Summary
En in vivo fysiologisk modell av α-synuclein er nødvendig for å studere og forstå patogenesen av Parkinsons sykdom. Vi beskriver en metode for å overvåke cytotoksisitet og aggregert dannelse av α-synuclein ved hjelp av en humanisert gjærmodell.
Abstract
Parkinsons sykdom er den nest vanligste nevrodegenerative lidelsen og er preget av progressiv celledød forårsaket av dannelsen av Lewy-legemer som inneholder feilfoldet og aggregert α-synuclein. α-synuclein er et rikelig presynaptisk protein som regulerer synaptisk vesikkelhandel, men akkumuleringen av proteinholdige inneslutninger resulterer i nevrotoksisitet. Nylige studier har vist at ulike genetiske faktorer, inkludert bakterielle chaperones, kan redusere dannelsen av α-synuclein-aggregater in vitro. Det er imidlertid også viktig å overvåke antiaggregeringseffekten i cellen for å anvende dette som en potensiell behandling for pasientene. Det ville være ideelt å bruke nevronceller, men disse cellene er vanskelige å håndtere og tar lang tid å utvise antiaggregeringsfenotypen. Derfor er det nødvendig med et raskt og effektivt in vivo-verktøy for videre evaluering av in vivo antiaggregeringsaktivitet. Metoden beskrevet her ble brukt til å overvåke og analysere antiaggregeringsfenotypen i den humaniserte gjæren Saccharomyces cerevisiae, som uttrykte humant α-synuclein. Denne protokollen demonstrerer in vivo verktøy som kan brukes til å overvåke α-synuclein-indusert cellulær toksisitet, samt dannelsen av α-synuclein-aggregater i celler.
Introduction
Parkinsons sykdom (PD) er et alvorlig problem for aldrende samfunn over hele verden. Aggregering av α-synuclein er nært forbundet med PD, og proteinaggregater av α-synuclein er mye brukt som en molekylær biomarkør for diagnostiseringav sykdommen. α-synuclein er et lite surt protein (140 aminosyrer i lengde) med tre domener, nemlig den N-terminale lipidbindende α-helixen, det amyloidbindende sentrale domenet (NAC) og den C-terminale sure halen2. Feilfoldingen av α-synuclein kan oppstå spontant og til slutt fører til dannelsen av amyloidaggregater kalt Lewy-legemer3. α-synuclein kan bidra til patogenesen av PD på flere måter. Generelt antas det at dets unormale, oppløselige oligomere former kalt protofibriller er giftige arter som forårsaker nevroncelledød ved å påvirke ulike cellulære mål, inkludert synaptisk funksjon3.
De biologiske modellene som brukes til å studere nevrodegenerative sykdommer må være relevante for mennesker med hensyn til deres genom- og cellebiologi. De beste modellene ville være menneskelige nevroncellelinjer. Imidlertid er disse cellelinjene forbundet med flere tekniske problemer, for eksempel vanskeligheter med vedlikehold av kulturer, lav effektivitet av transfeksjon og høye kostnader4. Av disse grunner er det nødvendig med et enkelt og pålitelig verktøy for å akselerere fremdriften på dette forskningsområdet. Det er viktig at verktøyet skal være enkelt å bruke for å analysere de innsamlede dataene. Fra disse perspektivene har ulike modellorganismer blitt mye brukt, inkludert Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, gjær og gnagere5. Blant dem er gjær den beste modellorganismen fordi genetisk manipulasjon er lett, og det er billigere enn de andre modellorganismene. Viktigst av alt har gjær høye likheter med humane celler, for eksempel 60% sekvens homologi til humane ortologer og 25% nær homologi med humane sykdomsrelaterte gener6, og de deler også grunnleggende eukaryotisk cellebiologi. Gjær inneholder mange proteiner med lignende sekvenser og analoge funksjoner som de i humane celler7. Faktisk har gjær som uttrykker menneskelige gener blitt mye brukt som et modellsystem for å belyse cellulære prosesser8. Denne gjærstammen kalles humanisert gjær og er et nyttig verktøy for å utforske funksjonen til menneskelige gener9. Humanisert gjær har fortjeneste for å studere genetiske interaksjoner fordi genetisk manipulasjon er godt etablert i gjær.
