale Borrelia burgdorferi ha aggiunto un valore incommensurabile alla comprensione della natura della malattia di Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi ha un genoma insolitamente complesso composto da un piccolo cromosoma lineare e plasmidi sia lineari che circolari 5,6. La perdita spontanea di plasmidi, il riarrangiamento intragenico (spostamento di geni da un plasmide all'altro all'interno dello stesso organismo) e il trasferimento genico orizzontale (HGT, il movimento del DNA tra due organismi) hanno dato origine a una quantità vertiginosa di eterogeneità genetica tra B. burgdorferi (per un esempio, vedi Schutzer et al.7). I genotipi risultanti (o "ceppi") sono tutti membri della stessa specie, ma hanno differenze genetiche che influenzano la loro capacità di trasmettere e infettare diversi ospiti di mammiferi 8,9,10,11. In questa relazione, il termine "ceppo" sarà utilizzato per riferirsi a B. burgdorferi con un particolare background genetico di derivazione naturale; Il termine "clone" sarà utilizzato per riferirsi a un ceppo che è stato geneticamente modificato per uno scopo particolare o come risultato di manipolazione sperimentale.

La cassetta degli attrezzi molecolare disponibile per l'uso in B. burgdorferi include marcatori selezionabili, segnalatori genici, vettori shuttle, mutagenesi dei trasposoni, promotori inducibili e marcatori controselezionabili (per una revisione, vedi Drektrah e Samuels12). L'uso efficace di queste metodologie richiede l'introduzione artificiale di DNA eterologo (estraneo) in un ceppo di interesse di B. burgdorferi. In B. burgdorferi, l'introduzione del DNA eterologo è ottenuta quasi esclusivamente tramite elettroporazione, un metodo che utilizza un impulso di elettricità per rendere una membrana batterica transitoriamente permeabile a piccoli pezzi di DNA introdotti nei mezzi1. La maggior parte delle cellule (stimate in ≥99,5%) vengono uccise dall'impulso, ma le cellule rimanenti hanno un'alta frequenza di trattenere il DNA eterologo13. Sebbene sia considerato uno dei metodi più efficienti per introdurre il DNA nei batteri, la frequenza di elettroporazione in B. burgdorferi è molto bassa (che va da 1 trasformante in 5 × 104 a 5 × 106 cellule)13. Gli ostacoli al raggiungimento di frequenze di trasformazione più elevate sembrano essere sia tecnici che biologici. Gli ostacoli tecnici al successo dell'elettroporazione di B. burgdorferi includono sia la quantità di DNA (>10 μg) necessaria sia il requisito che le spirochete siano esattamente nella corretta fase di crescita (mid-log, tra 2 × 10 7 cellule·mL−1 e 7 × 107 cellule·mL−1) durante la preparazione di cellule elettrocompetenti12,13. Queste barriere tecniche, tuttavia, possono essere più facili da superare rispetto alle barriere biologiche.

I ricercatori della malattia di Lyme riconoscono che i cloni di B. burgdorferi possono essere divisi in due grandi categorie rispetto alla loro capacità di essere manipolati geneticamente13,14. Gli isolati adattati in laboratorio ad alto passaggio sono spesso facilmente trasformabili, ma di solito hanno perso i plasmidi essenziali per l'infettività, si comportano in modo fisiologicamente aberrante e non sono in grado di infettare un ospite di mammifero o persistere all'interno di un vettore zecca12,13. Mentre questi cloni sono stati utili per sezionare la biologia molecolare della spirocheta all'interno del laboratorio, sono di scarso valore per lo studio della spirocheta nel contesto biologico del ciclo enzootico. Gli isolati infettivi a basso passaggio, invece, si comportano in maniera fisiologica riflettente uno stato infettivo e possono completare il ciclo infettivo ma di solito sono recalcitranti all'introduzione di DNA eterologo e sono, quindi, difficili da manipolare per lo studio12,13. La difficoltà nel trasformare gli isolati a basso passaggio è legata ad almeno due diversi fattori: (i) gli isolati a basso passaggio spesso si raggruppano strettamente, in particolare nelle condizioni di alta densità richieste per l'elettroporazione, bloccando così molte cellule dalla piena applicazione della carica elettrica o dall'accesso al DNA nei mezzi13,15; e (ii) B. burgdorferi codifica almeno due diversi sistemi di modificazione della restrizione trasmessa da plasmidi (R-M) che possono essere persi negli isolati ad alto passaggio14,16. I sistemi R-M si sono evoluti per consentire ai batteri di riconoscere ed eliminare il DNA estraneo17. Infatti, diversi studi su B. burgdorferi hanno dimostrato che l'efficienza di trasformazione aumenta quando la fonte del DNA è B. burgdorferi piuttosto che Escherichia coli13,16. Sfortunatamente, acquisire l'alta concentrazione di DNA necessaria per l'elettroporazione da B. burgdorferi è una prospettiva costosa e dispendiosa in termini di tempo. Un'altra potenziale preoccupazione quando si elettroporano e si selezionano isolati a basso passaggio è che il processo sembra favorire i trasformanti che hanno perso il plasmide associato alla virulenza critica, lp2514,18,19; pertanto, l'atto stesso di manipolare geneticamente isolati di B. burgdorferi a basso passaggio tramite elettroporazione può selezionare cloni che non sono adatti per analisi biologicamente rilevanti all'interno del ciclo enzootico20. Dati questi problemi, un sistema in cui il DNA eterologo potrebbe essere elettrotrasformato in cloni di B. burgdorferi ad alto passaggio e quindi trasferito in isolati infettivi a basso passaggio con un metodo diverso dall'elettroporazione potrebbe essere una gradita aggiunta alla crescente collezione di strumenti molecolari disponibili per l'uso nella spirocheta della malattia di Lyme.

Oltre alla trasformazione (l'assorbimento del DNA nudo), ci sono altri due meccanismi attraverso i quali i batteri assumono regolarmente DNA eterologo: la coniugazione, che è lo scambio di DNA tra batteri in contatto fisico diretto tra loro, e la trasduzione, che è lo scambio di DNA mediato da un batteriofago21. Infatti, la capacità del batteriofago di mediare l'HGT è stata utilizzata come strumento sperimentale per sezionare i processi molecolari all'interno di un certo numero di sistemi batterici22,23,24. B. burgdorferi non è naturalmente competente per l'assorbimento del DNA nudo, e ci sono poche prove che B. burgdorferi codifichi l'apparato necessario per promuovere una coniugazione di successo. Precedenti studi hanno descritto, tuttavia, l'identificazione e la caratterizzazione preliminare di φBB-1, un batteriofago temperato di B. burgdorferi25,26,27,28. φBB-1 racchiude una famiglia di plasmidi da 30 kb trovati in B. burgdorferi25; I membri di questa famiglia sono stati designati CP32. Coerentemente con il ruolo di φBB-1 nella partecipazione all'HGT tra i ceppi di B. burgdorferi, Stevenson et al. hanno riportato un cp32 identico trovato in due ceppi con cp32 altrimenti disparati, suggerendo una recente condivisione di questo cp32 tra questi due ceppi, probabilmente tramite trasduzione29. Ci sono anche prove di una significativa ricombinazione tramite HGT tra i cp32 in un genoma 30,31,32,33 altrimenti relativamente stabile. Infine, la capacità di φBB-1 di trasdurre sia cp32s che DNA vettoriale shuttle eterologo tra cellule dello stesso ceppo e tra cellule di due ceppi diversi è stata dimostrata in precedenza27,28. Alla luce di questi risultati, φBB-1 è stato proposto come un altro strumento da sviluppare per la dissezione della biologia molecolare di B. burgdorferi.

L'obiettivo di questo rapporto è quello di dettagliare un metodo per indurre e purificare il fago φBB-1 da B. burgdorferi, oltre a fornire un protocollo per eseguire un saggio di trasduzione tra cloni di B. burgdorferi e selezionare e selezionare potenziali trasduttori.

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Protocol

Tutti gli esperimenti che utilizzano DNA ricombinante e organismi BSL-2 sono stati esaminati e approvati dal Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'Università di Quinnipiac.

