Summary
Att främja studien av preantral follikulogenes kräver effektiva metoder för follikelisolering från enstaka äggstockar. Här presenteras ett strömlinjeformat, mekaniskt protokoll för follikelisolering från nötkreatur äggstockar med hjälp av en vävnadshackare och homogenisator. Denna metod möjliggör insamling av ett stort antal livskraftiga preantrala folliklar från en enda äggstock.
Abstract
Att förstå hela processen för däggdjursfollikulogenes är avgörande för att förbättra assisterad reproduktionsteknik hos boskap, människor och hotade arter. Forskningen har mestadels begränsats till antrala och stora preantrala folliklar på grund av svårigheter att isolera mindre preantrala folliklar, särskilt hos stora däggdjur som nötkreatur. Detta arbete presenterar ett effektivt tillvägagångssätt för att hämta ett stort antal små preantrala folliklar från en enda bovin äggstock. Cortex hos enskilda nötkreaturs äggstockar skivades i 500 μm kuber med hjälp av en vävnadshackare och homogeniserades i 6 minuter vid 9 000-11 000 rpm med en 10 mm sond. Stora skräp separerades från homogenatet med hjälp av en ostduk, följt av seriell filtrering genom 300 μm och 40 μm cellsilar. Innehållet som fanns kvar i 40 μm-silen sköljdes i en sökskål, där folliklar identifierades och samlades in i en droppe medium. Livskraften hos de uppsamlade folliklarna testades via trypanblå färgning. Denna metod möjliggör isolering av ett stort antal livskraftiga små preantrala folliklar från en enda nötkreaturs äggstock på cirka 90 minuter. Det är viktigt att denna metod är helt mekanisk och undviker användning av enzymer för att dissociera vävnaden, vilket kan skada folliklarna. Folliklarna erhållna med användning av detta protokoll kan användas för nedströms applikationer såsom isolering av RNA för RT-qPCR, immunolokalisering av specifika proteiner och in vitro-odling .
Introduction
Äggstocksfolliklar är de funktionella enheterna i äggstocken, som ansvarar för produktionen av könscellen (äggcellen) samt hormoner som är kritiska för reproduktiv funktion och allmän hälsa. Primordiala folliklar bildas i äggstocken under fostrets utveckling eller under neonatalperioden beroende på art1, och de utgör en kvinnas äggstocksreserv. Follikulär tillväxt börjar med aktivering av primordiala folliklar som lämnar vilopoolen och går in i odlingsfasen. Preantral follikulogenes, som omfattar alla follikelstadier före antrumutveckling, är en mycket dynamisk process som kräver synkrona morfologiska och metaboliska förändringar i äggcellen och de omgivande granulosacellerna, drivna av tät kommunikation mellan dessa två celltyper 2,3. Preantrala folliklar utgör majoriteten av de follikulära enheter som finns i äggstocken vid varje given tidpunkt4. Utveckling genom de preantrala stadierna av follikulogenes uppskattas vara flera veckor längre än antral utveckling 5,6, och denna tid är nödvändig för att oocyten och somatiska celler ska få tillräcklig mognad för att gå in i det sista utvecklingsstadiet (dvs. antralstadiet) och förbereda sig för ägglossning, befruktning och embryonal utveckling 7,8,9.
Mycket av den nuvarande kunskapen om ovariell preantral follikulogenes kommer från musmodeller10,11,12,13, delvis på grund av lättheten att återhämta ett stort antal av dessa folliklar från en mindre och mindre fibrös äggstock. Även om rapporter om isolering av ett stort antal preantrala folliklar från nötkreaturs äggstockar går tillbaka cirka 30 år14, har en mer fullständig förståelse för de processer som reglerar utvecklingen av dessa folliklar i tidigt stadium förblivit orealiserad, till stor del på grund av bristen på optimerade, effektiva och repeterbara metoder för att hämta tillräckligt antal livskraftiga preantrala folliklar, särskilt i tidiga utvecklingsstadier. Med det ökande intresset för att bevara äggstocksreserven för framtida användning vid assisterad befruktning hos människor blir kor en attraktiv modell på grund av deras mer liknande äggstocksstruktur15. Den bovina äggstocken är dock markant rikare på kollagen jämfört med musens äggstock16, vilket gör mekanisk isolering med metoder som beskrivs för musen mycket ineffektiva. Ansträngningar för att utöka fertilitetsbevarande tekniker inkluderar fullständig in vitro-tillväxt av preantrala folliklar till antralstadiet, följt av in vitro-mognad (IVM) av de slutna oocyterna, in vitro-befruktning (IVF) och embryoproduktion och överföring17. Hittills har hela denna process endast uppnåtts hos möss18. Hos nötkreatur är framstegen mot follikeltillväxt in vitro begränsad till några rapporter med varierande follikelstadier i början av kulturen, liksom varierande kulturlängd mellan protokoll17,19.
De metoder som beskrivs i litteraturen för skörd av preantrala folliklar från nötkreaturs äggstock har mestadels använt mekaniska och enzymatiska tekniker, antingen isolerade eller i kombination 2,14,17,20. Den första rapporten från ett protokoll för isolering av bovin preantral follikel använde en vävnadshomogenisator och seriell filtrering för att bearbeta hela äggstockarna20. Denna studie följdes av rapporter som kombinerar mekaniska och enzymatiska procedurer som använde kollagenas14. Ett återkommande tema när man använder kollagenas för att smälta äggstocksvävnaden är den potentiella risken för skador på det follikulära källarmembranet, vilket kan äventyra follikelns livskraft 14,21,22,23. Därför har olika kombinationer av mekaniska metoder använts, såsom användning av en vävnadshackare och upprepad pipettering eller en vävnadshackare i kombination med homogenisering20,24,25,26. En annan mekanisk teknik som har beskrivits använder nålar för att dissekera preantrala folliklar direkt från äggstocksvävnaden, vilket är särskilt användbart för att isolera större (>200 μm) sekundära folliklar. Denna process är dock tidskrävande, ineffektiv för att isolera mindre preantrala folliklar och är kompetensberoende vid försök i nötkreaturs äggstockar 19,27,28.
Genom att dra nytta av de olika teknikerna som beskrivs i litteraturen syftade detta protokoll till att optimera isoleringen av preantrala folliklar från enstaka nötkreatur äggstockar på ett enkelt, konsekvent och effektivt sätt som undviker inkubation i enzymatiska lösningar. Förbättring av metoderna för att isolera preantrala folliklar kommer att ge möjlighet att förbättra förståelsen för detta stadium av follikulogenes och möjliggöra utveckling av effektiva odlingssystem för att utveckla preantrala folliklar till antralstadiet. De detaljerade förfaranden som beskrivs häri för isolering av preantrala folliklar från ett stort däggdjur som nötkreatur kommer att vara avgörande för forskare som syftar till att studera tidig follikulogenes hos en icke-murin art som kan översättas till människor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nötkreatur (Bos taurus) äggstockar hämtades från ett lokalt slakteri och transporterades till laboratoriet inom 6 timmar efter insamling. På grund av det stora antalet djur som bearbetas i anläggningen är ålder, ras och stadium av djurens estruscykel okända. Eftersom inga levande djur användes i dessa experiment krävdes inget godkänt protokoll för djurvård och användning.
1. Beredning av utrustning och reagenser
- Täck en 2 fot bred del av en labbbänk med bänkpapper.
