Summary
Het bevorderen van de studie van preantrale folliculogenese vereist efficiënte methoden voor follikelisolatie van enkele eierstokken. Hier wordt een gestroomlijnd, mechanisch protocol gepresenteerd voor follikelisolatie van runderbitussen met behulp van een weefselhakselaar en homogenisator. Deze methode maakt het mogelijk om een groot aantal levensvatbare preantrale follikels uit een enkele eierstok te verzamelen.
Abstract
Het begrijpen van het volledige proces van folliculogenese van zoogdieren is cruciaal voor het verbeteren van geassisteerde voortplantingstechnologieën bij vee, mensen en bedreigde soorten. Onderzoek is meestal beperkt gebleven tot antrale en grote preantrale follikels vanwege moeilijkheden bij de isolatie van kleinere preantrale follikels, vooral bij grote zoogdieren zoals runderen. Dit werk presenteert een efficiënte aanpak om grote aantallen kleine preantrale follikels uit een enkele runder eierstok op te halen. De cortex van individuele runderbitussen werd gesneden in kubussen van 500 μm met behulp van een weefselhakselaar en gedurende 6 minuten gehomogeniseerd bij 9.000-11.000 tpm met behulp van een 10 mm-sonde. Groot puin werd van het homogenaat gescheiden met behulp van een kaasdoek, gevolgd door seriële filtratie door celzeefmachines van 300 μm en 40 μm. De inhoud die in de zeef van 40 μm werd achtergebleven, werd gespoeld in een zoekschaal, waar follikels werden geïdentificeerd en verzameld in een druppel medium. De levensvatbaarheid van de verzamelde follikels werd getest via trypan blue-kleuring. Deze methode maakt de isolatie van een groot aantal levensvatbare kleine preantrale follikels uit een enkele runder eierstok in ongeveer 90 minuten mogelijk. Belangrijk is dat deze methode volledig mechanisch is en het gebruik van enzymen vermijdt om het weefsel te dissociëren, wat de follikels kan beschadigen. De follikels verkregen met behulp van dit protocol kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals isolatie van RNA voor RT-qPCR, immunolokalisatie van specifieke eiwitten en in vitro cultuur.
Introduction
Ovariële follikels zijn de functionele eenheden van de eierstok, verantwoordelijk voor de productie van het gameat (eicel) en hormonen die cruciaal zijn voor de voortplantingsfunctie en de algehele gezondheid. Primordiale follikels vormen zich in de eierstok tijdens de foetale ontwikkeling of in de neonatale periode, afhankelijk van de soort1, en ze vormen het ovariële reservaat van een vrouw. Folliculaire groei begint met de activering van primordiale follikels die de rustpool verlaten en de groeifase ingaan. Preantrale folliculogenese, die alle follikelstadia vóór de ontwikkeling van het antrum omvat, is een zeer dynamisch proces dat synchrone morfologische en metabole veranderingen in de eicel en de omliggende granulosacellen vereist, aangedreven door nauwe communicatie tussen deze twee celtypen 2,3. Preantrale follikels vormen de meerderheid van de folliculaire eenheden die op een bepaald moment in de eierstok worden aangetroffen4. De ontwikkeling door de preantrale stadia van folliculogenese wordt geschat op enkele weken langer dan antrale ontwikkeling 5,6, en deze tijd is nodig voor de eicel en somatische cellen om voldoende volwassenheid te verwerven om de laatste fase van ontwikkeling (d.w.z. het antrale stadium) in te gaan en zich voor te bereiden op ovulatie, bevruchting en embryonale ontwikkeling 7,8,9.
Veel van de huidige kennis over ovariële preantrale folliculogenese komt van muismodellen 10,11,12,13, deels vanwege het gemak bij het herstellen van een groot aantal van deze follikels uit een kleinere en minder vezelige eierstok. Hoewel meldingen van isolatie van grote aantallen preantrale follikels uit runderbieuze eierstokken ongeveer 30 jaar oud zijn14, is een vollediger begrip van de processen die de ontwikkeling van deze follikels in een vroeg stadium reguleren, niet gerealiseerd, grotendeels vanwege het gebrek aan geoptimaliseerde, efficiënte en herhaalbare methoden om voldoende aantallen levensvatbare preantrale follikels op te halen, vooral in vroege stadia van ontwikkeling. Met de toenemende belangstelling voor het behoud van de ovariële reserve voor toekomstig gebruik bij geassisteerde voortplanting bij mensen, worden koeien een aantrekkelijk model vanwege hun meer vergelijkbare ovariële structuur15. De runderkolvis is echter aanzienlijk rijker aan collageen in vergelijking met de eierstok van de muis16, waardoor mechanische isolatie met behulp van methoden die voor de muis zijn beschreven, zeer inefficiënt is. Inspanningen om vruchtbaarheidsbehoudstechnieken uit te breiden omvatten volledige in vitro groei van preantrale follikels tot het antrale stadium, gevolgd door in vitro rijping (IVM) van de ingesloten eicellen, in vitro fertilisatie (IVF) en embryoproductie en -overdracht17. Tot nu toe is dit hele proces alleen bereikt bij muizen18. Bij runderen is de vooruitgang in de richting van follikelgroei in vitro beperkt tot enkele rapporten met variabele follikelstadia aan het begin van de kweek, evenals variabele lengte van de cultuur tussen protocollen17,19.
De in de literatuur beschreven methoden voor de oogst van preantrale follikels uit de runderkolvis hebben meestal mechanische en enzymatische technieken gebruikt, geïsoleerd of in combinatie 2,14,17,20. Het eerste rapport van een protocol voor runderpreantrale follikelisolatie gebruikte een weefselhomogenisator en seriële filtratie om hele eierstokken te verwerken20. Deze studie werd gevolgd door rapporten die mechanische en enzymatische procedures combineerden die collagenase14 gebruikten. Een terugkerend thema bij het gebruik van collagenase om het eierstokweefsel te verteren, is het potentiële risico op schade aan het folliculaire keldermembraan, wat de levensvatbaarheid van de follikel in gevaar kan brengen 14,21,22,23. Daarom zijn verschillende combinaties van mechanische methoden gebruikt, zoals het gebruik van een weefselhakselaar en herhaald pipetteren of een weefselhakselaar gecombineerd met homogenisatie 20,24,25,26. Een andere mechanische techniek die is beschreven, maakt gebruik van naalden om preantrale follikels rechtstreeks uit het eierstokweefsel te ontleden, wat vooral handig is voor het isoleren van grotere (> 200 μm) secundaire follikels. Dit proces is echter tijdrovend, inefficiënt voor het isoleren van kleinere preantrale follikels en is afhankelijk van vaardigheden wanneer het wordt geprobeerd in runderbieuze eierstokken 19,27,28.