1. Preparazione della coltura di B. burgdorferi per la produzione di φBB-1

  1. Preparare Barbour-Stoenner-Kelly medium integrato con siero di coniglio normale inattivato dal calore (BSK)15 al 6,6%. Per 1 L di 1x BSK, unire i componenti elencati nella Tabella 1 in 900 mL di acqua, regolare il pH a 7,6 utilizzando idrossido di sodio 1 N e mescolare lentamente a 4 °C per 2-4 ore. Al termine della miscelazione, controllare e regolare nuovamente il pH a 7,6, se necessario, e aumentare il volume a 1 L con acqua. Sterilizzare il mezzo passando attraverso un filtro da 0,22 μM (vedi Tabella dei materiali) e utilizzare fresco o conservare a 4 °C per ≤2 mesi.
  2. Da tre a cinque giorni prima di iniziare il protocollo di trasduzione, inoculare 150 μL del clone o dei cloni appropriati di B. burgdorferi in 15 mL di 1x BSK in provette coniche coniche sterili ben chiuse (vedere Tabella dei materiali). Integrare il terreno con la concentrazione appropriata di antibiotici o la combinazione di antibiotici per la selezione e il mantenimento del DNA eterologo all'interno del clone o dei cloni di B. burgdorferi (Tabella 2).
    NOTA: B. burgdorferi è un organismo di livello 2 di biosicurezza. Prendere tutte le precauzioni appropriate mentre si lavora con questo organismo. Eseguire tutti i lavori con colture vive di B. burgdorferi in un armadio di biosicurezza di classe II certificato e adeguatamente disinfettato. Smaltire correttamente tutto il materiale che contatta B. burgdorferi e gli organismi stessi in base alle linee guida CDC34.
  3. Incubare le colture a 33 °C senza agitare fino a quando le colture raggiungono una densità di ≥5 × 107 spirochette·mL−1, che richiede circa 3-5 giorni.

2. Determinare la densità della/e coltura/e di B. burgdorferi (modificata da Samuels)15

  1. Per densità che si prevede siano superiori a 5 × 106 cellule·mL−1, determinare la densità cellulare mediante spettroscopia.
    1. Trasferire 1 mL di coltura in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL e centrifugare a 8.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    2. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4 e 1,8mM KH2PO4). Trasferire l'intera sospensione cellulare in una cuvetta trasparente semi-micro UV.
    3. Determinare la densità ottica del campione risospeso a una lunghezza d'onda di 600 nm (A600). Azzerare lo spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali) rispetto al PBS.
    4. Per calcolare la concentrazione di spirochete·mL−1 nella coltura originale, moltiplicare la densità ottica a A600 per 1,4 × 109.
  2. Per densità previste comprese tra 5 × 104 celle·mL− 1 e 5 × 106 celle·mL−1, determinare la densità cellulare utilizzando una camera di conteggio di Petroff-Hausser (vedi Tabella dei materiali) per contare direttamente il numero di spirochete. Questo metodo può essere utilizzato anche per densità più elevate dopo un'appropriata diluizione.
    NOTA: La visualizzazione di spirochete vive richiede un microscopio modificato con un condensatore in campo oscuro.
    1. Applicare 10 μL di campione nella camera di conteggio e coprire con un vetro di copertura appropriato. Per densità superiori a 1 × 107, diluire il campione in PBS per ottenere 50-100 spirochete per campo.
    2. Contare le cellule usando un microscopio a campo scuro con un ingrandimento di 200x-400x. Conta l'intero campo di 25 gruppi di 16 piccoli quadrati in tutti i piani.
    3. Moltiplicare il numero contato per il fattore di diluizione (se presente) e 5 × 104 per ottenere cellule·mL−1 di coltura originale.

3. Induzione del fago di B. burgdorferi φBB-1

NOTA: Sterilizzare tutti i bicchieri e le materie plastiche in autoclave; sterilizzare tutte le soluzioni mediante autoclave o filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μM. I passaggi seguenti sono presentati in base a volumi di 15 ml, ma il metodo è scalabile a volumi più piccoli o più grandi a seconda delle esigenze individuali dell'esperimento.

  1. Per la coltura di B. burgdorferi da cui sarà prodotto il fago (il donatore), utilizzare la concentrazione calcolata con uno dei due metodi nella fase 2 per determinare il volume di coltura starter necessario per produrre 4 ml di 2 × 108 spirochette·mL−1. Ciò produrrà una concentrazione finale di 5 × 107 spirochete·mL−1 in 15 mL durante la fase di recupero (fase 3.6 sotto).
  2. Centrifugare il volume di coltura calcolato al punto 3.1 a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 4 mL di BSK fresco. Trasferire il campione nel tubo sterile più piccolo disponibile per contenere il campione con uno spazio minimo sulla testa.
  3. Aggiungere la quantità appropriata di agente induttore alla concentrazione raccomandata (Tabella 3) sulla base di un volume di coltura di 4 mL per indurre la produzione di fagi. Tappare bene il tubo e mescolare accuratamente.
  4. Incubare il campione a 33 °C per 2-4 ore.
  5. Dopo l'incubazione, trasferire il campione in una provetta da centrifuga da 15 ml. Centrifugare il campione a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 15 ml di 1x BSK.
    NOTA: Dopo l'induzione del fago, ci sono due modi diversi per procedere con il saggio di trasduzione. Questi metodi sono presentati nella Figura 1 e nei passaggi 4 e 6.

4. Trasduzione durante la co-coltura in seguito all'esposizione della donatrice all'agente induttore (Figura 1A)

NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato solo quando il ceppo fagico produttore (donatore) ha resistenza a un particolare antibiotico e il ceppo da trasdurre (ricevente) ha resistenza ad un altro antibiotico.

  1. Preparare una coltura di B. burgdorferi da utilizzare come ricevente nei saggi di trasduzione, come descritto per il ceppo donatore nella fase 1 sopra. Sulla base della densità determinata come nella fase 2, calcolare il volume necessario per produrre 15 ml di 1 × 107 spirochette·mL−1.
  2. Centrifugare il volume di coltura calcolato al punto 4.1 a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante.
  3. Risospendere il pellet in 1 mL di coltura dalla fase 3.6 (donatore fagico risospeso). Aggiungere nuovamente il ricevente risospeso nella coltura con il donatore. Non integrare con antibiotici. Il volume totale contenente entrambe le colture è di 15 ml.
  4. Incubare a 33 °C per 72-96 h.
  5. Eseguire la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida dopo co-coltura come descritto nella fase 7.

5. Precipitazione di polietilenglicole (PEG) per recuperare il fago da utilizzare nel saggio di trasduzione

NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato nei casi in cui il ceppo produttore di fagi (donatore) ha resistenza a un particolare antibiotico e il ceppo da trasdurre (ricevente) non ha resistenza agli antibiotici o resistenza ad un altro antibiotico.

  1. Integrare la coltura dal punto 3.6 con l'antibiotico appropriato alla concentrazione indicata nella Tabella 2. Incubare il campione a 33 °C per 72-96 h.
  2. Preparare le soluzioni per la precipitazione PEG.
    1. Preparare 500 ml di 5 m di NaCl. Sterilizzare in autoclave e lasciare raffreddare prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente.
    2. Preparare 500 ml di PEG al 40% sciogliendo 200 g di PEG8000 in 400 ml di acqua; Riscaldare delicatamente mescolando fino a quando la soluzione è ben miscelata. Portare il volume fino a 500 ml con acqua. Per sciogliere completamente il PEG8000 e sterilizzare la soluzione, autoclavare la soluzione e raffreddarla prima dell'uso. Conservare a temperatura ambiente.
    3. Preparare 100 mL di mezzo di sospensione (SM; 100 mM NaCl, 10 mM MgSO4 e 50 mM Tris-HCl [pH 7,5]). Sterilizzare in autoclave. Conservare a 4 °C.
  3. Per la precipitazione PEG del fago del clone del donatore B. burgdorferi (dal punto 3.6), dopo 72-96 ore di incubazione, centrifugare i campioni a 8.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
  4. Decantare il surnatante in un tubo conico pulito da 50 ml; Smaltire il pellet cellulare. Aggiungere 5 M NaCl ad una concentrazione finale di 1 M. Mescolare bene. Oscillare delicatamente a temperatura ambiente per 1 ora.
  5. Centrifugare i campioni a 8.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Decantare il surnatante in un tubo conico pulito da 50 ml; Il pellet potrebbe essere piccolo o assente. Aggiungere la soluzione di PEG8000 al 40% al surnatante fino a una concentrazione finale del 10%. Mescolare bene e mettere in ghiaccio per più di 1 ora fino a tutta la notte.
    NOTA: Tempi più lunghi non sembrano essere correlati con un aumento significativo del recupero dei fagi.
  6. Centrifugare i campioni a 8.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e rimuovere quanto più liquido in eccesso possibile senza perdere alcun pellet, che contiene le particelle fagiche.
  7. Risospendere il pellet in un volume minimo di SM, utilizzando l'SM per lavare il lato della bottiglia e raccogliere eventuali particelle fagiche. Il rapporto raccomandato è di 400 μL di SM per 10 mL di surnatante originale, ma a seconda delle dimensioni del pellet, può essere necessario più o meno SM per la completa risospensione.
  8. Trattare il campione di fago recuperato con un volume uguale di cloroformio in base al volume di risospensione. Mescolare bene il campione e quindi centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti. Rimuovere lo strato acquoso (superiore) in un tubo pulito, evitando qualsiasi strato di interfaccia spesso.
    NOTA: φBB-1 è un batteriofago senza involucro e non è suscettibile al trattamento con cloroformio25. Questo passaggio viene eseguito per interrompere ulteriormente qualsiasi struttura legata alla membrana (cioè cellule o bleb) e per uccidere qualsiasi potenziale contaminante cellulare. Il cloroformio è un elemento organico volatile e deve essere utilizzato solo in una cappa aspirante ben ventilata; Eliminare il materiale contenente cloroformio come rifiuto organico.
  9. Determinare il volume recuperato dopo il primo trattamento con cloroformio e trattare nuovamente il campione con una quantità di cloroformio pari al 10% di tale volume. Mescolare bene e centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti. Rimuovere lo strato acquoso (superiore), facendo attenzione a evitare qualsiasi interfaccia o strato organico. Trasferire lo strato acquoso in un tubo pulito.
  10. Utilizzare immediatamente il fago (come descritto al punto 6) o conservare a 4 °C.
    NOTA: Il congelamento dei campioni di fago φBB-1 non è raccomandato. Sebbene la stabilità di φBB-1 a 4 °C non sia stata rigorosamente studiata, i campioni conservati a 4 °C fino a 1 mese dopo il recupero sono stati utilizzati con successo nei saggi di trasduzione.