- Skaffa ett skalpellhandtag, sterilt skalpellblad, hemostat, par dissektionstångar, 20 ml luerlåsspruta, 18 G nål, två 200 ml bägare, 500 ml Erlenmeyerkolv, plasttratt med en diameter på 104 mm, skärbräda av plast, ett 22 cm2 lager ostduk (ostduken kan steriliseras genom autoklavering före användning) per äggstock som bearbetas, en cellsil på 300 μm och en cellsil på 40 μm (se materialtabell).
- Överför all utrustning till bänkpapperet.
- Använd hemostaten för att placera skalpellbladet på skalpellhandtaget. Rikta in bladets vinklade bas mot den vinklade indikatorn på handtaget och skjut sedan in bladet i handtagets spår.
- Placera tratten i Erlenmeyerkolven och täck trattöppningen med ostduken.
- Placera ett 50 ml koniskt rör per äggstock som ska bearbetas i ett vatten- eller pärlbad som är inställt på 38,5 °C.
- Placera en 100 mm x 15 mm fyrkantig petriskål per äggstock som bearbetas på en glidvärmare inställd på 38,5 °C.
- Tillsätt 10 ml penicillin-streptomycin (PenStrep; 10 000 U/ml penicillin och 10 000 μg/ml streptomycin) till 1 liter 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Värm PBS + PenStrep i ett vatten- eller pärlbad till 38,5 °C minst 2 timmar före bearbetning av äggstockar.
OBS: PBS + PenStrep-lösning är absolut nödvändig för att tvätta äggstockar när isolerade folliklar kommer att odlas, och det rekommenderas fortfarande för alla nedströms experiment för att mildra mikrobiell kontaminering. - För att samla bearbetat äggstocksfiltrat, använd Follicle Wash Medium (FWM) bestående av TCM199 med Hank's Salts (se materialtabell) innehållande 3 mg/ml bovint serumalbumin (BSA), 25 mM HEPES-buffert, 100 UI penicillin/100 μg/ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat (NaPyr) och 100 nM icke-essentiella aminosyror (NEAA).
- Överför steril TCM199, en 250 ml flaska och en 100 ml graderad cylinder till ett biosäkerhetsskåp (BSC). Överför 194 ml TCM199 till flaskan.
- Ta bort bägaren på TCM199 från BSC och ta till en omrörningsplatta. Tillsätt 600 mg BSA, 1,19 g HEPES-buffert och en autoklaverad omrörningsstång i flaskan och rör om tills den är upplöst.
- När BSA- och HEPES-bufferten har lösts upp helt, tillsätt 1 N natriumhydroxid (NaOH) till mediet tills det når ett pH på 7,6-7,8, mätt med en pH-mätare.
- Torka av flaskan med medium, en vakuumfiltreringsanordning, fyra 50 ml koniska rör och flaskorna med PenStrep, NaPyr och NEAA med 70% etanol innan de överförs till BSC.
- Tillsätt 2 ml vardera PenStrep (10 000 U/ml penicillin och 10 000 μg/ml streptomycin), 100 mM NaPyr och 100x NEAA i flaskan med TCM199 + 3 mg/ml BSA + 25 mM HEPES. Sterilfiltrera det slutliga mediet och alikvotera i de 50 ml koniska rören. Förvara mediet vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Värm ett 50 ml koniskt rör av medium per två äggstockar i ett pärlbad som är inställt på 38,5 °C minst 1 timme före bearbetning av äggstockar.
2. Inställning av vävnadshackare
- Se till att vävnadshackaren (se Materialförteckning) är inkopplad och påslagen.
- Ställ in skivtjockleken på 500 μm, bladets kraftkontrollknapp till 20 ° och hastighetskontrollratten till 90 ° enligt tillverkarens specifikationer.
- Sätt i en 60 mm petriskål i plast i platthållaren och sätt in platthållaren på scenen.
- Höj huggarmen så högt det går genom att vrida den manuella manövervredet medurs.
- Använd pincett och placera ett tveeggat rakblad (se materialtabell) på skruven som sätts in i huggarmen. Placera bladlåset över bladet och säkra med brickan och muttern. Låt muttern en fjärdedel gå loss.
- Vrid den manuella manövervredet tills huggarmen knäpper bladet platt på petriskålen. Dra åt muttern resten av vägen med mutterdrivaren.
- Höj huggarmen så högt det går med hjälp av den manuella manöverknappen. Flytta bordsutlösningsknappen hela vägen till vänster tills den skårar på plats.
3. Beredning av äggstockar
- Överför äggstockarna i laboratoriet till varm (38,5 °C) steril PBS + PenStrep.
OBS: Det rekommenderas att bearbeta äggstockarna för follikelisolering så snart det är möjligt efter avlägsnande från djuret. I detta protokoll bearbetades äggstockar inom 6 h efter skörden. Äggstockarna transporterades från slakteriet till laboratoriet i termosar innehållande steril 0,9% saltlösning vid cirka 38,5 °C. - Välj om möjligt små (≤ 4 cm x 3 cm x 3 cm) äggstockar som innehåller små (3-5 mm) antrala folliklar, inga stora (≥8 mm) antrala folliklar och inga framträdande corpus luteum (figur 1). Dessa kriterier rekommenderas för att säkerställa att en minimal mängd icke-follikelskräp, såsom stromaceller och extracellulär matris, ingår i den resulterande fyrkantiga skålen innehållande isolerade folliklar.
OBS: Antrala folliklar kan identifieras som sfäriska, vätskefyllda vesikulära strukturer på ytan av äggstocken. Corpora lutea kan identifieras som röda, orange eller gula styva strukturer som sticker ut från äggstockens yta. - Använd sax för att ta bort överflödig bindväv och fett från äggstockarna.
- Tvätta äggstockarna i 30 s i 70% etanol i en bägare.
- Tvätta äggstockarna 3x i 2 min vardera i bägare med varm (38,5 °C) PBS + PenStrep, med färsk PBS + PenStrep för varje tvätt.
- Förvara äggstockarna i varma (38,5 °C) PBS + PenStrep tills de är klara för bearbetning.
OBS: Avståndet mellan laboratoriet och äggstockskällan kan vara variabelt. Därför är det viktigt att slutföra protokollet i tid för att säkerställa underhåll av follikulär livskraft.
Figur 1: Anatomi hos nötkreatur äggstocken. Den bovina äggstocken består av två huvudregioner inneslutna i ett epitelskikt. Cortex, som består av vävnaden till vänster om den streckade linjen, innehåller äggstocksfolliklar från det ursprungliga stadiet till antralstadiet. Preantrala folliklar är för små för att se med blotta ögat; Antrala folliklar är markerade med asterisker. Medulla, som består av vävnaden till höger om den streckade linjen, innehåller blodkärl, lymfkärl och nerver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
4. Hacka procedur
OBS: Bearbeta endast en äggstock i taget. Bearbeta äggstockarna snabbt för att undvika temperaturminskningar, vilket kan påverka follikelns livskraft.
- Överför en äggstock till skärbrädan på bänkpappret (figur 2A) och förbered vävnadshackaren (figur 2B).
- Skär äggstocken i hälften med pincett och en skalpell och ta bort medulla från varje hälft och lämna endast cortex med en tjocklek av cirka 1 mm som visas i figur 2C.
- Skär äggstocken i hälften i längdriktningen från en ligamentfäste till motsatt fästplats.
- Förvara den ena halvan av äggstocken på skärbrädan som ska bearbetas och placera den andra halvan av äggstocken tillbaka i varm (38,5 °C) PBS + PenStrep.
- Med den exponerade medulla uppåt, skiva längs äggstockens krökning cirka 2 mm från äggstockens yta utan att skära genom cortexen.