I denne studien brukte vi gjær Saccharomyces cerevisiae som en modellorganisme for å studere patogenesen til PD, spesielt for å undersøke α-synuclein-aggregatdannelse og cytotoksisitet10. For uttrykket av α-synuclein i den spirende gjæren ble W303a-stammen brukt til transformasjon med plasmider som koder for villtype og familiære PD-assosierte varianter av α-synuclein. Siden W303a-stammen har en auxotrofisk mutasjon på URA3, er den anvendelig for valg av celler som inneholder plasmider med URA3. Uttrykket av α-synuclein kodet i et plasmid er regulert under GAL1-promotoren. Dermed kan ekspresjonsnivået av α-synuclein kontrolleres. I tillegg tillater fusjonen av grønt fluorescerende protein (GFP) ved den C-terminale regionen av α-synuclein overvåking av α-synuclein foci formasjon. For å forstå egenskapene til de familiære PD-assosierte varianter av α-synuclein, uttrykte vi også disse varianter i gjær og undersøkte deres cellulære effekter. Dette systemet er et enkelt verktøy for screening av forbindelser eller gener som viser beskyttende roller mot cytotoksisiteten til α-synuclein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av medier og løsninger
- Forberedelse av media
- For å forberede YPROD-medium, oppløs 50 g YPOD-pulver i dH2O for å lage et endelig volum på 1 L. Autoklav for sterilisering. Oppbevares ved romtemperatur (RT).
- For å lage YPD agar medium, oppløs 50 g YPD pulver og 20 g agar i 1 L dH2O. Autoklav for sterilisering. Etter avkjøling, hell på petriskåler. Oppbevares ved 4 °C.
- For å lage SC med raffinose (SRd)-Ura medium, oppløs 6,7 g gjærnitrogenbase med ammoniumsulfat og uten aminosyrer i 795 ml dH2O. Autoklav for sterilisering. Tilsett 100 ml 20% raffinose, 5 ml 20% glukose og 100 ml 10x -ura drop-out før bruk.
- For å lage SD-Ura agar medium, oppløs 6,7 g gjærnitrogenbase med ammoniumsulfat og uten aminosyrer og 20 g agar i 800 ml dH 2 O. Autoklav i en kolbe med et volum over2L. Tilsett 100 ml 20% glukose og 100 ml 10x -Ura drop-out. Bland godt og hell på petriskåler. Oppbevares ved 4 °C.
- For å lage SC med galaktose (SG) -Ura agar medium, oppløs 6,7 g gjærnitrogenbase med ammoniumsulfat og uten aminosyrer og 20 g agar i 800 ml dH 2 O. Autoklav i en kolbe med et volum over2L. Tilsett 100 ml 20% galaktose og 100 ml 10x -Ura drop-out. Bland godt og hell på petriskåler. Oppbevares ved 4 °C.
- Lagerløsninger for bruk med SD-medier
- For å lage en 20% karbonkilde (glukose, galaktose og raffinose), oppløs 100 g glukose, galaktose eller raffinose i dH2O for å lage et endelig volum på 500 ml. Autoklav og lagre på RT.
- For å lage 10x gjær syntetisk drop-out medium kosttilskudd uten uracil (10x-Ura drop-out), oppløs 19,2 g "gjær syntetisk drop-out medium kosttilskudd uten uracil" i dH2O for å lage et endelig volum på 1 L. Autoclave og lagre på RT.
NOTAT: For fremstilling av et medium som inneholder agar, legg til en magnetisk rørestang på kolben for å blande alle løsningene godt før du heller på petriskåler.
2. Gjær transformasjon
MERK: pRS426-plasmidet ble brukt til å klone α-synuclein-genet og inneholdt URA3-genet som en valgbar markør. Det finnes familiære PD-assosierte varianter av α-synuclein som har alvorlige sykdomsfenotyper (f.eks. cytotoksisitet). Disse variantene ble også brukt her for å overvåke deres cytotoksisitet og aggregerte focidannelse. Bruk den samme kolonien av gjærtransformanter for alle forsøkene for å få konsistente resultater.