Gebruikmakend van de verschillende technieken die in de literatuur worden beschreven, was dit protocol gericht op het optimaliseren van de isolatie van preantrale follikels uit enkele rundervliegen op een eenvoudige, consistente en efficiënte manier die incubatie in enzymatische oplossingen vermijdt. Het verbeteren van de methoden om preantrale follikels te isoleren zal een kans bieden om het begrip van dit stadium van folliculogenese te vergroten en de ontwikkeling van effectieve kweeksystemen mogelijk te maken om preantrale follikels tot het antrale stadium te ontwikkelen. De gedetailleerde procedures die hierin worden beschreven voor de isolatie van preantrale follikels van een groot zoogdier zoals de rundersoort zullen van vitaal belang zijn voor onderzoekers die vroege folliculogenese willen bestuderen in een niet-muizensoort die vertaalbaar is naar mensen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Runderen (Bos taurus) eierstokken werden afkomstig uit een lokaal slachthuis en binnen 6 uur na het verzamelen naar het laboratorium vervoerd. Vanwege het grote aantal dieren dat in de faciliteit wordt verwerkt, zijn de leeftijd, het ras en het stadium van de oestruscyclus van de dieren onbekend. Omdat er in deze experimenten geen levende dieren werden gebruikt, was een goedgekeurd protocol voor dierverzorging en -gebruik niet vereist.
1. Voorbereiding van apparatuur en reagentia
- Bedek een 2 ft breed gedeelte van een laboratoriumbank met bankpapier.
- Verkrijg een scalpelhandvat, steriel scalpelmes, hemostat, dissectietang, 20 ml luer-lock spuit, 18 G naald, twee bekers van 200 ml, erlenmeyer van 500 ml, plastic trechter met een diameter van 104 mm, plastic snijplank, één2-laag kaasdoek van 2 cm (de kaasdoek kan worden gesteriliseerd door vóór gebruik te autoclaveren) per eierstok die wordt verwerkt, een celzeef van 300 μm en een celzeef van 40 μm (zie materiaaltabel).
- Breng alle apparatuur over op het bankpapier.
- Gebruik de hemostaat om het scalpelmesje op het scalpelhandvat te plaatsen. Lijn de schuine basis van het blad uit op de schuine indicator op de handgreep en schuif het blad vervolgens in de groef van de handgreep.
- Plaats de trechter in de Erlenmeyer en bedek de trechteropening met het kaasdoek.
- Plaats één conische buis van 50 ml per eierstok die moet worden verwerkt in een water- of kraalbad dat is ingesteld op 38,5 °C.
- Plaats één vierkante petrischaal van 100 mm x 15 mm per eierstok die wordt verwerkt op een schuifwarmer op 38,5 °C.
- Voeg 10 ml penicilline-streptomycine (PenStrep; 10.000 U / ml penicilline en 10.000 μg / ml streptomycine) toe aan 1 l 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwarm de PBS + PenStrep in een water- of kralenbad op 38,5 °C ten minste 2 uur voorafgaand aan de eierstokverwerking.
OPMERKING: PBS + PenStrep-oplossing is noodzakelijk voor het wassen van eierstokken wanneer geïsoleerde follikels worden gekweekt, en het wordt nog steeds aanbevolen voor stroomafwaartse experimenten om microbiële besmetting te verminderen. - Gebruik voor het verzamelen van verwerkt eierstokfiltraat Follicle Wash Medium (FWM) bestaande uit TCM199 met Hank's Salts (zie Materiaaltabel) met 3 mg/ml runderserumalbumine (BSA), 25 mM HEPES-buffer, 100 UI-penicilline/100 μg/ml streptomycine, 1 mM natriumpyruvaat (NaPyr) en 100 nM niet-essentiële aminozuren (NEAA).
- Breng steriele TCM199, een fles van 250 ml en een gegradueerde cilinder van 100 ml over naar een bioveiligheidskast (BSC). Breng 194 ml TCM199 over op de fles.
- Haal het bekerglas van TCM199 uit de BSC en breng het op een roerbord. Voeg 600 mg BSA, 1,19 g HEPES-buffer en een geautoclaveerde roerstaaf toe aan de fles en roer tot het is opgelost.
- Zodra de BSA- en HEPES-buffer volledig zijn opgelost, voegt u 1 N natriumhydroxide (NaOH) toe aan het medium totdat het een pH van 7,6-7,8 bereikt, zoals gemeten door een pH-meter.
- Veeg de fles medium, een vacuümfiltratieapparaat, vier conische buizen van 50 ml en de flessen PenStrep, NaPyr en NEAA af met 70% ethanol voordat u ze naar de BSC overbrengt.
- Voeg 2 ml elk van PenStrep (10.000 U / ml penicilline en 10.000 μg / ml streptomycine), 100 mM NaPyr en 100x NEAA toe aan de fles TCM199 + 3 mg / ml BSA + 25 mM HEPES. Steriel filter het eindmedium en aliquot in de conische buizen van 50 ml. Bewaar het medium bij 4 °C gedurende maximaal 2 weken.
- Verwarm één conische buis van 50 ml medium per twee eierstokken in een kraalbad op 38,5 °C ten minste 1 uur voorafgaand aan de eierstokbehandeling.
2. Tissue chopper setup
- Zorg ervoor dat de tissue chopper (zie Tabel met materialen) is aangesloten en ingeschakeld.
- Stel de plakdikte in op 500 μm, de bladkrachtregelknop op 20° en de snelheidsregelaar op 90° volgens de specificaties van de fabrikant.
- Steek een plastic petrischaal van 60 mm in de plaathouder en plaats de plaathouder op het podium.
- Til de hakarm zo hoog mogelijk op door met de hand aan de handmatige bedieningsknop met de klok mee te draaien.
- Plaats met een tang een tweesnijdend scheermesje (zie Materiaaltafel) op de schroef die in de hakarm is gestoken. Plaats de bladsluiting over het mes en bevestig met de ring en moer. Laat de moer een kwartslag los.
- Draai aan de handmatige bedieningsknop totdat de hakarm het mes plat op de petrischaal klikt. Draai de moer de rest van de weg vast met de moerdriver.
- Til de hakarm zo hoog mogelijk op met behulp van de handmatige bedieningsknop. Beweeg de tafelontgrendelingsknop helemaal naar links totdat deze op zijn plaats inspringt.