6. Saggio di trasduzione dopo precipitazione PEG di φBB-1 (Figura 1B)

  1. Preparare colture di B. burgdorferi da utilizzare come ricevente nei saggi di trasduzione, come descritto per il ceppo donatore nella fase 1 sopra. Sulla base della densità determinata come nella fase 2, calcolare il volume di coltura del ricevente necessario per produrre 15 ml di 1 × 107 spirochete·mL−1.
  2. Centrifugare il volume di coltura calcolato al punto 6.1 a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in 14,5 mL di BSK fresco.
  3. Aggiungere ≤500 μL di campione di fago precipitato con PEG (dalla fase 5) alla coltura del clone ricevente. Mescolare bene e incubare a 33 °C per 72-96 h.
    NOTA: La quantità di fago recuperata durante le precipitazioni PEG può essere variabile, a seconda di una serie di fattori. Tuttavia, da 15 mL di coltura indotta di B. burgdorferi ceppo CA-11.2A, 500 μL contengono tipicamente 50-1.000 fagi vitali28. Volumi di recupero fagico ≥500 μL influenzano negativamente la crescita di B. burgdorferi , probabilmente a causa dell'aumento del rapporto tra SM e BSK.
  4. Eseguire la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida dopo miscelazione con fago precipitato con PEG come descritto al punto 7.

7. Selezione dei trasduttori

NOTA: La placcatura in fase solida di potenziali trasduttori viene eseguita utilizzando una modifica a strato singolo del protocollo descritto per la prima volta da Samuels15. Le colonie di B. burgdorferi crescono all'interno dell'agar, quindi per la selezione dei trasduttori mediante placcatura in fase solida, i campioni devono essere aggiunti al mezzo mentre le piastre vengono versate. Un metodo alternativo per la selezione dei trasformanti utilizzando un metodo di diluizione in piastre a 96 pozzetti è stato descritto in precedenza35. Questa tecnica potrebbe anche essere efficace per la selezione dei trasduttori ma non è ancora stata provata per questo scopo.

  1. Determinare il numero di piastre necessarie per la selezione dei trasduttori in base al numero di campioni dei saggi di trasduzione e dei controlli da placcare.
    NOTA: In genere, vengono versate due piastre per campione, una equivalente a circa il 10% del volume della coltura e una che include il resto della coltura. Inoltre, versare piastre che fungono da controlli negativi per verificare individualmente che la preparazione fagica e / o i cloni genitori utilizzati come donatore e ricevente non crescano in presenza degli antibiotici utilizzati durante la selezione. Si consiglia inoltre di preparare il materiale di placcatura per almeno due piastre extra. Ad esempio, se il numero di campioni e controlli da placcare è otto, preparare una miscela di placcatura sufficiente per 10 piastre.
  2. Preparare le soluzioni per la placcatura come descritto di seguito.
    NOTA: Ogni piastra sarà di 30 ml, composta da 20 ml di 1,5x BSK per la placcatura e 10 ml di agarosio al 2,1% (rapporto 2:1). Questo produrrà una piastra con concentrazioni finali di 1x BSK e 0,7% di agarosio. Ad esempio, per 10 piastre, preparare una miscela galvanica totale di 300 ml, composta da 200 ml di 1,5x BSK e 100 ml di agarosio al 2,1%.
    1. Preparare 1 L di 1,5x BSK come descritto per 1x BSK al punto 1.1 utilizzando le quantità di ciascun componente elencate per 1,5x BSK nella Tabella 1. Conservare come descritto per 1x BSK.
    2. Preparare il 2,1% di agarosio in acqua e autoclave. Utilizzare la soluzione di agarosio fresco o conservare a temperatura ambiente. Se conservato a temperatura ambiente, microonde con il coperchio liberamente fino a completa fusione prima della placcatura.
    3. Determinare il volume di antibiotici necessari per raggiungere la concentrazione appropriata (Tabella 2) in base all'intera miscela galvanica.
      NOTA: Se il volume totale della soluzione galvanica finale è di 300 ml, mescolare 200 mL di 1,5x BSK e abbastanza antibiotico per assicurarsi che l'intero 300 mL abbia la corretta concentrazione finale di antibiotico. Se sia il donatore che il ricevente nel test di trasduzione hanno geni di resistenza agli antibiotici diversi, la miscela galvanica deve contenere entrambi gli antibiotici. Se il fago precipitato PEG dal donatore (come preparato nella fase 5) codifica un marcatore di resistenza agli antibiotici e il ricevente non ne ha, la miscela galvanica deve contenere solo un antibiotico.
  3. In base al numero di piastre da versare, trasferire la quantità appropriata di 1,5 volte BSK e antibiotici in un flacone sterile abbastanza grande da contenere l'intera miscela galvanica. Equilibrare a bagnomaria a 56 °C per ≥15 min.
  4. Equilibrare l'agarosio fuso dall'autoclave o dal microonde a bagnomaria a 56 °C per ≥15 min.
  5. Dopo l'equilibratura, aggiungere la quantità determinata di 2,1% di agarosio al flacone con BSK 1,5x (con antibiotico) e rimettere la soluzione galvanica a bagnomaria a 42 °C per 10-15 minuti.
    NOTA: temperature più elevate possono danneggiare o uccidere le spirochete36. Se si utilizza lo stesso bagnomaria di cui sopra, raffreddare il bagno d'acqua a 42-45 °C prima di avviare il timer per l'equilibratura. Non lasciare che la soluzione galvanica si integri a 42 °C per più di 20 minuti o inizierà a solidificare mentre si versano le piastre.
  6. Durante l'equilibratura, preparare i campioni di B. burgdorferi da placcare. Trasferire la quantità da placcare in una provetta conica sterile da 50 mL (vedere Tabella dei materiali).
    1. Se si placca una quantità inferiore a 1,5 ml (<5% del volume finale della piastra di 30 ml), trasferire il campione nella nuova provetta e aggiungere la miscela galvanica direttamente al campione durante la placcatura.
    2. Per volumi maggiori, trasferire il volume desiderato di coltura nella nuova provetta e quindi centrifugare a 6.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente. Decantare tutti tranne 100-500 μL del surnatante e utilizzare il resto per risospendere completamente il pellet prima della placcatura.
    3. Per le piastre di controllo dopo co-coltura, aggiungere ≥107 cellule dei cloni donatori o riceventi alle provette coniche sterili da 50 mL. Se il volume è superiore a 1,5 ml, centrifugare e risospendere il pellet come al punto 7.6.2. Se è stato eseguito un test di trasduzione utilizzando il fago precipitato con PEG, oltre al clone ricevente, aggiungere 100-250 μL del campione fagico in un tubo conico sterile da 50 mL per la placcatura.
  7. Dopo che la soluzione galvanica si è equilibrata a 42-45 °C per 10-15 minuti, trasferire 30 mL della soluzione galvanica in un tubo con il campione appropriato; Erogare immediatamente la miscela galvanica e prelevare il campione in una piastra etichettata. Ripetere con una nuova pipetta per ogni campione da placcare.
  8. Lasciare solidificare le piastre per 15-20 minuti e poi metterle in un incubatore a 33 °C integrato con il 5% di CO2. Non capovolgere le piastre per almeno 48 ore dopo essere state versate.
  9. A seconda del background del clone ricevente, controllare che le colonie appaiano all'interno dell'agarosio sulle piastre di selezione dopo 10-21 giorni di incubazione. Prelevare almeno 5-10 colonie che crescono sulla piastra in presenza di entrambi gli antibiotici usando una pipetta sterilizzata in cotone 5,75 in borosilicato (vedi Tabella dei materiali) e inocularle in 1,5 ml di 1x BSK con l'antibiotico o gli antibiotici appropriati.
  10. Coltivare le colonie inoculate a 33 °C come nella fase 1.3 per 3-5 giorni o fino a raggiungere una densità di circa 20-40 spirochete per campo con ingrandimento 200x utilizzando la microscopia in campo oscuro.
    NOTA: Una volta sottoposte a screening (vedere punto 8), le spirochete possono essere congelate per la conservazione a lungo termine a -80 °C mescolando un uguale volume di coltura con una miscela di glicerolo al 60% e 1x BSK al 40% sterilizzata mediante filtrazione attraverso un filtro da 0,22 μm.

