Summary
מאמר זה מתאר מודל עכברי חדשני למעבר של פנאומוקוק ממתיישב אסימפטומטי לפתוגן הגורם למחלה במהלך זיהום ויראלי. מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות ומארח-פתוגן במהלך השלבים השונים של התקדמות המחלה ועל פני מארחים שונים.
Abstract
סטרפטוקוקוס פנאומוניה (Streptococcus pneumoniae ) הוא מתיישב אסימפטומטי של הלוע אצל רוב האנשים, אך יכול להתקדם לפתוגן ריאתי ומערכתי בזיהום בנגיף שפעת A (IAV). גיל מתקדם משפר את רגישות המארח לדלקת ריאות פנאומוקוקית משנית וקשור להחמרת תוצאות המחלה. הגורמים המארחים המניעים תהליכים אלה אינם מוגדרים היטב, בין השאר בשל מחסור במודלים של בעלי חיים המשחזרים את המעבר מנשאות א-סימפטומטית למחלה קלינית קשה.
מאמר זה מתאר מודל עכבר חדשני המשחזר את המעבר של פנאומוקוקים מהובלה אסימפטומטית למחלה עם זיהום ויראלי. במודל זה, עכברים מחוסנים תחילה תוך אפית בפנאומוקוקים שגודלו בביופילם כדי ליצור הובלה א-סימפטומטית, ולאחר מכן זיהום IAV הן בלוע והן בריאות. התוצאה היא הפצת חיידקים לריאות, דלקת ריאות וסימני מחלה ברורים שיכולים להתקדם לקטלניות. מידת המחלה תלויה בזן החיידק ובגורמים המאכסן.
חשוב לציין כי מודל זה משחזר את רגישות ההזדקנות, מכיוון שבהשוואה לעכברים צעירים, עכברים זקנים מפגינים מחלה קלינית קשה יותר ונכנעים למחלות בתדירות גבוהה יותר. על ידי הפרדת ההובלה והמחלה לשלבים נפרדים ומתן הזדמנות לנתח את הווריאנטים הגנטיים הן של הפתוגן והן של המאכסן, מודל זה של S. pneumoniae/IAV מאפשר בחינה מפורטת של יחסי הגומלין של פתוביונט חשוב עם המארח בשלבים שונים של התקדמות המחלה. מודל זה יכול לשמש גם ככלי חשוב לזיהוי מטרות טיפוליות פוטנציאליות נגד דלקת ריאות פנאומוקוקית משנית בפונדקאים רגישים.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) הם חיידקים גראם-חיוביים השוכנים באופן אסימפטומטי בלוע של רוב האנשים הבריאים 1,2. מקודם על ידי גורמים שאינם מוגדרים לחלוטין, pneumococci יכול לעבור ממתיישבים שפירים של nasopharynx לפתוגנים המתפשטים לאיברים אחרים וכתוצאה מכך זיהומים חמורים, כולל דלקת האוזן התיכונה, דלקת ריאות, חיידקים, חיידקי3. הצגת מחלת הפנאומוקוק תלויה בחלקה בהבדלים ספציפיים לזן, כולל הסרוטיפ, המבוסס על הרכב פוליסכרידים קפסולריים. עד כה אופיינו מעל 100 סרוטיפים, וחלקם קשורים לזיהומים פולשניים יותר 4,5. מספר גורמים נוספים מגבירים את הסיכון למחלת פנאומוקוק. גורם אחד כזה הוא זיהום ויראלי, שבו הסיכון לדלקת ריאות פנאומוקוקית גדל פי 100 על ידי IAV 6,7. מבחינה היסטורית, S. pneumoniae הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר לדלקת ריאות חיידקית משנית לאחר שפעת והוא קשור לתוצאות גרועות יותר8. גורם סיכון מרכזי נוסף הוא הגיל המתקדם. למעשה, S. pneumoniae הוא הגורם המוביל לדלקת ריאות חיידקית שנרכשה בקהילה בקרב קשישים מעל גיל65 9,10. קשישים מהווים את רוב (>75%) ממקרי המוות כתוצאה מדלקת ריאות ושפעת, מה שמצביע על כך ששני גורמי הסיכון - הזדקנות וזיהום IAV - מחמירים באופן סינרגטי את הרגישות למחלות11,12,13,14. עם זאת, המנגנונים שבאמצעותם זיהום ויראלי גורם למעבר של פנאומוקוקים ממתיישב אסימפטומטי לפתוגן פולשני וכיצד זה מעוצב על ידי גורמים מארחים נותרו מוגדרים בצורה גרועה. זה נובע בעיקר מהיעדר מודל של בעלי חיים קטנים המשחזר את המעבר מנשאות פנאומוקוק אסימפטומטית למחלה קלינית קריטית.
מחקרי זיהום משותף מודלו באופן קלאסי בעכברים שחוסנו בפנאומוקוקים ישירות לריאות 7 ימים לאחר זיהום שפעת15,16. זה משחזר את הרגישות לדלקת ריאות חיידקית משנית והוא אידיאלי לחקר האופן שבו תגובות חיסוניות אנטי-ויראליות פוגעות בהגנות אנטיבקטריאליות17. עם זאת, מחקרי אורך בבני אדם הוכיחו כי נשיאת פנאומוקוק בלוע, שם החיידקים יכולים ליצור ביופילמים אסימפטומטיים18, קשורה באופן אחיד למחלות פולשניות 19,20. חיידקים מבודדים מזיהומים של האוזן התיכונה, הריאה והדם זהים גנטית לאלה הנמצאים בלוע20. לכן, כדי לחקור את המעבר מהובלה א-סימפטומטית למחלה פולשנית בעקבות זיהום IAV, הוקם מודל שבו עכברים קיבלו פנאומוקוקים שגודלו בביופילם תוך אפי ואחריו זיהום IAV של הלוע21,22. זיהום ויראלי של דרכי הנשימה העליונות הוביל לשינויים בסביבה המארחת שהובילו לפיזור הפנאומוקוקים מהביופילמים והתפשטותם לדרכי הנשימה התחתונות21. חיידקים מפוזרים אלה היו בעלי ביטוי מוגבר של גורמי אלימות החשובים לזיהום, והפכו אותם ממתיישבים לפתוגנים21. תצפיות אלה מדגישות את האינטראקציה המורכבת בין הנגיף, המאכסן והחיידק ומראות כי לשינויים במארח הנגרמים על ידי זיהום ויראלי יש השפעה ישירה על התנהגות הפנאומוקוק, אשר, בתורו, משנה את מהלך הזיהום החיידקי. עם זאת, מודל זה אינו מצליח לשחזר את סימני המחלה החמורים שנצפו בבני אדם, ככל הנראה משום שהנגיף מוגבל לחלל האף, וההשפעות המערכתיות של זיהום ויראלי על חסינות המאכסן ונזק לריאות אינן משוחזרות.
לאחרונה ביססנו מודל המשלב את האינטראקציה המורכבת בין המאכסן לפתוגנים, אך גם מחקה באופן הדוק יותר את חומרת המחלה שנצפתה בבני אדם23 . במודל זה, עכברים נדבקים תחילה תוך אפית בפנאומוקוקים שגודלו בביופילם כדי ליצור הובלה א-סימפטומטית, ולאחר מכן זיהום IAV הן בלוע והן בריאות. זה הביא להפצת חיידקים לריאות, דלקת ריאות ומחלות שהתקדמו לקטלניות אצל חלק קטן מהעכברים הצעירים23. מחקר קודם זה הראה כי הן זיהום ויראלי והן זיהום חיידקי שינו את הגנת המאכסן: זיהום נגיפי קידם הפצת חיידקים, והתיישבות חיידקים קודמת פגעה ביכולתו של המארח לשלוט ברמות IAV ריאתי23. בחינת התגובה החיסונית גילתה כי זיהום IAV הפחית את הפעילות האנטיבקטריאלית של נויטרופילים, בעוד שהתיישבות חיידקים הקהתה את תגובת אינטרפרון מסוג I הקריטית להגנה אנטי-ויראלית23. חשוב לציין, מודל זה שיחזר את הרגישות של ההזדקנות. בהשוואה לעכברים צעירים, עכברים זקנים הראו סימני מחלה מוקדם יותר, הראו מחלה קלינית חמורה יותר, ונכנעו לזיהום בתדירות גבוהה יותר23. העבודה המוצגת בכתב יד זה מראה כי מידת המחלה תלויה גם בזן החיידקי, משום שזנים פולשניים של פנאומוקוק מפגינים הפצה יעילה יותר על זיהום IAV, מראים סימנים גלויים יותר של דלקת ריאות, וגורמים לשיעורי תחלואה מואצים בהשוואה לזנים לא פולשניים. לפיכך, מודל זה של S. pneumoniae/IAV מאפשר בחינה מפורטת של גורמים פתוגניים ומארחים כאחד, והוא מתאים היטב לחקר תגובות חיסוניות לזיהומים רב-מיקרוביאליים בשלבים השונים של התקדמות המחלה.
Protocol
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת באפלו.
1. הכנת מדיה מוגדרת כימית (CDM)
- הכינו את המלאי באופן הבא:
- יש להמיס את תערובת תרכובות I המפורטות בטבלה 1 ב-100 מ"ל מים טהורים במיוחד תוך כדי ערבוב. יש לאחסן ב-200 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C.
- יש להמיס את תרכובות תערובת II המפורטות בטבלה 1 ב-20 מ"ל של 0.1 מ' NaOH תוך כדי ערבוב. יש לאחסן ב-100 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C.
- יש להמיס את תרכובות תערובת III המפורטות בטבלה 1 ב-1 מ"ל מים אולטרה-טהורים תוך כדי ערבוב. יש לאחסן ב-10 μL aliquots ב-4°C.
- יש להמיס את תרכובת תערובת IV המפורטת בטבלה 1 ב-1 מ"ל מים טהורים במיוחד תוך כדי ערבוב. יש לאחסן ב-10 μL aliquots בטמפרטורה של -20°C.
- יש להמיס את התרכובות המפורטות בטבלה 2 בתחילה ב-15 מ"ל מים אולטרה-טהורים תוך כדי ערבוב. כוונן את ה- pH ל- 7.0 בכמה טיפות של 0.1 M NaOH וכוונן את הנפח הסופי ל- 20 מ"ל באמצעות מים טהורים במיוחד. יש לאחסן ב 1 מ"ל aliquots ב -20 °C.
