Summary
Dette papiret beskriver en ny musemodell for overgangen av pneumokokker fra en asymptomatisk kolonisator til et sykdomsfremkallende patogen under virusinfeksjon. Denne modellen kan lett tilpasses for å studere polymikrobielle og vertspatogene interaksjoner i de forskjellige faser av sykdomsprogresjon og på tvers av ulike verter.
Abstract
Streptococcus pneumoniae (pneumokokker ) er en asymptomatisk kolonisator av nasopharynx hos de fleste individer, men kan utvikle seg til et lunge- og systemisk patogen ved influensa A-virus (IAV) infeksjon. Høy alder øker vertsfølsomheten for sekundær pneumokokklungebetennelse og er forbundet med forverrede sykdomsutfall. Vertsfaktorene som driver disse prosessene er ikke godt definert, delvis på grunn av mangel på dyremodeller som reproduserer overgangen fra asymptomatisk kolonisering til alvorlig klinisk sykdom.
Denne artikkelen beskriver en ny musemodell som gjenskaper overgangen av pneumokokker fra asymptomatisk bærerskap til sykdom ved virusinfeksjon. I denne modellen blir mus først intranasalt inokulert med biofilmdyrkede pneumokokker for å etablere asymptomatisk bærerskap, etterfulgt av IAV-infeksjon av både nasopharynx og lunger. Dette resulterer i bakteriell spredning til lungene, lungebetennelse og åpenbare tegn på sykdom som kan utvikle seg til dødelighet. Graden av sykdom er avhengig av bakteriestammen og vertsfaktorene.
Det er viktig at denne modellen reproduserer følsomheten for aldring, fordi sammenlignet med unge mus, viser gamle mus mer alvorlig klinisk sykdom og bukker under for sykdom oftere. Ved å separere transport og sykdom i forskjellige trinn og gi muligheten til å analysere de genetiske variantene av både patogenet og verten, tillater denne S. pneumoniae / IAV-koinfeksjonsmodellen detaljert undersøkelse av interaksjonene til en viktig pathobiont med verten i forskjellige faser av sykdomsprogresjon. Denne modellen kan også tjene som et viktig verktøy for å identifisere potensielle terapeutiske mål mot sekundær pneumokokklungebetennelse hos følsomme verter.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumokokker) er Gram-positive bakterier som asymptomatisk bor i nasopharynx hos de fleste friske individer 1,2. Fremmet av faktorer som ikke er fullstendig definert, kan pneumokokker overgå fra godartede kolonisatorer av nasopharynx til patogener som sprer seg til andre organer som resulterer i alvorlige infeksjoner, inkludert otitis media, lungebetennelse og bakteriemi3. Pneumokokksykdomspresentasjon er delvis avhengig av belastningsspesifikke forskjeller, inkludert serotypen, som er basert på sammensetningen av kapsulære polysakkarider. Det har vært over 100 serotyper karakterisert så langt, og noen er assosiert med mer invasive infeksjoner 4,5. Flere andre faktorer øker risikoen for pneumokokksykdom. En slik faktor er virusinfeksjon, hvor risikoen for pneumokokkpneumoni økes 100 ganger med IAV 6,7. Historisk sett er S. pneumoniae en av de vanligste årsakene til sekundær bakteriell lungebetennelse etter influensa og er forbundet med verre utfall8. En annen viktig risikofaktor er høy alder. Faktisk er S. pneumoniae den ledende årsaken til samfunnservervet bakteriell lungebetennelse hos eldre personer over 65 år 9,10. Eldre individer står for flertallet (>75%) av dødsfallene på grunn av lungebetennelse og influensa, noe som indikerer at de to risikofaktorene - aldring og IAV-infeksjon - synergistisk forverrer sykdomsfølsomhet11,12,13,14. Imidlertid er mekanismene som virusinfeksjon ber om overgang av pneumokokker fra asymptomatisk kolonisator til invasivt patogen og hvordan dette formes av vertsfaktorer, dårlig definert. Dette skyldes i stor grad fraværet av en liten dyremodell som rekapitulerer overgangen fra asymptomatisk pneumokokkkolonisering til kritisk klinisk sykdom.
Koinfeksjonsstudier har klassisk blitt modellert hos mus inokulert med pneumokokker direkte i lungene 7 dager etter influensainfeksjon15,16. Dette reproduserer følsomheten for sekundær bakteriell lungebetennelse og er ideell for å studere hvordan antivirale immunresponser svekker antibakterielle forsvar17. Longitudinelle studier på mennesker har imidlertid vist at pneumokokkbærerskap i nasofarynks, der bakteriene kan danne asymptomatiske biofilmer18, er jevnt assosiert med invasive sykdommer19,20. Bakterieisolater fra infeksjoner i mellomøret, lungene og blodet er genetisk identiske med de som finnes i nasopharynx20. For å studere overgangen fra asymptomatisk bærerskap til invasiv sykdom etter IAV-infeksjon ble det derfor etablert en modell der mus ble intranasalt administrert biofilmdyrkede pneumokokker etterfulgt av IAV-infeksjon i nasofarynks21,22. Virusinfeksjon i de øvre luftveiene førte til endringer i vertsmiljøet som førte til spredning av pneumokokker fra biofilm og spredning til nedre luftveier21. Disse spredte bakteriene hadde oppregulert uttrykk for virulensfaktorer som er viktige for infeksjon, og konverterte dem fra kolonisatorer til patogener21. Disse observasjonene fremhever det komplekse samspillet mellom viruset, verten og bakteriene og viser at endringene i verten utløst av virusinfeksjon har en direkte innvirkning på pneumokokkoppførselen, noe som igjen endrer løpet av bakteriell infeksjon. Denne modellen klarer imidlertid ikke å rekapitulere de alvorlige tegn på sykdom observert hos mennesker, sannsynligvis fordi viruset er begrenset til nesehulen, og de systemiske effektene av virusinfeksjon på vertsimmunitet og lungeskade blir ikke rekapitulert.
Vi har nylig etablert en modell som inkorporerer det komplekse samspillet mellom verten og patogener, men også nærmere etterligner sykdomsgraden observert hos mennesker23. I denne modellen infiseres mus først intranasalt med biofilmdyrkede pneumokokker for å etablere asymptomatisk bærerskap, etterfulgt av IAV-infeksjon av både nasofarynks og lunger. Dette resulterte i bakteriell spredning til lungene, lungebetennelse og sykdom som utviklet seg til dødelighet hos en brøkdel av unge mus23. Denne tidligere studien viste at både viral og bakteriell infeksjon endret vertsforsvaret: virusinfeksjon fremmet bakteriell spredning, og tidligere bakteriell kolonisering svekket vertens evne til å kontrollere pulmonale IAV-nivåer23. Undersøkelse av immunresponsen viste at IAV-infeksjon reduserte den antibakterielle aktiviteten til nøytrofiler, mens bakteriell kolonisering reduserte type I interferonresponsen kritisk til antiviralt forsvar23. Det er viktig at denne modellen reproduserte følsomheten for aldring. Sammenlignet med unge mus viste gamle mus tegn på sykdom tidligere, viste mer alvorlig klinisk sykdom og bukket under for infeksjon oftere23. Arbeidet som presenteres i dette manuskriptet viser at sykdomsgraden også er avhengig av bakteriestammen, fordi invasive pneumokokkstammer viser mer effektiv spredning ved IAV-infeksjon, viser mer åpenbare tegn på lungebetennelse og resulterer i akselerert sykdomsfrekvens sammenlignet med ikke-invasive stammer. Dermed tillater denne S. pneumoniae/IAV-koinfeksjonsmodellen detaljert undersøkelse av både patogen- og vertsfaktorer og er godt egnet til å studere immunresponser mot polymikrobielle infeksjoner i de forskjellige fasene av sykdomsprogresjon.
Protocol
Alle dyrestudier ble utført i samsvar med anbefalingene i veiledningen for stell og bruk av forsøksdyr. Alle prosedyrer ble godkjent av University at Buffalo Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Klargjøring av kjemisk definerte medier (CDM)
- Forbered aksjene som følger:
- Løs opp blandingen I-forbindelsene oppført i tabell 1 i 100 ml ultrarent vann under omrøring. Oppbevares i 200 μL alikoter ved -20 °C.
- Løs opp blandingen II-forbindelsene oppført i tabell 1 i 20 ml 0,1 M NaOH under omrøring. Oppbevares i 100 μL alikoter ved −20 °C.
- Løs opp blandingen III-forbindelsene oppført i tabell 1 i 1 ml ultrarent vann under omrøring. Oppbevares i 10 μL alikoter ved 4 °C.
- Løs opp blandingen IV-forbindelsen oppført i tabell 1 i 1 ml ultrarent vann under omrøring. Oppbevares i 10 μL alikoter ved -20 °C.
- Løs opp forbindelsene oppført i tabell 2 innledningsvis i 15 ml ultrarent vann under omrøring. Juster pH til 7,0 med noen få dråper 0,1 M NaOH og juster det endelige volumet til 20 ml ved hjelp av ultrarent vann. Oppbevares i 1 ml alikoter ved −20 °C.
- Løs opp forbindelsene oppført i tabell 3 i 90 ml ultrarent vann på en kokeplate ved 50 °C under omrøring. Juster pH til 7,0 med 0,1 M NaOH, og juster deretter det endelige volumet til 100 ml ved hjelp av ultrarent vann. Oppbevares i 5 ml alikoter ved -20 °C.
- Lag starteren fersk hver gang ved å løse opp forbindelsene i tabell 4 i 70 ml ultrarent vann under omrøring.