3. Ovariumpreparaat
- Breng eierstokken over in het laboratorium naar warm (38,5 °C) steriel PBS + PenStrep.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de eierstokken te verwerken voor follikelisolatie zodra dit haalbaar is na verwijdering uit het dier. In dit protocol werden eierstokken binnen 6 uur na het oogsten verwerkt. Eierstokken werden van het slachthuis naar het laboratorium vervoerd in thermoskannen met steriele 0,9% zoutoplossing bij ongeveer 38,5 °C. - Selecteer indien mogelijk kleine (≤ 4 cm x 3 cm x 3 cm) eierstokken met kleine (3-5 mm) antrale follikels, geen grote (≥8 mm) antrale follikels en geen prominent corpus luteum (figuur 1). Deze criteria worden aanbevolen om ervoor te zorgen dat een minimale hoeveelheid niet-follikelresten, zoals stromale cellen en extracellulaire matrix, wordt opgenomen in de resulterende vierkante schaal met geïsoleerde follikels.
OPMERKING: Antrale follikels kunnen worden geïdentificeerd als bolvormige, met vloeistof gevulde vesiculaire structuren op het oppervlak van de eierstok. Corpora lutea kan worden geïdentificeerd als rode, oranje of gele stijve structuren die uitsteken uit het oppervlak van de eierstok. - Gebruik een schaar om overtollig bindweefsel en vet uit de eierstokken te verwijderen.
- Was de eierstokken gedurende 30 s in 70% ethanol in een bekerglas.
- Was de eierstokken 3x gedurende 2 minuten elk in bekers van warm (38,5 °C) PBS + PenStrep, met verse PBS + PenStrep voor elke wasbeurt.
- Houd de eierstokken warm (38,5 °C) PBS + PenStrep tot ze klaar zijn voor verwerking.
OPMERKING: De afstand tussen het laboratorium en de eierstokbron kan variabel zijn. Daarom is het belangrijk om het protocol tijdig te voltooien om ervoor te zorgen dat de folliculaire levensvatbaarheid behouden blijft.
Figuur 1: Anatomie van de runder eierstok. De runder eierstok bestaat uit twee hoofdgebieden ingesloten in een epitheliale laag. De cortex, bestaande uit het weefsel links van de stippellijn, bevat ovariële follikels van het primordiale stadium tot het antrale stadium. Voortrale follikels zijn te klein om met het blote oog te zien; antrale follikels zijn gemarkeerd met sterretjes. Het medulla, bestaande uit het weefsel rechts van de stippellijn, bevat bloedvaten, lymfevaten en zenuwen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Hakprocedure
OPMERKING: Verwerk slechts één eierstok tegelijk. Verwerk eierstokken snel om temperatuurdalingen te voorkomen, die de levensvatbaarheid van de follikel kunnen beïnvloeden.
- Breng één eierstok over op de snijplank op het bankpapier (figuur 2A) en bereid de tissuehakselaar voor (figuur 2B).
- Snijd met behulp van een tang en een scalpel de eierstok in tweeën en verwijder het medulla van elke helft, waardoor alleen de cortex overblijft op een dikte van ongeveer 1 mm, zoals weergegeven in figuur 2C.
- Snijd de eierstok in de lengterichting doormidden van de ene ligamentaanhechtingsplaats naar de tegenovergestelde aanhechtingsplaats.
- Houd de ene helft van de eierstok op de te verwerken snijplank en plaats de andere helft van de eierstok weer in warm (38,5 °C) PBS + PenStrep.
- Met de blootgestelde medulla naar boven gericht, snijdt u langs de kromming van de eierstok op ongeveer 2 mm afstand van het oppervlak van de eierstok zonder door de cortex te snijden.
- Gebruik het plakje langs de kromming van de eierstok als leidraad om het plakje te verdiepen, nog steeds volgens de kromming van de eierstok om de cortex van het medulla te scheiden.
- Ontleed en gooi alle corpora lutea uit de eierstok door langs de rand van het corpus luteum te snijden.
- Draai de eierstok half om zodat het epitheel naar boven is gericht en gebruik het scalpel om het medulla weg te snijden van de cortex. Knip het resterende witte bindweefsel weg rond de rand van het eierstokstuk dat verbonden was met de ligamenten.
- Zodra het grootste deel van de medulla is verwijderd, gebruikt u het scalpel om de cortex tot ongeveer 1 mm dikte te snijden. Manipuleer het scalpel met kleine, heen-en-weer bewegingen om de rest van de medulla weg te scheren.
OPMERKING: De medulla is het binnenste deel van de eierstok met grote bloedvaten. De cortex is het buitenste deel van de eierstok en ligt direct onder het buitenste oppervlakte-epitheel. De cortex is ongeveer 1 mm dik in de runder-eierstok en dus zal het snijden van de eierstok tot een dikte van 1 mm de medulla verwijderen.
- Snijd de cortex in stukjes die niet groter zijn dan 2,5 cm x 2,5 cm. Houd de cortexstukken in warme (38,5 °C) PBS + PenStrep tot ze klaar zijn om te hakken.
- Vul een bekerglas met ten minste 50 ml warme (38,5 °C) PBS + PenStrep en verkrijg een plastic transferpipet.
- Breng een enkel stukje cortex over naar de petrischaal op de weefselhakselaar en maak het weefsel nat met drie of vier druppels warme (38,5 °C) PBS + PenStrep.
- Houd het stukje weefsel stabiel met een tang en druk eenmaal op de resetknop om de tissue chopper te starten. Stabiliseer de petrischaal met één hand terwijl u het weefsel blijft stabiliseren met de tang. Beweeg de tang naar links langs het weefsel als dat nodig is om te voorkomen dat het mes de tang raakt. De resulterende strips zullen ongeveer 500 μm lang zijn.
- Zodra het hele stuk cortex in stroken is gesneden, gebruikt u de knop van de meshouder om het mes van de petrischaal en de tang op te tillen om weefsel van het mes te verwijderen.
- Draai de plaathouder 90°.
- Druk eenmaal op de resetknop. Stabiliseer de petrischaal met één hand terwijl u de tang gebruikt om de weefselstrips in het pad van het mes te duwen.
- Laat het mes volledig door de weefselstrips gaan. Gebruik de knop van de meshouder om het mes van de petrischaal te tillen en de tang om eventuele tissue van het mes te verwijderen.
- Gebruik de transferpipet en warme (38,5 °C) PBS + PenStrep om het gehakte weefsel (uiteindelijke grootte van het weefsel: 500 μm x 500 μm x 1 mm kubussen) te wassen in een voorverwarmde (38,5 °C) conische buis van 50 ml. Breng de conische buis terug naar het water- of kralenbad om het gehakte weefsel warm te houden (38,5 °C).
- Gebruik de moerdriver om de moer van de hakarm te verwijderen en verwijder de ring en messluiting. Verwijder met een tang het mes van de hakarm, draai het om zodat de ongebruikte rand naar de petrischaal is gericht en plaats het terug op de hakarm. Vervang de bladsluiting, ring en moer en reset de tafelontgrendelingsknop zoals beschreven in stap 2.5-2.7.
- Herhaal stap 4.5-4.12 voor alle resterende stukjes cortex uit de eierstok en vervang messen door nieuwe nadat elke snijkant is gebruikt.