- יש להמיס את התרכובות המפורטות בטבלה 3 ב-90 מ"ל מים אולטרה-טהורים על פלטה חמה בטמפרטורה של 50°C תוך כדי ערבוב. כוונן את ה- pH ל- 7.0 עם 0.1 M NaOH, ולאחר מכן כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 100 מ"ל באמצעות מים טהורים במיוחד. יש לאחסן ב-5 מ"ל aliquots בטמפרטורה של -20°C.
- הפוך את מלאי המתנע טרי בכל פעם על ידי המסת התרכובות בטבלה 4 ב 70 מ"ל של מים טהורים במיוחד תוך ערבוב.
- למלאי המתנע הטרי, הוסף את מלאי המיקס הבא לפי הסדר: 200 מיקרוליטר של מלאי Mix I (טבלה 1), 80 μL של מלאי Mix II (טבלה 1), 10 μL של מלאי Mix III (טבלה 1), 10 μL של מלאי Mix IV (טבלה 2), 1 מ"ל של מלאי ויטמינים (טבלה 3) ו-5 מ"ל של מלאי חומצות אמינו (טבלה 4).
- לאחר הוספת המלאי, התאם את הנפח הסופי ל -100 מ"ל על ידי הוספת 30 מ"ל מים טהורים במיוחד לכד.
- השלימו את ה-CDM עם תרכובות מטבלה 4. לאחר ערבוב יסודי, יש לסנן-לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך שבועיים לכל היותר.
2. גידול ביופילם S. pneumoniae
- הכינו RP-10 בינוני על ידי ערבוב 445 מ"ל של RPMI 1640 עם 50 מ"ל של נסיוב בקר עוברי מומת בחום (FBS) ו-5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין ב-10,000 U/mL ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה.
- לגדל את קו תאי קרצינומה רירית NCI-H292 (H292). הוסף את התאים מבקבוקון קנוי אחד ל -5 מ"ל של מדיום RP-10 בבקבוק T-25 שטופל בתרבית רקמה. יש לדגור ב-37°C/5% CO2 למשך 3-5 ימים כדי להגיע ל-100% מפגש.
- בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אור באמצעות הגדלה פי 10 כדי להעריך את המפגש.
הערה: כאשר כל התאים נמצאים במגע עם תאים אחרים ואין רווחים ביניהם, אז מגיעים למפגש הרצוי של 100%. - לשטוף את התאים 2x ב 5 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר. ודא שהמאגר הוא ללא סידן כדי למנוע chelating EDTA בשלב הבא.
- הוסיפו 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוק ודגרו ב-37°C/5% CO2 למשך 5-10 דקות עד שהתאים יתנתקו. נטרול עם 4 מ"ל של RP-10 בינוני. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה ומעבירים לצינור חרוטי 50 מ"ל.
- הוסף 500 μL של תרחיף התא לכל באר לצלחת 24 בארות שטופלה בתרבית רקמה. מצלוחית T-25 מתמזגת, צפו ל-2 × 10 6-4× 106 תאים/מ"ל.
- למחרת, בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהם חופפים, כמו בשלב 2.3. אם הם לא, אז לדגור במשך זמן רב יותר.
- ברגע שתאי H292 נפגשים ב-100% בצלחת בעלת 24 הקידוחים, שטפו בעדינות את התאים פי 3 עם 1 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר כדי להבטיח שלא יישאר מדיום המכיל אנטיביוטיקה או פסולת.
- לאחר שטיפת התאים, להוסיף 250 μL / באר של 4% paraformaldehyde כדי לתקן את התאים. יש לדגור במשך שעה אחת על קרח או למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- בלילה שלפני קיבוע התא, פזרו את זן S. pneumoniae המעניין על צלחות אגר הדם ודגרו במשך הלילה ב 37 ° C / 5% CO2.
הערה: הנתונים המוצגים כאן הם עם הזנים הבאים של S. pneumoniae המתקבלים באמצעות חילופי שיתוף פעולה: סרוטיפ 19F אוטיטיס מדיה לבודד EF3030 24, סרוטיפ קלאסי 2 זן אייברי D3925, וסרוטיפ 4 חיידק מבודד TIGR426. הזנים זמינים גם מאוספים ציבוריים המוזכרים בטבלת החומרים. - הכינו CDM בתוספת אוקסיאז (0.15 U/mL) על ידי הוספת 100 μL של אוקסירז (30 U/mL) ל-20 מ"ל CDM.
הערה: אוקסיאז משמש לסילוק חמצן כדי לאפשר צמיחה יעילה של S. pneumoniae בתרבית נוזלית27. - חסן את החיידקים מהצלחת לתוך CDM טרי + oxyrase על ידי שטיפת החיידקים מהצלחת על ידי הוספת 1 מ"ל של CDM + oxyrase בעדינות להרים את מושבות החיידקים באמצעות הצד של קצה פיפטה 1 מ"ל, נזהר לא לגרד את האגר. לחלופין, השתמש בלולאה חיסון כדי להרים את החיידקים ולחסן אותם לתוך צינור המכיל 1 מ"ל של CDM + oxyrase.
- לדלל את החיידקים CDM + oxyrase ל OD600 התחלתי של 0.05.
- לגדל את החיידקים בצינור חרוטי רופף של 50 מ"ל העומד על 37°C/5% CO 2 עד שמגיעים ל-OD600 של 0.2 (זה ייקח בין2-5 שעות). בדוק את OD600 מדי שעה כדי לוודא שהOD אינו עולה על 0.2.
- ברגע שה-OD הגיע ל-0.2, מערבלים את צינור תרבית החיידקים. זרע 0.5 מ"ל של החיידקים על תאי H292 קבוע ולהוסיף עוד 0.5 מ"ל של CDM + oxyrase בינוני לכל באר. הוסף 1 מ"ל של CDM + oxyrase לבארות הבקרה ללא חיידקים. לדגור על הצלחת במשך 48 שעות ב 34 ° C / 5% CO2.
הערה: צמיחה ב 34 ° C משמש כדי לחקות באופן הדוק יותר את הטמפרטורה הנמוכה יותר ב nasopharynx21. - כל 12 שעות לאחר הזריעה הראשונית, להסיר בעדינות 0.5 מ"ל של המדיום ולחדש עם 0.5 מ"ל של CDM טרי + oxyrase. היזהר לא לשבש את הביופילם המתהווה. בדוק את החלק התחתון של הצלחת עבור biofilm ולחפש עננות גוברת ככל שהזמן עובר עקב הצמיחה של הביופילם. כדי לשלוט בזיהום, בדוק את הבארות ללא חיידקים כדי לוודא שבארות הבקרה נשארות נקיות.
- ב 48 שעות לאחר החיסון, להסיר את supernatant ולשטוף 2x בעדינות רבה עם 1 מ"ל של PBS. יש להשהות מחדש ב-1 מ"ל CDM טרי ופיפטה מעלה ומטה במרץ כדי להרים את הביופילם. עבור כל זן חיידקי, אגרו את החיידקים מכל הבארות לצינור חרוטי של 50 מ"ל. יש לערבב היטב על ידי הטייה עדינה של הצינור הסגור היטב מעלה ומטה מספר פעמים.
- לצינור החרוטי של 50 מ"ל, הוסף 40% גליצרול ב- CDM בנפחים שווים כדי להשיג תרחיף חיידקי עם ריכוז סופי של 20% גליצרול. Aliquot 1 מ"ל לתוך צינורות microcentrifuge, להקפיא הבזק על קרח יבש, ולשמור ב -80 ° C.
- לפני השימוש, למנות את החיידקים על ידי הפשרת aliquot אחד על קרח, סיבוב הצינור ב 1,700 × גרם במשך 5 דקות, הסרת supernatant, resuspending את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS, ציפוי דילול סדרתי על צלחות אגר דם28.
- גדלו את צלחות האגר למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C/5% CO2 וספרו את המושבות בדילולים הרלוונטיים כדי לקבל את ריכוז החיידקים ביחידות יוצרות מושבה (CFU)/מ"ל.
הערה: מומלץ למנות את החיידקים במלאי לפחות יום לאחר ההקפאה או מאוחר יותר, שכן יש ירידה בכדאיות החיידקים בתוך 24 השעות הראשונות. aliquots קפוא מאוחסן יכול לשמש זיהום הבא של עכברים לכל היותר 2 חודשים.
3. חיסון תוך אפי של עכברים עם S. pneumoniae גדל ביופילם
- רכשו עכברים והשתמשו בגיל הרצוי.
הערה: עכברים בגילאי 3-4 חודשים מועדפים על פני מודלים של פונדקאים צעירים, ועכברים בגילאי 21-24 חודשים יכולים לשמש כמודל של אנשים מבוגרים >65 שנים שלגיל 29. הנתונים המוצגים כאן הם עם עכברים זכרים C57BL/6. - הפשירו את האליציטוטים החיידקיים שגודלו בביופילם על קרח והסתובבו במהירות של 1,700 × גרם במשך 5 דקות. בזהירות להסיר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע את הכדור, לשטוף את החיידקים על ידי resuspending את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS, ולסובב שוב ב 1,700 × גרם במשך 5 דקות. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה בנפח הדרוש כדי להגיע לריכוז הרצוי (יש לשאוף ל- 5 × 106 CFU/10 μL לחיסון תוך אפי). אשר את כמויות החיידקים הניתנות על ידי ציפוי החיסון המוכן על צלחות אגר דם כמו בשלב 2.19.
- חסן את העכברים תוך אפית עם 5 × 106 CFU על ידי pipeting 5 μL של inoculum מדולל לתוך כל naris. הקפידו להחזיק את העכברים בחוזקה, לייצב את הראש, עד לשאיפת עוצמת הקול (בדרך כלל תוך שניות מרגע החדרת עוצמת הקול לנארס). בצע שלב זה בהיעדר הרדמה כדי למנוע שאיפה ריאתית של החיסון.
4. זיהום ויראלי בנגיף שפעת A (IAV)
- ב 48 שעות לאחר חיסון intranasal עם S. pneumoniae, להפשיר את זן IAV של עניין על קרח.
הערה: הנתונים המוצגים כאן הם עם זן מותאם עכבר של וירוס שפעת A A/PR/8/34 H1N1 שהתקבל באמצעות חילופי שיתוף פעולה30. - לאחר הפשרת הנגיף, יש לדלל את הנגיף ב-PBS לריכוז הרצוי; יש לשאוף ל-20 יחידות יוצרות פלאק (PFU)/50 μL לזיהום תוך-טרכאלי ו-200 PFU/10 μL לזיהום תוך-אפי. עבור קבוצות נגועות בדמה וחיידקים בלבד, השתמשו ב-PBS כדי לחסן את העכברים.