- Til ferskstarterlageret legger du til følgende blandingslagre i rekkefølge: 200 μL Mix I-lager (tabell 1), 80 μL Mix II-lager (tabell 1), 10 μL Mix III-lager (tabell 1), 10 μL Mix IV-lager (tabell 2), 1 ml vitaminlager (tabell 3) og 5 ml aminosyrelager (tabell 4).
- Når lagrene er tilsatt, juster det endelige volumet til 100 ml ved å tilsette 30 ml ultrarent vann til begeret.
- Suppler CDM med forbindelser fra tabell 4. Etter grundig blanding, filtrersteriliser og oppbevar ved 4 °C i maksimalt 2 uker.
2. Dyrking av S. pneumoniae biofilm
- Forbered RP-10 medium ved å blande 445 ml RPMI 1640 med 50 ml varmeinaktivert føtal bovint serum (FBS) og 5 ml penicillin / streptomycin ved henholdsvis 10.000 U / ml og 10.000 μg / ml.
- Vokse NCI-H292 (H292) mucoepidermoid karsinom cellelinje. Legg cellene fra ett kjøpt hetteglass til 5 ml RP-10 medium i en T-25 vevskulturbehandlet kolbe. Inkuber ved 37 °C/5 % CO2 i 3-5 dager for å oppnå 100 % samløp.
- Sjekk cellene under et lysmikroskop ved hjelp av 10x forstørrelse for å vurdere konfluens.
MERK: Når alle cellene er i kontakt med andre celler og det ikke er noen hull i mellom, er ønsket 100% sammenløp nådd. - Vask cellene 2x i 5 ml romtemperert PBS. Forsikre deg om at bufferen er kalsiumfri for å unngå chelatering av EDTA i følgende trinn.
- Tilsett 1 ml trypsin-EDTA til kolben og inkuber ved 37 °C/5% CO2 i 5-10 minutter til cellene løsner. Nøytraliser med 4 ml RP-10 medium. Bland forsiktig ved å pipettere opp og ned og overfør til et 50 ml konisk rør.
- Tilsett 500 μL av cellesuspensjonen per brønn til en vevskulturbehandlet 24-brønnsplate. Fra en konfluent T-25 kolbe, forvent 2 × 10 6-4 × 106 celler / ml.
- Neste dag, sjekk cellene under et lysmikroskop for å sikre at de er sammenflytende, som i trinn 2.3. Hvis de ikke er det, må du inkubere lenger.
- Når H292-cellene er 100% sammenflytende i 24-brønnplaten, vask forsiktig cellene 3x med 1 ml romtemperatur PBS for å sikre at det ikke er noe medium som inneholder antibiotika eller rusk igjen.
- Etter vasking av cellene, tilsett 250 μL / brønn med 4% paraformaldehyd for å fikse cellene. Inkuber enten i 1 time på is eller over natten ved 4 °C.
- Natten før cellefiksering, strip S. pneumoniae-stammen av interesse på blodagarplater og inkuber over natten ved 37 ° C / 5% CO2.
MERK: Dataene som presenteres her er med følgende S. pneumoniae-stammer oppnådd via samarbeidsutveksling: serotype 19F otitis media isolat EF3030 24, klassisk serotype 2 Avery-stamme D3925 og serotype 4 bakteriemiisolatTIGR4 26. Stammene er også tilgjengelige fra offentlige samlinger referert til i materialfortegnelsen. - Forbered CDM pluss oksyrase (0,15 U / ml) ved å tilsette 100 μL oksyrase (30 U / ml) til 20 ml CDM.
MERK: Oxyrase brukes til å eliminere oksygen for å tillate effektiv vekst av S. pneumoniae i flytende kultur27. - Inokuler bakteriene fra platen til fersk CDM + oksyrase ved å vaske bakteriene av platen ved å tilsette 1 ml CDM + oksyrase og forsiktig løfte bakteriekoloniene ved å bruke siden av en 1 ml pipettespiss, og vær forsiktig så du ikke skraper agar. Alternativt kan du bruke en inokuleringssløyfe for å løfte bakteriene og inokulere dem i et rør som inneholder 1 ml CDM + oksyrase.
- Fortynn bakteriene i CDM + oksyrase til en start-OD600 på 0,05.
- Dyrk bakteriene i et løst avkortet 50 ml konisk rør som står ved 37 ° C / 5% CO 2 til en OD600 på 0,2 er nådd (dette vil ta hvor som helst mellom2-5 timer). Kontroller OD600 hver time for å sikre at OD ikke overstiger 0,2.
- Når OD har nådd 0,2, virvel bakteriekulturrøret. Frø 0,5 ml av bakteriene på de faste H292-cellene og tilsett ytterligere 0,5 ml CDM + oksyrasemedium per brønn. Tilsett 1 ml CDM + oksyrase til kontrollbrønnene uten bakterier. Inkuber platen i 48 timer ved 34 °C/5 % CO2.
MERK: Vekst ved 34 °C brukes til å etterligne den lavere temperaturen i nasopharynx21. - Hver 12. time etter den første såingen, fjern forsiktig 0,5 ml av mediet og fyll på med 0,5 ml fersk CDM + oksyrase. Vær forsiktig så du ikke forstyrrer den dannende biofilmen. Sjekk bunnen av platen for biofilm og se etter økende skyighet etter hvert som tiden går på grunn av veksten av biofilmen. For å kontrollere for forurensning, sjekk brønnene uten bakterier for å sikre at kontrollbrønnene forblir klare.
- Ved 48 timer etter inokulering, fjern supernatanten og vask 2x veldig forsiktig med 1 ml PBS. Resuspender i 1 ml fersk CDM og pipette kraftig opp og ned for å løfte biofilmen. For hver bakteriestamme, samle bakteriene fra alle brønnene i et 50 ml konisk rør. Bland godt ved å vippe det tette røret forsiktig opp og ned flere ganger.
- Til det 50 ml koniske røret, tilsett 40% glyserol i CDM ved like volumer for å oppnå en bakteriell suspensjon med en endelig konsentrasjon på 20% glyserol. Aliquot 1 ml i mikrosentrifugerør, flashfryser på tørris og sparer ved -80 °C.
- Før bruk, list opp bakteriene ved å tine en alikot på is, spinne røret ved 1,700 × g i 5 minutter, fjerne supernatanten, resuspendere pelleten i 1 ml PBS og plettere seriefortynninger på blodagarplater28.
- Dyrk agarplatene over natten ved 37 °C/5 % CO2 og tell koloniene ved relevante fortynninger for å oppnå bakteriekonsentrasjonen i kolonidannende enheter (CFU)/ml.
MERK: Det anbefales å oppregne bakteriene i lagrene minst en dag etter frysing eller senere, da det er et fall i bakteriell levedyktighet innen de første 24 timene. De lagrede frosne alikotene kan brukes til etterfølgende infeksjon av mus i maksimalt 2 måneder.
3. Intranasal inokulering av mus med biofilmdyrket S. pneumoniae
- Kjøp mus og bruk i ønsket alder.
MERK: Mus i alderen 3-4 måneder foretrekkes fremfor å modellere unge verter, og mus i alderen 21-24 måneder kan brukes til å modellere eldre personer >65 år29. Dataene som presenteres her er med C57BL/6 hannmus. - Tine de biofilmdyrkede bakteriealikotene på is og spinn ved 1 700 × g i 5 minutter. Fjern og kast supernatanten forsiktig uten å forstyrre pelleten, vask bakteriene ved å resuspendere pelleten i 1 ml PBS, og sentrifugerer igjen ved 1 700 × g i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender pelleten i volumet som trengs for å nå ønsket konsentrasjon (sikte på 5 × 106 CFU / 10 μL for intranasal inokulasjon). Bekreft mengden bakterier administrert ved plating av det preparerte inokulumet på blodagarplater som i trinn 2.19.
- Inokuler musene intranasalt med 5 × 106 CFU ved å pipetere 5 μL av det fortynnede inokulumet i hver naris. Sørg for å holde musene fast, stabilisere hodet, til volumet er inhalert (vanligvis innen sekunder etter pipettering volumet inn i nares). Utfør dette trinnet i fravær av anestesi for å forhindre lungeaspirasjon av inokulumet.
4. Virusinfeksjon med influensa A-virus (IAV)
- Ved 48 timer etter intranasal inokulering med S. pneumoniae, tine IAV-stammen av interesse på is.
MERK: Dataene som presenteres her er med en mustilpasset stamme av influensa A-virus A / PR / 8/34 H1N1 som ble oppnådd via samarbeidsutveksling30. - Når viruset har tint, fortynn viruset i PBS til ønsket konsentrasjon; 20 plakkdannende enheter (PFU)/50 μL ved intratrakeal infeksjon og 200 PFU/10 μL ved intranasal infeksjon. For mock-infiserte og bakterie-bare grupper, bruk PBS for å inokulere musene.
- Plasser oftalmisk smøremiddel på øynene til musene før anestesi. Bedøv musene med 5% isofluran og bekreft anestesi med en fast tåklemme.
- Når dyret er bedøvet, fjern det fra isoflurankammeret og infiser umiddelbart de bedøvede musene med 50 μL (20 PFU) IAV intratrakealt ved hjelp av butt pinsett for å trekke tungen ut av munnen og pipettere væskevolumet ned i luftrøret.
- Plasser musene i et eget bur og overvåk til fullstendig gjenoppretting (de er i stand til å opprettholde sternal recumbency [i stand til å ligge oppreist på brystet]).
- Etter utvinning, inokuler musene umiddelbart intranasalt med 10 μL (200 PFU) IAV ved bruk av inokulasjonsmetoden i trinn 3.3.
