Summary
Fremme studien av preantral follikulogenese krever effektive metoder for follikelisolasjon fra enkle eggstokkene. Presentert her er en strømlinjeformet, mekanisk protokoll for follikelisolasjon fra okse eggstokkene ved hjelp av en vevskrubber og homogenisator. Denne metoden tillater innsamling av et stort antall levedyktige preantralfollikler fra en enkelt eggstokk.
Abstract
Å forstå hele prosessen med pattedyrfollikulogenese er avgjørende for å forbedre assistert reproduksjonsteknologi hos husdyr, mennesker og truede arter. Forskning har for det meste vært begrenset til antral og store preantralfollikler på grunn av vanskeligheter med isolering av mindre preantralfollikler, spesielt hos store pattedyr som storfearter. Dette arbeidet presenterer en effektiv tilnærming til å hente et stort antall små preantralfollikler fra en enkelt bovin eggstokk. Cortex av individuelle okse eggstokkene ble skåret inn i 500 μm kuber ved hjelp av en vevskrubber og homogenisert i 6 minutter ved 9.000-11.000 o / min ved hjelp av en 10 mm sonde. Store rusk ble skilt fra homogenatet ved hjelp av en osteklut, etterfulgt av seriell filtrering gjennom 300 μm og 40 μm cellesiler. Innholdet som ble beholdt i silen på 40 μm ble skyllet inn i en søkeskål, hvor follikler ble identifisert og samlet inn i en dråpe medium. Levedyktigheten til de oppsamlede folliklene ble testet via trypanblå farging. Denne metoden muliggjør isolering av et stort antall levedyktige små preantralfollikler fra en enkelt bovin eggstokk på ca. 90 minutter. Det er viktig at denne metoden er helt mekanisk og unngår bruk av enzymer for å dissosiere vevet, noe som kan skade folliklene. Folliklene oppnådd ved bruk av denne protokollen kan brukes til nedstrøms applikasjoner som isolering av RNA for RT-qPCR, immunlokalisering av spesifikke proteiner og in vitro-kultur .
Introduction
Ovariefollikler er de funksjonelle enhetene i eggstokken, ansvarlig for produksjon av gameten (oocyten) samt hormoner som er kritiske for reproduktiv funksjon og generell helse. Primordial follikler dannes i eggstokken under fosterutvikling eller i nyfødtperioden avhengig av art1, og de utgjør en kvinnes eggstokkreserve. Follikulær vekst begynner med aktivering av primordiale follikler som forlater hvilebassenget og går inn i vekstfasen. Preantral follikulogenese, som omfatter alle follikelstadier før antrumutvikling, er en svært dynamisk prosess som krever synkrone morfologiske og metabolske endringer i oocytten og de omkringliggende granulosacellene, drevet av tett kommunikasjon mellom disse to celletypene 2,3. Preantralfollikler utgjør flertallet av follikulære enheter som finnes i eggstokken til enhver tid4. Utvikling gjennom preantrale stadier av follikulogenese anslås å være flere uker lenger enn antral utvikling5,6, og denne gangen er nødvendig for at oocyt- og somatiske celler skal oppnå tilstrekkelig modenhet til å gå inn i sluttfasen av utviklingen (dvs. antralstadiet), og forberede seg på eggløsning, befruktning og embryonal utvikling 7,8,9.
Mye av dagens kunnskap om ovarie preantral follikulogenese kommer fra musemodeller10,11,12,13, delvis på grunn av det enkle å gjenopprette et stort antall av disse folliklene fra en mindre og mindre fibrøs eggstokk. Selv om rapporter om isolering av et stort antall preantrale follikler fra storfe eggstokkene dateres tilbake ca 30 år14, har en mer fullstendig forståelse av prosessene som regulerer utviklingen av disse tidlige folliklene forblitt urealisert, hovedsakelig på grunn av mangel på optimaliserte, effektive og repeterbare metoder for å hente tilstrekkelig antall levedyktige preantralfollikler, spesielt i tidlige utviklingsstadier. Med den økende interessen for å bevare eggstokkreserven for fremtidig bruk i assistert befruktning hos mennesker, blir kyr en attraktiv modell på grunn av deres mer like eggstokkstruktur15. Imidlertid er okseovarieet markant rikere i kollagen sammenlignet med musens eggstokk16, noe som gjør mekanisk isolasjon ved hjelp av metoder beskrevet for musen svært ineffektiv. Arbeidet med å utvide fertilitetsbevaringsteknikker inkluderer fullstendig in vitro-vekst av preantralfollikler til antralstadiet, etterfulgt av in vitro-modning (IVM) av de vedlagte oocytter, in vitro befruktning (IVF) og embryoproduksjon og overføring17. Så langt har hele denne prosessen bare blitt oppnådd hos mus18. Hos storfe er fremgangen mot follikkelvekst in vitro begrenset til noen få rapporter med variable follikkelstadier ved kulturstart, samt variabel kulturlengde mellom protokollene17,19.
Metodene beskrevet i litteraturen for høsting av preantralfollikler fra bovin eggstokk har for det meste brukt mekaniske og enzymatiske teknikker, enten isolert eller i kombinasjon 2,14,17,20. Den første rapporten om en protokoll for bovin preantralfollikelisolasjon brukte en vevshomogenisator og seriell filtrering for å behandle hele eggstokkene20. Denne studien ble fulgt av rapporter som kombinerer mekaniske og enzymatiske prosedyrer som benyttet kollagenase14. Et tilbakevendende tema ved bruk av kollagenase for å fordøye eggstokkvevet er den potensielle risikoen for skade på follikulær kjellermembran, noe som kan kompromittere follikkelens levedyktighet 14,21,22,23. Derfor har forskjellige kombinasjoner av mekaniske metoder blitt brukt, for eksempel bruk av en vevskrubber og gjentatt pipettering eller en vevskrubber kombinert med homogenisering 20,24,25,26. En annen mekanisk teknikk som er beskrevet, bruker nåler til å dissekere preantralfollikler direkte fra eggstokkvevet, noe som er spesielt nyttig for å isolere større (>200 μm) sekundære follikler. Imidlertid er denne prosessen tidkrevende, ineffektiv for å isolere mindre preantrale follikler, og er ferdighetsavhengig når den forsøkes i storfeeggstokkene 19,27,28.