- יש להניח חומר סיכה אופתלמי על עיני העכברים לפני ההרדמה. מרדימים את העכברים באמצעות איזופלורן 5% ומאשרים את ההרדמה על ידי צביטת בוהן יציבה.
- לאחר שהחיה מורדמת, הוציאו אותה מתא האיזופלורן והדביקו מיד את העכברים המורדמים ב-50 μL (20 PFU) של IAV תוך טרכיאלי באמצעות פינצטה קהה כדי למשוך את הלשון מהפה ולזרום את נפח הנוזל במורד קנה הנשימה.
- הניחו את העכברים בכלוב נפרד ועקבו אחר ההחלמה עד להחלמה מלאה (הם מסוגלים לשמור על עצם החזה [מסוגלים לשכב זקוף על החזה]).
- לאחר ההחלמה, יש לחסן מיד את העכברים ב-10 מיקרוליטר (200 PFU) של IAV בשיטת החיסון בשלב 3.3.
- עכברי בית שעברו הדבקה חיידקית ונגיפית בודדת או כפולה באותה קבוצת זיהום ומפרידים אותם משאר הקבוצות.
5. מעקב אחר תסמיני המחלה בעכברים
- יש לעקוב אחר העכברים מדי יום במשך 10 ימים לפחות ולתת ניקוד עיוור לסימני מחלה באופן הבא:
- ציון כדלקמן לירידה במשקל: 0 = 5% או פחות; 1 = 5%-10%; 2 = 10%-15%; 3 = 20% או יותר. הרדימו את העכברים באמצעות שאיפתCO2 כאשר ציון הירידה במשקל הוא 3.
- ציון כדלקמן עבור פעילות: 0 = רגיל/פעיל; 1 = נע אך מופחת מעט; 2 = מופחת; 3 = ירידה חמורה/רדומה (זז רק אם נוגעים בו), 4 = תרדמת/חוסר תנועה. הרדימו את העכברים כאשר ציון הפעילות הוא 3.
- ציון כדלקמן עבור יציבה: 0 = ללא תחושה (נורמלי); 1 = יציבה כפופה מעט; 2 = תחושת בטן חמורה. הרדימו את העכברים כאשר ציון היציבה הוא 2.
- ציון כדלקמן עבור העיניים: 0 = נורמלי; 1 = בולט; 1 = שקוע; 1 = סגור; 1 = פריקה. זה יכול להיות שילוב. הוסף את הסכומים עבור ציון העין הסופי.
- ציון כדלקמן לנשימה: 0 = נשימה רגילה; 1 = לא סדיר או שונה (שיעור גבוה / נמוך יותר); 2 = עמל (מאמץ מוגזם או התנשמות). הרדימו את העכברים כאשר ציון הנשימה הוא 2.
- בהתבסס על הקריטריונים לעיל, הוסף את הציונים האישיים עבור ציון קליני כולל של בריא (0) לחולה מאוד (15). שקול כל עכבר המציג ציון כולל מעל 2 להיות חולה. הרדימו באופן אנושי כל עכבר המציג ציון כולל מעל 9 או את הציונים המצוינים עבור כל קריטריון וסמנו אותם על עקומת ההישרדות.
6. עיבוד רקמות נגועות לספירה חיידקית
- ב-48 שעות לאחר ההדבקה ב-IAV, יש להרדים את העכברים.
- הנח את העכבר במצב שכיבה. באמצעות 70% אתנול, לרסס את החזה והבטן של העכבר כדי לנקות את הפרווה. בעזרת מלקחיים, צובטים את הפרווה והעור במרכז העכבר וחותכים את הפרווה עם 4.5 מספריים דיסקציה כדי לחשוף את האזור מהכבד עד החזה.
- איסוף דם
- באמצעות מספריים דיסקציה, לחתוך בעדינות לתוך חלל הצפק כדי לחשוף את הכבד. באמצעות מלקחיים, לחשוף את וריד פורטל הכבד בחלק העליון של הכבד ליד הסרעפת. חותכים את וריד שער הכבד באמצעות מספריים דיסקציה. ברגע שהדם מתחיל להצטבר בחלל הצפק, יש לאסוף 10 מיקרוליטר דם באמצעות מיקרופיפטה ולהכניס ל-90 מיקרוליטר של תמיסת נוגדי קרישה (תמיסת EDTA של 50 מ"מ ב-PBS) בצינור מיקרוצנטריפוגה לציפוי לעומס חיידקי.
- השתמש מיקרופיפטה P-1000 כדי לאסוף את שאר הדם, לשים אותו בתוך צינור איסוף דם, צנטריפוגה, ב 7,600 × גרם במשך 2 דקות כדי לאסוף את הסרום. שמור את sera בצינורות microcentrifuge ב -80 ° C לניתוח הבא של כל ציטוקין או מטבוליט הרצוי.
- אוסף ריאות
- בעזרת מספריים לנתיחה, חתכו את צידי כלוב הצלעות החשוף ומשכו בעדינות את הצלעות כלפי מעלה לכיוון ראש העכבר כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט 25 גרם המחוברת למזרק 10 מ"ל ממולא מראש ב- PBS לחדר הימני והתחל לבלבל לאט. חפש הלבנה של הריאות כאינדיקטור של זילוח מוצלח. יש לשטוף באיטיות כדי למנוע שבירת רקמת הריאה.
- להרים את הלב עם המלקחיים ולעשות חתך כדי להפריד את הריאות ואת הלב. לאחר ההפרדה, להרים את כל האונות של הריאה עם מלקחיים ולשטוף בצלחת עם PBS סטרילי כדי להסיר כל שאריות דם. בצלחת פטרי, לטחון את הריאות לחתיכות קטנות ולערבב היטב. הסר מחצית מתערובת הריאות לקביעת CFU חיידקי או PFU נגיפי והניחו אותה בצינור תחתון עגול של 15 מ"ל ממולא מראש ב- 0.5 מ"ל PBS לצורך הומוגניזציה.
הערה: חשוב לא לקחת אונות שונות של אותה ריאה להערכות השונות. במקום זאת, יש לטחון את כל האונות, לערבב היטב זו את זו, ולנתח אותן באופן שווה עבור ההערכות השונות. - הסר את החצי השני של הריאה לצורך ציטומטריית זרימה (סעיף 7 להלן) והנח אותו בצלחת 24 בארות שאינה מטופלת בתרבית רקמה, כאשר כל באר מלאה מראש ב- 0.5 מ"ל של RP-10. יש להשאיר בטמפרטורת החדר עד לעיבוד.
- אוסף Nasopharynx
- בצוואר, השתמש מספריים דיסקציה לחתוך את הפרווה, ולאחר מכן לחתוך את השריר ולחשוף את קנה הנשימה.
הערה: קנה הנשימה הוא מבנה דמוי צינור הממוקם מתחת לשריר. - הניחו מלקחיים קטנים מתחת לקנה הנשימה במרחק של 1 ס"מ מלסת העכבר כדי לייצב אותה. באמצעות מספריים דיסקציה, בעדינות לעשות חריץ 0.1 ס"מ על החלק הקדמי של קנה הנשימה, הימנעות חיתוך קנה הנשימה לחלוטין.
- הכינו מזרק 1 מ"ל מלא 0.5 מ"ל של PBS עם צינור 0.58 מ"מ מחובר למחט 25 גרם. לאסוף את שטיפת האף על ידי החדרת הצינור לתוך קנה הנשימה עולה כלפי מעלה לכיוון האף. ברגע שהתנגדות מורגשת בכניסה לחלל האף, הניחו צינור מיקרוצנטריפוגה על האף ושטפו לאט את PBS דרך קנה הנשימה כדי לאסוף את שטיפת האף.
- מקם את העכבר במצב נוטה. לרסס את ראש העכבר עם אתנול. השתמש מספריים דיסקציה לחתוך את הפרווה כרית mystacial לחשוף את עצם הראש של העכבר.
- בעזרת מספריים דיסקציה, לעשות 1 ס"מ לחתוך את הצדדים של הלסת ובין העיניים. בעזרת מלקחיים, משכו לאט את עצמות הפנים מהגוף כדי לחשוף את חלל האף.
- השתמש במלקחיים כדי להסיר בעדינות את רקמת האף והניחו אותה לתוך צינור תחתון עגול ממולא מראש עם 0.5 מ"ל של PBS עבור הומוגניזציה.
- בצוואר, השתמש מספריים דיסקציה לחתוך את הפרווה, ולאחר מכן לחתוך את השריר ולחשוף את קנה הנשימה.
- כדי ליצור הומוגניזציה של הרקמה שנאספת, תחילה נקה את בדיקת ההומוגנייזר על ידי הכנסתו לאתנול 70% והפעלת ההומוגנייזר בעוצמה של 60% למשך 30 שניות. חזור על השלב במים סטריליים במשך 10 שניות. הומוגניזציה של כל רקמה למשך דקה אחת. נקו את בדיקת ההומוגנייזר במים סטריליים בין כל דגימה ובצינור טרי של 70% אתנול בין כל איבר וקבוצת דגימה.
- ספירת מספרי חיידקים
- לאחר שכל האיברים נקצרו והומוגניזציה, צלחות דילול סדרתי על צלחות אגר דם. כדי לחשב את סך CFU, השתמש ב- 10 μL כדי ללוח ולרשום את הנפח הסופי ב- mL עבור כל דגימה. צלחת דגימות nasopharynx על צלחות אגר דם בתוספת 3 מיקרוגרם / מ"ל gentamicin כדי לבחור את הצמיחה של S. pneumoniae תוך עיכוב הצמיחה של מיקרואורגניזמים אחרים ליישב את הרקמה. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C/5% CO2.
- כדי למנות את CFU חיידקי עבור הריאה ואת nasopharynx, תחילה לספור את המושבות על צלחות אגר הדם. לאחר מכן, השתמש במשוואה (1) ובמשוואה (2) כדי לחשב את הסכום למ"ל ואת המספר הכולל.
כמות למ"ל = מספר מושבות × גורם דילול × 100 (1)
המספר הכולל = כמות למ"ל × נפח כולל לדגימה (2)
הערה: במשוואה (1), 100 משמש להכפלה מכיוון ש- 10 μL מצופה, שהוא דילול פי 100 של 1 מ"ל. הנפח הכולל לדגימה במשוואה (2) הוא משלב 6.7.1, מה שמביא למגבלת הזיהוי של 100 לכל איבר. - כדי למנות את CFU חיידקי עבור חיידקים, תחילה לספור את המושבות על צלחות אגר הדם. לאחר מכן, השתמש במשוואה (3) כדי לקבוע את הכמות לכל מ"ל דם.