8. Verifica dei potenziali trasduttori

NOTA: Esaminare i cloni che crescono su piastre in presenza di due antibiotici per verificare che rappresentino veri trasduttori nello sfondo previsto (ricevente). Questi metodi si basano sull'amplificazione, e potenzialmente sul sequenziamento, di regioni specifiche mediante la reazione a catena della polimerasi. Protocolli dettagliati e pratiche di esecuzione della PCR in B. burgdorferi sono descritti altrove (per un esempio recente, vedi Seshu et al.37). Selezionare i primer utilizzati per vagliare i trasduttori in base ai ceppi utilizzati. Alcuni suggerimenti su come affrontare lo screening dei trasduttori sono descritti di seguito.

  1. Preparare i lisati di B. burgdorferi per lo screening PCR.
    NOTA: Il seguente protocollo viene utilizzato per produrre lisati di B. burgdorferi lavati da cellule in coltura coltivate come nella fase 7.9 per l'analisi immediata del DNA mediante PCR. Questo metodo è progettato per ridurre al minimo l'interferenza di potenziali inibitori nella BSK, ma non è raccomandato per la produzione di DNA di alta qualità per il sequenziamento o la conservazione. A tale scopo, utilizzare un protocollo o un kit per l'estrazione totale del genoma (vedi Tabella dei materiali). Si raccomanda vivamente di preparare contemporaneamente anche i lisati dei cloni progenitori (ceppi sia donatori che riceventi) da includere in ciascuna analisi.
    1. Trasferire 500 μL di ciascun potenziale trasduttore selezionato e coltivato come al punto 7.10 in una provetta di microcentrifuga pulita.
    2. Centrifugare le colture per 10 minuti a 8.000 x g a temperatura ambiente.
    3. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet in 500 μL di TE (10 mM Tris Cl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0). Centrifugare per 5 minuti a 8.000 x g a temperatura ambiente.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere ogni pellet in 50 μL di acqua di qualità PCR. Far bollire i campioni per 10 minuti. Lasciarli raffreddare brevemente, quindi centrifugare a 8.000 x g per 10 minuti a temperatura ambiente.
    5. Per ogni PCR, utilizzare immediatamente 2 μL dalla parte superiore del campione centrifugato; Evitare di disturbare il pellet.
  2. Esaminare i potenziali trasduttori per i geni specifici che codificano la resistenza agli antibiotici mediante PCR. Vedere la Tabella 4 per i primer per lo screening dei marcatori di resistenza agli antibiotici comunemente usati nei saggi di trasduzione.
    NOTA: Sebbene rara nella nostra esperienza, può verificarsi una mutazione spontanea degli antibiotici aminoglicosidi utilizzati per la selezione del DNA eterologo in B. burgdorferi.
  3. Schermare i potenziali trasduttori utilizzando anche un altro ceppo o marcatore clone per confermare che lo sfondo è quello del ricevente. Includere in queste analisi sia il clone genitore donatore che quello genitore ricevente. Screening dei marcatori specifici del ceppo utilizzando sequenze basate sui ceppi utilizzati e sui singoli protocolli di laboratorio per determinare l'integrità del ceppo.
  4. Se si tenta di trasdursi in cloni virulenti da utilizzare all'interno del vettore zecca o dell'ospite di mammifero o per il confronto diretto con un altro clone, determinare il contenuto plasmidico completo dei trasduttori e dei cloni genitori. Ciò avviene per garantire lo stesso contenuto plasmidico del ceppo comparativo o la presenza degli elementi genetici necessari per la propagazione all'interno del ciclo enzootico, come descritto altrove 18,19,37,38,39.

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Representative Results

L'uso del batteriofago per spostare il DNA tra ceppi di B. burgdorferi più facilmente trasformabili o cloni che sono recalcitranti all'elettrotrasformazione rappresenta un altro strumento per la continua indagine molecolare dei determinanti della malattia di Lyme. Il saggio di trasduzione qui descritto può essere modificato secondo necessità per facilitare il movimento del DNA tra eventuali cloni di interesse utilizzando uno o due antibiotici per la selezione di potenziali trasduttori. La trasduzione sia del DNA profagico che dei vettori eterologhi E. coli/B. burgdorferi shuttle tra un clone CA-11.2A del ceppo ad alto passaggio e un clone B31 del ceppo B31 ad alto passaggio e un clone virulento a basso passaggio del ceppo 297 è stata precedentemente dimostrata28. I risultati presentati di seguito dimostrano il movimento del DNA dei profagi tra due cloni avirulenti ad alto passaggio. Il clone donatore, c1673, è un clone di B. burgdorferi ceppo CA-11.2A che codifica per un gene di resistenza alla kanamicina sul DNA del profago27,28. Il ricevente è un clone di B. burgdorferi ceppo B31, designato c1706, che codifica un marcatore di resistenza alla gentamicina sul cromosoma28. Il saggio di trasduzione è stato eseguito come illustrato nella figura 1B; il fago precipitato PEG recuperato dai surnatanti di c1673 esposti al 5% di etanolo è stato miscelato con c1706 come descritto nella fase 6 del protocollo.

Dopo aver miscelato circa il 20% del fago recuperato dalla precipitazione PEG dai surnatanti di c1673 esposto all'etanolo (codificante la resistenza alla kanamicina) con c1706 (codificante la resistenza alla gentamicina), la miscela è stata placcata in presenza di entrambi gli antibiotici; Le unità formanti colonie (CFU) che sono in grado di crescere in presenza sia di kanamicina che di gentamicina sono indicative di eventi di trasduzione (Figura 2)27,28. Il numero di CFU è riportato come frequenza di trasduzione per cellula ricevente iniziale. In questo esperimento rappresentativo, circa 275 trasduttori sono stati recuperati dopo l'incubazione del fago con 1 × 107 cellule riceventi, producendo una frequenza di trasduzione di 2,75 × 10-5 CFU per cellula ricevente.

Dopo il recupero dei potenziali trasduttori, l'amplificazione PCR dei geni che codificano la resistenza alla kanamicina e alla gentamicina è stata eseguita su 10 cloni, con due campioni rappresentativi mostrati in Figura 3. Il gene di resistenza alla kanamicina potrebbe essere amplificato dal donatore (c1673) e dai potenziali trasduttori ma non dai riceventi (c1706). Allo stesso modo, il gene di resistenza alla gentamicina potrebbe essere amplificato dal ricevente (c1706) e dai potenziali trasduttori ma non dal donatore. Pertanto, i cloni recuperati codificano specificamente entrambi i geni di resistenza agli antibiotici e rappresentano eventi di trasduzione, non mutanti spontanei.

Per dimostrare che la cassetta di resistenza alla kanamicina è stata trasdotta da φBB-1 dal donatore al ricevente, lo sfondo dei trasduttori è stato determinato utilizzando marcatori specifici del ceppo, come descritto in precedenza28. Ciò è particolarmente importante se i trasduttori sono stati generati dal metodo di co-coltura di trasduzione. In breve, i primer28 precedentemente pubblicati sono stati utilizzati per amplificare regioni specifiche di vari plasmidi borreliali, generando un profilo che può essere utilizzato per identificare lo sfondo del clone (Figura 4). Il clone c1673 nello sfondo CA-11.2A codifica specifici ampliconi 4, 5 e 6, mentre c1706, che ha uno sfondo B31 ad alto passaggio, non lo fa. Allo stesso modo, i due trasduttori mancano degli ampliconi 4, 5 e 6; Pertanto, questi cloni hanno il background C1706 e hanno acquisito il gene di resistenza alla kanamicina da C1673.

Componente 1x BSK (per la coltivazione) (1 L) 1,5x BSK (per placcatura) (1 L)
Albumina sierica bovina (frazione V) 35 g 52,5 g
10x CMRL-1066 (senza L-glutammina) 8 g 12 g
Neopeptone 4 g 6 g
lievitato 1,6 g 2,4 g
HEPES 4,8 g 7,2 g
Glucosio 4 g 6 g
Citrato di sodio 0,56 g 0,84 g
Piruvato di sodio 0,64 g 0,96 g
N-acetil-glucosamina 0,32 g 0,48 g
Bicarbonato di sodio 1,76 g 2,64 g
Siero di coniglio normale inattivato dal calore (INRS) 66 ml 99 ml

Tabella 1: BSK per la coltivazione e la selezione di cloni di B. burgdorferi per saggi di trasduzione. La formulazione e la preparazione di 1x BSK per la coltura di B. burgdorferi e 1,5x BSK per la selezione in fase solida dei cloni di B. burgdorferi qui descritti sono basati su Samuels15. Diverse formulazioni di BSK (o MKP)37,40,41 che supportano la crescita di B. burgdorferi non sono ancora state testate utilizzando il saggio di trasduzione.