- For transformasjon av gjæruttrykksplasmider, bruk en tom vektor (pRS426) som kontroll og α-synucleinholdige plasmider. Med henvisning til standard litiumacetat (LiAc) metode11, lag seks kompetente celler og 0,5 μg av hvert plasmid, og utfør transformasjonen.
- For å velge for gjærtransformanter som inneholder plasmider, bruk det syntetiske definerte mediet (SD-medium) uten uracil (SD-Ura), og inkuber platene ved 30 ° C i 2-3 dager.
- Patch tre enkeltkolonier på en SD-Ura agarplate for valg av celler som inneholder plasmider for videre eksperimenter.
MERK: For å generere nøyaktige og pålitelige resultater, undersøkte vi minst tre biologiske replikasjoner per stamme.
3. Spotting analyse
MERK: Uttrykket av GFP-merket α-synuclein i høykopinummerplasmider er kjent for å være assosiert med cytotoksisitet i gjær10.
- Inokulere de tre lappede gjærtransformantene per stamme til 3 ml SRd-Ura for selektiv vekst av gjær som inneholder plasmidene med 2% raffinose for inhibering av induksjonen av α-synuclein under GAL1-promotoren og 0,1% glukose. Inkuber cellekulturen ved 30 °C under omrøring ved 200 o/min.
MERK: Det er viktig å gjenta alle eksperimentene med forskjellige kolonier. Å oppnå de samme resultatene fra over tre uavhengige kolonier betyr at resultatet er pålitelig. - Neste dag inokulerer de nattlige dyrkede cellene til 3 ml fersk SRd-Ura til en OD 600 på 0,2, og inkuberer i 6 timer ved 30 °C under omrøring ved200 o/min.
- Når OD600 når 0,6-0,8, fortynn cellene i 96-brønnsplater for spottinganalysen som følger.
- Mål OD 600 av alle prøvene, og fortynn prøvene til en OD 600 på 0,5 med steril dH2O (det blandede volumet er100 μL) i bane 1 av en 96-brønns plate for å utjevne antall celler i hver kultur.
- Utfør femfoldige serielle fortynninger av gjærcellene ved å legge til 160 μL steril dH2O til de neste fem banene. Sørg for et totalt volum på 40 μL når du serielt fortynner cellene i hvert kjørefelt.
MERK: Lave fortynningsfaktorer kan gi større forskjeller mellom prøvene. Tilstrekkelig pipettering er nødvendig for å sikre jevn blanding når serielle fortynninger utføres. Pipettespissen skal skiftes ut ved hvert fortynningspunkt. Ellers kan cellene festet til overflaten av spissen overføres til neste brønn og påvirke cellenummeret.
- Bruk en flerkanals pipette til å overføre 10 μL fra hver brønn for å oppdage prøvene på SD-Ura-agarplater for kontrollene og SG-Ura-agarplatene for å overvåke toksisitet.
MERK: Platene skal tørkes til de flekkete prøvene er fullstendig absorbert på platene. - Inkuber flekkplatene opp ned ved 30 °C i 4 dager.
- Ta bilder av platene hver 24. time til dag 4, og analyser deretter dataene ved å sammenligne vekstforskjellene mellom stammer oppdaget av øyet. Tell de enkelte koloniene i den mest fortynnede prøven, beregne antall levedyktige celler i den opprinnelige kulturen for hver stamme, eller sammenligne størrelsen på enkeltkoloniene.
4. Måling av gjærvekst ved hjelp av en mikroplateleser
- Inokuler de tre lappede gjærtransformantene per stamme til 3 ml SRd-Ura, og inkuber ved 30 ° C under omrøring ved 200 o / min over natten.
MERK: For å forstå hver kolonifenotype av den humaniserte gjærstammen som uttrykker α-synuclein, bruk de samme transformantene for alle forsøkene. - Neste dag inokulerer de nattlige dyrkede cellene til totalt 200 μL ferske SD-Ura og SG-Ura i 96-brønnsplater. Juster det endelige volumet, inkludert cellene, til 200 μL, og juster startcellen OD600 til 0,05.
- Juster programinnstillingene i mikrotiterplaten som følger: sett måltemperaturen til 30 ° C, sett ristingen (lineær) varighet til 890 s, sett ristingen (lineær) amplituden til 5 mm, sett intervalltiden til 00:15:00, og sett målingen som absorbans ved 600 nm.