- Gooi alle gebruikte messen weg in een hardwandige, plastic naaldencontainer.
5. Homogenisatieprocedure
- Zorg ervoor dat de homogenisatoreenheid (zie Tabel met materialen) is aangesloten en dat de snelheid is ingesteld op de tweede balk (9.000-11.000 tpm). Plaats de generatorsonde van 10 mm in het apparaat volgens de specificaties van de fabrikant.
- Stel een timer in voor 1 minuut en plaats de sonde in de conische buis van 50 ml met het gehakte cortexweefsel van één eierstok (stap 4.11) en voldoende PBS + PenStrep om de buis te vullen tot de 25 ml-lijn. De diepte waarop de sonde wordt ingebracht, moet 1/3 van de hoogte van de vloeistof zijn, gemeten vanaf de bodem van de kamer. Plaats de sonde iets uit het midden om vortexing te minimaliseren.
- Start de timer en schakel de homogenisator in. Zorg ervoor dat de onderkant van de sonde de buis niet raakt en houd de buis stil terwijl de homogenisator is ingeschakeld.
- Verwijder na 1 minuut homogenisatie de sonde uit de buis. Verwijder met behulp van een tang eventuele bindweefselverstopping van de ontluchtingsgaten en de ruimte tussen het rotormes en de rotorbuis. Als er stukjes cortex vastzitten in de sonde, verwijder ze dan met een tang en plaats ze terug in de buis.
- Herhaal stap 5.2-5.4 een extra 5x voor een totaal van 6 minuten homogenisatie.
- Plaats de buis met gehomogeniseerd weefsel in het water of het kralenbad om het weefsel warm te houden (38,5 °C). Na het verwerken van de laatste eierstok, onmiddellijk demonteren, reinigen en drogen van de generatorsonde volgens de specificaties van de fabrikant.
6. Filtratieprocedure
- Giet het gedispergeerde weefsel in de met kaasdoek bedekte trechter die in de Erlenmeyer is ingebracht. Spoel de inhoud van de buis in de trechter met warm (38,5 °C) PBS + PenStrep totdat er geen weefselfragmenten in de buis achterblijven.
- Dwing de weefselfragmenten door de gaten van de doek te gaan door de kaasdoek rond de weefselfragmenten te draaien en te knijpen totdat alle overtollige vloeistof en weefsel uit het kaasdoek zijn verwijderd.
- Open het kaasdoek over de trechter, spoel het kaasdoek af met PBS + PenStrep met een transferpipet en knijp opnieuw eventuele resterende weefselfragmenten door de doek.
- Gebruik een hemostat om de celzeef van 300 μm boven een bekerglas van 200 ml te houden. Giet het filtraat in de Erlenmeyer door de celzeef. Spoel de inhoud van de kolf in de celzeef met warme (38,5 °C) PBS + PenStrep totdat er geen weefselfragmenten achterblijven.
- Als de celzeef verstopt raakt met weefsel, tikt u voorzichtig op de celzeef tegen het bekerglas om ervoor te zorgen dat alle vloeistof in het bekerglas is gefilterd en draait u de celzeef ondersteboven en tikt u het grote weefselafval op het bankpapier. Breng de celzeef over het bekerglas en blijf het filtraat erdoorheen gieten. Herhaal dit zo nodig totdat al het filtraat uit de Erlenmeyer is doorgesijpeld.
- Gebruik een hemostaat om de celzeef van 40 μm boven een tweede bekerglas van 200 ml te houden. Giet het filtraat in het eerste bekerglas van 200 ml door de celzeef. Spoel de inhoud van het bekerglas in de celzeef met warme (38,5 °C) PBS + PenStrep totdat er geen weefselfragmenten achterblijven. Gooi de inhoud van de 40 μm celzeef niet weg.
- Plaats de naald van 18 G op de spuit van 20 ml. Vul de spuit met FWM. Draai de celzeef van 40 μm ondersteboven over een vierkante petrischaal en gebruik de spuit om de inhoud van de celzeef in de schaal uit te spoelen. Vul de spuit opnieuw en spoel de celzeef indien nodig af totdat er geen weefselfragmenten achterblijven.
OPMERKING: Doorgaans is 25 ml FWM voldoende om de inhoud van de 40 μm celzeef volledig uit te spoelen.
Figuur 2: Werkruimte-instelling voor eierstokverwerking en protocolworkflow. (A) Bench-opstelling voor het snijden van eierstokken voorafgaand aan het hakken en voor het filteren van het ovariumhomogenaat. (B) Weefselhakselaar en homogenisator opgezet, met piepschuimondersteuning om trillingen van het homogenisatorstadium te verminderen. (C) Schematische illustratie van de workflow voor de verwerking van een hele eierstok. Eierstokken worden bijgesneden van overtollig bindweefsel en vervolgens doormidden gesneden, en de medulla wordt verwijderd totdat een ~ 1 mm dik stukje cortex overblijft. De cortex wordt in stukjes van 2,5 cm x 2,5 cm gesneden en in een weefselhakselaar gehakt met een snij-interval van 500 μm. De stukjes worden vervolgens gehomogeniseerd en het homogenaat wordt gefilterd door kaasdoek gevolgd door filtratie door 300 μm en 40 μm celzeefjes. De inhoud van de 40 μm celzeef wordt gespoeld in een vierkante petrischaal, die met behulp van een stereomicroscoop naar follikels wordt gezocht. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
7. Follikels zoeken en verzamelen
- Breng de vierkante petrischaal (stap 6.6) over op een stereoscoop met een verwarmd podium op 38,5 °C. De stereoscoopvergroting moet worden ingesteld tussen 1,25x en 3,2x, afhankelijk van de voorkeur van de zoeker.
- Pipetteer 10 μL druppels FWM in een petrischaaltje van 60 mm en bedek de druppels met minerale olie om uitdroging te voorkomen. Plaats de petrischaal met mediadruppels op een op 38,5 °C ingestelde verwarmingsplaat.
OPMERKING: Een 4-well plaat kan worden gebruikt om follikels te verzamelen. Voeg 500 μL wasmedia toe aan een of twee putjes. Plaats op de op de op 38,5 °C ingestelde opwarmplaat. - Zorg voor een micropipette zuiger en tip.
OPMERKING: Een glazen micropipette van 1-5 μL (zie Materiaaltabel) wordt aanbevolen omdat de follikels zich minder snel hechten aan de glazen pipet en verloren gaan bij overdracht tussen oplossingen. Het is ook een instrument dat klein genoeg is om gemakkelijkere en nauwkeurigere micromanipulaties van de follikels mogelijk te maken. - Identificeer follikels uit de vierkante petrischaal en breng over naar media (FWM) druppels met behulp van de micropipette. Veel follikels zijn waarschijnlijk ingebed in weefselresten en kunnen worden opgehaald met behulp van een van de twee methoden zoals hieronder beschreven.