Antibiotico Concentrazione delle scorte Concentrazione finale nella cultura di Bb
Kanamicina 100 mg.mL-1 (in acqua) 200-400 μ g.mL-1
Gentamicina 50 mg.mL-1 (in acqua) 50 μ g.mL-1
Streptomicina 50 mg.mL-1 (in acqua) 50 μ g.mL-1
Eritromicina 2 mg.mL-1 (in EtOH) 0,06 μ g.mL-1

Tabella 2: Potenziali antibiotici e concentrazioni da utilizzare per la selezione e il mantenimento del DNA eterologo in B. burgdorferi. Questo elenco si basa sugli attuali marcatori di resistenza agli antibiotici comunemente usati in Borrelia burgdorferi42,43,44,45. Kanamicina, gentamicina e streptomicina sono preparati in acqua, sterilizzati con filtro attraverso un filtro da 0,22 μM e conservati a -20 °C. L'eritromicina viene preparata in etanolo al 95% e conservata a -20 °C. Molti laboratori riportano l'uso riuscito della kanamicina per la selezione ad una concentrazione di 200 μg·mL−1; quando si utilizzano sia gentamicina che kanamicina per la selezione nei saggi di trasduzione, viene utilizzata 400 μg·mL−1 di kanamicina. Il gene aadA conferisce resistenza sia alla streptomicina che alla spectinomicina44. Per la selezione di costrutti contenenti il gene aadA in E. coli, 100 μg·mL−1 spectinomicina è usato. Si noti che gli aminoglicosidi (kanamicina, gentamicina e streptomicina) non sono clinicamente rilevanti nel trattamento della malattia di Lyme; Tuttavia, l'eritromicina è usata clinicamente in determinate situazioni46. Sebbene sia stata riportata una resistenza naturale a questo antibiotico in B. burgdorferi 47, questo marcatore di resistenza non è stato finora utilizzato nei saggi di trasduzione qui riportati.

Agente inducente Concentrazione di magazzino (solvente) Concentrazione finale nel campione
Etanolo 100% (nessuno) 5%
Mitomicina C 2 mg.mL-1 (acqua) 20 μ g.mL-1
1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) 50 mg.mL-1 (DMSO) 10 μ g.mL-1

Tabella 3: Potenziali agenti induttori e concentrazioni utilizzati per l'induzione di φBB-1 da B. burgdorferi. N-metil-N′-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), mitomicina C ed etanolo, così come metanolo e isopropanolo, hanno tutti dimostrato di indurre φBB-1 al di sopra dei livelli costitutivi in B. burgdorferi ceppo CA.11-2A25,26,28. Il MNNG è un sospetto cancerogeno e un pericolo per l'ambiente; Usare con cautela, sciogliere in un solvente combustibile e incenerire per lo smaltimento. La mitomicina C è un sospetto cancerogeno e un potenziale pericolo per l'ambiente; Usare con cautela sotto una cappa aspirante chimica e smaltire correttamente. Mentre i dati pubblicati suggeriscono che MNNG è l'agente più efficace per indurre φBB-126, i rischi di lavorare con questa sostanza chimica e le difficoltà nell'acquisirla rendono il suo uso complicato48, in particolare con gli studenti. L'induzione con etanolo è costantemente migliore rispetto al metanolo o all'isopropanolo28 ed è stata più comunemente utilizzata nel saggio di trasduzione.

Nome o designazione del gene Resistenza agli antibiotici Riferimento Nome del primer Sequenza di primer (da 5 ́ a 3 ́)
kanR da Tn903 Kanamicina 42 kanR 382F CGGTTGCATTCGATTCCTGT
kanR 684R GGCAAGATCCTGGTATCGGT
aacC1 Gentamicina 43 aacC1 166F ACCTACTCCCAACATCAGCC
aacC1 497R TCTTCCCGTATGCCCAACTT
aadA streptomicina 44 aadA 273F TGTGCACGACGACATCATTC
aadA 594R TACTGCGCTGTACCAAATGC

Tabella 4: Primer utilizzati per l'analisi preliminare della trasduzione di marcatori di resistenza agli antibiotici. I primer qui indicati sono per la rilevazione di geni di resistenza agli antibiotici comunemente usati nei saggi di trasduzione. Questi primer sono utilizzati nella PCR con le seguenti condizioni ripetute per 28 cicli: denaturazione a 92 °C per 15 s, ricottura del primer a 56 °C per 15 s ed estensione del DNA target a 72 °C per 30 s.

Figure 1
Figura 1: Saggio di trasduzione per il monitoraggio del movimento mediato dai fagi (trasduzione) del DNA. Il test di trasduzione può essere eseguito utilizzando (A) il metodo di co-coltura o (B) fago recuperato da coltura surnatante mediante precipitazione PEG. Per il metodo di co-coltura (A), un clone indotto di B. burgdorferi (il donatore) che codifica per un gene di resistenza agli antibiotici sul DNA da trasdurre da φBB-1 (cerchio verde) viene coltivato con un clone non indotto di B. burgdorferi (il ricevente), che codifica per un secondo gene di resistenza agli antibiotici sul cromosoma o altro elemento genetico stabile (cerchio rosso). Questo metodo richiede l'uso di due diversi marcatori di resistenza agli antibiotici (in questo esempio, geni che codificano per la resistenza alla kanamicina e alla gentamicina). Per utilizzare il fago purificato nel saggio di trasduzione (B), le particelle fagiche recuperate dalla precipitazione PEG del surnatante dal donatore indotto vengono mescolate con il ricevente. Mentre mostrato qui usando due diversi antibiotici, questo metodo può essere eseguito con l'uso di un solo marcatore di resistenza agli antibiotici codificato sul DNA del profago φBB-1, come precedentemente dimostrato27. Dopo l'incubazione, i trasduttori vengono selezionati mediante placcatura in fase solida in presenza di entrambi gli antibiotici; se il metodo B viene utilizzato con un solo marcatore di resistenza agli antibiotici codificato sul DNA del fago, la selezione viene effettuata utilizzando solo quell'antibiotico durante la placcatura in fase solida. I trasduttori conterranno entrambi i marcatori di resistenza agli antibiotici e avranno lo sfondo del ricevente. Questa figura è ristampata da Eggers et al.28 con il permesso della Oxford University Press. Nell'esperimento modellato, c1673 e c1650 rappresentano due diversi cloni di CA-11.2A; c1673 porta un profago φBB-1 che codifica la resistenza alla kanamicina e c1650 codifica un marcatore di resistenza alla gentamicina in una posizione non fagica28. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Unità formanti colonie selezionate mediante placcatura in fase solida dopo il saggio di trasduzione. Le colonie che crescono in presenza di entrambi gli antibiotici in seguito alla miscelazione del fago da c1673 con c1706 rappresentano potenziali trasduttori. Nessuna colonia dovrebbe crescere su piastre di controllo contenenti i singoli cloni donatori e riceventi o un campione di preparazione fagica (non mostrato). Il numero minimo di fagi produttivi nel campione originale può essere determinato contando il numero di CFU e moltiplicando per il fattore di diluizione. In questo caso, il 20% del campione fagico precipitato PEG da una coltura di 15 ml del donatore ha prodotto circa 275 colonie. Pertanto, la concentrazione originale di fago produttivo recuperato dalla precipitazione PEG era ≥1,3 × 103 virioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Amplificazione PCR dei geni che conferiscono resistenza alla kanamicina e resistenza alla gentamicina da due potenziali trasduttori. La PCR utilizzando primer per i geni di resistenza alla kanamicina e alla gentamicina (Tabella 4) è stata eseguita per lo screening dei lisati generati da due colonie (transduttore 1 e transduttore 2). Queste colonie sono state selezionate su una piastra contenente sia kanamicina che gentamicina dopo la miscelazione di c1673 (donatore) e c1706 (ricevente). Gli ampliconi sono stati risolti su un gel di agarosio all'1% elettroforato per 60 minuti a 120 V in tampone 1x Tris-acetato-EDTA (TAE) e colorato con 0,5 μg·mL−1 bromuro di etidio. I numeri indicano i marcatori di dimensione in coppie di kilobasi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Conferma dello sfondo dei trasduttori. Le regioni di specifici elementi genetici sono state amplificate da c1673, c1706 e i due trasduttori, come descritto in precedenza28, per confermare che lo sfondo dei trasduttori era quello del clone ricevente, c1706. Le regioni scelte erano basate sulle sequenze di geni su specifici plasmidi lineari o circolari (lp o cp, rispettivamente) all'interno del ceppo di tipo B. burgdorferi , B316. 1 = BBA60 (lp54), 2 = BBB19 (cp26), 3 = BBE22 (lp25), 4 = BBG13 (lp28-2), 5 = BBI28 (lp28-4), 6 = BBK12 (lp36), 7 = BBS41 (cp32) e 8 = gene fla (cromosoma). Gli ampliconi sono stati risolti su un gel di agarosio all'1% elettroforato per 60 minuti a 120 V in 1x tampone TAE e colorato con 0,5 μg·mL−1 di bromuro di etidio. I numeri indicano i marcatori di dimensione in coppie di kilobasi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