- Inkuber platen i 2-3 dager for at alle stammene skal nå den stasjonære fasen i en mikroplateleser.
- Analyser dataene ved å tegne vekstkurven (for eksempel ved hjelp av arbeidsbok). Skaff datapunktene ved å beregne et gjennomsnitt av absorbansverdiene fra de tre biologiske replikasjonene, og angi feilfeltene. Bruk verdien for absorbans fra bare medier som en kontroll, og trekk dette fra verdiene fra dyrkede celler (valgfritt).
5. Fluorescensmikroskopi
- Inokuler de lappede gjærformene til 3 ml SRd-Ura, og dyrk dem over natten ved 30 ° C under agitasjon ved 200 o / min.
MERK: For å bestemme korrelasjonen av fenotypen med cytotoksisitet og focidannelse, bruk de samme koloniene for forsøket. - Neste dag, reinokulere natten dyrkede celler til 3 ml frisk SRd-Ura til en OD600 på 0,003 . Inkuber kulturen til OD 600 når 0,2 ved 30 °C under agitasjon ved200 o / min (~ 18 timer).
- Når en OD 600 av 0,2 oppnås, tilsett 300 μL 20% galaktose, og inkuber deretter i ytterligere 6 timer ved 30 ° C under omrøring ved200 o / min.
- Samle cellene ved sentrifugering ved 800 x g i 5 minutter, og kast supernatanten.
- Resuspend cellepelleten forsiktig i 30 μL destillert vann.
- Legg 5 μL av de resuspenderte cellene på et lysbildeglass. Forbered en agarosegelpute12 og legg den på de lastede cellene for å få den til å spre seg jevnt.
- Utfør mikroskopisk avbildning med et 100x mål ved hjelp av både brightfield og GFP-fluorescensfiltre.
- Bruk først brightfield til å fokusere cellen med et 100x mål ved hjelp av nedsenkningsolje. Bruk skjermopptaksalternativet for å generere bildene ved hjelp av programmet.
- Bytt til et GFP-fluorescensfilter. Juster bildeeksponeringstiden til mellom 50 ms og 300 ms for å oppnå et klart bilde ved å balansere signal-til-støy-forholdet. Skjermbilde bildet ved hjelp av programmet.
- Bilde mange celler fra flere punkter i stedet for bare en.
- Analyser bildene ved å telle prosentandelen av celler som inneholder foci av α-synuclein-aggregater ved hjelp av analytisk programvare. Vær oppmerksom på forskjellene mellom det oppløselige GFP-proteinsignalet og det foci-dannede GFP-signalet, samt diffusjonen av GFP med A30P-variantformen av α-synuclein.
MERK: Foci-dannelse vil bli observert med villtype-, E46K- og A53T-variantene av α-synuclein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det høye uttrykket av α-synuclein er kjent for å være knyttet til nevroncelledød og PD i modellsystemer av PD. Denne studien beskriver tre metoder for å overvåke cytotoksisiteten av α-synuclein og foci-dannelsen av aggregert α-synuclein i gjær. Her ble α-synuclein overuttrykt i gjær, og fenotypene av villtype α-synuclein og tre varianter av α-synuclein kjent som familiære mutanter av PD ble undersøkt (figur 1 og materialtabellen).
α-synuclein-uttrykket under GAL1-promotoren i pRS426-vektoren viste signifikant veksthemming på agarplaten som inneholdt galaktose som induktor (figur 2). Forskjellen i vekst ved α-synuclein-uttrykk ble også observert i flytende kulturer (figur 3). Under begge kulturforhold viste villtype α-synuclein og varianter med E46K- eller A53T-mutasjoner vekstdefekter på grunn av α-synucleintoksisitet. Imidlertid viste α-synuclein A30P-varianten, som ikke danner aggregater, en giftfri fenotype.
For å forstå forholdet mellom cytotoksisitet og aggregering av α-synuclein, er det nødvendig med en metode for å overvåke statusen til α-synuclein i gjær. α-synuclein ble merket av et GFP-protein ved C-terminalen for å overvåke statusen til α-synuclein i levende gjærceller ved å oppdage GFP-signalet ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Stammene med alvorlig cytotoksisitet viste fokus på α-synuclein-aggregater, men i A30P-varianten ble en mindre giftig form for α-synuclein diffundert gjennom cellene (figur 4).