- Husmus som har gjennomgått enkel eller dobbel bakterie- og virusinfeksjon med samme infeksjonsgruppe og skiller dem fra de andre gruppene.
5. Overvåke musene for sykdomssymptomer
- Overvåk musene daglig i minst 10 dager og blindt score for tegn på sykdom som følger:
- Score som følger for vekttap: 0 = 5% eller mindre; 1 = 5% -10%; 2 = 10% -15%; 3 = 20% eller mer. Avlive musene ved hjelp av CO2 -innånding når vekttapsscoren er på 3.
- Skår som følger for aktivitet: 0 = normal/aktiv; 1 = bevegelig, men litt redusert; 2 = redusert; 3 = sterkt redusert/sløv (beveger seg bare ved berøring), 4 = koma/immobile. Avlive musene når aktivitetspoengsummen er på 3.
- Score som følger for holdning: 0 = ingen anelse (normal); 1 = litt hakket holdning; 2 = alvorlig anelse. Avlive musene når holdningspoengsummen er på 2.
- Score som følger for øynene: 0 = normal; 1 = utstående; 1 = sunket; 1 = lukket; 1 = utslipp. Det kan være en kombinasjon. Legg sammen totalsummene for den endelige øyepoengsummen.
- Score som følger for å puste: 0 = Normal pust; 1 = uregelmessig eller endret (høyere/lavere hastighet); 2 = anstrengt (overdreven innsats eller gisping). Avlive musene når pustepoengsummen er på 2.
- Basert på kriteriene over legger man til individskårene for en samlet klinisk skår fra frisk (0) til ekstremt syk (15). Vurder enhver mus som viser en total poengsum over 2 for å være syk. Avlive alle mus som viser en totalscore over 9 eller de angitte poengsummene for hvert kriterium, og merk dem på overlevelseskurven.
6. Behandling av infisert vev for bakteriell oppregning
- Ved 48 timer etter IAV-infeksjon, avlive musene.
- Plasser musen i liggende stilling. Bruk 70% etanol, spray brystet og magen på musen for å rengjøre pelsen. Bruk tang, klem pelsen og huden midt på musen og klipp pelsen med 4,5 i disseksjonssaks for å eksponere området fra leveren opp til brystet.
- Blod samling
- Bruk disseksjonssaks, kutt forsiktig inn i bukhulen for å avsløre leveren. Bruk tang, utsett leverportalvenen på toppen av leveren nær membranen. Klipp leverportalvenen ved hjelp av disseksjonssaksen. Når blodet begynner å samle seg i bukhulen, samle 10 μL blod ved hjelp av en mikropipette og sett inn i 90 μL antikoagulantløsning (50 mM EDTA-løsning i PBS) i et mikrosentrifugerør for plating for bakteriell byrde.
- Bruk en P-1000 mikropipette for å samle resten av blodet, plasser det i et blodoppsamlingsrør og sentrifuge ved 7.600 × g i 2 minutter for å samle serumet. Lagre sera i mikrosentrifugerør ved -80 °C for senere analyse av ønsket cytokin eller metabolitt.
- Lunge samling
- Bruk disseksjonssaks, lag et kutt opp sidene av det eksponerte ribbeholderen og trekk ribbeina forsiktig opp mot musens hode for å avsløre hjertet. Stikk en 25 G kanyle festet til en 10 ml sprøyte ferdigfylt med PBS inn i høyre ventrikkel og begynn sakte med parfymering. Se etter bleking av lungene som en indikator på vellykket perfusjon. Skyll sakte for å unngå å bryte lungevevet.
- Løft hjertet med tangen og gjør et kutt for å skille lungene og hjertet. Når de er separert, plukk opp alle lungelapper med tangen og skyll i en tallerken med steril PBS for å fjerne gjenværende blod. I en petriskål, hakk lungene i små biter og bland godt. Fjern halvparten av lungeblandingen for bestemmelse av bakteriell CFU eller viral PFU og legg den i et rundt bunn 15 ml rør forhåndsfylt med 0,5 ml PBS for homogenisering.
MERK: Det er viktig å ikke ta forskjellige av samme lunge for de ulike vurderingene. I stedet skal alle hakkes, blandes godt sammen og analyseres likt for de forskjellige vurderingene. - Fjern den andre halvdelen av lungen for flowcytometri (avsnitt 7 nedenfor) og legg den i en ikke-vevsdyrkningsbehandlet 24-brønnsplate med hver brønn forhåndsfylt med 0,5 ml RP-10. La stå i romtemperatur til behandling.
- Nasofarynx-samlingen
- I nakken, bruk disseksjonssaksen til å kutte bort pelsen, og kutt deretter bort muskelen og utsett luftrøret.
MERK: Luftrøret er en rørlignende struktur som ligger under muskelen. - Plasser små tang under luftrøret i en avstand på 1 cm fra musens kjeve for å stabilisere den. Bruk disseksjonssaks, lag forsiktig en 0,1 cm spalt på den fremre delen av luftrøret, unngå å kutte luftrøret helt.
- Klargjør en 1 ml sprøyte fylt med 0,5 ml PBS med 0,58 mm slange festet til en 25 G kanyle. Samle nesevasken ved å sette slangen inn i luftrøret som går oppover mot nasopharynx. Når motstanden er følt inn i nesehulen, plasser et mikrosentrifugerør ved nesen og skyll sakte PBS gjennom luftrøret for å samle neseskyllingen.
- Plasser musen i mageleie. Spray musens hode med etanol. Bruk disseksjonssaks til å kutte pelsen og mystacialputen for å avsløre musens hodeben.
- Bruk disseksjonsaksen, gjør en 1 cm kutt ned sidene av mandibelen og mellom øynene. Bruk tang, trekk sakte ansiktsbenene bort fra kroppen for å avsløre nesehulen.
- Bruk tang for å forsiktig fjerne nesevevet og legg det i et rundt bunnrør forhåndsfylt med 0,5 ml PBS for homogenisering.
- I nakken, bruk disseksjonssaksen til å kutte bort pelsen, og kutt deretter bort muskelen og utsett luftrøret.
- For å homogenisere det oppsamlede vevet, rengjør først homogeniseringssonden ved å sette den i 70% etanol og slå på homogenisatoren ved 60% effekt i 30 s. Gjenta trinnet i sterilt vann i 10 s. Homogeniser hvert vev i 1 min. Rengjør homogenisatorsonden i sterilt vann mellom hver prøve og i et nytt rør med 70% etanol mellom hvert organ og prøvegruppe.
- Oppregning av bakterietall
- Når alle organene er høstet og homogenisert, plate seriefortynninger på blod agar plater. For å beregne total CFU, bruk 10 μL til plate og noter det endelige volumet i ml for hver prøve. Plate nasopharynx-prøvene på blodagarplater supplert med 3 μg / ml gentamicin for å velge for vekst av S. pneumoniae mens du hemmer veksten av andre mikroorganismer som koloniserer det vevet. Inkuber over natten ved 37 °C/5 % CO2.
- For å oppsummere bakteriell CFU for lunge og nasopharynx, må du først telle koloniene på blodagarplatene. Bruk deretter ligning (1) og ligning (2) for å beregne mengden per ml og totalt antall.
Mengde per ml = antall kolonier × fortynningsfaktor × 100 (1)
Totalt antall = mengde per ml × totalvolum per prøve (2)
MERK: I ligning (1) brukes 100 til å multiplisere siden 10 μL er belagt, som er en 100 ganger fortynning på 1 ml. Det totale volumet per prøve i ligning (2) er fra trinn 6.7.1, noe som resulterer i deteksjonsgrensen på 100 per organ. - For å oppsummere bakteriell CFU For bakteriemi, må du først telle koloniene på blodagarplatene. Bruk deretter ligning (3) for å bestemme mengden per ml blod.
Mengde per ml blod = antall kolonier × fortynningsfaktor × 100 × 10 (3)
MERK: I ligning (3) brukes 100 som 10 μL er belagt, som er en 100 ganger fortynning av 1 ml, og 10 indikerer en 1:10 fortynning av blodet i antikoagulant. Dette resulterer i deteksjonsgrensen på 1000/ml.
7. Behandling av lungeprøvene for flowcytometri
- Forbered de nødvendige mediene som følger:
- Forbered RP-10 som beskrevet i trinn 2.1.
- Forbered fordøyelsesbuffer ved å blande RP-10 med 2 mg / ml kollagenase og 30 μL / ml DNase I.
- Forbered lysisbuffer ved å oppløse 8,29 g NH4Cl, 1 g NaHCO3 og 0,038 g EDTA i 1 l H2O.
- Forbered 10x FACS-buffer ved å blande 450 ml HBSS med 50 ml varmeinaktivert FBS og 5 g natriumazid.
- Klargjør 1x FACS-buffer ved å fortynne 50 ml 10x FACS-buffer i 450 ml HBSS.
- Ta lungeprøvene fra trinn 6.4.3 og legg i en 24-brønns plate. Tilsett 500 μL fordøyelsesbuffer til hver brønn. Inkuber i 45 minutter opptil 1 time ved 37 °C/5 % CO2.
- Forfyll 50 ml koniske rør for hver prøve med 5 ml RP-10. Når inkubasjonen er over, plasser et 100 μm filter på toppen av det 50 ml koniske røret og våt det med 1 ml RP-10.
- Bruk en P-1000 mikropipette, flytt de fordøyde lungene og legg dem på filteret. Bruk stempelet på en 3 ml sprøyte til å mose organet. Skyll 2x med 1 ml RP-10 hver gang.
- Spinn prøvene ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml lysisbuffer. La i 3 minutter for å tillate lysis av de røde blodcellene. Nøytraliser med 5 ml RP-10.