L'uso della trasduzione potrebbe rappresentare un metodo per superare almeno alcune delle barriere biologiche e tecniche associate all'elettrotrasformazione di B. burgdorferi 1,4,13,37. In molti sistemi, il batteriofago può spostare il DNA dell'ospite (non profago) tra le cellule batteriche mediante trasduzione generalizzata o specializzata 22,23,24,49,50. Nella trasduzione specializzata, alcuni geni ospiti sono sempre impacchettati all'interno del capside fagico insieme al DNA del profago49,50. Ad esempio, φBB-1 impacchetta sempre quelle porzioni del cp32 che sono di origine batterica, perché sono inestricabilmente legate sul plasmide alle porzioni del cp32 che sono il genoma fagico. Nella trasduzione generalizzata, si ritiene che il meccanismo di impacchettamento del batteriofago si agganci a sequenze omologhe non fagiche e impacchetti "accidentalmente" DNA ospite casuale anziché DNA fagico; questi pezzi di DNA possono quindi essere introdotti in un'altra cellula49,50. Poco si sa ancora sulla trasduzione generalizzata da parte dei fagi in B. burgdorferi; tuttavia, nei sistemi batterici meglio caratterizzati, ben l'1% del batteriofago rilasciato da una cellula può contenere geni batterici casuali invece del DNA fagico51. Finora, non sono stati osservati marcatori cromosomici da trasdurre tra diversi cloni di B. burgdorferi, ma la precedente dimostrazione che sia cp32 che piccoli vettori shuttle eterologhi possono essere impacchettati e trasdotti da φBB-1 indica che questo fago può partecipare sia alla trasduzione specializzata che generalizzata28. Pertanto, viene proposto un caso d'uso per la trasduzione in laboratorio, in cui l'elettrotrasformazione che genera una mutazione cromosomica viene ancora eseguita sullo sfondo di interesse; Tuttavia, l'introduzione di vettori shuttle per la complementazione in trans o per studi di espressione utilizzando costrutti reporter in ceppi recalcitranti all'elettrotrasformazione potrebbe essere fatta attraverso la trasduzione tra un clone ad alto passaggio più trasformabile e ceppi meno trasformabili. Se studi futuri dimostrano la capacità di φBB-1 di impacchettare e spostare anche loci cromosomici, allora i metodi descritti nel presente documento potrebbero anche rivelarsi utili nello spostamento del DNA cromosomico modificato tra ceppi più facilmente trasformabili e ceppi altrimenti difficili da elettrotrasformare. I plasmidi cp32-like sono pervasivi tra tutti i ceppi di B. burgdorferi e la stragrande maggioranza delle altre malattie di Lyme spirochete52,53; ci sono anche prove di omologhi in altre specie di Borrelia, tra cui B. mayonii, B. miyamotoi, e quelli che causano febbre recidivante54,55,56. Non è ancora noto se anche gli omologhi di altre specie di Borrelia siano profagi, ma se così fosse, allora la trasduzione potrebbe anche essere uno strumento per la dissezione molecolare di queste specie, alcune delle quali devono ancora essere manipolate geneticamente con successo.

Qui sono stati presentati due metodi per trasdurre il DNA: co-coltivare insieme i cloni del donatore e del ricevente prima della selezione (Figura 1A) o del fago precipitante PEG dal donatore e mescolare solo quel fago con il ricevente (Figura 1B). Il numero di eventi di trasduzione per cellula ricevente è più alto dopo la co-coltura rispetto all'utilizzo del fago precipitato PEG28, ma la co-coltura richiede che sia il donatore che il ricevente portino diversi marcatori di resistenza agli antibiotici e che il background di eventuali potenziali trasduttori sia attentamente esaminato. Poiché i profagi φBB-1 sono onnipresenti tra i Borrelia52,53, esiste una possibilità teorica che, mescolando cloni in crescita attiva, un marcatore di resistenza agli antibiotici o altro DNA eterologo possa spostarsi dal ricevente al donatore (piuttosto che dal donatore al ricevente, come previsto). L'uso di fagi precipitati con PEG nel test di trasduzione elimina questa possibilità, poiché il donatore non è presente nel mix fago/ricevente. Inoltre, la precipitazione PEG del fago è necessaria se il fago e il suo contenuto genomico devono essere utilizzati sia per l'analisi (cioè analisi strutturale, quantificazione, identificazione del materiale confezionato, ecc.) che per la trasduzione. Nonostante questi vantaggi, l'uso di fagi precipitati da PEG ha i suoi potenziali svantaggi; oltre a non produrre tanti trasduttori come con la co-coltura, la precipitazione PEG può richiedere molto tempo, può portare a una significativa perdita di fagi e si traduce in campioni che contengono contaminanti che possono interferire con le applicazioni a valle57,58.

La trasduzione è stata dimostrata finora da tre ceppi di B. burgdorferi: CA-11.2A, un clone B31 ad alto passaggio, e un clone 297 a basso passaggio28. Di questi tre, il ceppo CA-11.2A di B. burgdorferi produce la più alta quantità di fago dopo induzione25,26,28; tuttavia, anche dopo l'induzione, il numero di fagi recuperati da B. burgdorferi è ancora ordini di grandezza inferiore al fago recuperato in sistemi meglio caratterizzati, come quello del colifago λ25,28,59. Pertanto, un problema che può sorgere nell'uso della trasduzione attraverso la co-coltura o la miscelazione di fagi dopo la precipitazione PEG è il piccolo numero di batteriofagi che vengono rilasciati da B. burgdorferi, anche se esposti ad agenti induttori. Inoltre, la variazione da lotto a lotto nella produzione di fagi è significativa, anche quando tutte le condizioni, i componenti dei supporti e i metodi sembrano essere coerenti tra gli esperimenti. Per questo motivo, è importante determinare che almeno un numero minimo di fagi sono prodotti da un determinato clone o in una determinata condizione. I saggi tradizionali per determinare il numero di fagi in un campione richiedono la miscelazione di una piccola quantità di campione contenente fago con un ospite batterico permissivo in cui il batteriofago è litico; Il numero di particelle fagiche produttive nel campione è determinato dal numero di eventi litici che si verificano in quel contesto, con conseguente formazione di placche su un prato dei batteri60,61. Il numero di fagi è riportato come unità formanti placca (PFU)61. Quantificare il numero di φBB-1 produttivi rilasciati dopo l'induzione utilizzando un saggio di placca è ostacolato dall'incapacità di coltivare Borrelia burgdorferi in un prato fitto e dall'attuale mancanza di comprensione dei meccanismi che controllano il passaggio tra i cicli di replicazione lisogenica e litica di φBB-1. Infatti, mentre i rapporti aneddotici di colture lisate di B. burgdorferi sono numerosi, finora non ci sono stati studi pubblicati che correlano l'osservazione della lisi di un'intera coltura con la produzione di fagi. Per esperienza, solo un piccolo numero di cellule in una data coltura sembra produrre spontaneamente fagi, presumibilmente per lisi, e questa produzione può essere solo modestamente aumentata con l'esposizione agli agenti induttori noti25,28,62. Pertanto, un saggio di placca non è attualmente possibile per quantificare φBB-1 da B. burgdorferi.

Per quantificare il numero di fagi produttivi prodotti in seguito all'induzione di B. burgdorferi, il saggio di trasduzione descritto in questo rapporto può essere eseguito utilizzando un clone permissivo di B. burgdorferi con un antibiotico diverso da quello confezionato dal batteriofago. Questo test si traduce in colonie che risultano dalla trasduzione, con ogni colonia che rappresenta un fago confermato. Pertanto, il numero minimo di fagi in un campione può essere riportato come CFU piuttosto che come UFC. Questo numero è probabilmente (molto) inferiore al numero totale effettivo di fagi prodotti a causa delle inefficienze inerenti al recupero del fago mediante precipitazione PEG (se usato), all'attaccamento e all'iniezione di DNA da parte del fago e alla placcatura in fase solida di B. burgdorferi.

Un potenziale metodo per determinare la quantità totale di DNA dei profagi all'interno dei surnatanti delle colture di B. burgdorferi è la PCR quantitativa (qPCR), ma i protocolli qPCR per il DNA cp32 di B. burgdorferi non sono ben rappresentati in letteratura e la qPCR non è ancora una metodologia ampiamente utilizzata per questo scopo. Per determinare qualitativamente che vi sia almeno un livello moderato di DNA fagico in un dato campione, il DNA totale può essere estratto dai supernatanti precipitati PEG delle colture di B. burgdorferi dopo il trattamento con DNasi prima dell'estrazione; il DNA del fago sarà protetto da un capside fagico intatto25. Il DNA recuperato viene quindi risolto in un gel di agarosio e visualizzato con una colorazione di DNA; questo protocollo produce tipicamente una debole banda di 30 kb che rappresenta il DNA lineare confezionato all'interno della testa del fago25. Sulla base della sensibilità della colorazione e dell'intensità della banda di DNA fagico correttamente dimensionata rispetto a un marcatore, il numero approssimativo di fagi totali recuperati può essere determinato25,27. Una forte correlazione positiva dei livelli di DNA fagico totale recuperato dal surnatante con il numero di trasduttori recuperati dopo il test di trasduzione è stata dimostrata in precedenza28.