כמות למ"ל דם = מספר מושבות × גורם דילול × 100 × 10 (3)
הערה: במשוואה (3), 100 משמש כ- 10 μL מצופה, שהוא דילול פי 100 של 1 מ"ל, ו- 10 מציין דילול של 1:10 של הדם בנוגדי קרישה. התוצאה היא מגבלת זיהוי של 1,000/מ"ל.
7. עיבוד דגימות הריאה לציטומטריית זרימה
- הכן את המדיה הנדרשת באופן הבא:
- הכן את RP-10 כמתואר בשלב 2.1.
- הכינו את חיץ העיכול על ידי ערבוב RP-10 עם 2 מ"ג/מ"ל קולגנאז ו-30 מיקרוליטר/מ"ל DNase I.
- הכן חיץ ליזיס על ידי המסת 8.29 גרם של NH4Cl, 1 גרם של NaHCO3, ו 0.038 גרם של EDTA ב 1 L של H2O.
- הכן מאגר FACS 10x על ידי ערבוב 450 מ"ל של HBSS עם 50 מ"ל של FBS מומת בחום ו -5 גרם של נתרן אזיד.
- הכן מאגר FACS אחד על-ידי דילול 50 מ"ל של מאגר FACS 10x ב- 450 מ"ל HBSS.
- קח את דגימות הריאה משלב 6.4.3 ומניחים בצלחת 24 בארות. הוסף 500 μL של חיץ העיכול לכל באר. יש לדגור במשך 45 דקות עד שעה אחת בטמפרטורה של 37°C/5% CO2.
- מלא מראש 50 מ"ל צינורות חרוטי עבור כל דגימה עם 5 מ"ל של RP-10. בסיום הדגירה, הניחו מסנן של 100 מיקרומטר בחלק העליון של הצינור החרוטי בנפח 50 מ"ל והרטיבו אותו ב-1 מ"ל RP-10.
- באמצעות מיקרופיפטה P-1000, להזיז את הריאות מעוכלות ולהניח אותם על המסנן. השתמש בבוכנה של מזרק 3 מ"ל כדי לרסק את האיבר. יש לשטוף פעמיים עם 1 מ"ל RP-10 בכל פעם.
- סובבו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C ו-327 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של חיץ ליזיס. להשאיר במשך 3 דקות כדי לאפשר ליזה של תאי הדם האדומים. נטרול עם 5 מ"ל של RP-10.
- סובבו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C ו-327 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה ב -1 מ"ל של RP-10, וקחו 10 מיקרוליטר לספירת הדגימות.
- סובבו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C ו-327 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-RP-10 ב-2 × 10 6-4 × 106 תאים/מ"ל. הוסף 60 μL מכל דגימה ללוח של 96 בארות כדי להכתים את סוגי התאים הרצויים23 המפורטים בשלב 7.9, טבלה 5 וטבלה 6.
- סובבו את הצלחת בטמפרטורה של 4°C ו-327 × גרם למשך 5 דקות.
- בינתיים, הכינו את תערובות מאסטר הנוגדנים, פלורסנט מינוס אחד (FMOs), ובקרות כתם יחיד עם הנוגדנים הרצויים. כדי להכתים לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים (PMN), מקרופאגים, מונוציטים, תאים דנדריטיים ותאי T, השתמש בנוגדנים ובדילולים הסופיים המפורטים בטבלה 5 ובטבלה 6. השתמש בנפח כולל של 100 μL / well של תערובת הנוגדנים. עקוב אחר הדילולים המפורטים בטבלאות לקביעת הנפח המתאים של תערובת האב והנוגדנים הבודדים הנדרשים.
- כאשר הסחרור מסתיים (שלב 7.8), נטרלו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הכדוריות ב-100 מיקרוליטר של תערובות הנוגדנים, FMOs או בקרות עם כתם יחיד, ודגרו על קרח במשך 30 דקות בחושך.
- שטפו את התאים פי 2 על ידי הוספת 150 מיקרוליטר של חיץ FACS לבארות וסיבוב הצלחת בטמפרטורה של 4°C ו-327 × גרם למשך 5 דקות.
- בסיום הסיבוב, מרוקנים את הסופרנטנט, משעים מחדש את הכדוריות ב-100 מיקרוליטר של חיץ קיבוע, ודגרים על קרח למשך 20 דקות.
- שטפו את התאים 2x על ידי הוספת 150 μL של חיץ FACS לבארות וסיבוב הצלחת ב 4 ° C ו 327 × גרם במשך 5 דקות.
- הכינו שפופרות FACS מסומנות עם מאגר FACS של 200 μL. השהה מחדש את הכדוריות ב 150 μL של חיץ FACS. סנן בנפרד כל דגימה לתוך צינור FACS המתאים לה באמצעות מסנן של 100 מיקרומטר. יש לשמור על קרח או בטמפרטורה של 4°C ולהגן מפני האור עד לניתוח.
- נתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה.
8. בדיקת פלאק לספירת IAV
- הכן את המדיה הנדרשת באופן הבא:
- הכינו את מדיום הזיהום על ידי המסת 2.5 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) לתוך 40 מ"ל DMEM תוך ערבוב ב-37°C במשך 10-20 דקות עד להמסה. סנן-לעקר לתוך 460 מ"ל של DMEM.
- הכינו תאית מיקרוקריסטלינית 2.4% על ידי המסת 1.2 מ"ג של תאית מיקרוקריסטלינית לתוך 50 מ"ל של H2O. Autoclave על ההגדרה הנוזלית ואחסנו בטמפרטורת החדר.
- הכן 5% של BSA DMEM על ידי המסת 2.5 גרם BSA לתוך 40 מ"ל של DMEM תוך ערבוב ב 37°C במשך 10-20 דקות. הוסף את 10 מ"ל הנותרים של DMEM לקבלת נפח סופי של 50 מ"ל. יש לסנן-לעקר ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
- הכן 2x MEM / 0.5% BSA על ידי ערבוב 1 מ"ל של 5% BSA DMEM עם 9 מ"ל של 2x MEM.
- הכינו שכבת על בצמיגות נמוכה על ידי ערבוב יחס של 1:1 של 2.4% תאית מיקרוקריסטלינית ו-2x MEM/0.5% BSA עם טריפסין TPCK (מעכב כימוטריפסין) 1 מ"ג/מ"ל.
- הכן EMEM/10% FBS על ידי ערבוב 450 מ"ל של Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) עם 50 מ"ל של FBS מומת חום.
- גדל את קו תאי הכליה הכלבי Madin-Darby (MDCK). הוסף את התאים מבקבוקון אחד שנרכש ל- 5 מ"ל EMEM/10% FBS בבקבוק T-25 שטופל בתרבית רקמה. יש לדגור במשך 3-5 ימים בטמפרטורה של 37°C/5% CO2 עד שהתאים מגיעים למפגש של 100%. בדוק את המפגש כמו בשלב 2.3.
- יש להסיר ולהשליך את מדיום התרבית, ולשטוף 2x עם 5 מ"ל של PBS בטמפרטורת החדר. הוסף 1 מ"ל של טריפסין-EDTA לבקבוק ודגור ב 37 ° C / 5% CO2 במשך 10-15 דקות עד שהתאים מתנתקים. לאחר ההרמה, נטרל עם 4mL של EMEM/10% FBS כדי לקבל תרחיף תאים ב 2 × 105 תאים / מ"ל.
- זרעו את תאי ה-MDCK בצלחת שטופלה בתרבית רקמה של 12 בארות על ידי הוספת 1 מ"ל של תאים מרחפים לכל באר (ב-2 × 10,5 תאים/באר) יום אחד לפני תחילת בדיקת הפלאק.
הערה: יש לוודא שהתאים מגיעים למפגש של 100% לפני השימוש ולדגור למשך זמן רב יותר במידת הצורך כדי להגיע למפגש. - לשימוש כסטנדרטים, בצע דילולים סדרתיים פי 10 (106-10 1) של מלאי IAV (של טיטר ידוע) בתווך הזיהום המפורט בשלב 8.1.1. בצע 1.2 מ"ל מכל דילול לבדיקה משולשת.
- הפשירו את האיבר על קרח. מסתובבים על צנטריפוגה שולחנית במשקל 2,000 × גרם ואוספים את הסופרנטנט השקוף.
- חזור על שלב 8.5 אך עם הסופרנאטנט מהדגימות בשלב 8.6.
- לשאוף את המדיום מן התאים ולשטוף 2x עם 1 מ"ל של PBS כדי להסיר את כל FBS.
- הוסיפו 300 מיקרוליטר מכל דילול סטנדרטי או דגימה בדילול סדרתי בעדינות לאורך הצד של כל באר, החל מהדילול הגבוה ביותר ועד הנמוך ביותר, ועשו זאת בשלשה.
- הניחו את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37°C/5% CO2, ונערו את הצלחת כל 10 דקות למשך 50 דקות בסך הכל. הקפידו למקם אותם שטוחים באינקובטור ולא לערום אותם.
- לאחר 50 דקות, לשטוף את התאים 2x עם 1 מ"ל של PBS.
- הוסף 2 מ"ל של מדיום כיסוי צמיגות נמוכה לכל באר למעט הבארות הדילול הנמוך ביותר וללא וירוס; לאלה, להוסיף מדיום זיהום וטריפסין.
- החזירו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37°C/5% CO 2 למשך2-4 ימים כדי להשיג פלאקים שניתן לדמיין בעין בלתי.
- שטפו את הצלחות על ידי הוספת 2 מ"ל PBS לכל באר מהר מהצד ונערו בעדינות כדי להשעות את מדיום הכיסוי בצמיגות נמוכה.
- יש להשליך את כל נפח הנוזל לבאר על ידי סילוק עדין של המדיום.
- חזור על הכביסה פעם נוספת עם 2 מ"ל PBS בכל באר, ולאחר מכן להשליך את כל נפח הנוזל על ידי pipetting עדין.
- כדי לתקן את הפלאקים, להוסיף 500 μL של 4% paraformaldehyde לתוך כל באר, לנער, ולתת לשבת במשך 30 דקות.
- לשטוף לאט בצד עם 1 מ"ל של PBS; לאחר מכן, השליכו בעדינות את הנוזל.
- הוסף 500 μL של 1% סגול קריסטל (מדולל במים) לכל באר כדי לכסות את monolayer התא. דוגרים במשך 5 דקות.
- לשטוף עם 1 מ"ל של מי ברז. הקפידו להשליך את כל הנוזלים לבאר על ידי פיפטינג עדין. הניחו את הצלחת הפוכה על כרית החתלה לייבוש למשך הלילה.