OPMERKING: Follikels zijn langwerpig, in plaats van perfecte bollen, en hebben meestal een eicel, die zich presenteert als een massieve witte cirkel in donkere contrasten, in de richting van het midden van de follikel (figuur 3A-C). Zorg ervoor dat u follikels niet verwart met ontblote eicellen. Eicellen hebben de neiging om perfecte bollen te zijn en zijn omgeven door een dik, helder membraan (de zona pellucida). Een omgekeerde microscoop met een vergroting van 10x (of meer) kan worden gebruikt voor nader onderzoek van follikels (figuur 3D).- Scheid de follikels voorzichtig van vuil met behulp van de punt van de micropipette of fijne (27 G) naalden.
- U kunt ook een glazen Pasteur-pipet met een rubberen bol gebruiken om het vuil in de schaal meerdere keren op te nemen en eruit te spuiten om de follikels uit het puin te verwijderen.
- Werk snel, niet langer dan 30 minuten, om de petrischaal te doorzoeken om de levensvatbaarheid van de follikel te behouden.
- Plaats maximaal slechts vijf follikels per druppel van 10 μL, omdat een hogere dichtheid de kans op aan elkaar klevende follikels kan vergroten.
8. Trypan blue exclusion levensvatbaarheidstest
OPMERKING: Gebruik het deksel van een petrischaaltje of een 4-wellsplaat voor alle volgende stappen, omdat de follikels minder aan het plastic van het deksel kleven dan aan het plastic van de eigenlijke schaal.
- Bereid PBS + 0,2% polyvinylpyrrolidon (PVP) door 100 mg PVP op te lossen in 50 ml PBS.
OPMERKING: PVP wordt hier gebruikt om de kans te verkleinen dat follikels zich aan het gerecht hechten. - Gebruik de micropipette om alle follikels (gemiddeld 40) van de mediadruppels over te brengen in een 50 μL druppel PBS + 0,2% PVP.
- Was de follikels 2x door ze achtereenvolgens over te brengen op verse 50 μL druppels PBS + 0,2% PVP.
- Breng de follikels over naar een 285 μL druppel PBS + 0,2% PVP.
- Voeg 15 μL trypan blue toe aan de 285 μL druppel PBS + 0,2% PVP (eindconcentratie van 0,05% trypan blue) en meng de druppel voorzichtig met behulp van een 200 μL pipetpunt ingesteld op 100 μL.
OPMERKING: Als u de 4-well plate gebruikt voor de levensvatbaarheidstest van trypan, voeg dan 475 μL PBS + 0,2% PVP en 25 μL trypan blue toe aan één put. - Incubeer de follikels gedurende 1 minuut in de trypanblauwe druppel en breng de follikels vervolgens over naar een druppel van 50 μL (of 500 μL goed) pbs + 0,2% PVP.
- Was de follikels 3x volgens stap 8.3 met verse druppels van 50 μL (of 500 μL per putje) PBS + 0,2% PVP.
- Gooi alle follikels weg die na drie wasbeurten nog steeds blauw lijken in PBS + 0,2% PVP, omdat deze niet-levensvatbaar zijn. Alle follikels die na drie wasbeurten geen blauwe kleur behouden, zijn levensvatbaar en kunnen worden gebruikt voor immunofluorescentie, kweek of andere procedures (figuur 3E). Vries de follikels in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik indien nodig.
- Voer RT-qPCR-analyse en immunofluorescentiekleuring van de follikels uit zoals beschreven in stap 9 en 10.
Figuur 3: Geïsoleerde follikels en trypanblauwe exclusietest. (A-C) Geïsoleerde follikels werden in beeld gebracht via een stereomicroscoop bij verschillende vergrotingen. (A) Geïsoleerde follikels tussen puin in de oorspronkelijke zoekschaal. Individuele follikels zijn rood omcirkeld. Schaalbalk = 2.000 μm. (B) Geïsoleerde follikels en puin in een druppel van follikelwasmedium bedekt met minerale olie. Schaalbalk = 1.000 μm. (C) Geïsoleerde follikels zonder puin bij een hogere vergroting. Schaalbalk = 1.000 μm. (D) Geïsoleerde follikels afgebeeld met een omgekeerde helderveldmicroscoop. Schaalbalk = 100 μm. (E) Representatieve beelden van levensvatbare (niet-gekleurde) en niet-levensvatbare (blauwe vlek) follikels afgebeeld met een omgekeerde brightfieldmicroscoop en een 20x objectief. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
9. RT-qPCR analyse
- Isoleer RNA uit levensvatbare follikels (vanaf stap 8.8) met behulp van een RNA-isolatiereagens (zie Materiaaltabel). Zuiver het RNA en behandel met DNase met behulp van een in de handel verkrijgbare opruimkit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
- Eluteer het RNA met 14 μL RNase-vrij water en kwantificeer met behulp van een spectrofotometer. Het RNA kan worden opgeslagen bij -80 °C tot cDNA-synthese.
- Voer cDNA-synthese uit uit gelijke hoeveelheden RNA geëxtraheerd uit primaire en vroege secundaire follikels, met behulp van een in de handel verkrijgbare cDNA-synthesekit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer het reactiemengsel gedurende 5 minuten bij 25 °C gevolgd door 60 minuten bij 42 °C en beëindig de reactie vervolgens door gedurende 5 minuten bij 70 °C te verwarmen.
- Voer RT-qPCR uit met het gesynthetiseerde cDNA (5 ng per reactie) en primers (tabel 1) met behulp van een in de handel verkrijgbare reactiemix (zie materiaaltabel). Gebruik thermische cyclusomstandigheden: 30 s bij 95 °C voor polymeraseactivering, gevolgd door 40 cycli van versterking, waarbij elke cyclus 15 s bij 95 °C voor denaturatie en 30 s bij 60 °C voor gloeien/extensie omvatte. Analyseer de RT-qPCR door cyclusdrempelwaarden (Ct) te kwantificeren en/of pcr-producten te bekijken met behulp van agarose gel-elektroforese.
OPMERKING: Transcriptie van de granulosacelmarker FSHR en kiemcelmarker DAZL werden in deze studie geëvalueerd. Referentiegenen waren H2A en ACTB. - Voer een smeltcurveanalyse uit door de temperatuur elke 5 s te verhogen van 65 °C in stappen van 0,5 °C totdat deze 95 °C bereikt.
10. Immunofluorescentie analyse
- Fixeer levensvatbare follikels (vanaf stap 8.8) gedurende 15 minuten in een 100 μL druppel van 4% (v/v) paraformaldehyde (PFA) bij kamertemperatuur (RT), gevolgd door 3x wassen in 100 μL druppels PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20.