- Använd skivan längs äggstockens krökning som en guide för att fördjupa skivan, som fortfarande följer äggstockens krökning för att skilja cortex från medulla.
- Dissekera och kassera eventuell corpora lutea från äggstocken genom att skära längs gränsen till corpus luteum.
- Vänd äggstocken hälften så att epitelet vetter uppåt och använd skalpellen för att avsluta skärningen av medulla bort från cortex. Klipp bort eventuell kvarvarande vit bindväv runt kanten på äggstocksstycket som var anslutet till ligamenten.
- När majoriteten av medulla har tagits bort, använd skalpellen för att skära cortex till cirka 1 mm tjocklek. Manipulera skalpellen med små, fram och tillbaka rörelser för att raka bort resten av medulla.
OBS: Medulla är den inre delen av äggstocken som innehåller stora blodkärl. Cortex är den yttre delen av äggstocken, som ligger direkt under det yttersta ytepitelet. Cortex är ungefär 1 mm tjock i nötkreaturäggstocken, och därmed skär äggstocken till en tjocklek av 1 mm kommer att ta bort medulla.
- Skär cortex i bitar som inte är större än 2,5 cm x 2,5 cm. Håll cortexbitarna i varma (38,5 ° C) PBS + PenStrep tills de är redo att hugga.
- Fyll en bägare med minst 50 ml varm (38,5 °C) PBS + PenStrep och få en plastöverföringspipett.
- Överför en enda bit cortex till petriskålen på vävnadshackaren och blöt vävnaden med tre eller fyra droppar varm (38,5 ° C) PBS + PenStrep.
- Håll vävnadsbiten stadigt med ett par pincett och tryck en gång på återställningsknappen för att starta vävnadshackaren. Stabilisera petriskålen med ena handen medan du fortsätter att stabilisera vävnaden med pincett. Flytta tången åt vänster längs vävnaden efter behov för att undvika att bladet träffar tången. De resulterande remsorna kommer att vara cirka 500 μm långa.
- När hela cortexbiten har skurits i remsor, använd bladhållarknappen för att lyfta bladet från petriskålen och tången för att ta bort eventuell vävnad från bladet.
- Vrid platthållaren 90°.
- Tryck en gång på återställningsknappen. Stabilisera petriskålen med ena handen medan du använder tången för att trycka in vävnadsremsorna i bladets väg.
- För bladet helt genom vävnadsremsorna. Använd knivhållarknappen för att lyfta bladet från petriskålen och tången för att ta bort eventuell vävnad från bladet.
- Använd överföringspipetten och värm (38,5 ° C) PBS + PenStrep för att tvätta den hackade vävnaden (slutlig storlek på vävnad: 500 μm x 500 μm x 1 mm kuber) i ett förvärmt (38,5 ° C) 50 ml koniskt rör. Sätt tillbaka det koniska röret i vattnet eller pärlbadet för att hålla den hackade vävnaden varm (38,5 °C).
- Använd muttern för att ta bort muttern från huggarmen och ta bort brickan och bladlåset. Ta bort bladet från huggarmen med pincett, vänd det så att den oanvända kanten är vänd mot petriskålen och lägg tillbaka den på huggarmen. Sätt tillbaka bladlåset, brickan och muttern och återställ bordsutlösningsknappen enligt beskrivningen i steg 2.5-2.7.
- Upprepa steg 4.5-4.12 för alla återstående bitar av cortex från äggstocken, ersätt blad med nya efter att varje skäregg har använts.
- Kassera alla använda blad i en hårdväggig behållare av vass plast.
5. Homogeniseringsförfarande
- Se till att homogenisatorenheten (se Materialförteckning) är inkopplad och att hastigheten är inställd på den andra stapeln (9 000-11 000 rpm). Sätt i 10 mm generatorsonden i enheten enligt tillverkarens specifikationer.
- Ställ in en timer i 1 min och sätt in sonden i det 50 ml koniska röret som innehåller den hackade cortexvävnaden från en äggstock (steg 4.11) och tillräckligt med PBS + PenStrep för att fylla röret till 25 ml linjen. Djupet till vilket sonden sätts in måste vara 1/3 av vätskans höjd mätt från kammarens botten. Placera sonden något utanför mitten för att minimera virvel.
- Starta timern och slå på homogenisatorn. Se till att sondens botten inte vidrör röret och håll röret stilla medan homogenisatorn är påslagen.
- Efter 1 minuters homogenisering, ta bort sonden från röret. Använd pincett, ta bort eventuell bindväv som täpper till ventilationshålen och utrymmet mellan rotorkniven och rotorröret. Om några bitar av cortex sitter fast i sonden, ta bort dem med pincett och placera dem tillbaka i röret.
- Upprepa steg 5.2-5.4 ytterligare 5x för totalt 6 minuters homogenisering.
- Placera röret med homogeniserad vävnad i vattnet eller pärlbadet för att hålla vävnaden varm (38,5 °C). Efter bearbetning av den sista äggstocken, demontera omedelbart, rengör och torka generatorsonden enligt tillverkarens specifikationer.
6. Filtreringsförfarande
- Häll den dispergerade vävnaden i den ostdukstäckta tratt som sätts in i Erlenmeyerkolven. Skölj innehållet i röret i tratten med varm (38,5 °C) PBS + PenStrep tills inga vävnadsfragment finns kvar i röret.
- Tvinga vävnadsfragmenten att passera genom hålen på duken genom att vrida ostduken runt vävnadsfragmenten och pressa tills allt överskott av vätska och vävnad har tagits bort från ostduken.
- Öppna ostduken igen över tratten, skölj ostduken med PBS + PenStrep med en överföringspipett och pressa igen eventuella kvarvarande vävnadsfragment genom duken.
- Använd en hemostat för att hålla 300 μm cellsil över en 200 ml bägare. Häll filtratet i Erlenmeyerkolven genom cellsilen. Skölj innehållet i kolven i cellsilen med varm (38,5 °C) PBS + PenStrep tills inga vävnadsfragment finns kvar.
- Om cellsilen blir igensatt av vävnad, knacka försiktigt cellsilen mot bägaren för att säkerställa att all vätska har filtrerats in i bägaren och vänd sedan cellsilen upp och ner och knacka ut det stora vävnadsskräpet på bänkpapperet. Sätt tillbaka cellsilen över bägaren och fortsätt hälla filtratet genom den. Upprepa vid behov tills allt filtrat från Erlenmeyerkolven har filtrerats igenom.
- Använd en hemostat för att hålla 40 μm cellsil över en andra 200 ml bägare. Häll filtratet i den första 200 ml bägaren genom cellsilen. Skölj innehållet i bägaren i cellsilen med varm (38,5 °C) PBS + PenStrep tills inga vävnadsfragment finns kvar. Kassera inte innehållet i cellsilen på 40 μm.
- Montera 18 G-nålen på 20 ml-sprutan. Fyll sprutan med FWM. Vänd 40 μm cellsilen upp och ner över en fyrkantig petriskål och använd sprutan för att tvätta ut innehållet i cellsilen i skålen. Fyll på sprutan och skölj cellsilen efter behov tills inga vävnadsfragment finns kvar.
OBS: Vanligtvis är 25 ml FWM tillräckligt för att helt skölja ut innehållet i 40 μm cellsilen.