Figur 1: α-synuclein domener og konstruksjoner brukt i denne studien . (A) Strukturen til humant α-synuclein med de tre forskjellige domenene - N-terminaldomenet, NAC-domenet og C-terminaldomenet. Aminosyrerestene er angitt nederst. De oransje linjene angir de muterte stedene. (B) De rekombinante plasmidkonstruksjonene som ble brukt i denne studien. pRS426-plasmidet ble brukt som ryggrad. α-synuclein ble smeltet sammen med en GFP-tag på C-terminalen, og uttrykket ble kontrollert av GAL1-promotoren . Forkortelser: NAC = ikke-amyloid-β komponent; GFP = grønt fluorescerende protein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Cytotoksisitet av α-synuclein på agar på grunn av ekspresjon av høykopitallplasmider i gjær. Gjærceller som uttrykker GAL1-drevne α-synuclein-GFP-varianter i pRS426-plasmider ble oppdaget i femfoldige fortynninger på et selektivt gjærmedium som inneholdt 2% glukose eller 2% galaktose. Cellene ble inkubert i 3 dager ved 30 °C, og platene ble fotografert. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; EV = tom vektor; WT = villtype; α-Syn = α-synuclein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cytotoksisitet av α-synuclein i flytende medier på grunn av ekspresjon av høykopierte tallplasmider i gjær. Gjærceller som uttrykker GAL1-drevne α-synuclein-GFP-varianter, ble dyrket i flytende medier i en 96-brønnsplate ved 30 ° C i 2 dager, og veksten ble overvåket ved hjelp av en mikroplateleser. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; EV = tom vektor; WT = villtype; α-Syn = α-synuclein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Analyse av gjærceller som uttrykker α-synuclein-GFP ved fluorescensmikroskopi. α-synuclein-GFP-varianter ble indusert ved å tilsette galaktose og inkubere i 6 timer. Bekreftelsen av α-synuclein-GFP ble gjort ved fluorescensmikroskopi. Skala bar = 10 μm. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; EV = tom vektor; WT = villtype; α-Syn = α-synuclein. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammendrag av denne metoden for måling av cytotoksisitet og aggregert dannelse av α-synuclein ved bruk av humanisert gjær. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gitt kompleksiteten til ulike cellulære systemer hos mennesker, er det fordelaktig å bruke gjær som en modell for å studere humane neurodegenerative sykdommer. Selv om det er nesten umulig å undersøke de komplekse cellulære interaksjonene til den menneskelige hjernen ved hjelp av gjær, har gjærceller fra et encellet perspektiv et høyt nivå av likhet med humane celler når det gjelder genomisk sekvens homologi og grunnleggende eukaryote cellulære prosesser 8,13. Videre, gitt den enkle genetiske manipulasjonen, kan gjær lette studiet av komplekse og krevende menneskelige systemer. Derfor har gjær blitt mye brukt som et modellsystem for å forstå eukaryote cellulære prosesser og patogenesen av ulike sykdommer14,15,16. Spesielt er det uoverensstemmelser mellom in silico, in vitro og in vivo aggregeringsegenskaper av amyloidogene proteiner, inkludert α-synuclein17. Med tanke på kompleksiteten og uforutsigbarheten av proteinadferd i cellen, er det viktig å studere proteinegenskaper in vivo. For å forstå hva som skjer i en celle med α-synuclein, er det derfor nødvendig å undersøke det under in vivo-forhold, og gjær antas å være et nyttig og kraftig modellsystem for dette.
I denne studien ble egenskapene til α-synuclein i gjær i en svært overuttrykket tilstand ved bruk av et 2 mikron plasmid analysert. α-synuclein-nivået ble kontrollert av en induserbar GAL1-promotor. Denne promotoren aktiveres når galaktose er tilgjengelig som næringsstoff, og dermed tillater dette systemet oss å studere fenotyper avledet fra spesifikke nivåer av α-synuclein-proteinuttrykk. Overuttrykket av villtype- og α-synuclein-variantene, bortsett fra A30P, forårsaket toksisitet i spottinganalysen, så vel som i vekstkurveanalysen. Disse villtype- og α-synuclein-variantene ble undersøkt ved hjelp av fluorescensmikroskopi for å overvåke proteinaggregatene av α-synuclein i cellene. Fra disse forsøkene ble dannelsen av foci avledet fra α-synuclein-aggregering observert i α-synuclein villtype og varianter som viste cytotoksisitet. Disse resultatene bekrefter at cellulær toksisitet og focidannelse som følge av feilfoldet α-synucleinproteinaggregering er knyttet til en av de representative fenotypene av PD i nevronceller18,19.