- Blokkeer de follikels gedurende 1 uur bij RT in een blokkerende buffer bestaande uit 1x PBS + 5% (v/v) normaal ezelserum (NDS). Incubeer na blokkering de follikels een nacht bij 4 °C in een druppel van 100 μL van 4 μg/ml konijnenantimens CX37-antilichaam of 4 μg/ml konijnenisotype IgG (negatieve controle) verdund in blokkerende buffer.
- Was de follikels 3x in 100 μL druppels PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20, en incubeer ze vervolgens gedurende 1 uur bij RT in het donker in een 100 μL druppel van 2 μg / ml ezel-anti-konijn AlexaFluor 488 secundair antilichaam verdund in blokkerende buffer.
- Incubeer de follikels gedurende 5 minuten bij RT in het donker in een druppel van 100 μL van 1 μg/ml Hoechst 33342 verdund in blokkerende buffer om DNA te labelen.
- Breng de follikels over op een druppel montagemedia van 5 μL (zie Materiaaltabel) op een glazen microscoopglaasje en dek af met een afdekslip. Laat de dia's een nacht uitharden bij RT, gevolgd door afdichting met nagellak. Bewaar ze bij 4 °C totdat ze in beeld worden gebracht.
- Afbeelding van alle dia's binnen 48 uur na het uitglijden van de omslag. Imaging uitvoeren met behulp van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop (zie Materiaaltabel) onder DAPI (excitatie 380 nm en emissie 450 nm) en FITC (excitatie 470 nm en emissie 525 nm) filters.
- Bepaal de belichtingstijd voor beide kanalen. Pas de FITC (CX37) belichtingstijd aan op basis van de negatieve controle van het konijnenisotype. Gebruik een 20x-objectief en het DAPI-kanaal ingesteld op 50 ms blootstellingstijd om de folollikels met het isotype-label van konijnen te identificeren.
- Beeld deze follikels af onder het FITC-kanaal en verkort de belichtingstijd totdat alle achtergrondgroene signalen zijn afgeschaft. Let op deze belichtingstijd.
- Breng alle CX37-antilichaamgelabelde follikels in beeld met behulp van de blootstellingstijd die is ingesteld voor het ISOTYPE FITC-kanaal en 50 ms blootstellingstijd voor het DAPI-kanaal.
- Verwerk de signaalintensiteit, gemeten aan de hand van het gemiddelde grijze gebied na drempels, met behulp van een computerbeeldverwerkingsprogramma29 (zie Materiaaltabel).
- Pas het tiff-bestand van de DAPI-afbeelding voor elke follikel zodanig aan dat de hele follikel wordt omlijnd. Gebruik de functie Deeltjes analyseren van het programma om de volledige follikel te selecteren als een interessante regio (ROI).
- Open het tiff-bestand van de FITC-afbeelding voor de bijbehorende follikel en leg de ROI die wordt gegenereerd door de DAPI-afbeelding bovenop de FITC-afbeelding. Gebruik de meetfunctie van het programma om het gemiddelde grijze gebied van het FITC-beeld te kwantificeren, dat de signaalintensiteit vertegenwoordigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overzicht en kritieke stappen
Met behulp van dit protocol kunnen kleine boviene preantrale follikels betrouwbaar worden geïsoleerd uit enkele eierstokken in experimenteel relevante aantallen. Uit een totaal van 30 replicaties werden gemiddeld 41 follikels per replicatie verkregen, met een bereik van 11 tot 135 follikels (figuur 4A). In 14 replicaties werden de follikels gekarakteriseerd voor het stadium van ontwikkeling zoals eerder beschreven26 door de follikeldiameter te meten met behulp van een 1 μm microscoopkalibratiedia onder de stereomicroscoop. Met behulp van deze methode werden in totaal 476 follikels geclassificeerd als primaire (follikels van 40-79 μm), vroeg secundaire (80-119 μm) of secundaire (≥120 μm) follikels (figuur 4B). Primordiale follikels werden uitgesloten vanwege de filtratiestap van 40 μm. De levensvatbaarheid van de follikel werd geëvalueerd met behulp van de trypan blue-exclusietest zoals eerder beschreven30. Geïsoleerde follikels werden kort geïncubeerd gedurende 1 minuut in 0,05% (v/v) trypan blauw in PBS met 0,2% PVP, gevolgd door drie wasbeurten met PBS + PVP en onderzoek onder een stereoscoop. Met behulp van de beschreven procedure was 100% van de geïsoleerde follikels levensvatbaar in alle replicaties. Over het algemeen duurt het mechanische isolatieproces, van het verzamelen van eierstokken tot vlak voordat de petrischaal wordt gezocht, ongeveer 30-45 minuten. De tijd die wordt besteed aan het zoeken en identificeren van follikels duurt niet langer dan 30 minuten, wat resulteert in een proces dat in totaal 1-1,25 uur per eierstok duurt.
De meest kritische stap van dit protocol is ervoor te zorgen dat het eierstokweefsel goed wordt gehomogeniseerd. Het verhogen van de homogenisatietijd van 5 min naar 6 min leidde tot een toename van het aantal geïsoleerde follikels (P < 0,05). Gemiddeld werden 41 follikels geïsoleerd per eierstok uit 30 onderzoeken met behulp van een homogenisatie van 6 minuten, wat een bijna drievoudige toename is ten opzichte van het gemiddelde van 13,8 follikels per eierstok verkregen uit 22 onderzoeken met een homogenisatietijd van 5 minuten (figuur 5). Een andere belangrijke stap is de homogenisatiesnelheid, die binnen 9.000-11.000 tpm moet blijven. Hogere snelheden leiden tot verminderde opbrengsten, vermoedelijk als gevolg van overmatige schade en/of scheuring van follikels. Follikelisolatie kan na de filtratiestappen verder worden verbeterd door de inhoud van de zoekschaal meerdere keren door een glazen Pasteur-pipet met een rubberen bol te laten gaan. Door het gebruik van de Pasteur pipet worden follikels losgemaakt van puin en zijn er meer follikels in de schaal te zien.
Als de follikels na isolatie moeten worden gekweekt, is het belangrijk om microbiële besmetting te verminderen. Besmetting kan worden voorkomen door overtollig bindweefsel en vet uit de hele eierstok te snijden en vervolgens een reeks wasstappen uit te voeren. De bijgesneden eierstokken moeten kort worden gewassen in 70% ethanol om de microbiële belasting te verminderen, gevolgd door verschillende wasbeurten in warme (38,5 ° C) PBS + PenStrep-oplossing om de 70% ethanol weg te spoelen en eventuele micro-organismen verder te verwijderen. Deze wasbeurten kunnen worden gedaan zonder de levensvatbaarheid van de fluisterfolie in gevaar te brengen. Om besmetting verder te voorkomen, is het mogelijk om het volledige isolatieprotocol uit te voeren in een bioveiligheidskast of een schone bank met gesteriliseerde apparatuur.