- ספור את הלוחות באופן חזותי ושמור את התמונות בכל מכונת צילום זמינה.
Representative Results
S. pneumoniae שגודלו בביופילם (איור 1A) שימשו כדי להדביק עכברים (איור 1B) באמצעות חיסון קטן של 10 μL שהועבר דרך האף לעכברים לא מורדמים. החיסון בנפח קטן הזה גורם להובלה עקבית של פנאומוקוק המוגבלת לאף ולוע (איור 2A, +sp קבוצות) תוך הימנעות מהתפשטות מערכתית (איור 2B,C, +sp קבוצות). יומיים לאחר החיסון התוך-אפי, העכברים נדבקו בנגיף שפעת H1N1 A A/PR/8/34 (IAV)22,30 המותאם למורין ובאופן תוך-אפי כדי להשיג אספקה עקבית של כמויות ספציפיות לאף ולריאות 23.
כאן, המודל שימש להשוואת מהלך המחלה לאחר זיהום ויראלי בעכברים המאותגרים תוך אפית עם זנים שונים של S. pneumoniae, כולל TIGR4 ו- D39, שהם זנים פולשניים הגורמים לדלקת ריאות המתקדמת לחיידקים, ו- EF3030, שהוא זן דלקת האוזן התיכונה 21,24,25,26,31. הצגת המחלה בעכברים נגועים ב-S. pneumoniae/IAV הייתה תלויה בזן החיידקי (איור 2). בעוד שלא היה הבדל משמעותי במספר החיידקים של הלוע (איור 2A) בין אף אחד מהזנים, S. pneumoniae TIGR4 ו-D39, אך לא EF3030, הופצו לריאות עד 48 שעות לאחר זיהום IAV (איור 2B). ארבעים אחוז מהעכברים שנדבקו ב-S. pneumoniae TIGR4 הפגינו הפצה חיידקית לריאות, ומתוכם מחצית מהם הפכו לחיידקיים (איור 2C), בהתאם לממצאים קודמים23.
עכברים שנדבקו ב-S. pneumoniae D39 הראו הפצה יעילה יותר, מאחר שהתפשטות לריאות נצפתה ב-100% מהעכברים שנדבקו יחד (איור 2B). בדומה ל-S. pneumoniae TIGR4, מחצית מאלה חוו חיידק (איור 2C). במעקב אחר ההישרדות הכוללת, ללא קשר לזן החיידקי, שיעור ההישרדות של עכברים שנדבקו במשותף היה נמוך משמעותית מהעכברים שאותגרו עם S. pneumoniae בלבד עבור כל הזנים שנבדקו (איור 2D). בהשוואה לעכברי הביקורת שאותגרו עם IAV בלבד, העכברים שנדבקו ב-S. pneumoniae TIGR4 ו-D39, אך לא ב-EF3030, הציגו שיעורי מחלה מואצים. עד היום השני לאחר ההדבקה ב-IAV, 30% (D39) ו-20% (TIGR4) מהעכברים נכנעו, בעוד שקבוצות הביקורת של IAV בלבד החלו להיכנע רק ביום 5 שלאחר האתגר (איור 2D). לעכברים שנדבקו יחד ב-S. pneumoniae EF3030 וב-IAV היו תסמינים מאוחרים, דומים יותר לבקרות של IAV בלבד (איור 2D). ממצאים אלה מראים כי מודל ההדבקה המשותפת גורם למחלה בעכברים צעירים ובריאים התלויה בזנים חיידקיים, מה שהופך אותו לאידיאלי לחקר הגורמים החיידקיים הנדרשים בכל שלב של התקדמות המחלה.
מודל זה שימש להערכת נוכחותם של תאי חיסון שונים בריאות (סוגי תאים ואסטרטגיית gating באיור 3) לאחר זיהום IAV בעכברים שחוסנו בזנים שונים של S. pneumoniae. הזנים החיידקיים D39 ו-TIGR4, שהתפזרו לריאות בעקבות זיהום IAV, גרמו לעלייה משמעותית מעל קו הבסיס (לא נגועים) בזרם של תאי חיסון דלקתיים ממחזור הדם, כמו למשל נויטרופילים (PMN) ומונוציטים, בעוד ש-EF3030 לא (איור 4A-C). זיהום IAV לבדו גרם לעלייה משמעותית מעבר לקו הבסיס בזרם תאי החיסון החשובים להגנה של המאכסן מפני זיהום נגיפי, כמו למשל תאי NK ותאי T מסוג גמא-דלתא (איור 4A-C). התגובות האנטי-ויראליות האלה היו קהות באופן משמעותי בעכברים שנדבקו בדלקת ריאות S. לפני האתגר הנגיפי (איור 4A-C). זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהעריכו תגובות ציטוקינים שמצאו כי הובלת S. pneumoniae הקהתה את הייצור של אינטרפרונים מסוג I ופגעה ביכולתו של המארח לשלוט בעומסי IAV בריאות23. ממצאים אלה מראים כי ניתן להשתמש במודל הזיהום המשותף כדי לחקור כיצד תגובות חיסוניות משתנות בזיהומים מונו לעומת זיהומים רב-מיקרוביאליים.
מודל זה שימש גם להערכת השפעת ההזדקנות על מהלך המחלה לאחר זיהום IAV בעכברים שנדבקו תוך אפית ב-S. pneumoniae TIGR4. בעכברים שנדבקו ביחידות, הטיטרים הנגיפיים לא השתנו בין קבוצות צעירות וגילאיות (איור 5A)23. כמו במחקרים קודמים23, עכברים זקנים הראו סימני מחלה מוקדמים יותר וחמורים יותר באופן משמעותי בהשוואה לעמיתיהם הצעירים, כפי שהודגם בציונים הקליניים הגבוהים יותר (איור 5B). בהתאם לתסמיני המחלה, עכברים זקנים שחוסנו בדלקת ריאות S. החלו למות מהר יותר תוך 24 שעות לאחר ההדבקה ב-IAV, וכולם מתו מהמחלה, בעוד שקבוצת הביקורת הצעירה שרדה את הזיהום בשיעור גבוה משמעותית (33%) (איור 5C). ממצאים אלה מראים כי ניתן להשתמש במודל ההדבקה המשותפת כדי לזהות מחלה חמורה יותר אצל מארחים פגיעים, מה שהופך אותו לאידיאלי לחקר גורמי מארח המקנים עמידות או רגישות להדבקה משותפת.
איור 1: ציר הזמן של זיהום משותף ועיבוד איברים להערכת זרימת תאי מערכת החיסון ונטל הפתוגנים . (A) סטרפטוקוקוס דלקת ריאות גדלים בביופילמים. (B) עכברים מחוסנים דרך האף עם 5 × 106 CFU של זן S. pneumoniae שגדל בביופילם כדי ליצור הובלה של האף והלוע או לא מטופלים. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, העכברים מטופלים ב-PBS או מקבלים 200 PFU של נגיף שפעת A PR8 תוך אפי ו-20 PFU תוך טרככי. עכברים מנוטרים לאורך זמן לציוני מחלות קליניות והישרדות. (C) ב-48 שעות לאחר ההדבקה ב-IAV, נבדקים CFU חיידקי או PFU נגיפי באיברים השונים או זרימת תאי מערכת החיסון בריאות. קיצורים: CFU = יחידות יוצרות מושבה; PFU = יחידות יוצרות לוח; IAV = שפעת וירוס A PR8; IT = intratracheally; NP = nasopharyngeally. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהום IAV תוך-אף/תוך-טרכאלי כפול בעכברים שחוסנו בדלקת ריאות S. pneumoniae מוביל להתפשטות חיידקים ולמחלות התלויות בזן החיידקי. עכברים צעירים (בני 10-12 שבועות) זכרים C57BL/6 (B6) נדבקו כמו באיור 1. מספרי החיידקים בלוע (A), בריאות (B) ובדם (C) נקבעו כולם 48 שעות לאחר זיהום IAV. (ב,ג) אחוזים מציינים את שבריר העכברים שהציגו התפשטות. (D) ההישרדות נוטרה במשך 10 ימים לאחר ההדבקה ב-IAV. מוצגים נתונים מאוגמים מ- (A,B) n = 5, (C) n = 11 ו- (D) n = 6 עכברים לכל קבוצה. כל מעגל מתאים לעכבר אחד, והקווים המקווקווים מציינים את גבול הזיהוי. (A-C) *, מציין הבדל משמעותי (p < 0.05) בין הקבוצות שצוינו כפי שנקבע במבחן Kruskal-Wallis. (D) *, מציין הבדל משמעותי (p < 0.05) בין +sp ועכברי Co-inf לכל זן חיידקי כפי שנקבע על ידי מבחן log-rank (Mantel-Cox). קיצורים: +sp = עכברים נגועים intranasally עם חיידקים רק באמצעות הזן המצוין; Co-inf = עכברים נגועים בחיידקים שנדבקו ב- IAV; IAV = עכברים שקיבלו את נגיף שפעת A; CFU = יחידות יוצרות מושבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אסטרטגיית התאגדות תאי מערכת החיסון. הריאות נקצרו, וזרם תאי החיסון נקבע על ידי ציטומטריית זרימה. מוצגת אסטרטגיית ה-gating המייצגת של סוגי התאים השונים. (A) CD45+, תאים בודדים חיים היו מגודרים והאחוזים של (B) PMN (Ly6G+, CD11b+), מקרופאגים (Ly6G-, Ly6C-, F480+), ומונוציטים (Ly6G-, Ly6C+), (C) DCs (Ly6G-, CD11c+) ותאי NK (NK1.1+, CD3-), (D) TCR- γΔ ו- CD8 (CD8+, TCRβ+) ו- CD4 (CD4+, TCRβ+ ) נקבעו תאי T. קיצורים: SSC-A = אזור פיזור-שיא צד; FSC-A = אזור פיזור-שיא קדמי; FSC-H = גובה פיזור שיא קדימה; SSC-W = רוחב פיזור-שיא צד; L/D = חי/מת; FMO = פלורסנט מינוס אחד; NK = רוצח טבעי; PMN = לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים; DC = תא דנדריטי; TCR = קולטן תא T. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תגובות חיסוניות ריאתיות תלויות בזן חיידקי. עכברים זכרים צעירים (בני 10-12 שבועות) C57BL/6 לא נדבקו, חוסנו ביחידות בזן Streptococcus pneumoniae המצוין (+sp), אותגרו ביחידות עם IAV (IAV), או נדבקו יחד עם S. pneumoniae ו- IAV (Co-inf). ארבעים ושמונה שעות לאחר ההדבקה ב-IAV (ראו את תכנון הניסוי באיור 1), הריאות נקצרו, וזרימת תאי החיסון נקבעה על-ידי ציטומטריית זרימה בעקבות אסטרטגיית ה-gating באיור 3. (A) האחוזים הממוצעים של כל סוג תא מצוין בתוך שער CD45 מוצגים עבור כל קבוצות הטיפול במפת החום. (B) חלקות נקודות מייצגות של סוגי תאים שהציגו הבדלים משמעותיים בין טיפולים מוצגות עבור כל קבוצת עכברים. (C) האחוזים של סוגי תאי החיסון שצוינו מוצגים. כל עיגול מתאים לעכבר אחד. (א,ג) מוצגים נתונים מאוגמים מ-n = 5 עכברים לקבוצה. *, מציין הבדל משמעותי (p < 0.05) בין Co-inf ולא נגוע; $, מציין משמעותי בין IAV ללא נגוע; #, מציין הבדל משמעותי בין Co-inf לבין IAV בלבד. הבדלים משמעותיים בין קבוצות האתגר עבור כל סוג תא נקבעו על ידי ANOVA ואחריו מבחן Tukey. קיצורים: NK = רוצח טבעי; PMN = לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים; DC = תא דנדריטי; TCR = קולטן תא T; IAV = וירוס שפעת A. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הזדקנות ורגישות מוגברת של מארחים לזיהום משותף בדלקת ריאות IAV/סטרפטוקוקוס . עכברים זכרים צעירים (10-12 שבועות) ובגילאי 21-22 חודשים, C57BL/6 נדבקו יחד ב-S. pneumoniae , TIGR4, i.n. ו-IAV, i.n. ו-i.t. (כמו באיור 1), או התמודדו לבדם עם IAV בלבד. (A) טיטרים נגיפיים נקבעו 48 שעות מאוחר יותר. כוכביות מציינות מובהקות סטטיסטית (p < 0.05) כפי שנקבע במבחן t של התלמיד. הנתונים נאספים מ-n = 4 עכברים לקבוצה. (B) הציון הקליני ו-(C) ההישרדות נוטרו לאורך זמן. (B) מוצג הממוצע ± SEM מאוגד מ-n = 6 עכברים לקבוצה. כוכביות מצביעות על מובהקות סטטיסטית (p < 0.05) בין עכברים צעירים לעומת זקנים בנקודת הזמן שצוינה כפי שנקבע במבחן מאן-ויטני. (C) הנתונים נאספים מ-n = 6 עכברים לקבוצה. כוכביות מצביעות על מובהקות סטטיסטית (p < 0.05) בין עכברים צעירים לעומת זקנים כפי שנקבע על ידי מבחן לוג-דרג (Mantel-Cox). קיצורים: IAV = וירוס שפעת A; i.n. = intranasally; i.t. = intratracheally; SEM = שגיאת תקן של הממוצע. איור 5A הודפס מחדש באישור Joma et al.23. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| Mix I stock for CDM | |
| אדנין | 0.1 גרם |
| די-אלנין | 0.25 גרם |
| CaCl2 נטול מים | 0.025 גרם |
| מנגן סולפט | 0.03 גרם |
| ציאנוקובלמין | 100 μL של 10 מ"ג/מ"ל מלאי |
| חומצה פארא-אמינובנזואית | 400 μL של 5 מ"ג/מ"ל מלאי |
| פירידוקסאמין 2HCl | 100 μL של 10 מ"ג/מ"ל מלאי |
| מניית Mix II עבור CDM | |
| גואנין | 0.05 גרם |
| אורסיל | 0.05 גרם |
| מניית Mix III עבור CDM | |
| ברזל ניטראט 9H2O | 50 מ"ג/מ"ל |
| ברזל סולפט 7H2O | 10 מ"ג/מ"ל |
| Mix IV stock for CDM | |
| בטא-ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד | 25 מ"ג/מ"ל |
טבלה 1: ערבוב מניות I, II, III ו- IV עבור CDM. קיצור: CDM = מדיה מוגדרת כימית.
| מלאי תערובת ויטמינים עבור CDM | |
| פירידוקסל הידרוכלוריד | 0.8 גרם |
| תיאמין Cl2 | 0.4 גרם |
| ריבופלבין | 0.4 גרם |
| קא-פנטותנט | 0.4 גרם |
| ביוטין | 0.04 גרם |
| חומצה פולית | 0.4 גרם |
| ניאצינאמיד | 0.4 גרם |
טבלה 2: מלאי תערובת ויטמינים עבור CDM. קיצור: CDM = מדיה מוגדרת כימית.
| מלאי חומצות אמינו עבור CDM | |
| אל-אלנין | 0.480 גרם |
| ל-ארגינין | 0.250 גרם |
| ל-אספרגין | 0.700 גרם |
| L-חומצה אספרטית | 0.600 גרם |
| ל-ציסטאין | 1.000 גרם |
| ל-ציסטין | 0.100 גרם |
| L-חומצה גלוטמית | 0.200 גרם |
| ל-גלוטמין | 0.780 גרם |
| ל-גליצין | 0.350 גרם |
| ל-היסטידין | 0.300 גרם |
| ל-איזולאוצין | 0.430 גרם |
| ל-לאוצין | 0.950 גרם |
| ל-ליזין | 0.880 גרם |
| ל-מתיונין | 0.250 גרם |
| ל-פנילאלנין | 0.550 גרם |
| ל-פרולין | 1.350 גרם |
| ל-סרין | 0.680 גרם |
| ל-תראונין | 0.450 גרם |
| ל-טריפטופן | 0.100 גרם |
| ל-ולין | 0.650 גרם |
טבלה 3: מלאי חומצות אמינו עבור CDM. קיצור: CDM = מדיה מוגדרת כימית.
| מלאי התחלתי עבור CDM | |
| דקסטרוז | 1.0 גרם |
| מגנזיום גופרתי-7-הידרט | 0.070 גרם |
| אשלגן פוספט דיבייסיק | 0.02 גרם |
| אשלגן פוספט מונובייסיק | 0.1 גרם |
| נתרן אצטט נטול מים | 0.45 גרם |
| סודיום ביקרבונט | 0.25 גרם |
| נתרן פוספט דיבסיסי | 0.735 גרם |
| נתרן פוספט מונובייסיק | 0.32 גרם |
| תוספים סופיים עבור CDM | |
| כולין כלוריד | 0.1 גרם |
| ל-ציסטאין הידרוכלוריד | 0.075 גרם |
| סודיום ביקרבונט | 0.25 גרם |
טבלה 4: מלאי התחלתי ותוספים סופיים עבור CDM. קיצור: CDM = מדיה מוגדרת כימית.
| נוגדן/פלואורופור | שיבוט | גורם דילול |
| L / D לעירור UV | לא ישים | 0.38888889 |
| Ly6G AF 488 | 1א8 | 0.25 |
| נגמ"ש CD11b | M1/70 | 0.25 |
| CD11c PE | N418 | 0.18055556 |
| בלוק Fc עכבר | 2.4G2 | 0.11111111 |
| F4/80 PE Cy7 | BM8 | 0.18055556 |
| Ly6C BV605 | אל-21 | 0.25 |
| CD103 BV 421 | M290 | 0.18055556 |
| CD45 APC-eF-780 | 30-F11 | 0.18055556 |
טבלה 5: לוח נוגדנים 1.
| נוגדן/פלואורופור | שיבוט | גורם דילול |
| L / D לעירור UV | לא ישים | 0.388888889 |
| TCR-β APC Cy7 | H57-597 | 0.180555556 |
| CD4 V450 (כחול פסיפי) | RM4-5 | 0.25 |
| CD8 BV650 | 53-6.7 | 0.180555556 |
| בלוק Fc עכבר | 2.4G2 | 0.111111111 |
| CD45 PE | 30-F11 | 0.180555556 |
| CD3 AF488 | 145-2ג11 | 0.180555556 |
| TCR- γΔ APC | GL-3 | 0.180555556 |
| NK1.1 AF 700 | PK136 | 0.180555556 |
טבלה 6: לוח נוגדנים 2.
Discussion
רוב המחקרים הניסיוניים הקיימים של S. pneumoniae/IAV מסתמכים על העברת חיידקים לריאות של עכברים שנדבקו מראש ב-IAV. מודלים אלה סייעו לזהות שינויים בסביבת הריאות ובתגובה חיסונית מערכתית שהופכים את המארח לרגיש לזיהום חיידקי משני15,16,17,32,33,34,35,36,37. עם זאת, מודלים אלה לא הצליחו לחקות את המעבר של S. pneumoniae מ colonizer אסימפטומטית לפתוגן המסוגל לגרום לזיהומים ריאתיים וסיסטמיים חמורים. יתר על כן, מודלים אלה אינם מתאימים לחקר הגורמים המארחים ואינטראקציות מארח-פתוגן בדרכי הנשימה העליונות התורמות לרגישות לזיהום. מודל קודם לתנועה של פנאומוקוקים מהלוע לריאה לאחר זיהום IAV הסתמך על זיהום חיידקי של הלוע ואחריו זיהום ויראלי. עם זאת, הוא לא הצליח לשחזר את סימני המחלה החמורים שנצפו בחולים אנושיים21. מודל זיהום מורין שונה המתואר כאן משחזר את המעבר של S. pneumoniae מהובלה אסימפטומטית לפתוגן הגורם למחלה קלינית קשה.
שלב קריטי של מודל זה הוא הקמת זיהום S. pneumoniae ב nasopharynx. Streptococcus pneumoniae יוצרים ביופילמים ומאכלסים את הלוע ביעילות שונה21,38. כדי לבסס זיהום עקבי, נדרשים לפחות 5 × 106 CFU של זני חיידקים שגודלו בביופילם שנבדקו עד כה23. מומלץ לבדוק כל זן חיידקי חדש לזיהום יציב של הלוע לפני הדבקה ויראלית. עבור זיהום משותף ויראלי, מחקרים קודמים מצאו כי זיהום תוך אפי עם IAV נדרש לפיזור החיידקים מן הלוע21,22,23. במחקרים קודמים אלה, 500 PFU של IAV עבור משלוח intranasal שימשו, בעוד במחקר זה, 200 PFU היו מספיקים כדי להגדיל את מספר החיידקים בלוע. זיהום IAV אינו מוגבל לדרכי הנשימה העליונות ויכול להתפשט לריאות39,40, שהוא המפתח להפיכת הסביבה הריאתית למתירנית יותר לזיהום חיידקי15,16,41. משלוח IAV לריאות יכול להיות מושג על ידי משלוח intranasal או התקנה intratracheal של עכברים מורדמים. עבודה קודמת עם עכברי BALB/cByJ מצאה כי העברה תוך אפית גורמת לדלקת ריאות ויראלית21; עם זאת, הגישה של החיסון לריאות לאחר חיסון תוך אפי מוגבלת יותר בעכברי C57BL/6. בעכברי C57BL/6, נדרשת התקנה תוך טרכאלית לאספקה עקבית של הנגיף23. במודל זה, נשאות חיידקים קודמת מאיצה את הצגת תסמיני המחלה לאחר זיהום ויראלי23. מכיוון שזיהום ויראלי כשלעצמו יכול לגרום לתסמיני מחלה עם שונות פוטנציאלית בקינטיקה, מומלץ לבדוק תחילה מגוון מינונים לכל זן נגיפי חדש שנבדק ולבחור מינון החושף קינטיקה מואצת אצל מארחים שנדבקו במשותף.