Ved å dra nytte av de forskjellige teknikkene som er beskrevet i litteraturen, hadde denne protokollen som mål å optimalisere isoleringen av preantralfollikler fra enkeltbovine eggstokkene på en enkel, konsistent og effektiv måte som unngår inkubasjon i enzymatiske løsninger. Forbedring av metodene for å isolere preantralfollikler vil gi en mulighet til å forbedre forståelsen av dette stadiet av follikulogenese og muliggjøre utvikling av effektive kultursystemer for å utvikle preantralfollikler til antralstadiet. De detaljerte prosedyrene som er beskrevet her for isolering av preantralfollikler fra et stort pattedyr som storfearten, vil være avgjørende for forskere som tar sikte på å studere tidlig follikulogenese hos en ikke-murinart som kan oversettes til mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bovine (Bos taurus) eggstokker ble hentet fra et lokalt slakteri og transportert til laboratoriet innen 6 timer etter samlingen. På grunn av det store antallet dyr som behandles i anlegget, er alderen, rasen og scenen i østrussyklusen til dyrene ukjente. Fordi ingen levende dyr ble brukt i disse forsøkene, var det ikke nødvendig med en godkjent dyrepleie- og bruksprotokoll.
1. Klargjøring av utstyr og reagenser
- Dekk en 2 fot bred del av en laboratoriebenk med benkpapir.
- Få et skalpellhåndtak, sterilt skalpellblad, hemostat, par disseksjonstang, 20 ml luerlåssprøyte, 18 G nål, to 200 ml begerglass, 500 ml Erlenmeyer kolbe, 104 mm diameter plasttrakt, plastskjærebrett av plast, ett 22 cm2 lag osteklær (ostekluten kan steriliseres ved autoklavering før bruk) per eggstokk som behandles, en cellesil på 300 μm og en cellesil på 40 μm (se Materialtabell).
- Overfør alt utstyr til benkpapiret.
- Bruk hemostat til å spalte skalpellbladet på skalpellhåndtaket. Juster den vinklede bunnen av bladet til den vinklede indikatoren på håndtaket, og skyv deretter bladet inn i sporet på håndtaket.
- Plasser trakten i Erlenmeyer-kolben og dekk traktåpningen med osteklæren.
- Plasser ett 50 ml konisk rør per eggstokk som skal behandles i et vann- eller perlebad satt til 38,5 °C.
- Plasser en 100 mm x 15 mm firkantet petriskål per eggstokk som behandles på en lysbildevarmer satt til 38,5 °C.
- Tilsett 10 ml penicillin-streptomycin (PenStrep; 10 000 U/ml penicillin og 10 000 μg/ml streptomycin) til 1 liter 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Varm PBS + PenStrep i et vann- eller perlebad satt til 38,5 ° C minst 2 timer før eggstokkbehandling.
MERK: PBS + PenStrep-løsning er avgjørende for vasking av eggstokkene når isolerte follikler skal dyrkes, og det anbefales fortsatt for eventuelle nedstrømseksperimenter for å redusere mikrobiell forurensning. - For oppsamling av bearbeidet ovariefiltrat, bruk Follicle Wash Medium (FWM) bestående av TCM199 med Hank's Salts (se Materialtabell) som inneholder 3 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 25 mM HEPES-buffer, 100 UI penicillin/100 μg/ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat (NaPyr) og 100 nM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA).
- Overfør steril TCM199, en 250 ml flaske og en 100 ml gradert sylinder til et biosikkerhetsskap (BSC). Overfør 194 ml TCM199 til flasken.
- Fjern begeret til TCM199 fra BSC og ta med til en røreplate. Tilsett 600 mg BSA, 1,19 g HEPES-buffer og en autoklaveret rørestang i flasken og rør til den er oppløst.
- Når BSA- og HEPES-bufferen er fullstendig oppløst, tilsett 1 N natriumhydroksyd (NaOH) til mediet til den når en pH på 7,6-7,8, målt med en pH-meter.
- Tørk flasken med medium, en vakuumfiltreringsenhet, fire 50 ml koniske rør og flaskene PenStrep, NaPyr og NEAA med 70% etanol før du overfører til BSC.
- Tilsett 2 ml hver PenStrep (10 000 U/ml penicillin og 10 000 μg/ml streptomycin), 100 mM NaPyr og 100x NEAA til flasken TCM199 + 3 mg/ml BSA + 25 mM HEPES. Steril-filtrer det endelige mediet og aliquot inn i 50 ml koniske rør. Oppbevar mediet ved 4 °C i opptil 2 uker.
- Varm ett 50 ml konisk rør av medium per to eggstokker i et perlebad satt til 38,5 °C minst 1 time før eggstokkbehandling.
2. Oppsett av vevskrubber
- Forsikre deg om at vevsbeholderen (se Materialtabell) er koblet til og slått på.
- Sett skivetykkelsen til 500 μm, bladkraftkontrollknappen til 20° og hastighetskontrollknappen til 90° i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Sett inn en 60 mm petriskål av plast i plateholderen og sett plateholderen på scenen.
- Løft hakkearmen så høyt som den vil gå ved å vri den manuelle betjeningsknappen med klokken.
- Bruk tang til å plassere et tveegget barberblad (se Materialtabell) på skruen som er satt inn i skjærearmen. Plasser knivlåsen over bladet og fest den med vaskemaskinen og mutteren. La mutteren en kvart sving løs.
- Drei den manuelle betjeningsknappen til skjærearmen fester bladet flatt på petriskålen. Stram mutteren resten av veien med mutterdriveren.
- Løft hakkearmen så høyt som den vil gå ved hjelp av den manuelle betjeningsknappen. Flytt bordutløserknappen helt til venstre til den hakker på plass.
3. Forberedelse av eggstokk
- Overfør eggstokkene i laboratoriet til varm (38,5 °C) steril PBS + PenStrep.