- Spinn prøvene ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter. Aspirer supernatanten, resuspender pelleten i 1 ml RP-10, og ta 10 μL for å telle prøvene.
- Spinn prøvene ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i RP-10 ved 2 × 10 6-4 × 106 celler/ml. Tilsett 60 μL av hver prøve i en 96-brønnplate for å beise for de ønskede celletypene23 oppført i trinn 7.9, tabell 5 og tabell 6.
- Snurr platen ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter.
- I mellomtiden forbereder antistoffmesterblandingene, florescerende minus en (FMO) og enkeltflekkkontroller med de ønskede antistoffene. For å farge polymorfonukleære leukocytter (PMN), makrofager, monocytter, dendrittiske celler og T-celler, bruk antistoffene og endelige fortynninger oppført i tabell 5 og tabell 6. Bruk et totalvolum på 100 μL/brønn av antistoffblandingen. Følg fortynningene listet opp i tabellene for å bestemme riktig volum av hovedblandingen og de individuelle antistoffene som kreves.
- Når spinnet er ferdig (trinn 7.8), dekanterer supernatanten, resuspenderer pellets i 100 μL av antistoffblandingene, FMOene eller enkeltflekkkontrollene, og ruger på is i 30 minutter i mørket.
- Vask cellene 2x ved å tilsette 150 μL FACS-buffer til brønnene og spinne platen ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter.
- Når spinnet er ferdig, dekanter supernatanten, resuspender pellets i 100 μL fikseringsbuffer og inkuber på is i 20 minutter.
- Vask cellene 2x ved å tilsette 150 μL FACS-buffer til brønnene og spinne platen ved 4 °C og 327 × g i 5 minutter.
- Forbered merkede FACS-rør med 200 μL FACS-buffer. Resuspender pellets i 150 μL FACS-buffer. Filtrer hver prøve individuelt i det tilsvarende FACS-røret ved hjelp av et 100 μm filter. Oppbevares på is eller ved 4 °C og beskyttes mot lyset til det er klart til analyse.
- Analyser cellene ved hjelp av et flowcytometer.
8. Plakkanalyse for opplisting av IAV
- Forbered de nødvendige mediene som følger:
- Tilbered infeksjonsmedium ved å løse opp 2,5 g bovint serumalbumin (BSA) i 40 ml DMEM under omrøring ved 37 °C i 10-20 minutter til det er oppløst. Filtrer-steriliser i 460 ml DMEM.
- Tilbered 2,4% mikrokrystallinsk cellulose ved å oppløse 1,2 mg mikrokrystallinsk cellulose i 50 mlH2O. Autoklav på væskeinnstillingen og oppbevares ved romtemperatur.
- Tilbered 5 % av BSA DMEM ved å løse opp 2,5 g BSA i 40 ml DMEM under omrøring ved 37 °C i 10-20 minutter. Tilsett de resterende 10 ml DMEM for et endelig volum på 50 ml. Filtrer og oppbevar ved 4 °C.
- Klargjør 2x MEM/0,5 % BSA ved å blande 1 ml 5 % BSA DMEM med 9 ml 2x MEM.
- Forbered lavviskositetsoverleggsmedium ved å blande et 1: 1-forhold på 2,4% mikrokrystallinsk cellulose og 2x MEM / 0,5% BSA med 1 mg / ml TPCK (hemmer av chymotrypsin) trypsin.
- Forbered EMEM / 10% FBS ved å blande 450 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) med 50 ml varmeinaktivert FBS.
- Vokse Madin-Darby hjørnetann nyre (MDCK) cellelinje. Legg til cellene fra ett kjøpt hetteglass til 5 ml EMEM / 10% FBS i en T-25 vevskulturbehandlet kolbe. Inkuber i 3-5 dager ved 37 °C/5% CO2 til cellene når 100% samløp. Se etter samløp som i trinn 2.3.
- Fjern og kast dyrkningsmediet, og skyll 2x med 5 ml romtemperert PBS. Tilsett 1 ml trypsin-EDTA til kolben og inkuber ved 37 °C / 5% CO2 i 10-15 minutter til cellene løsner. Når den er løftet, nøytraliser med 4 ml EMEM / 10% FBS for å oppnå en cellesuspensjon ved 2 × 105 celler / ml.
- Frø MDCK-cellene i en 12-brønns vevskulturbehandlet plate ved å tilsette 1 ml resuspenderte celler per brønn (ved 2 × 105 celler / brønn) 1 dag før du begynner plakkanalysen.
MERK: Forsikre deg om at cellene når 100% sammenløp før bruk og inkuber lenger om nødvendig for å nå sammenløp. - For bruk som standarder, gjør 10 ganger serielle fortynninger (106-10 1) av IAV-lager (av en kjent titer) i infeksjonsmediet oppført i trinn 8.1.1. Lag 1,2 ml av hver fortynning for å teste i tre eksemplarer.
- Tine orgelhomogenatene på is. Spinn ned på en bordplatesentrifuge ved 2000 × g og samle den klare supernatanten.
- Gjenta trinn 8.5, men med supernatanten fra prøvene i trinn 8.6.
- Aspirer mediet fra cellene og vask 2x med 1 ml PBS for å fjerne all FBS.
- Tilsett 300 μL av hver standard fortynning eller seriefortynnet prøve forsiktig langs siden av hver brønn, begynn ved høyeste fortynning til den laveste, og gjør dette i tre eksemplarer.
- Plasser platene i inkubatoren ved 37 °C/5% CO2, rist platen hvert 10. minutt i totalt 50 minutter. Sørg for å plassere dem flatt i inkubatoren og ikke stable dem.
- Etter 50 min, vask cellene 2x med 1 ml PBS.
- Tilsett 2 ml av lavviskositetsoverleggsmediet i hver brønn bortsett fra brønnene med lavest fortynning og uten virus; Til dem, legg til infeksjonsmedium og trypsin.
- Sett platen tilbake i inkubatoren ved 37 ° C / 5% CO 2 i2-4 dager for å oppnå plakk som kan visualiseres med det blotte øye.
- Vask platene ved å tilsette 2 ml PBS raskt i hver brønn fra siden og rist forsiktig for å suspendere det avgjorte overleggsmediet med lav viskositet.
- Kast hele væskevolumet i brønnen ved å pipettere mediet forsiktig av.
- Gjenta vasken en gang til med 2 ml PBS i hver brønn, og kast deretter hele væskevolumet ved forsiktig pipettering.
- For å fikse plakkene, tilsett 500 μL 4% paraformaldehyd i hver brønn, rist og la stå i 30 minutter.
- Vask sakte nedover siden med 1 ml PBS; Kast deretter forsiktig væsken.
- Tilsett 500 μL 1% krystallfiolett (fortynnet i vann) til hver brønn for å dekke cellemonolaget. Inkuber i 5 min.
- Vask med 1 ml vann fra springen. Sørg for å kaste all væske i brønnen ved forsiktig pipettering. Legg tallerkenen opp ned på en bleiepute for å tørke over natten.
- Tell plakettene visuelt og lagre bildene på et hvilket som helst tilgjengelig bildeapparat.
Representative Results
Biofilmdyrket S. pneumoniae (figur 1A) ble brukt til å infisere mus (figur 1B) ved hjelp av et lite inokulum på 10 μL levert intranasalt til ikke-bedøvede mus. Dette lille volumet inokulum resulterer i konsistent pneumokokkbærerskap begrenset til nasofarynks (figur 2A, +sp grupper) samtidig som systemisk spredning unngås (figur 2B, C, +sp grupper). To dager etter intranasal inokulering ble musene infisert med et murintilpasset H1N1 influensa A-virus A/PR/8/34 (IAV)22,30 levert både intranasalt og intratrakealt for å oppnå konsistent levering av spesifikke mengder til nasofarynks og lungene 23.
Her ble modellen brukt til å sammenligne sykdomsforløpet etter virusinfeksjon hos mus intranasalt utfordret med forskjellige stammer av S. pneumoniae, inkludert TIGR4 og D39, som er invasive stammer som resulterer i lungebetennelse som utvikler seg til bakteriemi, og EF3030, som er en otitis mediestamme 21,24,25,26,31. Sykdomspresentasjonen hos S. pneumoniae/IAV-koinfiserte mus var avhengig av bakteriestammen (figur 2). Mens det ikke var noen signifikant forskjell i bakterieantall i nasofarynks (figur 2A) mellom noen av stammene, ble S. pneumoniae TIGR4 og D39, men ikke EF3030, spredt til lungene ved 48 timer etter IAV-infeksjon (figur 2B). Førti prosent av musene intranasalt infisert med S. pneumoniae TIGR4 viste bakteriell spredning til lungene, og av disse ble halvparten bakteriemiske (figur 2C), i samsvar med tidligere funn23.
Mus intranasalt infisert med S. pneumoniae D39 viste mer effektiv spredning, fordi spredning til lungene ble observert hos 100 % av de koinfiserte musene (figur 2B). I likhet med S. pneumoniae TIGR4 opplevde halvparten av dem bakteriemi (figur 2C). Ved sporing av total overlevelse, uavhengig av bakteriestammen, var overlevelsesgraden for saminfiserte mus signifikant lavere enn musene som ble utfordret med S. pneumoniae alene for alle stammene som ble testet (figur 2D). Sammenlignet med kontrollmusene som ble utfordret med IAV alene, viste musene intranasalt infisert med S. pneumoniae TIGR4 og D39, men ikke EF3030, akselerert sykdomsfrekvens. Ved dag 2 etter IAV-infeksjon hadde 30 % (D39) og 20 % (TIGR4) av musene bukket under, mens kontrollgruppene med kun IAV ikke begynte å bukke under før dag 5 etter smitte (figur 2D). Musene som samtidig var infisert med S. pneumoniae EF3030 og IAV hadde forsinkede symptomer, mer lik kontrollene som bare var IAV (figur 2D). Disse funnene viser at koinfeksjonsmodellen resulterer i sykdom hos unge friske mus som er bakteriestammeavhengig, noe som gjør den ideell for å utforske bakterielle faktorer som kreves ved hvert trinn av sykdomsprogresjon.