La scelta dei ceppi donatori e riceventi è fondamentale per il successo dell'uso della trasduzione come strumento molecolare. La nostra comprensione dei cp32 come profago di φBB-1 è complicata sia dalla pervasività dei cp32 nelle spirochete 52,53 della malattia di Lyme sia dal fatto che una singola cellula di B. burgdorferi può contenere omologhi multipli di questi plasmidi. Tutti i cp32 all'interno di una cellula sembrano essere confezionati all'interno delle teste dei fagi nei ceppi produttori di fagi che sono stati esaminati27. Non è chiaro, tuttavia, se tutti i ceppi di B. burgdorferi contenenti cp32 possano produrre batteriofagi, e i ceppi dovrebbero essere testati per questa capacità prima dell'uso. Allo stesso modo, non si sa nulla sui recettori che permettono a un particolare ceppo di essere trasdotta da φBB-1, sebbene l'ubiquità del plasmide profagico in tutto il genere suggerisca un'alta probabilità che un particolare ceppo possa essere trasdotto. Come si può dedurre dalla presenza di plasmidi cp32 multipli all'interno di una singola cellula di B. burgdorferi, non sembra esserci alcuna immunità fagica63 conferita dalla presenza di un profago esistente; i ceppi CA.11-2A, B31 e 297 sono stati utilizzati nei saggi di trasduzione ed entrambi producono e possono essere trasdotti da φBB-127,28. Mentre le relazioni precedenti indicavano che la trasduzione era possibile solo in un numero limitato di ceppi utilizzando il fago precipitato con PEG27, ciò potrebbe essere dovuto a difficoltà tecniche con tale metodo, poiché tutti i ceppi testati fino ad oggi sono stati trasducibili con successo utilizzando il metodo di co-coltura28.

Quando si progetta un esperimento per utilizzare il saggio di trasduzione, le considerazioni principali per la scelta del ceppo del donatore dovrebbero essere il background genetico, la sua capacità di essere prontamente trasformato tramite elettroporazione e la sua capacità di produrre fagi. Sebbene non sia stata effettuata un'indagine esaustiva dei cloni ad alto passaggio di ogni ceppo, il ceppo CA-11.2A produce fagi costitutivamente a livelli rilevabili anche in assenza di induzione. Allo stesso modo, i cloni ad alto passaggio di B31, il primo ceppo di B. burgdorferi ad essere completamente sequenziato5 e un ceppo comunemente usato negli studi molecolari, producono anche costitutivamente quantità rilevabili di φBB-1 e sono generalmente altamente trasformabili 1,4,25,27,37,64 . Se le indagini richiedono altri ceppi, si raccomanda che i cloni ad alto passaggio di quel ceppo siano prima testati per la loro trasformabilità introducendo un plasmide contenente un marcatore di resistenza agli antibiotici tramite elettroporazione e quindi valutati per la loro capacità di essere trasdotti eseguendo un test di trasduzione con un ricevente permissivo, come CA-11.2A o B31, che codifica un diverso marcatore di resistenza agli antibiotici. Allo stesso modo, per garantire che un ceppo o clone ricevente sia permissivo alla trasduzione, un ceppo che produce fagi, come CA-11.2A che trasporta un profago che codifica la resistenza a un antibiotico, può essere miscelato con il clone di interesse per garantire che avvenga la trasduzione.

Molto resta da capire sulla biologia molecolare di φBB-1 e sul suo ruolo nell'HGT all'interno di B. burgdorferi, in particolare durante il transito del ciclo enzootico. La capacità di φBB-1 di trasdurre sperimentalmente sia il DNA fagico che quello eterologo all'interno del laboratorio, tuttavia, presenta l'opportunità di aggiungere un altro strumento per la dissezione molecolare di B. burgdorferi e il suo ruolo nella patogenesi della malattia di Lyme.

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Disclosures

L'autore non ha nulla da rivelare.

Acknowledgments

L'autore desidera ringraziare Shawna Reed, D. Scott Samuels e Patrick Secor per la loro utile discussione e Vareeon (Pam) Chonweerawong per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Dipartimento di Scienze Biomediche e dalle borse di ricerca della facoltà a Christian H. Eggers della School of Health Sciences della Quinnipiac University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 L filter units (PES, 0.22 µm pore size) Millipore Sigma S2GPU10RE
12 mm x 75 mm tube (dual position cap) (polypropylene) USA Scientific 1450-0810 holds 4 mL with low void volume (for induction)
15 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 5618-8271
1-methyl-3-nitroso-nitroguanidine (MNNG) Millipore Sigma CAUTION: potential carcinogen; no longer readily available, have not tested offered substitute
5.75" Pasteur Pipettes (cotton-plugged/borosilicate glass/non-sterile) Thermo Fisher Scientific 13-678-8A autoclave prior to use
50 mL conical centrifuge tubes (polypropylene) USA Scientific 1500-1211
Absolute ethanol
Agarose LE Dot Scientific inc. AGLE-500
Bacto Neopeptone Gibco DF0119-17-9
Bacto TC Yeastolate Gibco 255772
Bovine serum albumin (serum replacement grade) Gemini Bio-Products 700-104P
Chloroform (for molecular biology) Thermo Fisher Scientific BP1145-1 CAUTION: volatile organic; use only in a chemical fume hood
CMRL-1066 w/o L-Glutamine (powder) US Biological C5900-01 cell culture grade
Erythromycin Research Products International Corp E57000-25.0
Gentamicin reagent solution Gibco 15750-060
Glucose (Dextrose Anhydrous) Thermo Fisher Scientific BP350-500
HEPES Thermo Fisher Scientific BP310-500
Kanamycin sulfate Thermo Fisher Scientific 25389-94-0
Millex-GS (0.22 µM pore size) Millipore Sigma SLGSM33SS to filter sterilize antibiotics and other small volume solutions
Mitomycin C Thermo Fisher Scientific BP25312 CAUTION: potential carcinogen; use only in a chemical fume hood
N-acetyl-D-glucosamine MP Biomedicals, LLC 100068
Oligonucleotides (primers for PCR) IDT DNA
OmniPrep (total genomic extraction kit) G Biosciences 786-136
Petri Dish (100 mm × 15 mm) Thermo Fisher Scientific FB0875712
Petroff-Hausser counting chamber Hausser scientific HS-3900
Petroff-Hausser counting chamber cover glass Hausser scientific HS-5051
Polyethylene glycol 8000 (PEG) Thermo Fisher Scientific BP233-1
Rabbit serum non-sterile trace-hemolyzed young (NRS) Pel-Freez Biologicals 31119-3 heat inactivate as per manufacturer's instructions
Semi-micro UV transparent cuvettes USA Scientific 9750-9150
Sodium bicarbonate Thermo Fisher Scientific BP328-500
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific BP358-1
Sodium pyruvate Millipore Sigma P8674-25G
Spectronic Genesys 5 Thermo Fisher Scientific
Streptomycin sulfate solution Millipore Sigma S6501-50G
Trisodium citrate dihydrate Millipore Sigma S1804-500G sodium citrate for BSK