MERK: Det anbefales å behandle eggstokkene for follikelisolasjon så snart det er mulig etter fjerning fra dyret. I denne protokollen ble eggstokkene behandlet innen 6 timer etter høsting. Eggstokkene ble transportert fra slakteriet til laboratoriet i termoser som inneholdt steril 0,9 % saltoppløsning ved ca. 38,5 °C. - Velg om mulig små (≤ 4 cm x 3 cm x 3 cm) eggstokkene som inneholder små (3-5 mm) antralfollikler, ingen store (≥8 mm) antralfollikler og ingen fremtredende corpus luteum (figur 1). Disse kriteriene anbefales for å sikre at en minimal mengde ikke-follikkelrester, som stromale celler og ekstracellulær matrise, er inkludert i den resulterende firkantede parabolen som inneholder isolerte follikler.
MERK: Antralfollikler kan identifiseres som sfæriske, væskefylte vesikulære strukturer på overflaten av eggstokken. Corpora lutea kan identifiseres som røde, oransje eller gule stive strukturer som stikker ut fra overflaten av eggstokken. - Bruk saks for å fjerne overflødig bindevev og fett fra eggstokkene.
- Vask eggstokkene i 30 s i 70% etanol i et beger.
- Vask eggstokkene 3x i 2 minutter hver i beger med varme (38,5 °C) PBS + PenStrep, med fersk PBS + PenStrep for hver vask.
- Hold eggstokkene i varme (38,5 °C) PBS + PenStrep til de er klare til behandling.
MERK: Avstanden mellom laboratoriet og eggstokkkilden kan variere. Derfor er det viktig å fullføre protokollen i tide for å sikre vedlikehold av follikulær levedyktighet.
Figur 1: Anatomien til eggstokken fra storfe. Bovin eggstokk består av to hovedregioner innelukket i et epitellag. Cortex, som består av vevet til venstre for den stiplede linjen, inneholder eggstokkfollikler fra primordialstadiet til antralstadiet. Preantralfollikler er for små til å se med det blotte øye; Antralfollikler er merket med stjerner. Medulla, som består av vevet til høyre for den stiplede linjen, inneholder blodkar, lymfekar og nerver. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Hakk prosedyre
MERK: Behandle bare en eggstokk om gangen. Behandle eggstokkene raskt for å unngå temperaturreduksjoner, noe som kan påvirke follikkelens levedyktighet.
- Overfør en eggstokk til skjærebrettet på benkpapiret (figur 2A) og klargjør vevskopperen (figur 2B).
- Bruk tang og en skalpell, kutt eggstokken i to og fjern medulla fra hver halvdel, og la bare cortex ha en tykkelse på ca. 1 mm som vist i figur 2C.
- Skjær eggstokken i to i lengderetningen fra ett ligamentfestested til motsatt festested.
- Hold den ene halvdelen av eggstokken på skjærebrettet som skal behandles, og legg den andre halvdelen av eggstokken tilbake i varm (38,5 ° C) PBS + PenStrep.
- Med den eksponerte medulla vendt oppover, skjær langs krumningen av eggstokken ca. 2 mm fra overflaten av eggstokken uten å kutte gjennom cortex.
- Bruk skiven langs krumningen av eggstokken som en veiledning for å utdype skiven, og følg fortsatt krumningen av eggstokken for å skille cortex fra medulla.
- Disseker og kast eventuelle corpora lutea fra eggstokken ved å kutte langs grensen til corpus luteum.
- Vend eggstokken halvt over slik at epitelet vender oppover og bruk skalpellen til å kutte medulla vekk fra cortex. Trim bort eventuelt gjenværende hvitt bindevev rundt kanten av eggstokkstykket som var koblet til leddbåndene.
- Når mesteparten av medulla er fjernet, bruk skalpellen til å kutte cortex til omtrent 1 mm tykkelse. Manipuler skalpellen med små, frem og tilbake bevegelser for å barbere bort resten av medulla.
MERK: Medulla er den indre delen av eggstokken som inneholder store blodkar. Cortex er den ytre delen av eggstokken, som ligger rett under det ytterste overflateepitelet. Cortex er ca. 1 mm tykk i bovin ovarie, og dermed vil kutting av eggstokken til en tykkelse på 1 mm fjerne medulla.
- Klipp cortex i stykker som ikke er større enn 2,5 cm x 2,5 cm. Hold cortexbitene i varme (38,5 °C) PBS + PenStrep til de er klare til å hogge.
- Fyll et beger med minst 50 ml varm (38,5 °C) PBS + PenStrep og skaff deg en plastoverføringspipette.
- Overfør et enkelt stykke cortex til petriskålen på vevskvulpen og fukt vevet med tre eller fire dråper varm (38,5 ° C) PBS + PenStrep.
- Hold vevstykket stødig med et par tang og trykk på tilbakestillingsknappen en gang for å starte vevshakkeren. Stabiliser petriskålen med en hånd mens du fortsetter å stabilisere vevet med tangen. Flytt tangen som er igjen langs vevet etter behov for å unngå at bladet treffer tangen. De resulterende stripene vil være omtrent 500 μm lange.
- Når hele cortex-stykket er kuttet i strimler, bruk bladholderknappen til å løfte bladet av petriskålen og tangen for å fjerne vev fra bladet.
- Drei plateholderen 90°.
- Trykk én gang på tilbakestillingsknappen. Stabiliser petriskålen med en hånd mens du bruker tangen til å skyve vevsstrimlene inn i banen til bladet.
- Før bladet helt gjennom vevsstrimlene. Bruk knivholderknappen til å løfte bladet av petriskålen og tangen for å fjerne vev fra bladet.
- Bruk overføringspipetten og varm (38,5 °C) PBS + PenStrep til å vaske det hakkede vevet (endelig størrelse på vev: 500 μm x 500 μm x 1 mm kuber) til en forvarmet (38,5 °C) 50 ml konisk rør. Sett koniskrøret tilbake i vannet eller perlebadet for å holde det hakkede vevet varmt (38,5 °C).
- Bruk mutterdriveren til å fjerne mutteren fra hakkearmen, og fjern vaskemaskinen og bladlåsen. Bruk tang, fjern bladet fra hakkearmen, snu det slik at den ubrukte kanten vender mot petriskålen, og legg den tilbake på hakkearmen. Sett på plass bladlåsen, vaskemaskinen og mutteren, og tilbakestill bordutløserknappen som beskrevet i trinn 2.5-2.7.
- Gjenta trinn 4.5-4.12 for alle gjenværende biter av cortex fra eggstokken, og erstatt kniver med nye etter at hver forkant er brukt.