Bild 2: Arbetsyteinställning för äggstocksbearbetning och protokollarbetsflöde . (A) Bänkinställning för skärning av äggstockar före hackning och för filtrering av äggstockshomogenatet. (B) Vävnadshackare och homogenisator inrättad, med styrofoamstöd för att minska vibrationer i homogenisatorsteget. (C) Schematisk som illustrerar arbetsflödet för bearbetning av en hel äggstock. Äggstockarna trimmas av överflödig bindväv och skärs sedan i hälften, och medulla avlägsnas tills en ~ 1 mm tjock bit cortex kvarstår. Cortex skärs i 2,5 cm x 2,5 cm bitar och hackas i en vävnadshackare inställd på ett skärintervall på 500 μm. Bitarna homogeniseras sedan och homogenatet filtreras genom ostduken följt av filtrering genom 300 μm och 40 μm cellsilar. Innehållet i 40 μm cellsilen sköljs i en fyrkantig petriskål, som söks efter folliklar med hjälp av ett stereomikroskop. Skapad med BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
7. Söka och samla folliklar
- Överför den fyrkantiga petriskålen (steg 6.6) till ett stereoskop med ett uppvärmt steg inställt på 38,5 °C. Stereoskopförstoringen bör ställas in mellan 1,25x och 3,2x beroende på sökarens önskemål.
- Pipettera 10 μL droppar FWM i en 60 mm petriskål och täck dropparna med mineralolja för att förhindra uttorkning. Lägg petriskålen med mediadroppar på en värmeplatta som är inställd på 38,5 °C.
OBS: En 4-brunnsplatta kan användas för att samla folliklar. Tillsätt 500 μL tvättmedia till en eller två brunnar. Placera på värmeplattan inställd på 38,5 °C. - Skaffa en mikropipettkolv och spets.
OBS: Ett glas 1-5 μL mikropipett (se materialtabell) rekommenderas eftersom folliklarna är mindre benägna att fästa vid glaspipetten och gå förlorade när de överförs mellan lösningar. Det är också ett tillräckligt litet instrument för att möjliggöra enklare och mer exakta mikromanipuleringar av folliklarna. - Identifiera folliklar från den fyrkantiga petriskålen och överför till media (FWM) droppar med hjälp av mikropipetten. Många folliklar är sannolikt inbäddade i vävnadsskräp och kan hämtas med en av två metoder som beskrivs nedan.
OBS: Folliklar är avlånga, snarare än perfekta sfärer, och har vanligtvis en äggcell, som presenteras som en solid vit cirkel i mörkare kontraster, mot mitten av follikeln (figur 3A-C). Var noga med att undvika att förvirra folliklar med denuderade oocyter. Oocyter tenderar att vara perfekta sfärer och är omgivna av ett tjockt, klart membran (zona pellucida). Ett inverterat mikroskop med en förstoring på 10x (eller högre) kan användas för närmare undersökning av folliklar (figur 3D).- Separera försiktigt folliklarna från skräp med hjälp av spetsen på mikropipetten eller fina (27 G) nålar.
- Alternativt kan du använda en pasteurpipett i glas med en gummilampa för att ta upp och spruta ut skräpet i skålen flera gånger för att lossa folliklar från skräpet.
- Arbeta snabbt, tar inte längre än 30 minuter, för att söka i petriskålen för att bevara follikelns livskraft.
- Placera högst fem folliklar per 10 μL droppe, eftersom en högre densitet kan öka sannolikheten för att folliklar klibbar ihop.
8. Trypan blå uteslutning viabilitetstest
OBS: Använd locket på en petriskål eller en 4-brunnsplatta för alla följande steg, eftersom folliklarna fastnar mindre på lockets plast än de gör på plasten i själva skålen.
- Förbered PBS + 0,2% polyvinylpyrrolidon (PVP) genom att lösa 100 mg PVP i 50 ml PBS.
OBS: PVP används här för att minska sannolikheten för att folliklar fäster vid skålen. - Använd mikropipetten för att överföra alla folliklar (i genomsnitt 40) från mediedropparna till en 50 μL droppe PBS + 0,2% PVP.
- Tvätta folliklarna 2x genom att överföra dem sekventiellt till färska 50 μL droppar PBS + 0,2% PVP.
- Överför folliklarna till en 285 μL droppe PBS + 0,2% PVP.
- Tillsätt 15 μL trypanblått till 285 μL droppen PBS + 0,2% PVP (slutlig koncentration av 0,05% trypanblå) och blanda försiktigt droppen med en 200 μL pipettspetssats till 100 μL.
OBS: Om du använder 4-brunnsplattan för trypan-viabilitetstestet, tillsätt 475 μL PBS + 0,2% PVP och 25 μL trypanblå till en brunn. - Inkubera folliklarna i 1 min i trypanblå droppe och överför sedan folliklarna till en 50 μL droppe (eller 500 μL brunn) PBS + 0,2% PVP.
- Tvätta folliklarna 3x enligt steg 8.3 med färska 50 μL droppar (eller 500 μL per brunn) PBS + 0,2% PVP.
- Kassera alla folliklar som fortfarande verkar blåa efter tre tvättar i PBS + 0,2% PVP, eftersom dessa inte är livskraftiga. Alla folliklar som inte behåller blå färg efter tre tvättar är livskraftiga och kan användas för immunofluorescens, odling eller andra procedurer (figur 3E). Snäppfrys folliklarna i flytande kväve och förvara vid -80 °C tills vidare användning vid behov.
- Utför RT-qPCR-analys och immunofluorescensfärgning av folliklarna enligt beskrivningen i steg 9 och 10.
Figur 3: Isolerade folliklar och trypanblått uteslutningstest. (A-C) Isolerade folliklar avbildades genom ett stereomikroskop vid flera förstoringar . (A) Isolerade folliklar bland skräp i den ursprungliga sökskålen. Enskilda folliklar är cirklade i rött. Skalstång = 2 000 μm. (B) Isolerade folliklar och skräp i en droppe follikeltvättmedium täckt med mineralolja. Skalstreck = 1 000 μm. (C) Isolerade folliklar utan skräp vid en högre förstoring. Skalstreck = 1 000 μm. (D) Isolerade folliklar avbildade med ett inverterat ljusfältmikroskop. Skalstreck = 100 μm. (E) Representativa bilder av livskraftiga (ostoppade) och icke-livskraftiga (blå fläck) folliklar avbildade med ett inverterat ljusfältmikroskop och ett 20x mål. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
9. RT-qPCR-analys
- Isolera RNA från viabla folliklar (från steg 8.8) med hjälp av ett RNA-isoleringsreagens (se materialförteckning). Rena RNA och behandla med DNase med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt rengöringskit (se Materialförteckning) enligt tillverkarens instruktioner.
- Eluera RNA med 14 μL RNasfritt vatten och kvantifiera med hjälp av en spektrofotometer. RNA kan lagras vid -80 °C tills cDNA-syntes.
- Utför cDNA-syntes från lika stora mängder RNA extraherat från primära och tidiga sekundära folliklar, med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt cDNA-synteskit (se materialtabell) enligt tillverkarens instruktioner. Inkubera reaktionsblandningen i 5 minuter vid 25 °C följt av 60 min vid 42 °C och avsluta sedan reaktionen genom upphettning vid 70 °C i 5 minuter.
- Utför RT-qPCR med syntetiserat cDNA (5 ng per reaktion) och primers (tabell 1) med hjälp av en kommersiellt tillgänglig reaktionsblandning (se materialförteckning). Använd termiska cykelförhållanden: 30 s vid 95 °C för polymerasaktivering, följt av 40 amplifieringscykler, där varje cykel inkluderade 15 s vid 95 °C för denaturering och 30 s vid 60 °C för glödgning/förlängning. Analysera RT-qPCR genom att kvantifiera cykeltröskelvärden (Ct) och / eller visa PCR-produkter med hjälp av agarosgelelektrofores.