RNA-isolatie en RT-qPCR
Follikels van hetzelfde stadium en van afzonderlijke isolaties werden samengevoegd en in totaal werden 46 primaire en 34 vroege secundaire follikels gebruikt voor de analyse van mRNA-expressie. RNA werd geïsoleerd uit de gepoolde follikels (primaire follikels = 259 ng totaal RNA en vroege secundaire follikels = 91 ng totaal RNA) en gebruikt voor cDNA-synthese. Transcriptexpressie van de granulosacelmarker FSHR19 en kiemcelmarker DAZL in de follikels werd vervolgens geëvalueerd met RT-qPCR. Zoals verwacht drukten zowel primaire als vroege secundaire follikels FSHR - en DAZL-transcripten uit, wat een eerder rapport in menselijke follikels31 bevestigde en aantoonde dat de FSHR tot expressie komt in runderfollikels in het primaire stadium van ontwikkeling32 (figuur 6A, B).
Immunoflourescente lokalisatie van Connexin 37
Immunofluorescente lokalisatie van eiwitten kan worden uitgevoerd in hele follikels. Hier werd deze techniek gebruikt om het gap junction-eiwit Connexin 37 (CX37) te lokaliseren in geïsoleerde preantrale follikels in zowel de primaire als de vroege secundaire stadia. CX37 is van cruciaal belang voor de communicatie tussen de eicel- en granulosacellen van de follikel en is in alle stadia van de follikelontwikkeling bij runderen in histologische analysesgeïdentificeerd 33. Na de trypan blue exclusion test werden levensvatbare follikels gefixeerd in PFA en geïncubeerd met konijn anti-humaan CX37 antilichaam of konijn isotype IgG (negatieve controle), gevolgd door incubatie met ezel-anti-konijn AlexaFluor 488 secundair antilichaam. Hoechst 33342 werd gebruikt om DNA te labelen. De follikels werden in beeld gebracht met behulp van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop onder DAPI- en FITC-filters en de signaalintensiteit werd gekwantificeerd. CX37 bleek te lokaliseren naar het ooplasma, hoewel opvallend afwezig in de eicelkern, en naar het membraan van de granulosacellen (figuur 7). Deze resultaten komen overeen met de bekende lokalisatie van CX37 naar de eicel en het membraan van de granulosacellen33. De immunolokalisatie van eiwitten waarvan bekend is dat ze cruciaal zijn voor celcommunicatie en follikelgroei, zoals CX37 (hier weergegeven) en FSHR32 , is een essentieel hulpmiddel om de ontwikkeling van preantrale follikels, effecten van interventies op follikelgroei, structuur en kwaliteit te bestuderen, evenals om de effectiviteit van de cultuur te beoordelen door in vivo verkregen en in vitro gekweekte follikels te vergelijken.
| Gen | Voorwaartse volgorde (5'-3') | Omgekeerde volgorde (5'-3') | Productgrootte (bp) | ||||
| FSHR | CCC AAC TCG ATG AGC TGA ATC T | KAT AGC TAG GCA GGG AAC GG | 132 | ||||
| Dazl | GCC CAC AAA AGA AAT CTG TGG A | ACT TAA GCA CTG CCC GAC TT | 156 | ||||
| H2A | GAG GAG CTG AAC AAG CTG TTG | TTG TGG TGG CTC TCA GTC TTC | 104 | ||||
| Actb | CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT | GGG CAG TGA TCT CTT TCT GC | 178 | ||||
Tabel 1: Lijst van primers die worden gebruikt voor RT-qPCR.
Figuur 4: Aantal en ontwikkelingsstadium van geïsoleerde preantrale follikels. (A) Totaal aantal geïsoleerde preantrale follikels per replicatie met behulp van 6 min weefselhomogenisatie (n = 30 replicaten). Het gemiddelde aantal follikels wordt weergegeven door de rode lijn over de balken. (B) In 14 replicaties werd het ontwikkelingsstadium van de geïsoleerde follikels geregistreerd. Het cirkeldiagram toont de verdeling van ontwikkelingsstadia als een deel van de totale geïsoleerde follikels (n = 476). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Vergelijking van 5- versus 6-min homogenisatie. Homogenisatie van de ovariële cortex gedurende 6 minuten leverde een groter aantal preantrale follikels op in vergelijking met homogenisatie met dezelfde snelheid gedurende 5 minuten (n = 22 replicaties gedurende 5 minuten en 30 replicaties gedurende 6 minuten; P < 0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Reverse-transcriptie kwantitatieve PCR van transcripten uitgedrukt in geïsoleerde preantrale follikels. Primaire en vroege secundaire preantrale follikels brachten mRNA-transcripten tot expressie voor markers van granulosacellen (FSHR), geslachtscellen (DAZL) en referentiegenen (H2A en ACTB). (A) Agarose-gel van PCR-producten voor elk gen met respectievelijke base pair (bp) productgroottes. (B) De expressie van FSHR - en DAZL-transcripten werd gekwantificeerd ten opzichte van die van het referentiegen ACTB. NTC = niet-template controle, CT = cyclusdrempel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Immunofluorescente lokalisatie van CX37 in geïsoleerde preantrale follikels. Representatieve beelden van CX37 immunolocalisatie in een primaire (A) en vroege secundaire (B) bovine preantrale follikel. (C) Representatief beeld van de isotype-etikettering van het konijn met negatieve controle in een vroege secundaire boviene preantrale follikel. Linkerpaneel: DNA-etikettering (DAPI). Middenpaneel: primaire antilichaam konijn anti-humane CX37 labeling (FITC). Rechterpaneel: DAPI en FITC samengevoegd. Schaalbalken = 50 μm. (D) Gemiddelde CX37-signaalintensiteit volgens het ontwikkelingsfasestadium van de follikel (n = 21 primaire en 11 vroege secundaire follikels in twee replicaties). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een reproduceerbare methode om preantrale follikels in een vroeg stadium, met name in primaire en vroege secundaire stadia, uit de runderkolvisus te halen. Dit protocol bouwt voort op eerdere rapporten 20,25,30,34,35,36 en biedt optimalisaties die resulteren in de isolatie van een betekenisvol aantal follikels uit een individuele eierstok. Preantrale follikels geïsoleerd met behulp van deze methode zijn levensvatbaar en kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen zoals immunolokalisatie van eiwitten en RNA-extractie voor analyse van genexpressie. Het kweken van de geïsoleerde follikels werd in deze studie niet geprobeerd. Er zijn momenteel echter inspanningen aan de gang om een succesvolle langetermijncultuur van kleine boviene preantrale follikels te bereiken, wat een belangrijke downstream-toepassing van dit protocol zal zijn die zal helpen het begrip van ovariële folliculogenese te verbeteren, toxicologische tests uit te voeren en manieren te bedenken om follikels met succes te manipuleren voor vruchtbaarheidsbehoud.