הריאות מספקות קריאה קריטית נוספת להערכת מחלות במודל זה. להערכת נטל הפתוגן וזרם תאי החיסון, ניתן להשתמש בריאה מאותו עכבר. עם זאת, מכיוון שזיהום וחומרת דלקת יכולים להיות שונים בין אונות, מומלץ לא לקחת אונות שונות של אותה ריאה להערכות השונות. במקום זאת, ניתן לטחון את כל האונות לחתיכות קטנות, לערבב היטב יחד, ואז לנתח אותן באופן שווה עבור ההערכות השונות. באופן דומה, nasopharynx יכול לשמש לספירה של CFU חיידקי או PFU נגיפי ותגובה חיסונית. עם זאת, מספר התאים המתקבלים מהשטיפות והרקמה נמוך מכדי לבצע ציטומטריית זרימה מבלי לאגד את הדגימות מעכברים באותה קבוצה. לחלופין, דלקת בלוע ניתן להעריך היסטולוגית23.
מאפיין קריטי של מודל זה הוא שהוא משחזר את המחלה הקלינית שנצפתה בחולים. בבני אדם, דלקת ריאות פנאומוקוקית משנית לאחר זיהום IAV גורמת לעתים קרובות לסימנים ברורים של מחלה, כולל שיעול, קוצר נשימה, חום וכאבי שרירים שיכולים להוביל לאשפוזים, כשל נשימתי, ואפילו מוות 8,15,42,43. מודל זה משחזר את הסימנים החמורים של מחלה קלינית שנצפו בבני אדם במונחים של קשיי נשימה (המשתקפים בניקוד הנשימה) וחולשה כללית (המשתקפת בציוני יציבה ותנועה) שהוצגו על ידי העכברים, כמו גם מוות בחלק מקבוצת הביקורת הצעירה והבריאה. תסמיני המחלה המחמירים בעכברים שנדבקו במשותף הם ככל הנראה תוצאה של הפצת חיידקים לריאות ופגיעה בסילוק הנגיפים בעכברים עם נשאה פנאומוקוקית23. מגבלה של המודל היא ששכיחות המחלה הקלינית והפצת החיידקים מהלוע משתנה בין עכברים ומושפעת מזן חיידקי, גיל המאכסן וגנוטיפ21,22,23. המשקף זאת, עבור זנים פולשניים, ההתקדמות מזיהום מקומי (ללא חיידק ניתן לזיהוי) למוות יכולה להתרחש תוך 24 שעות. לכן, להערכה אמיתית של התפשטות מערכתית, יש לעקוב אחר חיידקים בפרקי זמן קצרים יותר (כל 6-12 שעות). באופן דומה, ציון המחלה יכול להשתנות במהירות, במיוחד ב -72 השעות הראשונות לאחר זיהום משותף. לכן, כדי לעקוב מקרוב אחר תסמיני המחלה, מומלץ לעקוב אחר עכברים שלוש פעמים ביום במשך ימים 1-3 לאחר זיהום IAV.
לסיכום, מודל זה משכפל את התנועה של S. pneumoniae ממתיישב אסימפטומטי של הלוע לפתוגן המסוגל לגרום למחלה ריאתית וסיסטמית עם זיהום IAV. במודל זה, IAV מעורר את המעבר של S. pneumoniae באמצעות שינוי ההתנהגות החיידקית בלוע, הגברת התפשטות החיידקים לריאה, ושינוי חסינות אנטיבקטריאלית23. באופן דומה, הובלת חיידקים מקהה את התגובה החיסונית האנטי-ויראלית ופוגעת בסילוק IAV מהריאות23. זה הופך את המודל הזה לאידיאלי לניתוח שינויים בתגובות החיסון בזיהומים חד-מיקרוביאליים לעומת זיהומים רב-מיקרוביאליים. בנוסף, מהלך המחלה לאחר זיהום משותף תלוי, בחלקו, בזן של pneumococci נוכח nasopharynx. לכן, המודל מתאים לנתח את הגורמים החיידקיים הדרושים לנשאות אסימפטומטית לעומת מעבר פתוגני של S. pneumoniae. לבסוף, מודל זה משחזר את רגישות ההזדקנות לזיהומים משותפים, ולמרות שזה לא נבדק כאן, ניתן להשתמש בו בקלות כדי להעריך את ההשפעה של רקע המארח על מהלך המחלה. לסיכום, הפרדת ההובלה והמחלה לשלבים נפרדים מספקת הזדמנות לנתח את הווריאנטים הגנטיים הן של הפתוגנים והן של המאכסן, ומאפשרת בחינה מפורטת של יחסי הגומלין של פתוביונט חשוב עם המארח בשלבים שונים של התקדמות המחלה. בעתיד, מודל זה יכול לשמש להתאמת אפשרויות טיפול עבור מארחים פגיעים.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לניק לנהרד על הקריאה והעריכה הביקורתית של כתב היד הזה. ברצוננו להודות גם לאנדרו קמילי ואנתוני קמפנארי על זני החיידקים ולברוס דייווידסון על הזנים הנגיפיים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המכון הלאומי לבריאות (R21AG071268-01) ל- J.L. והמכון הלאומי למענקי בריאות (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) ל- E.N.B.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminobenzoic acid | Fisher | AAA1267318 | Mix I stock |
| 96-well round bottom plates | Greiner Bio-One | 650101 | |
| 100 µm Filters | Fisher | 07-201-432 | |
| Adenine | Fisher | AC147440250 | Mix I stock |
| Avicel | Fisher | 501785325 | Microcyrstalline cellulose |
| BD Cytofix Fixation Buffer | Fisher | BDB554655 | Fixation Buffer |
| BD Fortessa | Flow cytometer | ||
| BD Intramedic Polyethylene Tubing | Fisher | 427410 | Tubing for nasal lavage |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) | Fisher | 14-823-30 | |
| BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure | Fisher | 02-675-185 | Blood collection tubes |
| Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide | Fisher | AAJ6233703 | Mix IV stock |
| Biotin | Fisher | AC230090010 | Vitamin stock |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000644 | Mice used in this study |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Chemical | C77-500 | Mix I stock |
| CD103 BV 421 | BD Bioscience | BDB562771 | Clone: M290 DF 1:200 |
| CD11b APC | Invitrogen | 50-112-9622 | Clone: M1/70, DF 1:300 |
| CD11c PE | BD Bioscience | BDB565592 | Clone: N418 DF 1:200 |
| CD3 AF 488 | BD Bioscience | OB153030 | Clone: 145-2C11 DF 1:200 |
| CD4 V450 | BD Horizon | BDB560470 | Clone: RM4.5 DF 1:300 |
| CD45 APC eF-780 | BD Bioscience | 50-112-9642 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
| CD45 PE | Invitrogen | 50-103-70 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
| CD8α BV 650 | BD Horizon | BDB563234 | Clone: 53-6.7 DF 1:200 |
| Choline chloride | Fisher | AC110290500 | Final supplement to CDM |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-107 | Filter sterilzation apparatus |
| Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks | Fisher | 10-126-9 | |
| Corning Costar Clear Multiple Well Plates | Fisher | 07-201-590 | |
| Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate | Fisher | MT10017CM | |
| Cyanocobalamin | Fisher | AC405925000 | Mix I stock |
| D39 | National Collection of Type Culture (NCTC) | NCTC 7466 | Streptococcus pneumoniae strain |
| D-Alanine | Fisher | AAA1023114 | Mix I stock |
| D-Calcium pantothenate | Fisher | AC243301000 | Vitamin stock |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Starter stock |
| Dnase | Worthington Biochemical | LS002147 | |
| Eagles Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| EDTA | VWR | BDH4616-500G | |
| EF3030 | Center for Disease Control and Prevention | Available via the isolate bank request | Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name |
| F480 PE Cy7 | BD Bioscience | 50-112-9713 | Clone: BMB DF 1:200 |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | 50 mL round bottom tube |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher | 14-959-11B | 15 mL round bottom tube |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) | Fisher | 14-959-5 | FACS tubes |
| FBS | Thermofisher | 10437-028 | |
| Ferric Nitrate Nonahydrate | Fisher | I110-100 | Mix III stock |
| Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors | Fisher | 08-951-5 | Instruments used for harvest |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops | Fisher | 22-363-602 | Inoculating loops |
| Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps | Fisher | 13-812-38 | Forceps for harvest |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher | 05-408-137 | Micocentrifuge tubes |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) | Fisher | 14-955-459 | |
| Folic Acid | Fisher | AC216630500 | Vitamin stock |
| Gibco RPMI 1640 (ATCC) | Fisher | A1049101 | |
| Gibco DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher | 14190250 | |
| Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Fisher | 14025134 | |
| Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red | Fisher | 11-935-046 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher | 15-140-122 | |
| Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher | 15-250-061 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher | 25-200-056 | |
| Glycerol (Certified ACS) | Fisher | G33-4 | |
| Glycine | Fisher | AA3643530 | Amino acid stock |
| Guanine | Fisher | AAA1202414 | Mix II stock |
| Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads | Fisher | 50-112-9040 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher | AAA1517836 | Mix III stock |
| L-Alanine | Fisher | AAJ6027918 | Amino acid stock |
| L-Arginine | Fisher | AAA1573814 | Amino acid stock |
| L-Asparagine | Fisher | AAB2147322 | Amino acid stock |
| L-Aspartic acid | Fisher | AAA1352022 | Amino acid stock |
| L-Cysteine | Fisher | AAA1043518 | Amino acid stock |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Fisher | AAA1038914 | Final supplement to CDM |
| L-Cystine | Fisher | AAA1376218 | Amino acid stock |
| L-Glutamic acid | Fisher | AC156211000 | Amino acid stock |
| L-Glutamine | Fisher | O2956-100 | Amino acid stock |
| L-Histidine | Fisher | AC166150250 | Amino acid stock |
| LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | 50-112-1524 | Clone: N/A DF 1:500 |
| L-Isoleucine | Fisher | AC166170250 | Amino acid stock |
| L-Leucine | Fisher | BP385-100 | Amino acid stock |
| L-Lysine | Fisher | AAJ6222514 | Amino acid stock |
| L-Methionine | Fisher | AAA1031822 | Amino acid stock |
| Low endotoxin BSA | Sigma Aldrich | A1470-10G | |
| L-Phenylalanine | Fisher | AAA1323814 | Amino acid stock |
| L-Proline | Fisher | AAA1019922 | Amino acid stock |
| L-Serine | Fisher | AC132660250 | Amino acid stock |
| L-Threonine | Fisher | AC138930250 | Amino acid stock |
| L-Tryptophan | Fisher | AAA1023014 | Amino acid stock |
| L-Valine | Fisher | AAA1272014 | Amino acid stock |
| Ly6C BV 605 | BD Bioscience | BDB563011 | Clone: AL-21 DF 1:300 |
| Ly6G AF 488 | Biolegend | NC1102120 | Clone: IA8, DF 1:300 |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-34 | MDCK cell line for PFU analuysis |
| Magnesium Sulfate 7-Hydrate | Fisher | 60-019-68 | CDM starter stock |
| Manganese Sulfate | Fisher | M113-500 | Mix I stock |
| MilQ water | Ultra-pure water | ||