Det er viktig å inkubere transformantene i 3 dager og å velge store og rødlige kolonier for videre eksperimenter. W303a-stammen har en adeninmutasjon, noe som gjør at cellen blir rød20. Derfor resulterer valg av en hvit koloni i å jobbe med feil forurensning. Å velge riktig cellestadium for induksjon av α-synuclein ved å tilsette galaktose er viktig for å observere en reproduserbar fenotype. For å teste effekten av et spesifikt protein på cytotoksisiteten til α-synuclein, kan andre proteiner uttrykkes ved kotransformasjon. Imidlertid må plasmider med Ura-markører unngås da α-synuclein-plasmidet opprettholdes med Ura.
Denne metoden er ikke begrenset til studiet av de cellulære egenskapene til selve α-synuclein og kan være et nyttig verktøy for å validere kandidatgener som kan påvirke aggregering av α-synuclein. Interessant nok har forskjellige bakterielle proteiner (f.eks. chaperoner og curli) nylig blitt rapportert å påvirke dannelsen av α-synuclein in vitro21,22. Effekten av et kandidatgen på α-synuclein-avledet toksisitet eller aggregatdannelse kan overvåkes ved kouttrykk. For eksempel ble α-synuclein opprettholdt av URA3-markørgenet co-uttrykt i celler med et kandidatgen fra pRS425-plasmidet, som inneholdt en galaktoseinduserbar promotor og en LEU2-markør. Videre kan dette systemet brukes til genetisk screening ved hjelp av gendelesjon eller overekspresjonsbiblioteker, samt kjemiske biblioteker, i gjær23. Men i genom-brede screeninganalyser som tar sikte på å avdekke genetiske interaksjoner, vil co-overekspresjon med andre proteiner i et plasmid ikke være lett å oppnå når det gjelder transformasjonseffektivitet. I slike situasjoner kan det være bedre å uttrykke α-synuclein i genomet i flere kopier for å manipulere den giftige formen20. Avslutningsvis gir dette gjærmodellsystemet og protokollen en enkel og omfattende plattform for å forstå fysiologien til α-synuclein og evaluere gener med potensiell evne til å modulere α-synuclein toksisitet og aggregering (figur 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Vi takker James Bardwell og Tiago F. Outeiro for vennlig deling av plasmider som inneholder α-synuclein. Changhan Lee mottok finansiering fra National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (MSIT) (stipend 2021R1C1C1011690), Basic Science Research Program gjennom NRF finansiert av Utdanningsdepartementet (stipend 2021R1A6A1A10044950), og det nye fakultetets forskningsfond ved Ajou University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plate | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Gas permeable sealing membrane for microtiter plates |
| cover glasses | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Culture tube | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galactose | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucose | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubator (shaking) | Labtron | model: SHI1 | |
| Incubator (static) | Vision scientific | model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Microplate reader | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| multichannel pipette 20-200 µL | gilson | FA10011 | |
| multichannel pipette 2-20 µL | gilson | FA10009 | |
| Olympus microscope | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | average mol wt 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promoter α-synuclein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Reservoir | SPL | 23050 | |
| Spectrophotometer | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Present from James Bardwell | ||
| Yeast nitrogen base w/o amino acids | Difco | 291940 | |
| Yeast synthetic drop-out medium supplements without uracil | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
References
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
- Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
- Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
- Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C.
- Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
- Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
- Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
- Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. Methods in Yeast Genetics and Genomics. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).
- Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
- Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421 (2019).
- Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
- Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15 (2019).
- Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643 (2021).
- Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease. PLoS One. 7 (6), 38545 (2012).
- Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson's Disease. 2016, 1720621 (2016).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111 (2020).
- Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).