Gegevens uit deze experimenten tonen aan dat de homogenisatie van 6 minuten van cruciaal belang is voor een goede dispersie van het ovariële corticale weefsel en de follikelafgifte (figuur 4). Extra stappen die bijdragen aan een grondige homogenisatie van het weefsel zijn de initiële dissectie van de cortex van het medulla die zorgt voor de juiste dikte van de cortex (~ 1 mm), het wegsnijden van overtollig bindweefsel en het hakken van de cortex in kleine fragmenten. Deze stappen voorkomen verstopping van de homogenisatorsonde en onnodig vuil in de zoekplaat. Celzeef porie grootte is belangrijk voor het uitsluiten van puin en follikels van ongewenste grootte en stadium; in het geval van dit protocol is de laatste stap het verzamelen van de inhoud van een celzeef van 40 μm om primordiale follikels uit te sluiten, die typisch < 40 μm in diameter zijn bij runderen26. Ten slotte wordt het gebruik van een Pasteur-pipet om follikels los te maken van puin in de zoekschaal aanbevolen in plaats van te proberen follikels handmatig uit het puin te ontleden, omdat de laatste techniek meer technische vaardigheden vereist en, indien onjuist gedaan, de follikels kan beschadigen.
Hoewel dit protocol verbeteringen biedt ten opzichte van bestaande methoden, zijn er beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. Ten eerste, vanwege de heterogene aard van de ovariële follikelpopulatie15 en onbekende geschiedenis van de dieren waaruit eierstokken werden opgehaald, was het aantal gebelde follikels geïsoleerd na het uitvoeren van dit protocol zeer variabel. Een factor waarmee rekening moet worden gehouden, is de leeftijd van het dier, omdat bekend is dat de ovariële reserve afneemt met de leeftijdvan 37 jaar.
Isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok biedt mogelijkheden om fundamentele wetenschappelijke vragen op het niveau van één monster te onderzoeken, een aanpak die eerder moeilijk uit te voeren was. Alle hier geëvalueerde preantrale follikelstadia vertoonden bijvoorbeeld expressie van CX37, een kritisch eiwit voor de communicatie tussen eicellen en granulosacellen. Evenzo is expressie van FSH-receptor eerder aangetoond in individueel geïsoleerde preantrale follikels32. Andere specifieke markers van granulosacellen, zoals de steroidogene enzymen CYP17 en CYP1938, zouden relevante toevoegingen zijn aan het gen/eiwitexpressiepaneel van preantrale follikels en zullen het onderwerp zijn van toekomstige projecten. De visualisatie van de gehele folliculaire structuur via reguliere of confocale microscopie is uitgebreider in vergelijking met histologisch onderzoek, waarbij slechts één segment van de follikel tegelijkertijd kan worden geanalyseerd. Dit is vooral voordelig in studies die mogelijk immunostaining of in situ hybridisatie willen gebruiken, waar gedetailleerde ruimtelijke lokalisatie van expressie vereist is. Bovendien kunnen geïsoleerde preantrale follikels worden gebruikt om de genexpressie van enkele follikels te onderzoeken met behulp van gevoelige kits voor RT-qPCR30. Het vermogen om follikels individueel en zonder invloed van de ovariële omgeving te analyseren, is een cruciale stap voorwaarts in het begrijpen van de complexiteit van preantrale folliculogenese.
Cryopreservatie van het eierstokschorsweefsel is een veelbelovende techniek geworden voor het beschermen van de vruchtbaarheid bij vrouwelijke zoogdieren39, waaronder vrouwen40. Het behoud en herstel van de vruchtbaarheid met behulp van preantrale follikels biedt een aantrekkelijke geassisteerde voortplantingstechnologie en een veelbelovende methode voor het bestuderen van folliculogenese41. Na bevriezing en ontdooien kan het weefsel worden onderworpen aan dit isolatieprotocol voor het ophalen van levensvatbare preantrale follikels. Hoewel het potentiële vermogen van dit protocol om follikels uit eerder gecryopreserveerd weefsel op te halen niet specifiek werd beoordeeld, hebben anderen succes aangetoond en levensvatbare kleine preantrale follikels gebruikt die zijn geïsoleerd uit bevroren ontdooide weefsel voor in vitro kweek 42,43,44,45. Bovendien kunnen vers geïsoleerde preantrale follikels individueel worden gecryopreserveerd via vitrificatie en de structurele integriteit behouden36.
Een update over details voor de efficiënte isolatie van preantrale follikels van een grote zoogdiersoort zoals het rund ontbreekt in de literatuur. Bovendien is een visuele en expliciete gids over het isoleren van runderpreantrale follikels hard nodig, omdat het gebrek aan reproduceerbaarheid een knelpunt in het veld is geweest. Onlangs beschreven Bus et al.36 de isolatie van runderpreantrale follikels met behulp van een mechanische methode, met een berekende gemiddelde opbrengst van 6,1 primaire follikels per eierstok. De hier beschreven mechanische isolatiemethode resulteert in de isolatie van gemiddeld 41 preantrale follikels per eierstok, waarvan de meerderheid zich in het primaire stadium bevindt. Daarom is deze techniek vooral nuttig voor studies gericht op primaire follikelfysiologie en -ontwikkeling. Primaire follikels vertegenwoordigen de eerste fase van de groeiende pool en zijn overvloedig aanwezig in de ovariële cortex. Daarom is het gebruik van de beschreven techniek, die is geoptimaliseerd om deze ontwikkelingsfase te oogsten, nieuw en kan het bijzonder wenselijk zijn om te profiteren van de ovariële reserve terwijl de moeilijkere manipulatie van primordiale follikels wordt vermeden. Een ander voordeel van het isoleren van primaire follikels zou zijn om ovariële weefselkweek te associëren voor de initiële activering van primordiale follikels met daaropvolgende isolatie van primaire follikels voor verdere kweek. Gezien de interesse in het kweken van follikels uit het meer overvloedige primaire stadium, kan de hier gepresenteerde methode onderzoekers stimuleren om wegen na te streven die ze eerder hebben vermeden vanwege de uitdaging van het isoleren van primaire follikels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door USDA Multi-state project W4112 en UC Davis Jastro Shields award aan SM.
De auteurs willen hun waardering uitspreken voor Central Valley Meat, Inc. voor het leveren van de rundervliegen die in alle experimenten worden gebruikt. De auteurs bedanken ook Olivia Silvera voor hulp bij eierstokverwerking en follikelisolatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope - Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope - Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope - Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
References
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the 'holy grail' for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