OBS: Transkriptuttryck av granulosacellmarkören FSHR och bakteriecellmarkören DAZL utvärderades i denna studie. Referensgener var H2A och ACTB. - Kör en smältkurvanalys genom att höja temperaturen från 65 °C i steg om 0,5 °C var 5:e sekund tills den når 95 °C.
10. Immunofluorescensanalys
- Fixera livskraftiga folliklar (från steg 8.8) i 15 minuter i en droppe på 100 μL 4% (v/v) paraformaldehyd (PFA) vid rumstemperatur (RT), följt av tvättning 3x i 100 μL droppar PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20.
- Blockera folliklarna i 1 h vid RT i en blockerande buffert bestående av 1x PBS + 5% (v / v) normalt åsneserum (NDS). Efter blockering, inkubera folliklarna över natten vid 4 °C i en 100 μL droppe av 4 μg/ml kanin anti-human CX37-antikropp eller 4 μg/ml kaninisotyp IgG (negativ kontroll) utspädd i blockerande buffert.
- Tvätta folliklarna 3x i 100 μL droppar PBS + 0,1% BSA + 0,1% Tween 20 och inkubera dem sedan i 1 h vid RT i mörkret i en 100 μL droppe av 2 μg / ml åsna-anti-kanin AlexaFluor 488 sekundär antikropp utspädd i blockerande buffert.
- Inkubera folliklarna i 5 minuter vid RT i mörker i en 100 μl droppe av 1 μg/ml Hoechst 33342 utspädd i blockerande buffert för att märka DNA.
- Överför folliklarna till en 5 μl droppe monteringsmedia (se materialtabell) på ett glasmikroskopglas och täck med en täckglidning. Låt bilderna härda vid RT över natten, följt av tätning med nagellack. Förvara dem vid 4 °C tills de är av.
- Bild alla bilder inom 48 timmar efter att locket glider. Utför avbildning med hjälp av ett inverterat epifluorescensmikroskop (se materialförteckning) under DAPI (excitation 380 nm och emission 450 nm) och FITC (excitation 470 nm och emission 525 nm) filter.
- Fixa exponeringstiden för båda kanalerna. Justera exponeringstiden för FITC (CX37) baserat på kaninisotypens negativa kontroll. Använd ett 20x mål och DAPI-kanalen inställd på 50 ms exponeringstid för att identifiera kaninisotypmärkta folliklar.
- Avbilda dessa folliklar under FITC-kanalen och minska exponeringstiden tills all bakgrundsgrön signal har avskaffats. Observera denna exponeringstid.
- Bild av alla CX37-antikroppsmärkta folliklar med den exponeringstid som ställts in för isotyp FITC-kanalen och 50 ms exponeringstid för DAPI-kanalen.
- Bearbeta signalintensiteten, mätt med medelgråzon efter tröskel, med hjälp av ett datorbildbehandlingsprogram29 (se Materialförteckning).
- Justera tiff-filen för DAPI-bilden för varje follikel så att hela follikeln beskrivs. Använd funktionen Analysera partiklar i programmet för att välja hela follikeln som en intressant region (ROI).
- Öppna tiff-filen för FITC-bilden för motsvarande follikel och lägg över ROI som genereras från DAPI-bilden ovanpå FITC-bilden. Använd programmets mätfunktion för att kvantifiera det genomsnittliga gråområdet för FITC-bilden, som representerar signalintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Översikt och kritiska steg
Med hjälp av detta protokoll kan små bovina preantrala folliklar isoleras på ett tillförlitligt sätt från enstaka äggstockar i experimentellt relevanta antal. Från totalt 30 replikat erhölls i genomsnitt 41 folliklar per replikat, med ett intervall på 11 till 135 folliklar (figur 4A). I 14 replikat karakteriserades folliklarna för utvecklingsstadium som tidigare beskrivits26 genom att mäta follikeldiametern med hjälp av en 1 μm mikroskopkalibreringsglas under stereomikroskopet. Med hjälp av denna metod klassificerades totalt 476 folliklar som antingen primära (folliklar som mäter 40-79 μm), tidiga sekundära (80-119 μm) eller sekundära (≥120 μm) folliklar (figur 4B). Primordiala folliklar uteslöts på grund av filtreringssteget på 40 μm. Follikelns livskraft utvärderades med hjälp av trypan blue exclusion test som beskrivits tidigare30. Isolerade folliklar inkuberades kort i 1 min i 0,05% (v/v) trypanblå i PBS innehållande 0,2% PVP, följt av tre tvättar med PBS + PVP och undersökning under ett stereoskop. Med hjälp av det beskrivna förfarandet var 100% av isolerade folliklar livskraftiga i alla replikat. Sammantaget tar den mekaniska isoleringsprocessen, från äggstocksuppsamling till omedelbart före sökning i petriskålen, cirka 30-45 minuter. Tiden för att söka och identifiera folliklar tar inte längre än 30 minuter, vilket resulterar i en process som tar totalt 1-1,25 timmar per äggstock.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är att se till att äggstocksvävnaden är ordentligt homogeniserad. Att öka homogeniseringstiden från 5 min till 6 min ledde till en ökning av antalet isolerade folliklar (P < 0,05). I genomsnitt 41 folliklar isolerades per äggstock från 30 försök med en 6 minuters homogenisering, vilket är en nästan trefaldig ökning jämfört med genomsnittet på 13,8 folliklar per äggstock erhållen från 22 försök med en homogeniseringstid på 5 minuter (Figur 5). Ett annat viktigt steg är homogeniseringshastigheten, som måste ligga inom 9 000-11 000 rpm. Högre hastigheter leder till minskade utbyten, förmodligen på grund av överdriven skada och / eller bristning av folliklar. Follikelisolering kan förbättras ytterligare efter filtreringsstegen genom att föra innehållet i sökskålen genom en pasteurpipett i glas med en gummilampa flera gånger. Genom att använda Pasteur-pipetten lossnar folliklar från skräp och fler folliklar kan ses i skålen.
Om folliklarna ska odlas efter isolering är det viktigt att mildra mikrobiell kontaminering. Kontaminering kan förhindras genom att trimma överflödig bindväv och fett från hela äggstocken och sedan utföra en serie tvättsteg. De trimmade äggstockarna ska tvättas kort i 70% etanol för att minska den mikrobiella belastningen, följt av flera tvättar i varm (38,5 ° C) PBS + PenStrep-lösning för att tvätta bort 70% etanol och ytterligare avlägsna eventuella mikroorganismer. Dessa tvättar kan göras utan att kompromissa med follikelns livskraft. För att ytterligare förhindra kontaminering är det möjligt att utföra hela isoleringsprotokollet inuti ett biosäkerhetsskåp eller en ren bänk med steriliserad utrustning.
RNA-isolering och RT-qPCR
Folliklar av samma stadium och från separata isoleringar poolades, och totalt 46 primära och 34 tidiga sekundära folliklar användes för analys av mRNA-uttryck. RNA isolerades från de poolade folliklarna (primära folliklar = 259 ng av totalt RNA och tidiga sekundära folliklar = 91 ng av totalt RNA) och användes för cDNA-syntes. Transkriptuttryck av granulosacellmarkören FSHR19 och bakteriecellmarkören DAZL i folliklarna utvärderades sedan med hjälp av RT-qPCR. Som förväntat uttryckte både primära och tidiga sekundära folliklar FSHR- och DAZL-transkript, vilket bekräftar en tidigare rapport i mänskliga folliklar 31 och visar att FSHR uttrycks i nötkreatur folliklar vid det primära utvecklingsstadiet32 (figur 6A, B).