- Kast alle brukte kniver i en hardvegget beholder for skarpe plastgjenstander.
5. Homogenisering prosedyre
- Forsikre deg om at homogenisatorenheten (se Materialtabell) er koblet til og at hastigheten er satt til den andre linjen (9,000-11,000 o / min). Sett 10 mm generatorsonden inn i enheten i henhold til produsentens spesifikasjoner.
- Sett en timer i 1 min og sett sonden inn i 50 ml konisk rør som inneholder hakket cortexvev fra en eggstokk (trinn 4.11) og nok PBS + PenStrep til å fylle røret til 25 ml linjen. Dybden som sonden settes inn i, må være 1/3 av væskens høyde målt fra bunnen av kammeret. Plasser sonden litt utenfor midten for å minimere virvel.
- Start timeren og slå på homogenisatoren. Forsikre deg om at bunnen av sonden ikke berører røret og hold røret stille mens homogenisatoren er slått på.
- Etter 1 min homogenisering, fjern sonden fra røret. Bruk tang, fjern eventuelt bindevev som tetter ventilasjonshullene og mellomrommet mellom rotorkniven og rotorrøret. Hvis noen biter av cortex sitter fast i sonden, fjern dem med tang og legg dem tilbake i røret.
- Gjenta trinn 5,2-5,4 og ytterligere 5x i totalt 6 minutter homogenisering.
- Plasser slangen med homogenisert vev i vannet eller perlebadet for å holde vevet varmt (38,5 °C). Etter å ha behandlet den siste eggstokken, demonter, rengjør og tørk generatorsonden umiddelbart i henhold til produsentens spesifikasjoner.
6. Filtrering prosedyre
- Hell det dispergerte vevet i den osteklærdekkede trakten som er satt inn i Erlenmeyer-kolben. Skyll innholdet i røret inn i trakten med varm (38,5 °C) PBS + PenStrep til ingen vevsfragmenter forblir i røret.
- Tving vevsfragmentene til å passere gjennom hullene i kluten ved å vri ostekluten rundt vevsfragmentene og klemme til alt overflødig væske og vev er fjernet fra osteklæren.
- Åpne ostekluten igjen over trakten, skyll ostekluten med PBS + PenStrep ved hjelp av en overføringspipette, og klem igjen eventuelle gjenværende vevsfragmenter gjennom kluten.
- Bruk en hemostat for å holde 300 μm cellesilen over et 200 ml beger. Hell filtratet i Erlenmeyer-kolben gjennom cellesilen. Skyll innholdet i kolben inn i cellesilen med varm (38,5 °C) PBS + PenStrep til det ikke er noen vevsfragmenter igjen.
- Hvis cellesilen blir tilstoppet med vev, banker du forsiktig cellesilen mot begeret for å sikre at all væske har filtrert inn i begeret, og snu deretter cellesilen opp ned og trykk ut det store vevsavfallet på benkpapiret. Returner cellesilen over begeret og fortsett å helle filtratet gjennom det. Gjenta etter behov til all filtrat fra Erlenmeyer-kolben er filtrert gjennom.
- Bruk en hemostat for å holde 40 μm celle sil over et sekund 200 ml beger. Hell filtratet i det første 200 ml begeret gjennom cellesilen. Skyll innholdet i begeret inn i cellesilen med varm (38,5 °C) PBS + PenStrep til det ikke er rester av vevsfragmenter. Ikke kast innholdet i cellesilen på 40 μm.
- Sett 18 G kanylen på 20 ml sprøyten. Fyll sprøyten med FWM. Snu cellesilen på 40 μm opp ned over en firkantet petriskål og bruk sprøyten til å vaske ut innholdet i cellesilen i fatet. Fyll på sprøyten og skyll cellesilen etter behov til det ikke er noen vevsfragmenter igjen.
MERK: Vanligvis er 25 ml FWM tilstrekkelig til å skylle ut innholdet i 40 μm cellesilen.
Figur 2: Arbeidsområdeoppsett for eggstokkbehandling og protokollarbeidsflyt . (A) Benkoppsett for kutting av eggstokkene før hakking og for filtrering av eggstokkhomogenatet. (B) Vevskrubber og homogenisator satt opp, med isoporstøtte for å redusere vibrasjoner i homogenisatortrinnet. (C) Skjematisk illustrerer arbeidsflyten for behandling av en hel eggstokk. Eggstokkene er trimmet av overflødig bindevev og deretter kuttet i to, og medulla fjernes til en ~ 1 mm tykk skive cortex gjenstår. Cortex er kuttet i 2,5 cm x 2,5 cm stykker og hakket i en vevskrubber satt til et kuttintervall på 500 μm. Bitene blir deretter homogenisert, og homogenatet filtreres gjennom osteklær etterfulgt av filtrering gjennom 300 μm og 40 μm cellesiler. Innholdet i 40 μm cellesilen skylles inn i en firkantet petriskål, som søkes etter follikler ved hjelp av et stereomikroskop. Laget med BioRender.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
7. Søke og samle follikler
- Overfør den firkantede petriskålen (trinn 6.6) til et stereoskop med en oppvarmet scene satt til 38,5 °C. Stereoskopet forstørrelse bør settes mellom 1,25x og 3,2x avhengig av søkerens preferanser.
- Pipette 10 μL dråper FWM i en 60 mm petriskål og dekk dråpene med mineralolje for å forhindre uttørking. Plasser petriskålen med mediedråper på en varmeplate satt til 38,5 °C.
MERK: En 4-brønns plate kan brukes til å samle follikler. Tilsett 500 μL vaskemedium i en eller to brønner. Plasser på varmeplaten satt til 38,5 °C. - Skaff deg et mikropipettestempel og spiss.
MERK: En glassmikropipette på 1-5 μL (se materialtabell) anbefales fordi folliklene er mindre tilbøyelige til å feste seg til glasspipetten og gå tapt når de overføres mellom oppløsningene. Det er også et lite nok instrument til å tillate enklere og mer presise mikromanipuleringer av folliklene. - Identifiser follikler fra den firkantede petriskålen og overfør til media (FWM) dråper ved hjelp av mikropipetten. Mange follikler er sannsynligvis innebygd i vevsrester og kan gjenvinnes ved hjelp av en av to metoder som beskrevet nedenfor.