Denne modellen ble brukt til å vurdere tilstedeværelse av ulike immunceller i lungene (celletyper og gatingstrategi i figur 3) etter IAV-infeksjon hos mus intranasalt inokulert med forskjellige stammer av S. pneumoniae. Bakteriestammene D39 og TIGR4, som spredte seg til lungene etter IAV-infeksjon, fremkalte en signifikant økning over baseline (uinfisert) i tilstrømningen av inflammatoriske immunceller fra sirkulasjonen, som nøytrofile granulocytter (PMN) og monocytter, mens EF3030 ikke gjorde det (figur 4A-C). IAV-infeksjon alene fremkalte en signifikant økning over baseline i tilstrømningen av immunceller som er viktige for vertsforsvar mot virusinfeksjon, som NK-celler og gamma-delta T-celler (figur 4A-C). Disse antivirale responsene ble signifikant dempet hos mus intranasalt infisert med S. pneumoniae før viral smitte (figur 4A-C). Dette stemmer overens med tidligere studier som vurderte cytokinrespons som fant at S. pneumoniae bærervogn svekket produksjonen av type I interferoner og svekket vertens evne til å kontrollere IAV-belastninger i lungene23. Disse funnene viser at koinfeksjonsmodellen kan brukes til å studere hvordan immunresponser endres i mono versus polymikrobielle infeksjoner.
Denne modellen ble også brukt til å vurdere effekten av aldring på sykdomsforløpet etter IAV-infeksjon hos mus intranasalt infisert med S. pneumoniae TIGR4. Hos enkeltinfiserte mus varierte ikke virustiterne mellom de unge og eldre kohortene (figur 5A)23. Som i tidligere studier23 viste gamle mus tidligere og signifikant mer alvorlige sykdomstegn sammenlignet med sine unge kolleger, som demonstrert ved høyere kliniske score (figur 5B). I samsvar med sykdomssymptomene begynte gamle mus inokulert med S. pneumoniae å dø raskere innen 24 timer etter IAV-infeksjon, og alle bukket under for sykdommen, mens de unge kontrollpersonene overlevde infeksjonen med en signifikant høyere (33 %) rate (figur 5C). Disse funnene viser at koinfeksjonsmodellen kan brukes til å oppdage mer alvorlig sykdom i sårbare verter, noe som gjør den ideell for å utforske vertsfaktorer som gir motstand eller følsomhet for co-infeksjon.
Figur 1: Tidslinje for koinfeksjon og organbehandling for vurdering av immuncelletilstrømning og patogenbyrde . (A) Streptococcus pneumoniae dyrkes i biofilmer. (B) Mus inokuleres intranasalt med 5 × 106 CFU av den indikerte biofilmdyrkede S. pneumoniae-stammen for å etablere nasofaryngeal bærerskap eller forlates ubehandlet. Førtiåtte timer senere blir musene enten spottet behandlet med PBS eller får 200 PFU influensa A-virus PR8 intranasalt og 20 PFU intratrakealt. Mus overvåkes over tid for klinisk sykdomsscore og overlevelse. Ved 48 timer etter IAV-infeksjon vurderes bakteriell CFU eller viral PFU i de ulike organene eller immuncelleinnstrømning i lungene. Forkortelser: CFU = kolonidannende enheter; PFU = plakkdannende enheter; IAV = influensa A-virus PR8; IT = intratrakealt; NP = nasofaryngealt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Dobbel intranasal/intratrakeal IAV-infeksjon av S. pneumoniae-inokulerte mus fører til bakteriell spredning og sykdom som er avhengig av bakteriestammen. Unge (10-12 uker gamle) hannmus C57BL/6 (B6) ble smittet som i figur 1. Bakterietall i (A) nasofarynks, (B) lunger og (C) blod ble alle bestemt ved 48 timer etter IAV-infeksjon. (B,C) Prosentandeler angir brøkdelen av mus som viste spredning. (D) Overlevelsen ble overvåket i 10 dager etter IAV-infeksjon. Samlede data fra (A,B) n = 5, (C) n = 11 og (D) n = 6 mus per gruppe er vist. Hver sirkel tilsvarer en mus, og de stiplede linjene indikerer grensen for deteksjon. (A-C) *, indikerer en signifikant forskjell (p < 0,05) mellom de angitte gruppene som bestemt ved Kruskal-Wallis-testen. (D) *, indikerer en signifikant forskjell (p < 0,05) mellom +sp og Co-inf mus per bakteriestamme som bestemt av log-rank (Mantel-Cox) test. Forkortelser: +sp = mus infisert intranasalt med bakterier bare ved bruk av den angitte stammen; Co-inf = bakterieinfiserte mus som var infisert med IAV; IAV = mus som fikk influensa A-viruset; CFU = kolonidannende enheter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Strategi for immuncellegating. Lungene ble høstet, og immuncelletilstrømningen ble bestemt ved flowcytometri. Den representative gatingstrategien for de forskjellige celletypene vises. (A) CD45+, levende enkeltceller ble regulert og prosentandelen av (B) PMN (Ly6G+, CD11b+), makrofager (Ly6G-, Ly6C-, F480+) og monocytter (Ly6G-, Ly6C+), (C) DCs (Ly6G-, CD11c+) og NK-celler (NK1.1+, CD3-), (D) TCR- γΔ og CD8 (CD8+, TCRβ+) og CD4 (CD4+, TCRβ+) og CD4 (CD4+, TCRβ+ ) T-celler ble bestemt. Forkortelser: SSC-A = side scatter-peak område; FSC-A = fremover scatter-peak område; FSC-H = fremover scatter-peak høyde; SSC-W = side scatter-peak bredde; L/D = levende/død; FMO = fluorescerende minus en; NK = naturlig morder; PMN = polymorfonukleær leukocytt; DC = dendritisk celle; TCR = T-celle reseptor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Pulmonale immunresponser er bakteriestammeavhengige. Unge (10-12 uker gamle) C57BL/6 hannmus var enten uinfiserte, enkeltinokulert med den indikerte Streptococcus pneumoniae-stammen (+sp), enkeltvis smittet med IAV (IAV), eller samtidig infisert med S. pneumoniae og IAV (Co-inf). Førtiåtte timer etter IAV-infeksjon (se eksperimentelt design i figur 1) ble lungene høstet, og immuncelletilstrømningen ble bestemt ved flowcytometri etter gatingstrategien i figur 3. (A) Gjennomsnittlig prosentandel av hver indikerte celletype innenfor CD45-porten vises for alle behandlingsgruppene på varmekartet. (B) Representative prikkplott av celletyper som viste signifikante forskjeller mellom behandlinger er vist for hver musegruppe. (C) Prosentandelen av de angitte immuncelletypene vises. Hver sirkel tilsvarer en mus. (A,C) Samlede data fra n = 5 mus per gruppe er vist. *, indikerer en signifikant forskjell (p < 0,05) mellom Co-inf og uinfiserte; $, indikerer en signifikant mellom IAV og uinfisert; #, indikerer en signifikant forskjell mellom Co-inf og IAV alene. Signifikante forskjeller mellom utfordringsgruppene for hver celletype ble bestemt av ANOVA etterfulgt av Tukeys test. Forkortelser: NK = naturlig morder; PMN = polymorfonukleær leukocytt; DC = dendritisk celle; TCR = T-celle reseptor; IAV = influensa A-virus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Aldring og økt vertsfølsomhet for IAV/Streptococcus pneumoniae co-infeksjon. Unge (10-12 uker) og eldre (21-22 måneder) C57BL/6 hannmus ble samtidig infisert med S. pneumoniae TIGR4 i.n. og IAV i.n. og i.t. (som i figur 1) eller enkeltvis utfordret med IAV alene. (A) Virale titere ble bestemt 48 timer senere. Stjerner angir statistisk signifikans (p < 0,05) som bestemt av Student t-test. Data er samlet fra n = 4 mus per gruppe. (B) Klinisk score og (C) overlevelse ble overvåket over tid. (B) Gjennomsnittet ± SEM samlet fra n = 6 mus per gruppe er vist. Stjerner indikerer statistisk signifikans (p < 0,05) mellom unge versus gamle mus ved det angitte tidspunktet som bestemt av Mann-Whitney-testen. (C) Data er samlet fra n = 6 mus per gruppe. Stjerner indikerer statistisk signifikans (p < 0,05) mellom unge versus gamle mus som bestemt av log-rank (Mantel-Cox) test. Forkortelser: IAV = influensa A-virus; i.n. = intranasalt; i.t. = intratrakealt; SEM = standardfeil av gjennomsnittet. Figur 5A er gjengitt med tillatelse fra Joma et al.23. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Bland I-lager for CDM | |
| Adenin | 0,1 g |
| D-alanin | 0,25 g |
| CaCl2 vannfri | 0,025 g |
| Mangansulfat | 0,03 g |
| Cyanokobalamin | 100 μL 10 mg/ml stamløsning |
| Para-aminobenzoesyre | 400 μL 5 mg/ml stamløsning |
| Pyridoksamin 2HCl | 100 μL 10 mg/ml stamløsning |
| Mix II-lager for CDM | |
| Guanin | 0,05 g |
| Uracil | 0,05 g |
| Mix III-lager for CDM | |
| Jernnitrat 9H2o | 50 mg/ml |
| Jernsulfat7H2O; | 10 mg/ml |
| Bland IV-lager for CDM | |
| Beta-nikotinamid adenin dinukleotid | 25 mg/ml |
Tabell 1: Bland I-, II-, III- og IV-aksjer for CDM. Forkortelse: CDM = kjemisk definerte medier.