Immunoflourescerande lokalisering av Connexin 37
Immunofluorescerande lokalisering av proteiner kan utföras i hela folliklar. Här användes denna teknik för att lokalisera gapkorsningsproteinet Connexin 37 (CX37) i isolerade preantrala folliklar i både primärt och tidigt sekundärt stadium. CX37 är avgörande för kommunikationen mellan follikelns oocyt- och granulosaceller och har identifierats i båda celltyperna i alla stadier av follikelutveckling hos nötkreatur i histologiska analyser33. Efter trypanblått uteslutningstest fixerades livskraftiga folliklar i PFA och inkuberades med kaninanti-human CX37-antikropp eller kaninisotyp IgG (negativ kontroll), följt av inkubation med åsnan-anti-kanin AlexaFluor 488 sekundär antikropp. Hoechst 33342 användes för att märka DNA. Folliklarna avbildades med hjälp av ett inverterat epifluorescensmikroskop under DAPI- och FITC-filter, och signalintensiteten kvantifierades. CX37 visade sig lokalisera till ooplasman, även om den var särskilt frånvarande från oocytkärnan, och till membranet i granulosacellerna (figur 7). Dessa resultat överensstämmer med den kända lokaliseringen av CX37 till oocyten och membranet i granulosacellerna33. Immunlokaliseringen av proteiner som är kända för att vara kritiska för cellkommunikation och follikeltillväxt, såsom CX37 (visas här) och FSHR32 är ett viktigt verktyg för att studera utvecklingen av preantrala folliklar, effekter av interventioner på follikeltillväxt, struktur och kvalitet, samt för att bedöma odlingseffektivitet genom att jämföra in vivo-erhållna och in vitro-odlade folliklar.
| Gen | Framåt-sekvens (5'-3') | Omvänd sekvens (5'-3') | Produktens storlek (bp) | ||||
| FSHR | CCC AAC TCG ATG AGC TGA ATC T | KATT AGC TAG GCA GGG AAC GG | 132 | ||||
| DAZL | GCC CAC AAA AGA AAT CTG TGG A | AGERA TAA GCA CTG CCC GAC TT | 156 | ||||
| H2A | GAG GAG CTG AAC AAG CTG TTG | TTG TGG TGG CTC TCA GTC TTC | 104 | ||||
| ACTB | CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT | GGG CAG TGA TCT CTT TCT GC | 178 | ||||
Tabell 1: Lista över primers som används för RT-qPCR.
Figur 4: Antal och utvecklingsstadium för isolerade preantrala folliklar. (A) Totalt antal isolerade preantrala folliklar per replikat med 6 minuters vävnadshomogenisering (n = 30 replikat). Det genomsnittliga antalet folliklar representeras av den röda linjen över staplarna. (B) I 14 replikat registrerades utvecklingsstadiet för de isolerade folliklarna. Cirkeldiagrammet visar fördelningen av utvecklingsstadier som en andel av de totala isolerade folliklarna (n = 476). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Jämförelse av 5- kontra 6-minuters homogenisering. Homogenisering av äggstocksbarken i 6 minuter gav ett större antal preantrala folliklar jämfört med homogenisering med samma hastighet i 5 min (n = 22 replikat i 5 min och 30 replikat i 6 min; P < 0,01). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Omvänd transkription kvantitativ PCR av transkript uttryckta i isolerade preantrala folliklar. Primära och tidiga sekundära preantrala folliklar uttryckte mRNA-transkript för markörer av granulosaceller (FSHR), bakterieceller (DAZL) och referensgener (H2A och ACTB). (A) Agarosgel av PCR-produkter för varje gen med respektive produktstorlek för baspar (bp). (B) Uttrycket av FSHR - och DAZL-transkript kvantifierades i förhållande till uttrycket för referensgenen ACTB. NTC = icke-mallkontroll, CT = cykeltröskel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Immunofluorescerande lokalisering av CX37 i isolerade preantrala folliklar. Representativa bilder av CX37-immunlokalisering i en primär (A) och tidig sekundär (B) bovin preantral follikel. (C) Representativ bild av otypmärkning av negativ kontrollkanin i en tidig sekundär bovin preantral follikel. Vänster panel: DNA-märkning (DAPI). Mellanpanel: primär antikroppskanin anti-human CX37-märkning (FITC). Höger panel: DAPI och FITC slogs samman. Skalstänger = 50 μm. (D) Genomsnittlig CX37-signalintensitet enligt follikelutvecklingsstadium (n = 21 primära och 11 tidiga sekundära folliklar i två replikat). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en reproducerbar metod för att hämta preantrala folliklar i tidigt stadium, särskilt i primära och tidiga sekundära stadier, från bovin äggstock. Detta protokoll bygger på tidigare rapporter 20,25,30,34,35,36 och ger optimeringar som resulterar i isolering av ett meningsfullt antal folliklar från en enskild äggstock. Preantrala folliklar isolerade med denna metod är livskraftiga och kan användas för nedströms applikationer såsom immunlokalisering av proteiner och RNA-extraktion för analys av genuttryck. Odling av de isolerade folliklarna försöktes inte i denna studie. Ansträngningar pågår dock för närvarande för att uppnå framgångsrik långsiktig odling av små bovina preantrala folliklar, vilket kommer att vara en viktig nedströms tillämpning av detta protokoll som kommer att bidra till att förbättra förståelsen av äggstocksfollikulogenes, utföra toxikologiska tester och utforma sätt att framgångsrikt manipulera folliklar för fertilitetsbevarande.
Data från dessa experiment visar att 6 minuters homogenisering är avgörande för korrekt spridning av äggstockskortikal vävnad och follikelfrisättning (figur 4). Ytterligare steg som bidrar till grundlig homogenisering av vävnaden är den initiala dissektion av cortex från medulla som säkerställer korrekt tjocklek på cortex (~ 1 mm), trimning av överskott av bindväv och huggning av cortex i små fragment. Dessa steg förhindrar igensättning av homogenisatorsonden och onödigt skräp i sökplattan. Cellsilporstorlek är viktig för att utesluta skräp och folliklar av oönskad storlek och stadium; När det gäller detta protokoll är det sista steget att samla in innehållet i en 40 μm cellsil för att utesluta primordiala folliklar, som vanligtvis är <40 μm i diameter hos nötkreatur26. Slutligen rekommenderas att använda en Pasteur-pipett för att lossa folliklar från skräp i sökskålen över att försöka manuellt dissekera folliklar ur skräpet, eftersom den senare tekniken kräver mer teknisk skicklighet och, om den görs felaktigt, kan skada folliklarna.
Även om detta protokoll presenterar förbättringar jämfört med befintliga metoder, finns det begränsningar som måste beaktas. För det första, på grund av den heterogena naturen hos äggstocksfollikelpopulationen15 och okänd historia hos de djur från vilka äggstockarna hämtades, var antalet folliklar isolerade efter att ha utfört detta protokoll mycket varierande. En faktor som måste beaktas är djurens ålder, eftersom äggstocksreserven är känd för att minska med37 års ålder.