MERK: Follikler er avlange, snarere enn perfekte kuler, og har vanligvis en oocyt, som presenterer seg som en solid hvit sirkel i mørkere kontraster, mot midten av follikkelen (figur 3A-C). Pass på å unngå å forvirre follikler med denuderte oocytter. Oocytter har en tendens til å være perfekte kuler og er omgitt av en tykk, klar membran (zona pellucida). Et omvendt mikroskop med en forstørrelse på 10x (eller høyere) kan brukes til nærmere undersøkelse av follikler (figur 3D).- Skill folliklene forsiktig fra rusk ved hjelp av spissen av mikropipetten eller fine (27 G) nåler.
- Alternativt kan du bruke en pasteurpipette av glass med en gummipære til å ta opp og sprute ut ruskene i fatet flere ganger for å løsne follikler fra ruskene.
- Arbeid raskt, tar ikke lenger enn 30 min, for å søke petriskålen for å bevare follikkelens levedyktighet.
- Plasser maksimalt bare fem follikler per 10 μL dråpe, da en høyere tetthet kan øke sannsynligheten for at follikler fester seg sammen.
8. Trypan blå eksklusjon levedyktighet test
MERK: Bruk lokket på en petriskål eller en 4-brønns tallerken for alle følgende trinn, da folliklene fester seg mindre til plasten på lokket enn de gjør til plasten i selve parabolen.
- Forbered PBS + 0,2% polyvinylpyrrolidon (PVP) ved å oppløse 100 mg PVP i 50 ml PBS.
MERK: PVP brukes her for å redusere sannsynligheten for at follikler festes til parabolen. - Bruk mikropipetten til å overføre alle follikler (gjennomsnitt på 40) fra mediedråpene til en 50 μL dråpe PBS + 0,2% PVP.
- Vask folliklene 2x ved å overføre dem sekvensielt til friske 50 μL dråper PBS + 0,2% PVP.
- Overfør folliklene til en 285 μL dråpe PBS + 0,2% PVP.
- Tilsett 15 μL trypanblå til 285 μL dråpen PBS + 0,2% PVP (endelig konsentrasjon på 0,05% trypanblå) og bland dråpen forsiktig med en 200 μL pipettespiss satt til 100 μL.
MERK: Hvis du bruker 4-brønnsplaten for trypan levedyktighetstesten, tilsett 475 μL PBS + 0.2% PVP og 25 μL trypanblå til en brønn. - Inkuber folliklene i 1 min i trypanblå dråpen, og overfør deretter folliklene til en 50 μL dråpe (eller 500 μL brønn) PBS + 0,2% PVP.
- Vask folliklene 3x i henhold til trinn 8.3 med friske 50 μL dråper (eller 500 μL per brønn) PBS + 0,2% PVP.
- Kast eventuelle follikler som fortsatt ser blå ut etter tre vasker i PBS + 0,2% PVP, da disse ikke er levedyktige. Eventuelle follikler som ikke beholder blå farge etter tre vasker, er levedyktige og kan brukes til immunfluorescens, kultur eller andre prosedyrer (figur 3E). Frys folliklene i flytende nitrogen og oppbevar ved -80 °C til videre bruk om nødvendig.
- Utfør RT-qPCR-analyse og immunfluorescensfarging av folliklene som beskrevet i trinn 9 og 10.
Figur 3: Isolerte follikler og trypanblå eksklusjonstest. (A-C) Isolerte follikler ble avbildet gjennom et stereomikroskop ved flere forstørrelser. (A) Isolerte follikler blant rusk i den første søkeparabolen. Individuelle follikler er sirklet i rødt. Skala bar = 2,000 μm. (B) Isolerte follikler og rusk i en dråpe follikkelvaskemedium dekket med mineralolje. Skalabar = 1,000 μm. (C) Isolerte follikler uten rusk ved høyere forstørrelse. Skalalinje = 1,000 μm. (D) Isolerte follikler avbildet ved hjelp av et omvendt lysfeltmikroskop. Skalalinje = 100 μm. (E) Representative bilder av levedyktige (ufargede) og ikke-levedyktige (blå flekk) follikler avbildet ved hjelp av et omvendt lysfeltmikroskop og et 20x mål. Skala bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
9. RT-qPCR-analyse
- Isoler RNA fra levedyktige follikler (fra trinn 8.8) ved hjelp av et RNA-isolasjonsreagens (se materialtabell). Rens RNA og behandle med DNase ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig oppryddingssett (se materialtabell) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Eluter RNA med 14 μL RNasefritt vann og kvantifiser ved hjelp av et spektrofotometer. RNA kan lagres ved -80 °C til cDNA-syntese.
- Utfør cDNA-syntese fra like mengder RNA ekstrahert fra primære og tidlige sekundære follikler, ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig cDNA-syntesesett (se materialtabell) i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber reaksjonsblandingen i 5 minutter ved 25 °C etterfulgt av 60 minutter ved 42 °C, og avslutt deretter reaksjonen ved oppvarming ved 70 °C i 5 minutter.
- Utfør RT-qPCR med syntetisert cDNA (5 ng per reaksjon) og primere (tabell 1) ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig reaksjonsblanding (se materialtabell). Bruk termiske syklusforhold: 30 s ved 95 ° C for polymeraseaktivering, etterfulgt av 40 sykluser med forsterkning, hvor hver syklus inkluderte 15 s ved 95 ° C for denaturering og 30 s ved 60 ° C for gløding / forlengelse. Analyser RT-qPCR ved å kvantifisere syklusterskelverdier (Ct) og / eller se PCR-produkter ved hjelp av agarosegelelektroforese.
MERK: Transkripsjonsuttrykk av granulosacellemarkøren FSHR og kimcellemarkøren DAZL ble evaluert i denne studien. Referansegener var H2A og ACTB. - Kjør en smeltekurveanalyse ved å øke temperaturen fra 65 °C i trinn på 0,5 °C hver 5 s til den når 95 °C.
10. Immunfluorescens analyse
- Fest levedyktige follikler (fra trinn 8,8) i 15 minutter i en 100 μL dråpe på 4% (v / v) paraformaldehyd (PFA) ved romtemperatur (RT), etterfulgt av vask 3x i 100 μL dråper PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20.