| Vitamin Mix Stock for CDM | |
| Pyridoxal hydroklorid | 0,8 g |
| Tiamin Cl2 | 0,4 g |
| Riboflavin | 0,4 g |
| Ca-pantotenat | 0,4 g |
| Biotin | 0,04 g |
| Folinsyre | 0,4 g |
| Niacinamide | 0,4 g |
Tabell 2: Vitamin Mix Stock for CDM. Forkortelse: CDM = kjemisk definerte medier.
| Aminosyrelager for CDM | |
| L-alanin | 0,480 g |
| L-arginin | 0,250 g |
| L-asparagin | 0,700 g |
| L-asparaginsyre | 0,600 g |
| L-cystein | 1.000 g |
| L-cystin | 0,100 g |
| L-glutaminsyre | 0,200 g |
| L-glutamin | 0,780 g |
| L-glycin | 0,350 g |
| L-histidin | 0,300 g |
| L-isoleucin | 0,430 g |
| L-leucin | 0,950 g |
| L-lysin | 0,880 g |
| L-metionin | 0,250 g |
| L-fenylalanin | 0,550 g |
| L-proline | 1,350 g |
| L-Serine | 0,680 g |
| L-treonin | 0,450 g |
| L-tryptofan | 0,100 g |
| L-Valine | 0,650 g |
Tabell 3: Aminosyrelager for CDM. Forkortelse: CDM = kjemisk definerte medier.
| Startlager for CDM | |
| Druesukker | 1,0 g |
| Magnesiumsulfat-7-hydrat | 0,070 g |
| Kaliumfosfat Dibasisk | 0,02 g |
| Monobasisk kaliumfosfat | 0,1 g |
| Vannfritt natriumacetat | 0,45 g |
| Natron | 0,25 g |
| natriumfosfat dibasisk | 0,735 g |
| Natriumfosfat monobasisk | 0,32 g |
| Endelige kosttilskudd for CDM | |
| Kolinklorid | 0,1 g |
| L-cystein HCl | 0,075 g |
| Natron | 0,25 g |
Tabell 4: Startlager og slutttilskudd for CDM. Forkortelse: CDM = kjemisk definerte medier.
| Antistoff/fluorofor | Klon | Fortynningsfaktor |
| L/D for UV-eksitasjon | N/A | 0.38888889 |
| Ly6G AF 488 | 1A8 | 0.25 |
| CD11b APC | M1/70 | 0.25 |
| CD11c PE | N418 | 0.18055556 |
| Mus Fc-blokk | 2.4G2 | 0.11111111 |
| F4/80 PE Cy7 | BM8 | 0.18055556 |
| Ly6C BV605 | AL-21 | 0.25 |
| CD103 BV 421 | M290 | 0.18055556 |
| CD45 APC-eF-780 | 30-F11 | 0.18055556 |
Tabell 5: Antistoffpanel 1.
| Antistoff/fluorofor | Klon | Fortynningsfaktor |
| L/D for UV-eksitasjon | N/A | 0.388888889 |
| TCR-β APC Cy7 | H57-597 | 0.180555556 |
| CD4 V450 (stillehavsblå) | RM4-5 | 0.25 |
| CD8 BV650 | 53-6.7 | 0.180555556 |
| Mus Fc-blokk | 2.4G2 | 0.111111111 |
| CD45 PE | 30-F11 | 0.180555556 |
| CD3 AF488 | 145-2C11 | 0.180555556 |
| TCR- γΔ APC | GL-3 | 0.180555556 |
| NK1.1 AF 700 | PK136 | 0.180555556 |
Tabell 6: Antistoffpanel 2.
Discussion
De fleste av de eksisterende S. pneumoniae / IAV co-infeksjon eksperimentelle studier stole på bakteriell levering i lungene av mus pre-infisert med IAV. Disse modellene har bidratt til å identifisere endringer i lungemiljøet og systemisk immunrespons som gjør verten utsatt for sekundær bakteriell infeksjon 15,16,17,32,33,34,35,36,37. Imidlertid har disse modellene ikke klart å etterligne overgangen til S. pneumoniae fra en asymptomatisk kolonisator til et patogen som kan forårsake alvorlige lunge- og systemiske infeksjoner. Videre er disse modellene ikke egnet for å studere vertsfaktorer og vertspatogeninteraksjoner i øvre luftveier som bidrar til mottakelighet for infeksjon. En tidligere modell for bevegelse av pneumokokker fra nasofarynks til lunge etter IAV-infeksjon var avhengig av bakteriell infeksjon i nasofarynks etterfulgt av virusinfeksjon. Det klarte imidlertid ikke å reprodusere de alvorlige sykdomstegnene som ble observert hos mennesker21. Den modifiserte murine infeksjonsmodellen beskrevet her rekapitulerer overgangen av S. pneumoniae fra asymptomatisk bærerskap til et patogen som forårsaker alvorlig klinisk sykdom.
Et kritisk skritt i denne modellen er å etablere S. pneumoniae-infeksjon i nasopharynx. Streptococcus pneumoniae danner biofilmer og koloniserer nasopharynx med forskjellige effektiviteter 21,38. For å etablere konsistent infeksjon kreves minst 5 × 106 CFU av de biofilmdyrkede bakteriestammene som er testet så langt23. Det anbefales at enhver ny bakteriestamme testes for stabil infeksjon i nasofarynks før virusinfeksjon. For viral co-infeksjon har tidligere studier funnet at intranasal infeksjon med IAV er nødvendig for spredning av bakteriene fra nasopharynx21,22,23. I de tidligere studiene ble det brukt 500 PFU IAV for intranasal fødsel, mens i denne studien var 200 PFU tilstrekkelig til å øke bakterietall i nasofarynks. IAV-infeksjon er ikke begrenset til de øvre luftveiene og kan spre seg til lungene39,40, noe som er nøkkelen til å gjøre lungemiljøet mer ettergivende for bakteriell infeksjon15,16,41. Levering av IAV til lungene kan oppnås ved enten intranasal levering eller intratrakeal installasjon av bedøvede mus. Tidligere arbeid med BALB / cByJ-mus fant at intranasal levering resulterer i viral lungebetennelse21; Imidlertid er inokulumets tilgang til lungene etter intranasal inokulasjon mer begrenset hos C57BL/6-mus. I C57BL/6-mus er intratrakeal installasjon nødvendig for konsistent levering av viruset23. I denne modellen akselererer tidligere bakteriell kolonisering presentasjonen av sykdomssymptomer etter virusinfeksjon23. Siden virusinfeksjon i seg selv kan forårsake sykdomssymptomer med potensiell variasjon i kinetikk, anbefales det først å teste en rekke doser for enhver ny virusstamme som testes, og velge en dose som avslører akselerert kinetikk hos koinfiserte verter.
Lungene gir en annen kritisk avlesning for sykdomsevaluering i denne modellen. For vurdering av patogenbelastning og immuncelletilstrømning kan en lunge fra samme mus brukes. Men da infeksjons- og betennelsesalvorlighetsgrad kan variere mellom, anbefales det å ikke ta forskjellige av samme lunge for de ulike vurderingene. I stedet kan alle hakkes i små biter, blandes godt sammen, og deretter analyseres likt for de forskjellige vurderingene. På samme måte kan nasopharynx brukes til oppregning av bakteriell CFU eller viral PFU og immunrespons. Imidlertid er antall celler hentet fra vask og vev for lavt til å utføre flowcytometri uten å samle prøvene fra mus i samme gruppe. Alternativt kan inflammasjon i nasofarynks vurderes histologisk23.
Et kritisk trekk ved denne modellen er at den rekapitulerer den kliniske sykdommen sett hos pasienter. Hos mennesker resulterer sekundær pneumokokklungebetennelse etter IAV-infeksjon ofte i åpenbare tegn på sykdom, inkludert hoste, dyspné, feber og muskelsmerter som kan føre til sykehusinnleggelser, respirasjonssvikt og til og med død 8,15,42,43. Denne modellen rekapitulerer de alvorlige tegnene på klinisk sykdom observert hos mennesker når det gjelder pustevansker (reflektert i pustepoengsummen) og generell ulempe (reflektert i holdning og bevegelsespoeng) som vises av musene, samt død hos noen av de friske unge kontrollene. De forverrede sykdomssymptomene hos koinfiserte mus er sannsynligvis et resultat av både bakteriell spredning til lungene og nedsatt virusclearance hos mus med pneumokokkbærervogn23. En begrensning ved modellen er at forekomsten av klinisk sykdom og bakteriell spredning fra nasofarynks varierer mellom mus og påvirkes av bakteriestamme, gisselalder og genotype21,22,23. Reflekterer dette, for invasive stammer, kan progresjonen fra lokalisert infeksjon (uten påviselig bakteriemi) til døden forekomme innen 24 timer. Derfor, for en sann vurdering av systemisk spredning, bør bakteriemi følges over kortere intervaller (hver 6-12 timer). På samme måte kan sykdomspoengsummen endres raskt, spesielt i de første 72 timene etter co-infeksjon. Derfor, for å følge sykdomssymptomene nøye, anbefales det å overvåke mus tre ganger daglig i dagene 1-3 etter IAV-infeksjon.