Isolering av små preantrala folliklar från bovin äggstock ger möjligheter att undersöka grundläggande vetenskapliga frågor på enprovsnivå, ett tillvägagångssätt som tidigare varit svårt att genomföra. Till exempel visade alla preantrala follikelstadier som utvärderades här uttryck av CX37, ett kritiskt protein för oocyt-granulosa-cellkommunikation. På liknande sätt har uttryck av FSH-receptor tidigare visats i individuellt isolerade preantrala folliklar32. Andra specifika markörer för granulosaceller, såsom de steroidogena enzymerna CYP17 och CYP1938, skulle vara relevanta tillägg till gen-/proteinuttryckspanelen för preantrala folliklar och kommer att bli föremål för framtida projekt. Visualiseringen av hela follikelstrukturen via regelbunden eller konfokalmikroskopi är mer omfattande jämfört med histologisk undersökning, där endast ett segment av follikeln kan analyseras åt gången. Detta är särskilt fördelaktigt i studier som kanske vill använda immunfärgning eller in situ-hybridisering , där detaljerad rumslig lokalisering av uttryck krävs. Dessutom kan isolerade preantrala folliklar användas för att undersöka genuttryck med en follikel genom att använda känsliga kit för RT-qPCR30. Förmågan att analysera folliklar individuellt och utan påverkan av äggstocksmiljön är ett kritiskt steg framåt för att förstå komplexiteten hos preantral follikulogenes.
Kryokonservering av äggstocksbarkvävnaden har blivit en lovande teknik för att skydda fertiliteten hos kvinnliga däggdjur39, inklusive kvinnor40. Bevarande och återställande av fertilitet med preantrala folliklar presenterar en attraktiv assisterad reproduktionsteknik samt en lovande metod för att studera follikulogenes41. Efter frysning och upptining kan vävnaden utsättas för detta isoleringsprotokoll för hämtning av livskraftiga preantrala folliklar. Även om den potentiella förmågan hos detta protokoll att hämta folliklar från tidigare kryokonserverad vävnad inte bedömdes specifikt, har andra visat framgång och använt livskraftiga små preantrala folliklar isolerade från fryst tinad vävnad för in vitro-odling 42,43,44,45. Dessutom kan nyisolerade preantrala folliklar vara individuellt kryokonserverade via förglasning och upprätthålla strukturell integritet36.
En uppdatering av detaljer för effektiv isolering av preantrala folliklar från en stor däggdjursart som nötkreatur har saknats i litteraturen. Dessutom behövs en visuell och tydlig guide om hur man isolerar bovina preantrala folliklar, eftersom bristen på reproducerbarhet har varit en flaskhals i fältet. Nyligen beskrev Bus et al.36 isoleringen av bovina preantrala folliklar med hjälp av en mekanisk metod, med ett beräknat genomsnittligt utbyte på 6,1 primära folliklar per äggstock. Den mekaniska isoleringsmetoden som beskrivs här resulterar i isolering av i genomsnitt 41 preantrala folliklar per äggstock, varav majoriteten befinner sig i primärstadiet. Därför är denna teknik särskilt användbar för studier inriktade på primär follikelfysiologi och utveckling. Primära folliklar representerar den första etappen av den växande poolen och är rikliga i äggstocksbarken. Därför är användningen av den beskrivna tekniken, som är optimerad för att skörda detta utvecklingsstadium, ny och kan vara särskilt önskvärd för att dra nytta av äggstocksreserven samtidigt som man undviker den svårare manipulationen av primordiala folliklar. En annan fördel med att isolera primära folliklar skulle vara att associera äggstocksvävnadsodling för den initiala aktiveringen av primordiala folliklar med efterföljande isolering av primära folliklar för vidare odling. Med tanke på intresset för att odla folliklar från det mer rikliga primära stadiet kan metoden som presenteras här stimulera forskare att driva vägar som de tidigare kan ha undvikit på grund av utmaningen att isolera primära folliklar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt finansierades delvis av USDA Multi-state project W4112 och UC Davis Jastro Shields award till SM.
Författarna vill utöka sin uppskattning till Central Valley Meat, Inc. Författarna tackar också Olivia Silvera för hjälp med äggstocksbearbetning och follikelisolering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-3/4" Soda Lime Disposable Glass Pasteur Pipette | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pasteur pipette that can be used to dislodge follicles from debris while searching within the petri dish |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4%; fixation of follicles for immunostaining |
| 20 mL Luer-lock Syringe | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Syringe used with the 18 G needle to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| #21 Sterile Scalpel Blade | Fisher Scientific | 50-365-023 | Used to cut the ovaries and remove the medula |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-547 | Used to filter the filtrate from the 300 μm cell strainer |
| 104 mm Plastic Funnel | Fisher Scientific | 10-348C | Size can vary, but ensure the cheese cloth is cut appropriately and that the ovarian homogenate will not spill over |
| 300 μm Cell Strainer | pluriSelect | 43-50300-03 | Used to filter the filtrate from the cheese cloth |
| 500 mL Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | FB500500 | Funnel and flask used to catch filtrate from the cheese cloth |
| Air-Tite Sterile Needles 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offers enough pressure to dislodge follicles from the 40 μm cell strainer |
| Air-Tite Sterile Needles 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Needles that can be used to manipulate any debris in which follicles are stuck |
| BD Hoechst 33342 Solution | Fisher Scientific | BDB561908 | Fluorescent DNA stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Component of follicle wash media |
| Cheese Cloth | Electron Microscopy Sciences | 71748-00 | First filtering step of the ovarian homogenate meant to remove large tissue debris |
| Classic Double Edge Safety Razor Blades | Wilkinson Sword | N/A | Razor blades that fit the best in the McIlwain Tissue Chopper and do not dull quickly |
| Donkey-Anti-Rabbit Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Secondary antibody for immunostaining |
| Eisco Latex Pipette Bulbs | Fisher Scientific | S29388 | Rubber bulb to use with Pasteur pipettes |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Component of follicle wash media |
| Homogenizer | VWR | 10032-336 | Homogenize the ovarian tissue to release follicles |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software used for analysis of fluorescence-immunolocalization |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Used to cut ovarian tissue small enough for homogenization |
| Microscope - Stereoscope | Olympus | SZX2-ILLT | Dissection microscope used for searching and harvesting follicles from the filtrate |
| Microscope - Inverted | Nikon | Diaphot 300 | Inverted microscope used for high magnification brightfield visualization of isolated follicles |
| Microscope - Inverted | ECHO | Revolve R4 | Inverted microscope used for high magnification brightfield and epifluorescence visualization of isolated follicles |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Oil to cover the drops of follicle wash medium to prevent evaporation during searching |
| Non-essential Amino Acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Component of follicle wash medium |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagent for immunostaining blocking buffer |
| Nunc 4-well Dishes for IVF | Thermo Fisher Scientific | 144444 | 4-well dishes for follicle isolation and washing |
| Penicillin-Streptomycin Solution 100x | Gibco | 15-140-122 | Component of follicle wash medium |
| Petri Dish 60 mm OD x 13.7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Petri dish that fits the best in the McIlwain Tissue Chopper |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Washing buffer for ovaries and follicles |
| Plastic Cutting Board | Fisher Scientific | 09-002-24A | Cutting board of sufficient size to safely cut ovaries |
| Polyvinylpyrrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | Addition of PVP (0.1% w/v) to PBS prevents follicles from sticking to the plate or each other |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting medium for fluorescently labeled cells or tissue |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | RNA column clean-up kit |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Statistical analysis software |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Polyclonal Antibody | Abcam | ab181701 | Cx37 primary antibody for immunostaining |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | cDNA synthesis kit |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Statistical analysis software |
| Sodium Hydroxide Solution (1N/Certified) | Fisher Scientific | SS266-1 | Used to increase media pH to 7.6-7.8 |
| Sodium Pyruvate (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Component of follicle wash medium |
| Square Petri Dish 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Gridded petri dishes allow for more efficient identification of follicles |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix for PCR reaction |
| Steritop Threaded Bottle Top Filter | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Used to sterilize follicle wash medium |
| SYBR-safe DNA gel stain | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Staining to visual PCR products on agarose gel |
| TCM199 with Hank’s Salts | Gibco | 12-350-039 | Component of follicle wash medium |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergent for immunostaining permeabilization buffer |
| Trizol reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | RNA isolation reagent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15-250-061 | Used for testing viability of isolated follicles |
| Tween 20 | Detergent for immunostaining wash buffer | ||
| Warmer Plate Universal | WTA | 20931 | Warm plate to keep follicles at 38.5 °C while searching under the microscope |
| Wiretrol II Calibrated Micropipets | Drummond | 50002-005 | Glass micropipettes to manipulate follicles |
References
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology. 195 (4), 327-336 (1997).