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References

  1. Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
  2. Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. F1000Research. 8, F1000 Faculty Rev-763 (2019).
  3. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42, 473-518 (2021).
  4. Rosa, P. A., Jewett, M. W. Genetic manipulation of Borrelia. Current Issues in Molecular Biology. 42, 307-332 (2021).
  5. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390 (6660), 580-586 (1997).
  6. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: The twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35 (3), 490-516 (2000).
  7. Schutzer, S. E., et al. Whole-genome sequences of thirteen isolates of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (4), 1018-1020 (2011).
  8. Ohnishi, J., Piesman, J., de Silva, A. M. Antigenic and genetic heterogeneity of Borrelia burgdorferi populations transmitted by ticks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (2), 670-675 (2001).
  9. Dykhuizen, D. E., et al. The propensity of different Borrelia burgdorferi sensu stricto genotypes to cause disseminated infections in humans. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 78 (5), 806-810 (2008).
  10. Hanincova, K., et al. Multilocus sequence typing of Borrelia burgdorferi suggests existence of lineages with differential pathogenic properties in humans. PLoS One. 8 (9), 73066 (2013).
  11. Kern, A., et al. Heterogeneity of Borrelia burgdorferi sensu stricto population and its involvement in Borrelia pathogenicity: Study on murine model with specific emphasis on the skin interface. PLoS One. 10 (7), 0133195 (2015).
  12. Drecktrah, D., Samuels, D. S. Genetic manipulation of Borrelia spp. Current Topics in Microbiology and Immunology. 415, 113-140 (2017).
  13. Tilly, K., Elias, A. F., Bono, J. L., Stewart, P., Rosa, P. DNA exchange and insertional inactivation in spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 433-442 (2000).
  14. Lawrenz, M. B., Kawabata, H., Purser, J. E., Norris, S. J. Decreased electroporation efficiency in Borrelia burgdorferi containing linear plasmids lp25 and lp56: Impact on transformation of infectious B. burgdorferi. Infection and Immunity. 70 (9), 4798-4804 (2002).
  15. Samuels, D. S. Electrotransformation of the spirochete Borrelia burgdorferi. Methods in Molecular Biology. 47, 253-259 (1995).
  16. Rego, R. O., Bestor, A., Rosa, P. A. Defining the plasmid-borne restriction-modification systems of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 193 (5), 1161-1171 (2011).
  17. Makarova, K. S., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. Comparative genomics of defense systems in archaea and bacteria. Nucleic Acids Research. 41 (8), 4360-4377 (2013).
  18. Grimm, D., Elias, A. F., Tilly, K., Rosa, P. A. Plasmid stability during in vitro propagation of Borrelia burgdorferi assessed at a clonal level. Infection and Immunity. 71 (6), 3138-3145 (2003).
  19. Grimm, D., et al. Experimental assessment of the roles of linear plasmids lp25 and lp28-1 of Borrelia burgdorferi throughout the infectious cycle. Infection and Immunity. 72 (10), 5938-5946 (2004).
  20. Heery, D. M., Powell, R., Gannon, F., Dunican, L. K. Curing of a plasmid from E. coli using high-voltage electroporation. Nucleic Acids Research. 17 (23), 10131 (1989).
  21. Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
  22. Morsczeck, C. Strategies for mycobacterial genetics. International Journal of Medical Microbiology. 293 (4), 251-259 (2003).
  23. Thomason, L. C., Costantino, N., Court, D. L. E. coli genome manipulation by P1 transduction. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 1-8 (2007).
  24. Keller, C. M., Kendra, C. G., Bruna, R. E., Craft, D., Pontes, M. H. Genetic modification of Sodalis species by DNA transduction. mSphere. 6 (1), e01331 (2021).
  25. Eggers, C. H., Samuels, D. S. Molecular evidence for a new bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 181 (23), 7308-7313 (1999).
  26. Eggers, C. H., et al. Bacteriophages of spirochetes. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 2 (4), 365-373 (2000).
  27. Eggers, C. H., et al. Transduction by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 183 (16), 4771-4778 (2001).
  28. Eggers, C. H., et al. Phage-mediated horizontal gene transfer of both prophage and heterologous DNA by φBB-1, a bacteriophage of Borrelia burgdorferi. Pathogens and Disease. 74 (9), (2016).
  29. Stevenson, B., Miller, J. C. Intra- and interbacterial genetic exchange of Lyme disease spirochete erp genes generates sequence identity amidst diversity. Journal of Molecular Evolution. 57 (3), 309-324 (2003).
  30. Dykhuizen, D. E., Baranton, G. The implications of a low rate of horizontal transfer in Borrelia. Trends in Microbiology. 9 (7), 344-350 (2001).
  31. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Reviews in Genetics. 46, 515-536 (2012).
  32. Brisson, D., Zhou, W., Jutras, B. L., Casjens, S., Stevenson, B. Distribution of cp32 prophages among Lyme disease-causing spirochetes and natural diversity of their lipoprotein-encoding erp loci. Applied and Environmental Microbiology. 79 (13), 4115-4128 (2013).
  33. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of Lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42, 409-454 (2021).
  34. Centers for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,. 6th edition. , Centers for National Institutes of Health. Bethesda, Maryland. (2020).
  35. Yang, X. F., Pal, U., Alani, S. M., Fikrig, E., Norgard, M. V. Essential role for OspA/B in the life cycle of the Lyme disease spirochete. Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 641-648 (2004).
  36. Lee, S. K., Yousef, A. E., Marth, E. H. Thermal inactivation of Borrelia burgdorferi, the cause of Lyme disease. Journal of Food Protection. 53 (4), 296-299 (1990).
  37. Seshu, J., Moy, B. E., Ingle, T. M. Transformation of Borrelia burgdorferi. Current Protocols. 1 (3), 61 (2021).
  38. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13865-13870 (2000).
  39. Labandeira-Rey, M., Seshu, J., Skare, J. T. The absence of linear plasmid 25 or 28-1 of Borrelia burgdorferi dramatically alters the kinetics of experimental infection via distinct mechanisms. Infection and Immunity. 71 (8), 4608-4613 (2003).
  40. Ruzic-Sabljic, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  41. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  42. Bono, J. L., et al. Efficient targeted mutagenesis in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2445-2452 (2000).
  43. Elias, A. F., et al. New antibiotic resistance cassettes suitable for genetic studies in Borrelia burgdorferi. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. 6 (1), 29-40 (2003).
  44. Frank, K. L., Bundle, S. F., Kresge, M. E., Eggers, C. H., Samuels, D. S. aadA confers streptomycin resistance in Borrelia burgdorferi. Journal of Bacteriology. 185 (22), 6723-6727 (2003).
  45. Sartakova, M. L., et al. Novel antibiotic-resistance markers in pGK12-derived vectors for Borrelia burgdorferi. Gene. 303 (1-2), 131-137 (2003).
  46. Wormser, G. P., et al. The clinical assessment, treatment, and prevention of Lyme disease, human granulocytic anaplasmosis, and babesiosis: Clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America. Clinical Infectious Diseases. 43 (9), 1089-1134 (2006).
  47. Terekhova, D., Sartakova, M. L., Wormser, G. P., Schwartz, I., Cabello, F. C. Erythromycin resistance in Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (11), 3637-3640 (2002).
  48. Sorbye, H., Kvinnsland, S., Svanes, K. Penetration of N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to proliferative cells in gastric mucosa of rats is different in pylorus and fundus and depends on exposure time and solvent. Carcinogenesis. 14 (5), 887-892 (1993).
  49. Muniesa, M., Imamovic, L., Jofre, J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments. Microbial Biotechnology. 4 (6), 725-734 (2011).
  50. Penades, J. R., Chen, J., Quiles-Puchalt, N., Carpena, N., Novick, R. P. Bacteriophage-mediated spread of bacterial virulence genes. Current Opinion in Microbiology. 23, 171-178 (2015).
  51. Thierauf, A., Perez, G., Maloy, A. S. Generalized transduction. Methods in Molecular Biology. 501, 267-286 (2009).
  52. Casjens, S. R., et al. Plasmid diversity and phylogenetic consistency in the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi. BMC Genomics. 18 (1), 165 (2017).
  53. Ojaimi, C., et al. Borrelia burgdorferi gene expression profiling with membrane-based arrays. Methods in Enzymology. 358, 165-177 (2002).
  54. Stevenson, B., et al. The relapsing fever spirochete Borrelia hermsii contains multiple, antigen-encoding circular plasmids that are homologous to the cp32 plasmids of Lyme disease spirochetes. Infection and Immunity. 68 (7), 3900-3908 (2000).
  55. Kingry, L. C., et al. Whole genome sequence and comparative genomics of the novel Lyme borreliosis causing pathogen, Borrelia mayonii. PLoS One. 11 (12), 0168994 (2016).
  56. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  57. Dong, D., Sutaria, S., Hwangbo, J. Y., Chen, P. A simple and rapid method to isolate purer M13 phage by isoelectric precipitation. Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (18), 8023-8029 (2013).
  58. Kleiner, M., Hooper, L. V., Duerkop, B. A. Evaluation of methods to purify virus-like particles for metagenomic sequencing of intestinal viromes. BMC Genomics. 16, 7 (2015).
  59. Patterson, T. A., Dean, M. Preparation of high titer lambda phage lysates. Nucleic Acids Research. 15 (15), 6298 (1987).
  60. Ackermann, H. W., et al. Guidelines for bacteriophage characterization. Advances in Virus Research. 23, 1-24 (1978).
  61. Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
  62. Eggers, C. H., Casjens, S., Samuels, D. S. Bacteriophages of Borrelia burgdorferi and Other Spirochetes. The Spirochetes: Molecular and Cellular Biology. Saier, M. H., Garcia-Lara, J. , Horizon Scientific Press. Wymondham, UK. Chapter 4 35-44 (2001).
  63. Birge, E. A. Bacterial and Bacteriophage Genetics,. 5th edition. , Springer. New York, NY. (2010).
  64. Eggers, C. H., et al. Identification of loci critical for replication and compatibility of a Borrelia burgdorferi cp32 plasmid and use of a cp32-based shuttle vector for the expression of fluorescent reporters in the Lyme disease spirochaete. Molecular Microbiology. 43 (2), 281-295 (2002).

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Immunologia e infezione Numero 187 Borrelia burgdorferi batteriofago trasferimento genico orizzontale trasduzione
Manipolazione genetica mediata dai fagi della malattia di Lyme Spirochete <em>Borrelia burgdorferi</em>
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Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic … More

Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (187), e64408, doi:10.3791/64408 (2022).

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