Oppsummert replikerer denne modellen bevegelsen av S. pneumoniae fra en asymptomatisk kolonisator av nasopharynx til et patogen som kan forårsake lunge- og systemisk sykdom ved IAV-infeksjon. I denne modellen utløser IAV overgangen til S. pneumoniae ved å modifisere bakterieoppførselen i nasopharynx, øke bakteriell spredning til lungen og endre antibakteriell immunitet23. På samme måte sløver bakteriell vogn de antivirale immunresponsene og svekker IAV-clearance fra lungene23. Dette gjør denne modellen ideell for å analysere endringer i immunresponser i enkeltstående versus polymikrobielle infeksjoner. I tillegg er sykdomsforløpet etter koinfeksjon delvis avhengig av belastningen av pneumokokker som er tilstede i nasopharynx. Derfor er modellen egnet til å dissekere bakteriefaktorene som kreves for asymptomatisk kolonisering versus patogen overgang av S. pneumoniae. Til slutt reproduserer denne modellen følsomheten for aldring av koinfeksjoner, og selv om dette ikke ble testet her, kan det lett brukes til å vurdere effekten av vertsbakgrunn på sykdomsforløpet. Avslutningsvis gir separering av vogn og sykdom i forskjellige trinn muligheten til å analysere de genetiske varianter av både patogener og verten, slik at detaljert undersøkelse av samspillet mellom en viktig pathobiont og verten i ulike faser av sykdomsprogresjon. Fremover kan denne modellen brukes til å skreddersy behandlingsalternativer for sårbare verter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Nick Lenhard for kritisk lesing og redigering av dette manuskriptet. Vi vil også takke Andrew Camilli og Anthony Campagnari for bakteriestammene og Bruce Davidson for virusstammene. Dette arbeidet ble støttet av National Institute of Health Grant (R21AG071268-01) til JL og National Institute of Health Grants (R21AI145370-01A1), (R01AG068568-01A1), (R21AG071268-01) til E.N.B.G.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Aminobenzoic acid | Fisher | AAA1267318 | Mix I stock |
| 96-well round bottom plates | Greiner Bio-One | 650101 | |
| 100 µm Filters | Fisher | 07-201-432 | |
| Adenine | Fisher | AC147440250 | Mix I stock |
| Avicel | Fisher | 501785325 | Microcyrstalline cellulose |
| BD Cytofix Fixation Buffer | Fisher | BDB554655 | Fixation Buffer |
| BD Fortessa | Flow cytometer | ||
| BD Intramedic Polyethylene Tubing | Fisher | 427410 | Tubing for nasal lavage |
| BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (1 mL) | Fisher | 14-823-30 | |
| BD Microtainer Capillary Blood Collector and BD Microgard Closure | Fisher | 02-675-185 | Blood collection tubes |
| Beta-Nicotinamide adenine dinucleotide | Fisher | AAJ6233703 | Mix IV stock |
| Biotin | Fisher | AC230090010 | Vitamin stock |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | #000644 | Mice used in this study |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher Chemical | C77-500 | Mix I stock |
| CD103 BV 421 | BD Bioscience | BDB562771 | Clone: M290 DF 1:200 |
| CD11b APC | Invitrogen | 50-112-9622 | Clone: M1/70, DF 1:300 |
| CD11c PE | BD Bioscience | BDB565592 | Clone: N418 DF 1:200 |
| CD3 AF 488 | BD Bioscience | OB153030 | Clone: 145-2C11 DF 1:200 |
| CD4 V450 | BD Horizon | BDB560470 | Clone: RM4.5 DF 1:300 |
| CD45 APC eF-780 | BD Bioscience | 50-112-9642 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
| CD45 PE | Invitrogen | 50-103-70 | Clone: 30-F11 DF 1:200 |
| CD8α BV 650 | BD Horizon | BDB563234 | Clone: 53-6.7 DF 1:200 |
| Choline chloride | Fisher | AC110290500 | Final supplement to CDM |
| Corning Disposable Vacuum Filter/Storage Systems | Fisher | 09-761-107 | Filter sterilzation apparatus |
| Corning Tissue Culture Treated T-25 Flasks | Fisher | 10-126-9 | |
| Corning Costar Clear Multiple Well Plates | Fisher | 07-201-590 | |
| Corning DMEM With L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose; Without Sodium Pyruvate | Fisher | MT10017CM | |
| Cyanocobalamin | Fisher | AC405925000 | Mix I stock |
| D39 | National Collection of Type Culture (NCTC) | NCTC 7466 | Streptococcus pneumoniae strain |
| D-Alanine | Fisher | AAA1023114 | Mix I stock |
| D-Calcium pantothenate | Fisher | AC243301000 | Vitamin stock |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16-500 | Starter stock |
| Dnase | Worthington Biochemical | LS002147 | |
| Eagles Minimum Essential Medium | ATCC | 30-2003 | |
| EDTA | VWR | BDH4616-500G | |
| EF3030 | Center for Disease Control and Prevention | Available via the isolate bank request | Streptococcus pneumoniae strain, request using strain name |
| F480 PE Cy7 | BD Bioscience | 50-112-9713 | Clone: BMB DF 1:200 |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 14-432-22 | 50 mL round bottom tube |
| Falcon Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap | Fisher | 14-959-11B | 15 mL round bottom tube |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes (5 mL) | Fisher | 14-959-5 | FACS tubes |
| FBS | Thermofisher | 10437-028 | |
| Ferric Nitrate Nonahydrate | Fisher | I110-100 | Mix III stock |
| Fisherbrand Delicate Dissecting Scissors | Fisher | 08-951-5 | Instruments used for harvest |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops | Fisher | 22-363-602 | Inoculating loops |
| Fisherbrand Dissecting Tissue Forceps | Fisher | 13-812-38 | Forceps for harvest |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher | 05-408-137 | Micocentrifuge tubes |
| Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (10 mL) | Fisher | 14-955-459 | |
| Folic Acid | Fisher | AC216630500 | Vitamin stock |
| Gibco RPMI 1640 (ATCC) | Fisher | A1049101 | |
| Gibco DPBS, no calcium, no magnesium | Fisher | 14190250 | |
| Gibco HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Fisher | 14025134 | |
| Gibco MEM (Temin's modification) (2x), no phenol red | Fisher | 11-935-046 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher | 15-140-122 | |
| Gibco Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher | 15-250-061 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Fisher | 25-200-056 | |
| Glycerol (Certified ACS) | Fisher | G33-4 | |
| Glycine | Fisher | AA3643530 | Amino acid stock |
| Guanine | Fisher | AAA1202414 | Mix II stock |
| Invitrogen UltraComp eBeads Compensation Beads | Fisher | 50-112-9040 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher | AAA1517836 | Mix III stock |
| L-Alanine | Fisher | AAJ6027918 | Amino acid stock |
| L-Arginine | Fisher | AAA1573814 | Amino acid stock |
| L-Asparagine | Fisher | AAB2147322 | Amino acid stock |
| L-Aspartic acid | Fisher | AAA1352022 | Amino acid stock |
| L-Cysteine | Fisher | AAA1043518 | Amino acid stock |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Fisher | AAA1038914 | Final supplement to CDM |
| L-Cystine | Fisher | AAA1376218 | Amino acid stock |
| L-Glutamic acid | Fisher | AC156211000 | Amino acid stock |
| L-Glutamine | Fisher | O2956-100 | Amino acid stock |
| L-Histidine | Fisher | AC166150250 | Amino acid stock |
| LIFE TECHNOLOGIES LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | Invitrogen | 50-112-1524 | Clone: N/A DF 1:500 |
| L-Isoleucine | Fisher | AC166170250 | Amino acid stock |
| L-Leucine | Fisher | BP385-100 | Amino acid stock |
| L-Lysine | Fisher | AAJ6222514 | Amino acid stock |
| L-Methionine | Fisher | AAA1031822 | Amino acid stock |
| Low endotoxin BSA | Sigma Aldrich | A1470-10G | |
| L-Phenylalanine | Fisher | AAA1323814 | Amino acid stock |
| L-Proline | Fisher | AAA1019922 | Amino acid stock |
| L-Serine | Fisher | AC132660250 | Amino acid stock |
| L-Threonine | Fisher | AC138930250 | Amino acid stock |
| L-Tryptophan | Fisher | AAA1023014 | Amino acid stock |
| L-Valine | Fisher | AAA1272014 | Amino acid stock |
| Ly6C BV 605 | BD Bioscience | BDB563011 | Clone: AL-21 DF 1:300 |
| Ly6G AF 488 | Biolegend | NC1102120 | Clone: IA8, DF 1:300 |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-34 | MDCK cell line for PFU analuysis |
| Magnesium Sulfate 7-Hydrate | Fisher | 60-019-68 | CDM starter stock |
| Manganese Sulfate | Fisher | M113-500 | Mix I stock |
| MilQ water | Ultra-pure water | ||
| Mouse Fc Block | BD Bioscience | BDB553142 | Clone: 2.4G2 DF 1:100 |
| MWI VETERINARY PURALUBE VET OINTMENT | Fisher | NC1886507 | Eye lubricant for infection |
| NCI-H292 mucoepidermoid carcinoma cell line | ATCC | CRL-1848 | H292 lung epithelial cell line for biofilm growth |
| Niacinamide | Fisher | 18-604-792 | Vitamin stock |
| NK 1.1 AF 700 | BD Bioscience | 50-112-4692 | Clone: PK136 DF 1:200 |
| Oxyrase For Broth 50Ml Bottle 1/Pk | Fisher | 50-200-5299 | To remove oxygen from liquid cultures |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | Thermoscientific | J19932-K2 | |
| Pivetal Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-8440 | Isoflurane for anesthesia during infection |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | P288-500 | Starter stock |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | P285-500 | Starter stock |
| Pyridoxal hydrochloride | Fisher | AC352710250 | Vitamin stock |
| Pyridoxamine dihydrochloride | Fisher | AAJ6267906 | Mix I stock |
| Riboflavin | Fisher | AC132350250 | Vitamin stock |
| Sodium Acetate | VWR | 0530-500G | Starter stock |
| Sodium Azide | Fisher Bioreagents | BP922I-500 | For FACS buffer |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | Starter stock and final supplement to CDM |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Chemical | S374-500 | Starter stock |
| Sodium Phosphate Monobasic | Fisher Chemical | S369-500 | Starter stock |
| TCR APC | BD Bioscience | 50-112-8889 | Clone: GL-3 DF 1:200 |
| TCRβ APC-Cy7 | BD Pharmigen | BDB560656 | Clone: H57-597 DF 1:200 |
| Thermo Scientific Blood Agar with Gentamicin | Fisher | R01227 | Blood agar plates with the antibiotic gentamicin |
| Thermo Scientific Trypsin, TPCK Treated | Fisher | PI20233 | |
| Thiamine hydrochloride | Fisher | AC148991000 | Vitamin stock |
| TIGR4 | ATCC | BAA-334 | Streptococcus pneumoniae strain |
| Uracil | Fisher | AC157300250 | Mix II stock |
| Worthington Biochemical Corporation Collagenase, Type 2, 1 g | Fisher | NC9693955 |
References
- Kadioglu, A., Weiser, J. N., Paton, J. C., Andrew, P. W. The role of Streptococcus pneumoniae virulence factors in host respiratory colonization and disease. Nature Reviews Microbiology. 6 (4), 288-301 (2008).