- Jaffe, L. A., Egbert, J. R. Regulation of mammalian oocyte meiosis by intercellular communication within the ovarian follicle. Annual Review of Physiology. 79, 237-260 (2017).
- Driancourt, M. A., Reynaud, K., Cortvrindt, R., Smitz, J. Roles of KIT and KIT LIGAND in ovarian function. Reviews of Reproduction. 5 (3), 143-152 (2000).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproductive Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Aerts, J. M. J., Bols, P. E. J. Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and preantral follicle development. Reproduction in Domestic Animals. 45 (1), 171-179 (2010).
- Sugiura, K., Pendola, F. L., Eppig, J. J. Oocyte control of metabolic cooperativity between oocytes and companion granulosa cells: energy metabolism. Developmental Biology. 279 (1), 20-30 (2005).
- Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biology of Reproduction. 73 (2), 351-357 (2005).
- Sugimura, S., et al. Amphiregulin co-operates with bone morphogenetic protein 15 to increase bovine oocyte developmental competence: effects on gap junction-mediated metabolite supply. Molecular Human Reproduction. 20 (6), 499-513 (2014).
- Edson, M. A., Nagaraja, A. K., Matzuk, M. M. The mammalian ovary from genesis to revelation. Endocrine Reviews. 30 (6), 624-712 (2009).
- Matzuk, M. M., Burns, K. H. Genetics of mammalian reproduction: modeling the end of the germline. Annual Review of Physiology. 74, 503-528 (2012).
- McGee, E. A., Raj, R. S. Regulators of ovarian preantral follicle development. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (3), 179-184 (2015).
- Chen, Y., et al. The factors and pathways regulating the activation of mammalian primordial follicles in vivo. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 575706 (2020).
- Figueiredo, J. R., et al. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology. 40 (4), 789-799 (1993).
- Sirard, M. A. The ovarian follicle of cows as a model for human. Animal Models and Human Reproduction. , 127-144 (2017).
- Parkes, W. S., et al. Hyaluronan and collagen are prominent extracellular matrix components in bovine and porcine ovaries. Genes. 12 (8), 1186 (2021).
- Araújo, V. R., Gastal, M. O., Figueiredo, J. R., Gastal, E. L. In vitro culture of bovine preantral follicles: a review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12 (1), 1-14 (2014).
- Eppig, J. J., Schroeder, A. C. Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro. Biology of Reproduction. 41 (2), 268-276 (1989).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Nuttinck, F., Mermillod, P., Massip, A., Dessy, F. Characterization of in vitro growth of bovine preantral ovarian follicles: A preliminary study. Theriogenology. 39 (4), 811-821 (1993).
- Demeestere, I., et al. Effect of preantral follicle isolation technique on in-vitro follicular growth, oocyte maturation and embryo development in mice. Human Reproduction. 17 (8), 2152-2159 (2002).
- Fattahi, A., et al. Optimization of porcine ovarian follicle isolation methods for better developmental potential. Tissue Engineering Part A. 26 (13-14), 712-719 (2020).
- Nagashima, J. B., Hill, A. M., Songsasen, N. In vitro development of mechanically and enzymatically isolated cat ovarian follicles. Reproduction and Fertility. 2 (1), 35-46 (2021).
- Lucci, C. M., Rumpf, R., Figueiredo, J. R., Báo, S. N. Zebu (Bos indicus) ovarian preantral follicles: Morphological characterization and development of an efficient isolation method. Theriogenology. 57 (5), 1467-1483 (2002).
- Langbeen, A., et al. Characterization of freshly retrieved preantral follicles using a low-invasive, mechanical isolation method extended to different ruminant species. Zygote. 23 (5), 683-694 (2014).
- Candelaria, J. I., Denicol, A. C. Characterization of isolated bovine preantral follicles based on morphology, diameter and cell number. Zygote. 28 (2), 154-159 (2020).
- vanden Hurk, R., et al. Ultrastructure and viability of isolated bovine preantral follicles. Human Reproduction Update. 4 (6), 833-841 (1998).
- Paes, V. M., et al. Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex. Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- de Aguiar, L. H., Hyde, K. A., Pedroza, G. H., Denicol, A. C. Heat stress impairs in vitro development of preantral follicles of cattle. Animal Reproduction Science. 213, 106277 (2020).
- Kristensen, S. G., Ebbesen, P., Andersen, C. Y. Transcriptional profiling of five isolated size-matched stages of human preantral follicles. Molecular and Cellular Endocrinology. 401, 189-201 (2015).
- Candelaria, J. I., Rabaglino, M. B., Denicol, A. C. Ovarian preantral follicles are responsive to FSH as early as the primary stage of development. Journal of Endocrinology. 247 (2), 153-168 (2020).
- Nuttinck, F., et al. Comparative immunohistochemical distribution of Connexin 37 and Connexin 43 throughout folliculogenesis in the bovine ovary. Molecular Reproduction and Development. 57 (1), 60-66 (2000).
- Itoh, T., Hoshi, H. Efficient isolation and long-term viability of bovine small preantral follicles in vitro. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Animal. 36 (4), 235-240 (2000).
- Saha, S., Shimizu, M., Geshi, M., Izaike, Y. In vitro culture of bovine preantral follicles. Animal Reproduction Science. 63 (1-2), 27-39 (2000).
- Bus, A., et al. Preservation of connexin 43 and transzonal projections in isolated bovine pre-antral follicles before and following vitrification. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (2), 479-492 (2021).
- Gougeon, A., Ecochard, R., Thalabard, J. C. Age-related changes of the population of human ovarian follicles: increase in the disappearance rate of non-growing and early-growing follicles in aging women. Biology of Reproduction. 50 (3), 653-663 (1994).
- Xu, D., et al. Raf-ERK1/2 signaling pathways mediate steroid hormone synthesis in bovine ovarian granulosa cells. Reproduction in Domestic Animals. 54 (5), 741-749 (2019).
- Santos, R. R., et al. Cryopreservation of ovarian tissue: an emerging technology for female germline preservation of endangered species and breeds. Animal Reproduction Science. 122 (3-4), 151-163 (2010).
- Leonel, E. C. R., Lucci, C. M., Amorim, C. A. Cryopreservation of human ovarian tissue: a review. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 46 (3), 173-181 (2019).
- Bus, A., Langbeen, A., Martin, B., Leroy, J. I. M. R., Bols, P. E. J. Is the pre-antral ovarian follicle the 'holy grail' for female fertility preservation. Animal Reproduction Science. 207, 119-130 (2019).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. , (2021).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 1-9 (2017).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