- Blokker folliklene i 1 time ved RT i en blokkerende buffer bestående av 1x PBS + 5 % (v/v) normalt eselserum (NDS). Etter blokkering, inkuber folliklene over natten ved 4 °C i en 100 μL dråpe 4 μg/ml kanin anti-humant CX37 antistoff eller 4 μg/ml kanin isotype IgG (negativ kontroll) fortynnet i blokkeringsbuffer.
- Vask folliklene 3x i 100 μL dråper PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20, og inkuber dem deretter i 1 time ved RT i mørket i en 100 μL dråpe 2 μg / ml esel-anti-kanin AlexaFluor 488 sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer.
- Inkuber folliklene i 5 minutter ved RT i mørket i en 100 μL dråpe på 1 μg / ml Hoechst 33342 fortynnet i blokkeringsbuffer for å merke DNA.
- Overfør folliklene til en 5 μL dråpe monteringsmedier (se materialtabell) på et glassmikroskopglass og deksel med en dekselglide. La lysbildene herde på RT over natten, etterfulgt av tetting med neglelakk. Oppbevar dem ved 4 °C til bildebehandling.
- Bilde alle lysbilder innen 48 timer etter at dekselet glir. Utfør avbildning ved hjelp av et omvendt epifluorescensmikroskop (se materialtabell) under DAPI (eksitasjon 380 nm og utslipp 450 nm) og FITC (eksitasjon 470 nm og utslipp 525 nm) filtre.
- Løs eksponeringstiden for begge kanalene. Juster eksponeringstiden for FITC (CX37) basert på negativ kontroll av kaninisotypen. Bruk et 20x mål og DAPI-kanalen satt til 50 ms eksponeringstid for å identifisere kanin isotype-merkede follikler.
- Bilde disse folliklene under FITC-kanalen, og reduser eksponeringstiden til alt grønt bakgrunnssignal er avskaffet. Legg merke til denne eksponeringstiden.
- Bilde alle CX37-antistoffmerkede follikler ved hjelp av eksponeringstiden som er angitt for isotype FITCH-kanalen og 50 ms eksponeringstid for DAPI-kanalen.
- Behandle signalintensiteten, målt ved gjennomsnittlig gråsone etter terskel, ved hjelp av et databildebehandlingsprogram29 (se Materialtabell).
- Juster tiff-filen til DAPI-bildet for hver follikkel slik at hele follikkelen er skissert. Bruk funksjonen Analyser partikler i programmet til å velge hele follikkelen som et interesseområde (ROI).
- Åpne tiff-filen til FITC-bildet for den tilsvarende follikkelen, og legg over avkastningen som genereres fra DAPI-bildet, oppå FITC-bildet. Bruk Mål-funksjonen i programmet til å kvantifisere det gjennomsnittlige gråområdet i FITC-bildet, som representerer signalintensiteten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oversikt og kritiske trinn
Ved hjelp av denne protokollen kan små bovine preantralfollikler isoleres pålitelig fra enkle eggstokkene i eksperimentelt relevante tall. Fra totalt 30 replikasjoner ble det i gjennomsnitt oppnådd 41 follikler per replikasjon, med et område på 11 til 135 follikler (figur 4A). I 14 replikasjoner ble folliklene karakterisert for utviklingsstadium som tidligere beskrevet26 ved å måle follikeldiameteren ved hjelp av et 1 μm mikroskopkalibreringsglass under stereomikroskopet. Ved hjelp av denne metoden ble totalt 476 follikler klassifisert som enten primære (follikler som måler 40-79 μm), tidlig sekundær (80-119 μm) eller sekundær (≥120 μm) follikler (figur 4B). Primordiale follikler ble ekskludert på grunn av filtreringstrinnet på 40 μm. Follikkel levedyktighet ble evaluert ved hjelp av trypan blå eksklusjonstest som beskrevet tidligere30. Isolerte follikler ble kort inkubert i 1 min i 0,05% (v / v) trypanblå i PBS som inneholdt 0,2% PVP, etterfulgt av tre vasker med PBS + PVP og undersøkelse under et stereoskop. Ved hjelp av prosedyren som er beskrevet, var 100% av isolerte follikler levedyktige i alle replikasjoner. Totalt sett tar den mekaniske isolasjonsprosessen, fra eggstokksamling til umiddelbart før søk i petriskålen, omtrent 30-45 minutter. Tiden brukt på å søke og identifisere follikler tar ikke lenger enn 30 minutter, noe som resulterer i en prosess som tar totalt 1-1,25 timer per eggstokk.
Det mest kritiske trinnet i denne protokollen er å sikre at eggstokkvevet er riktig homogenisert. Økning av homogeniseringstiden fra 5 minutter til 6 minutter førte til en økning i antall isolerte follikler (P < 0,05). Gjennomsnittlig 41 follikler ble isolert per eggstokk fra 30 studier ved bruk av en homogenisering på 6 minutter, noe som er en nesten tredobling over gjennomsnittet på 13,8 follikler per eggstokk oppnådd fra 22 studier med en 5 min homogeniseringstid (figur 5). Et annet viktig skritt er homogeniseringshastigheten, som må holde seg innenfor 9.000-11.000 o / min. Høyere hastigheter fører til reduserte utbytter, antagelig på grunn av overdreven skade og / eller brudd på follikler. Follikkelisolasjon kan forbedres ytterligere etter filtreringstrinnene ved å føre innholdet i oppvasken gjennom en pasteurpipette i glass med en gummipære flere ganger. Ved å bruke Pasteur-pipetten løsnes follikler fra rusk, og flere follikler kan ses i parabolen.
Hvis folliklene skal dyrkes etter isolering, er det viktig å redusere mikrobiell kontaminering. Forurensning kan forebygges ved å trimme overflødig bindevev og fett fra hele eggstokken og deretter utføre en rekke vasketrinn. De trimmede eggstokkene skal vaskes kort i 70% etanol for å redusere den mikrobielle belastningen, etterfulgt av flere vasker i varm (38,5 ° C) PBS + PenStrep-løsning for å vaske bort 70% etanol og ytterligere fjerne potensielle mikroorganismer. Disse vaskene kan gjøres uten at det går ut over follikkelens levedyktighet. For ytterligere å forhindre forurensning er det mulig å utføre hele isolasjonsprotokollen inne i et biosikkerhetsskap eller ren benk med sterilisert utstyr.