- Obaro, S., Adegbola, R. The pneumococcus: Carriage, disease and conjugate vaccines. Journal of Medical Microbiology. 51 (2), 98-104 (2002).
- Chong, C. P., Street, P. R. Pneumonia in the elderly: A review of the epidemiology, pathogenesis, microbiology, and clinical features. Southern Medical Journal. 101 (11), 1141-1145 (2008).
- Kadioglu, A., Andrew, P. W. Susceptibility and resistance to pneumococcal disease in mice. Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 4 (3), 241-247 (2005).
- Ganie, F., et al. Structural, genetic, and serological elucidation of Streptococcus pneumoniae serogroup 24 serotypes: Discovery of a new serotype, 24C, with a variable capsule structure. Journal of Clinical Microbiology. 59 (7), 0054021 (2021).
- Centers for Disease Control and Prevention. Estimates of deaths associated with seasonal influenza --- United States. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Shrestha, S., et al. Identifying the interaction between influenza and pneumococcal pneumonia using incidence data. Science Translational Medicine. 5 (191), (2013).
- McCullers, J. A. Insights into the interaction between influenza virus and pneumococcus. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 571-582 (2006).
- Pneumococcal Disease Global Pneumococcal Disease and Vaccine. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/pneumococcal/global.html (2018).
- Grudzinska, F. S., et al. Neutrophils in community-acquired pneumonia: Parallels in dysfunction at the extremes of age. Thorax. 75 (2), 164-171 (2020).
- Boe, D. M., Boule, L. A., Kovacs, E. J. Innate immune responses in the ageing lung. Clinical and Experimental Immunology. 187 (1), 16-25 (2017).
- Krone, C. L., van de Groep, K., Trzcinski, K., Sanders, E. A., Bogaert, D. Immunosenescence and pneumococcal disease: An imbalance in host-pathogen interactions. The Lancet Respiratory Medicine. 2 (2), 141-153 (2014).
- Cho, S. J., et al. Decreased NLRP3 inflammasome expression in aged lung may contribute to increased susceptibility to secondary Streptococcus pneumoniae infection. Experimental Gerontology. 105, 40-46 (2018).
- Disease Burden of Influenza. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/flu/about/burden/index.html (2018).
- McCullers, J. A. The co-pathogenesis of influenza viruses with bacteria in the lung. Nature Reviews Microbiology. 12 (4), 252-262 (2014).
- McCullers, J. A., Rehg, J. E. Lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae: Characterization of a mouse model and the role of platelet-activating factor receptor. The Journal of Infectious Diseases. 186 (3), 341-350 (2002).
- Metzger, D. W., Sun, K. Immune dysfunction and bacterial coinfections following influenza. Journal of Immunology. 191 (5), 2047-2052 (2013).
- Chao, Y., Marks, L. R., Pettigrew, M. M., Hakansson, A. P. Streptococcus pneumoniae biofilm formation and dispersion during colonization and disease. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 194 (2014).
- Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: The key to pneumococcal disease. The Lancet Infectious Diseases. 4 (3), 144-154 (2004).
- Simell, B., et al. The fundamental link between pneumococcal carriage and disease. Expert Review of Vaccines. 11 (7), 841-855 (2012).
- Marks, L. R., Davidson, B. A., Knight, P. R., Hakansson, A. P. Interkingdom signaling induces Streptococcus pneumoniae biofilm dispersion and transition from asymptomatic colonization to disease. mBio. 4 (4), 00438 (2013).
- Reddinger, R. M., Luke-Marshall, N. R., Sauberan, S. L., Hakansson, A. P., Campagnari, A. A. Streptococcus pneumoniae modulates Staphylococcus aureus biofilm dispersion and the transition from colonization to invasive disease. mBio. 9 (1), 02089 (2018).
- Joma, B. H., et al. A murine model for enhancement of Streptococcus pneumoniae pathogenicity upon viral infection and advanced age. Infection and Immunity. 89 (8), 0047120 (2021).
- Andersson, B., et al. Identification of an active disaccharide unit of a glycoconjugate receptor for pneumococci attaching to human pharyngeal epithelial cells. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 559-570 (1983).
- Avery, O. T., Macleod, C. M., McCarty, M. Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types: Induction of transformation by a desoxyribonucleic acid fraction isolated from pneumococcus type III. The Journal of Experimental Medicine. 79 (2), 137-158 (1944).
- Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
- Tothpal, A., Desobry, K., Joshi, S. S., Wyllie, A. L., Weinberger, D. M. Variation of growth characteristics of pneumococcus with environmental conditions. BMC Microbiology. 19 (1), 304 (2019).
- Bou Ghanem, E. N., et al. Extracellular adenosine protects against Streptococcus pneumoniae lung infection by regulating pulmonary neutrophil recruitment. PLoS Pathogens. 11 (8), 1005126 (2015).
- Bou Ghanem, E. N., et al. The alpha-tocopherol form of vitamin E boosts elastase activity of human PMNs and their ability to kill Streptococcus pneumoniae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 161 (2017).
- Tait, A. R., Davidson, B. A., Johnson, K. J., Remick, D. G., Knight, P. R. Halothane inhibits the intraalveolar recruitment of neutrophils, lymphocytes, and macrophages in response to influenza virus infection in mice. Anesthesia & Analgesia. 76 (5), 1106-1113 (1993).
- Aaberge, I. S., Eng, J., Lermark, G., Lovik, M. Virulence of Streptococcus pneumoniae in mice: A standardized method for preparation and frozen storage of the experimental bacterial inoculum. Microbial Pathogenesis. 18 (2), 141-152 (1995).
- McCullers, J. A., Bartmess, K. C. Role of neuraminidase in lethal synergism between influenza virus and Streptococcus pneumoniae. The Journal of Infectious Diseases. 187 (6), 1000-1009 (2003).
- Smith, A. M., McCullers, J. A. Secondary bacterial infections in influenza virus infection pathogenesis. Current Topics in Microbiology and Immunology. 385, 327-356 (2014).
- Cundell, D. R., Gerard, N. P., Gerard, C., Idanpaan-Heikkila, I., Tuomanen, E. I. Streptococcus pneumoniae anchor to activated human cells by the receptor for platelet-activating factor. Nature. 377 (6548), 435-438 (1995).
- Ballinger, M. N., Standiford, T. J. Postinfluenza bacterial pneumonia: Host defenses gone awry. Journal of Interferon & Cytokine Research. 30 (9), 643-652 (2010).
- Sun, K., Metzger, D. W. Inhibition of pulmonary antibacterial defense by interferon-gamma during recovery from influenza infection. Nature Medicine. 14 (5), 558-564 (2008).
- Nakamura, S., Davis, K. M., Weiser, J. N. Synergistic stimulation of type I interferons during influenza virus coinfection promotes Streptococcus pneumoniae colonization in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (9), 3657-3665 (2011).
- Blanchette-Cain, K., et al. Streptococcus pneumoniae biofilm formation is strain dependent, multifactorial, and associated with reduced invasiveness and immunoreactivity during colonization. mBio. 4 (5), 00745 (2013).
- Rello, J., Pop-Vicas, A. Clinical review: Primary influenza viral pneumonia. Critical Care. 13 (6), 235 (2009).
- Torres, A., Loeches, I. M., Sligl, W., Lee, N. Severe flu management: A point of view. Intensive Care Medicine. 46 (2), 153-162 (2020).
- Bakaletz, L. O.
- Palacios, G., et al. Streptococcus pneumoniae coinfection is correlated with the severity of H1N1 pandemic influenza. PLoS One. 4 (12), 8540 (2009).
- Dhanoa, A., Fang, N. C., Hassan, S. S., Kaniappan, P., Rajasekaram, G. Epidemiology and clinical characteristics of hospitalized patients with pandemic influenza A (H1N1) 2009 infections: The effects of bacterial coinfection. Virology Journal. 8, 501 (2011).