| Mouse Fc Block | BD Bioscience | BDB553142 | Clone: 2.4G2 DF 1:100 |
| MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT | Fisher | NC1886507 | Eye lubricant for infection |
| NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line | ATCC | CRL-1848 | H292 lung epithelial cell line for biofilm growth |
| Niacinamide | Fisher | 18-604-792 | Vitamin stock |
| NK 1.1 AF 700 | BD Bioscience | 50-112-4692 | Clone: PK136 DF 1:200 |
| Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk | Fisher | 50-200-5299 | To remove oxygen from liquid cultures |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | Thermoscientific | J19932-K2 | |
| Pivetal Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Isoflurane for anesthesia during infection |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | P288-500 | Starter stock |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | Starter stock |
| Pyridoxal hydrochloride | Fisher | AC352710250 | Vitamin stock |
| Pyridoxamine dihydrochloride | Fisher | AAJ6267906 | Mix I stock |
| Riboflavin | Fisher | AC132350250 | Vitamin stock |
| Sodium Acetate | VWR | 0530-500G | Starter stock |
| Sodium Azide | Fisher Bioreagents | BP922I-500 | For FACS buffer |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | Starter stock and final supplement to CDM |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S374-500 | Starter stock |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | S369-500 | Starter stock |
| TCR APC | BD Bioscience | 50-112-8889 | Clone: GL-3 DF 1:200 |
| TCRβ APC-Cy7 | BD Pharmigen | BDB560656 | Clone: H57-597 DF 1:200 |
| Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin | Fisher | R01227 | Blood agar plates with the antibiotic gentamicin |
| Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated | Fisher | PI20233 | |
| Thiamine hydrochloride | Fisher | AC148991000 | Vitamin stock |
| TIGR4 | ATCC | BAA-334 | Streptococcus pneumoniae strain |
| Uracil | Fisher | AC157300250 | Mix II stock |
| Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g | Fisher | NC9693955 |
References
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nature Reviews Microbiology. 6 (4), 288-301 (2008).
- Obaro, S., Adegbola, R. The pneumococcus: Carriage, disease and conjugate vaccines. Journal of Medical Microbiology. 51 (2), 98-104 (2002).
- Chong, C. P., Street, P. R. Pneumonia in the elderly: A review of the epidemiology, pathogenesis, microbiology, and clinical features. Southern Medical Journal. 101 (11), 1141-1145 (2008).
- Kadioglu, A., Andrew, P. W. Susceptibility and resistance to pneumococcal disease in mice. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 4 (3), 241-247 (2005).
- Ganie, F., et al. Structural, genetic, and serological elucidation of Streptococcus pneumoniae serogroup 24 serotypes: Discovery of a new serotype, 24C, with a variable capsule structure. Journal of Clinical Microbiology. 59 (7), 0054021 (2021).
- Centers for Disease Control and Prevention. Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Shrestha, S., et al. Identifying the interaction between influenza and pneumococcal pneumonia using incidence data. Science Translational Medicine. 5 (191), (2013).
- McCullers, J. A. Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 571-582 (2006).
- Pneumococcal Disease Global Pneumococcal Disease and Vaccine. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/pneumococcal/global.html (2018).
- Grudzinska, F. S., et al. Neutrophils in community-acquired pneumonia: Parallels in dysfunction at the extremes of age. Thorax. 75 (2), 164-171 (2020).
- Boe, D. M., Boule, L. A., Kovacs, E. J. Innate immune responses in the ageing lung. Clinical and Experimental Immunology. 187 (1), 16-25 (2017).
- Krone, C. L., van de Groep, K., Trzcinski, K., Sanders, E. A., Bogaert, D. Immunosenescence and pneumococcal disease: An imbalance in host-pathogen interactions. The Lancet Respiratory Medicine. 2 (2), 141-153 (2014).
- Cho, S. J., et al. Decreased NLRP3 inflammasome expression in aged lung may contribute to increased susceptibility to secondary Streptococcus pneumoniae infection. Experimental Gerontology. 105, 40-46 (2018).
- Disease Burden of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/flu/about/burden/index.html (2018).
- McCullers, J. A. The co-pathogenesis of influenza viruses with bacteria in the lung. Nature Reviews Microbiology. 12 (4), 252-262 (2014).
- McCullers, J. A., Rehg, J. E. Lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae: Characterization of a mouse model and the role of platelet-activating factor receptor. The Journal of Infectious Diseases. 186 (3), 341-350 (2002).
- Metzger, D. W., Sun, K. Immune dysfunction and bacterial coinfections following influenza. Journal of Immunology. 191 (5), 2047-2052 (2013).
- Chao, Y., Marks, L. R., Pettigrew, M. M., Hakansson, A. P. Streptococcus pneumoniae biofilm formation and dispersion during colonization and disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 194 (2014).
- Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: The key to pneumococcal disease. The Lancet Infectious Diseases. 4 (3), 144-154 (2004).
- Simell, B., et al. The fundamental link between pneumococcal carriage and disease. Expert Review of Vaccines. 11 (7), 841-855 (2012).
- Marks, L. R., Davidson, B. A., Knight, P. R., Hakansson, A. P. Interkingdom signaling induces Streptococcus pneumoniae biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to disease. mBio. 4 (4), 00438 (2013).
- Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Sauberan, S. L., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Streptococcus pneumoniae modulates Staphylococcus aureus biofilm dispersion and the transition from colonization to invasive disease. mBio. 9 (1), 02089 (2018).
- Joma, B. H., et al. A murine model for enhancement of Streptococcus pneumoniae pathogenicity upon viral infection and advanced age. Infection and Immunity. 89 (8), 0047120 (2021).
- Andersson, B., et al. Identification of an active disaccharide unit of a glycoconjugate receptor for pneumococci attaching to human pharyngeal epithelial cells. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 559-570 (1983).
- Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. The Journal of Experimental Medicine. 79 (2), 137-158 (1944).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
- Tothpal, A., Desobry, K., Joshi, S. S., Wyllie, A. L., Weinberger, D. M. Variation of growth characteristics of pneumococcus with environmental conditions. BMC Microbiology. 19 (1), 304 (2019).
- Bou Ghanem, E. N., et al. Extracellular adenosine protects against Streptococcus pneumoniae lung infection by regulating pulmonary neutrophil recruitment. PLoS Pathogens. 11 (8), 1005126 (2015).
- Bou Ghanem, E. N., et al. The alpha-tocopherol form of vitamin E boosts elastase activity of human PMNs and their ability to kill Streptococcus pneumoniae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 161 (2017).
- Tait, A. R., Davidson, B. A., Johnson, K. J., Remick, D. G., Knight, P. R. Halothane inhibits the intraalveolar recruitment of neutrophils, lymphocytes, and macrophages in response to influenza virus infection in mice. Anesthesia & Analgesia. 76 (5), 1106-1113 (1993).
- Aaberge, I. S., Eng, J., Lermark, G., Lovik, M. Virulence of Streptococcus pneumoniae in mice: A standardized method for preparation and frozen storage of the experimental bacterial inoculum. Microbial Pathogenesis. 18 (2), 141-152 (1995).
- McCullers, J. A., Bartmess, K. C. Role of neuraminidase in lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae. The Journal of Infectious Diseases. 187 (6), 1000-1009 (2003).
- Smith, A. M., McCullers, J. A. Secondary bacterial infections in influenza virus infection pathogenesis. Current Topics in Microbiology and Immunology. 385, 327-356 (2014).
- Cundell, D. R., Gerard, N. P., Gerard, C., Idanpaan-Heikkila, I., Tuomanen, E. I. Streptococcus pneumoniae anchor to activated human cells by the receptor for platelet-activating factor. Nature. 377 (6548), 435-438 (1995).
- Ballinger, M. N., Standiford, T. J. Postinfluenza bacterial pneumonia: Host defenses gone awry. Journal of Interferon & Cytokine Research. 30 (9), 643-652 (2010).
- Sun, K., Metzger, D. W. Inhibition of pulmonary antibacterial defense by interferon-gamma during recovery from influenza infection. Nature Medicine. 14 (5), 558-564 (2008).
- Nakamura, S., Davis, K. M., Weiser, J. N. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3657-3665 (2011).
- Blanchette-Cain, K., et al. Streptococcus pneumoniae biofilm formation is strain dependent, multifactorial, and associated with reduced invasiveness and immunoreactivity during colonization. mBio. 4 (5), 00745 (2013).
- Rello, J., Pop-Vicas, A. Clinical review: Primary influenza viral pneumonia. Critical Care. 13 (6), 235 (2009).
- Torres, A., Loeches, I. M., Sligl, W., Lee, N. Severe flu management: A point of view. Intensive Care Medicine. 46 (2), 153-162 (2020).
- Bakaletz, L. O.
- Palacios, G., et al. Streptococcus pneumoniae coinfection is correlated with the severity of H1N1 pandemic influenza. PLoS One. 4 (12), 8540 (2009).
- Dhanoa, A., Fang, N. C., Hassan, S. S., Kaniappan, P., Rajasekaram, G. Epidemiology and clinical characteristics of hospitalized patients with pandemic influenza A (H1N1) 2009 infections: The effects of bacterial coinfection. Virology Journal. 8, 501 (2011).