RNA-isolasjon og RT-qPCR
Follikler av samme stadium og fra separate isolasjoner ble samlet, og totalt 46 primære og 34 tidlige sekundære follikler ble brukt til analyse av mRNA-ekspresjon. RNA ble isolert fra de samlede folliklene (primære follikler = 259 ng av totalt RNA og tidlige sekundære follikler = 91 ng av totalt RNA) og brukt til cDNA-syntese. Transkripsjonsuttrykk av granulosacellemarkøren FSHR19 og kimcellemarkøren DAZL i folliklene ble deretter evaluert ved hjelp av RT-qPCR. Som forventet uttrykte både primære og tidlige sekundære follikler FSHR- og DAZL-transkripsjoner, som bekreftet en tidligere rapport i humane follikler31 og demonstrerte at FSHR uttrykkes i storfefollikler i det primære utviklingsstadiet32 (figur 6A, B).
Immunoflourescerende lokalisering av Connexin 37
Immunofluorescerende lokalisering av proteiner kan utføres i hele follikler. Her ble denne teknikken brukt til å lokalisere gapet kryssprotein Connexin 37 (CX37) i isolerte preantralfollikler både i primær og tidlig sekundær fase. CX37 er kritisk for kommunikasjon mellom oocytt- og granulosacellene i follikkelen og er identifisert i begge celletyper i alle stadier av follikkelutvikling hos storfearter i histologiske analyser33. Etter trypanblå eksklusjonstest ble levedyktige follikler fiksert i PFA og inkubert med kanin anti-humant CX37 antistoff eller kanin isotype IgG (negativ kontroll), etterfulgt av inkubasjon med esel-anti-kanin AlexaFluor 488 sekundært antistoff. Hoechst 33342 ble brukt til å merke DNA. Folliklene ble avbildet ved hjelp av et omvendt epifluorescensmikroskop under DAPI- og FITC-filtre, og signalintensiteten ble kvantifisert. CX37 ble funnet å lokalisere til ooplasma, men spesielt fraværende fra oocytkjernen, og til membranen til granulosacellene (figur 7). Disse resultatene er i samsvar med den kjente lokaliseringen av CX37 til oocytten og membranen i granulosacellene33. Immunlokalisering av proteiner som er kjent for å være kritiske for cellekommunikasjon og follikkelvekst, som CX37 (vist her) og FSHR32 , er et viktig verktøy for å studere utviklingen av preantralfollikler, effekter av intervensjoner på follikkelvekst, struktur og kvalitet, samt å vurdere dyrkningseffektivitet ved å sammenligne in vivo-oppnådde og in vitro-dyrkede follikler.
| Gen | Fremskutt sekvens (5'-3') | Omvendt sekvens (5'-3') | Produktstørrelse (bp) | ||||
| FSHR | CCC AAC TCG ATG AGC TGA ATC T | CAT AGC TAG GCA GGG AAC GG | 132 | ||||
| DAZL | GCC CAC AAA AGA AAT CTG TGG EN | HANDLE TAA GCA CTG CCC GAC TT | 156 | ||||
| H2A | GAG GAG CTG AAC AAG CTG TTG | TTG TGG TGG CTC TCA GTC TTC | 104 | ||||
| ACTB | CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT | GGG CAG TGA TCT CTT TCT GC | 178 | ||||
Tabell 1: Liste over primere brukt til RT-qPCR.
Figur 4: Antall og utviklingsstadium av isolerte preantralfollikler. (A) Totalt antall isolerte preantralfollikler per replikasjon ved bruk av 6 min vevshomogenisering (n = 30 replikasjoner). Gjennomsnittlig antall follikler er representert av den røde linjen over stolpene. (B) I 14 replikasjoner ble utviklingsstadiet av de isolerte folliklene registrert. Kakediagrammet viser fordelingen av utviklingsstadier som andel av de totale isolerte folliklene (n = 476). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av 5- versus 6-minutters homogenisering. Homogenisering av ovariebarken i 6 minutter ga et større antall preantrale follikler sammenlignet med homogenisering med samme hastighet i 5 minutter (n = 22 replikerer i 5 minutter og 30 replikasjoner i 6 minutter; P < 0,01). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Revers transkripsjon kvantitativ PCR av transkripsjoner uttrykt i isolerte preantralfollikler. Primære og tidlige sekundære preantralfollikler uttrykte mRNA-transkripsjoner for markører av granulosaceller (FSHR), kimceller (DAZL) og referansegener (H2A og ACTB). (A) Agarosegel av PCR-produkter for hvert gen med respektive basepar (bp) produktstørrelser. (B) Ekspresjon av FSHR - og DAZL-transkripsjoner ble kvantifisert i forhold til referansegenet ACTB. NTC = ikke-malkontroll, CT = syklusterskel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Immunfluorescerende lokalisering av CX37 i isolerte preantrale follikler. Representative bilder av CX37 immunlokalisering i en primær (A) og tidlig sekundær (B) bovin preantral follikkel. (C) Representativt bilde av negativ kontroll kanin isotype merking i en tidlig sekundær bovin preantral follikkel. Venstre panel: DNA-merking (DAPI). Midtpanel: primært antistoff kanin anti-human CX37 merking (FITC). Høyre panel: DAPI og FITC slått sammen. Skalastenger = 50 μm. (D) Gjennomsnittlig CX37 signalintensitet i henhold til follikkelutviklingsstadium (n = 21 primære og 11 tidlige sekundære follikler i to replikasjoner). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den foreliggende protokollen beskriver en reproduserbar metode for å hente preantrale follikler i tidlig stadium, spesielt i primære og tidlige sekundære stadier, fra bovin eggstokk. Denne protokollen bygger på tidligere rapporter 20,25,30,34,35,36 og gir optimaliseringer som resulterer i isolering av et meningsfylt antall follikler fra en individuell eggstokk. Preantralfollikler isolert ved hjelp av denne metoden er levedyktige og kan brukes til nedstrøms applikasjoner som immunlokalisering av proteiner og RNA-ekstraksjon for analyse av genuttrykk. Dyrking av de isolerte folliklene ble ikke forsøkt i denne studien. Imidlertid pågår det for tiden innsats for å oppnå vellykket langsiktig kultur av små storfe preantralfollikler, noe som vil være en viktig nedstrøms anvendelse av denne protokollen som vil bidra til å forbedre forståelsen av ovariefollikulogenese, utføre toksikologiske tester og utarbeide måter å manipulere follikler for fruktbarhetsbevaring.
Data fra disse forsøkene viser at homogeniseringen på 6 minutter er kritisk for riktig spredning av ovariekortikale vev og follikkelfrigjøring (figur 4). Ytterligere trinn som bidrar til grundig homogenisering av vevet er den første disseksjonen av cortex fra medulla som sikrer riktig tykkelse av cortex (~ 1 mm), trimming bort overflødig bindevev og hakking av cortex i små fragmenter. Disse trinnene forhindrer tilstopping av homogenisatorsonden og unødvendig rusk i søkeplaten. Celle sil pore størrelse er viktig for å utelukke rusk og follikler av uønsket størrelse og stadium; Når det gjelder denne protokollen, er det siste trinnet å samle innholdet i en 40 μm cellesil for å utelukke primordiale follikler, som vanligvis er <40 μm i diameter hos storfe26. Til slutt anbefales det å bruke en Pasteur-pipette for å løsne follikler fra rusk i oppvasken fremfor å forsøke å manuelt dissekere follikler ut av ruskene, da sistnevnte teknikk krever mer teknisk dyktighet og, hvis den gjøres feil, kan skade folliklene.
Selv om denne protokollen gir forbedringer sammenlignet med eksisterende metoder, er det begrensninger som må vurderes. For det første, på grunn av den heterogene karakteren av eggstokkfollikelpopulasjonen15 og ukjent historie av dyrene som eggstokkene ble hentet fra, var antall follikler isolert etter å ha utført denne protokollen svært variabel. En faktor som må vurderes er dyrealder, da eggstokkreserven er kjent for å avta med37 år.
Isolering av små preantrale follikler fra bovin eggstokk gir muligheter til å undersøke grunnleggende vitenskapelige spørsmål på enkeltprøvenivå, en tilnærming som har vært vanskelig å gjennomføre tidligere. For eksempel viste alle preantrale follikelstadier evaluert her ekspresjon av CX37, et kritisk protein for oocytt-granulosacellekommunikasjon. Tilsvarende er ekspresjon av FSH-reseptor tidligere påvist i individuelt isolerte preantralfollikler32. Andre spesifikke markører for granulosaceller, som de steroidogene enzymene CYP17 og CYP1938, vil være relevante tillegg til gen/protein-ekspresjonspanelet for preantralfollikler, og vil være gjenstand for fremtidige prosjekter. Visualiseringen av hele follikulærstrukturen via vanlig eller konfokal mikroskopi er mer omfattende sammenlignet med histologisk undersøkelse, hvor bare ett segment av follikkelen kan analyseres om gangen. Dette er spesielt fordelaktig i studier som kanskje vil bruke immunostaining eller in situ hybridisering, der detaljert romlig lokalisering av uttrykk er nødvendig. I tillegg kan isolerte preantralfollikler brukes til å undersøke enkeltfollikelgenuttrykk ved å bruke følsomme sett for RT-qPCR30. Evnen til å analysere follikler individuelt og uten påvirkning av eggstokkmiljøet er et kritisk skritt fremover for å forstå kompleksiteten av preantralfollikulogenese.
Kryopreservering av ovariebarkvevet har blitt en lovende teknikk for å ivareta fruktbarheten hos hunnpattedyr39, inkludert kvinner40. Bevaring og restaurering av fruktbarhet ved bruk av preantralfollikler presenterer en attraktiv assistert reproduksjonsteknologi, samt en lovende metode for å studere follikulogenese41. Etter frysing og tining kan vevet bli utsatt for denne isolasjonsprotokollen for gjenfinning av levedyktige preantralfollikler. Selv om denne protokollens potensielle evne til å hente follikler fra tidligere kryopreservert vev ikke ble spesifikt vurdert, har andre vist suksess og brukt levedyktige små preantralfollikler isolert fra frosset tint vev for in vitro-kultur 42,43,44,45. Videre kan nyisolerte preantralfollikler individuelt kryopreserveres via vitrifisering og opprettholde strukturell integritet36.
En oppdatering på detaljer for effektiv isolering av preantralfollikler fra en stor pattedyrart som storfe har manglet i litteraturen. Videre er en visuell og eksplisitt veiledning om hvordan man isolerer bovine preantralfollikler sårt tiltrengt, da mangelen på reproduserbarhet har vært en flaskehals i feltet. Nylig beskrev Bus et al.36 isoleringen av storfe preantralfollikler ved hjelp av en mekanisk metode, med et beregnet gjennomsnittlig utbytte på 6,1 primære follikler per eggstokk. Den mekaniske isolasjonsmetoden beskrevet her resulterer i isolering av gjennomsnittlig 41 preantralfollikler per eggstokk, de fleste er på primærstadiet. Derfor er denne teknikken spesielt nyttig for studier fokusert på primær follikkelfysiologi og utvikling. Primære follikler representerer den første fasen av det voksende bassenget og er rikelig i ovariebarken. Derfor er bruken av den beskrevne teknikken, som er optimalisert for å høste dette utviklingsstadiet, ny og kan være spesielt ønskelig for å dra nytte av eggstokkreserven samtidig som man unngår vanskeligere manipulering av primordiale follikler. En annen fordel med å isolere primære follikler ville være å knytte ovarievevskultur for den første aktiveringen av primordiale follikler med påfølgende isolering av primære follikler for videre kultur. Gitt interessen for å dyrke follikler fra det mer rikelige primærstadiet, kan metoden som presenteres her stimulere forskere til å forfølge veier de tidligere har unngått på grunn av utfordringen med å isolere primære follikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble delvis finansiert av USDA Multi-state prosjekt W4112 og UC Davis Jastro Shields prisen til SM.
Forfatterne ønsker å utvide sin takknemlighet til Central Valley Meat, Inc., for å gi de storfe eggstokkene som brukes i alle eksperimenter. Forfatterne takker også Olivia Silvera for hjelp med eggstokkbehandling og follikkelisolasjon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope - Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope - Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope - Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
References
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the 'holy grail' for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
