Summary
C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하기 위해 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 환원 분석을 사용하는 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 프로토콜이 본원에 설명되어 있습니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
칸디다 종은 전신 병원 감염의 네 번째로 흔한 원인입니다. 전신 또는 침습성 칸디다증은 종종 이식 된 장치 또는 카테터에 생물막 형성을 수반하며, 이는 독성 및 사망률 증가와 관련이 있습니다. 다른 칸디다 종에 의해 생성 된 생물막은 다양한 항진균제에 대해 향상된 내성을 나타냅니다. 따라서, 칸디다 생물막에 대한 효과적인 면역요법 또는 보조 치료법을 개발할 필요가 있다. 세포 면역의 역할은 항 칸디다 보호에서 잘 확립되어 있지만 체액 면역의 역할은 덜 연구되었습니다.
생물막 형성 및 성숙의 억제는 보호 항체의 주요 기능 중 하나이며, 칸디다 알비칸스 생식관 항체(CAGTA)는 C. 알비칸스의 시험관 내 성장 및 생물막 형성을 조기에 억제하는 것으로 나타났습니다. 이 논문은 C. tropicalis에 의해 형성된 생물막에 대한 항체의 역할을 평가하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 방법론은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 C. tropicalis 생물막을 형성한 다음 항원 특이적 항체의 존재 또는 부재 하에서 배양한 다음 생물막에서 진균 세포의 대사 활성을 측정하기 위한 2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-카르복사닐리드-2H-테트라졸륨(XTT) 분석을 포함합니다.
특이성은 Sap2-특이적 항체-고갈된 혈청을 포함하는 적절한 혈청 대조군을 사용하여 확인하였다. 상기 결과는 면역화된 동물의 혈청에 존재하는 항체가 시험관내에서 칸디다 생물막 성숙을 억제할 수 있음을 입증한다. 요약하면, 이 논문은 침습성 칸디다증 동안 생물막에 대한 새로운 면역 요법 및 시너지 또는 보조 치료법을 개발하는 데 있어 항체의 잠재력에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
전신 칸디다증은 전 세계적으로 높은 이환율 및 사망률과 관련된 병원 감염의 네 번째 주요 원인입니다. 전 세계적으로 전신성 칸디다증은 약 700,000명의 개인에게 영향을 미칩니다1. 칸디다 종, 즉 C. 알비칸스, C. 트로피칼리스, C. 파라프실라증, C. 글라브라타, 및 C. 아우리스는 침습성 칸디다 감염의 가장 흔한 원인입니다2. 칸디다 종은 생물막을 생성하는 기회 주의적 병원체입니다3. 생물막은 주로 칸디다 균병과 관련이 있으며, 칸디다 균은 생물막 형성을 유도하여 산화 및 삼투압 스트레스 조건을 견딜 수 있습니다4. 생물막은 독성 인자 및 세포벽 성분의 발현을 추가로 조절하고 외중합체 보호 매트릭스를 형성하여 칸디다가 다른 숙주 틈새에 적응하도록 돕습니다4. 생물막은 숙주 조직 및 의료 기구에 대한 효모 부착에 기여합니다5. 이와 같이, 생물막 형성은 효모에 대한 이점과 연관되는데, 이는 생물막 내의 효모 세포가 숙주면역 반응을 회피할 수 있기 때문이다6. 생물막 형성은 또한 항진균제의 작용으로부터 병원성 효모를 보호합니다5. 암포테리신 B에 대한 C. 알비칸스 생물막의 감수성 감소는 Pierce et al.7,8에 의해 입증되었습니다. 또한, 생물막은 플루코나졸에 대한 항진균성 약물 내성을 입증하여 전신 칸디다증의 효과적인 관리를 손상시킵니다 9,10.
미생물은 다양한 생물 및 비 생물 적 표면에 부착하는 본질적인 경향을 가지고있어 생물막 형성을 초래합니다. 이형 곰팡이 인 칸 디다 알비 칸스 (Candida albicans)는 효모 및 균사 형태로 존재하며, 그의 생물막 형성은 다양한 시험관 내 및 생체 내 모델 시스템11에서 특성화되었다. 생물막 형성의 단계는 기질에 대한 칸디다 세포의 부착, 필라멘트화, 증식, 및 생물막 성숙(11)을 포함한다. 처음에는 효모 형태의 C. albicans가 의료 기기 및 인체 조직을 포함한 기질에 부착 된 다음 C. albicans의 필라멘트 화 및 균사 형태로 증식하고 마지막으로 세포 외 기질11에 내장 된 생물막이 성숙합니다. 생물막 형성은 C. albicans의 발병 기전 메커니즘에 크게 기여합니다12. 칸디다 종은 약물 내성 생물막을 형성하여 박멸을 어렵게 만듭니다13. C. albicans 생물막 생성 집단의 작은 하위 집합은 항진균제 암포테리신 B 및 클로르헥시딘14에 대해 매우 내성이 있는 것으로 설명되었습니다. 참고로, 생물막의 효모 세포는 플랑크톤 단계 및 증식 단계14의 효모 세포에 비해 다제 요법에 대해 높은 내성을 나타냅니다. 생물막에 존재하는 효모 세포는 항진균제에 대해 매우 내성이 있으며, 이는 생물막에서 C. albicans의 생존에 기여한다고 제안되었습니다14. 이들 기존 세포는 돌연변이14가 아닌 C. albicans의 표현형 변이체인 것으로 보고되었다. 더욱이, "지속성 세포"로 알려진 칸디다 생물막의 세포는 고용량의 암포테리신-B 치료에 내성이 있고 칸디다 생존에 기여하여 고위험 개인에서 재발하는 전신 칸디다 감염의 큰 부담을 초래합니다15.
칸디다 균주에서 항진균제 내성이 증가함에 따라 새로운 항진균제 및 면역 요법에 대한 연구가 필요합니다. 위에서 언급 한 연구에서 분명히 알 수 있듯이 칸디다 생물막은 항진균제에 대한 감수성이 감소한 것으로 나타났습니다. 따라서, 칸디다 생물막 형성을 조절하기 위한 개선된 면역요법이 필요하다. 이전 연구에 따르면 CAGTA는 시험관 내16에서 C. albicans의 생물막 형성을 억제함으로써 전신 칸디다 감염에 대한 효과적인 보호를 제공 할 수 있습니다. 또 다른 연구에서는 C. albicans rAls3-N 단백질로 마우스를 면역화하면 시험관 내17에서 C. albicans 생물막 형성을 방해하는 높은 항체가를 유도한다고 보고했습니다. 항-Als3-N 항체는 또한 생물막으로부터 C. 알비칸스 분산에 억제 효과를 발휘하였다17. C. albicans를 기반으로 한 NDV-3A 백신은 현재 임상 시험 중이며 항 -NDV-3A 혈청도 C. auris 생물막 형성18을 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. 최근 연구에서는 전신 칸디다증의 쥐 모델에서 보호 메커니즘으로 Sap2- 항체에 의한 생물막 형성 억제를 확인했습니다19.
이 논문은 미리 형성된 칸디다 트로피칼리스 생물막에 대한 다양한 그룹의 Sap2 백신 접종 마우스에서 얻은 다클론 혈청에 존재하는 항원 특이적 항체의 효과를 평가하기 위한 자세한 시험관 내 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이를 달성하기 위해 XTT 환원 분석을 기반으로 하는 방법이 실험실에서 최적화 및 개발되었으며, 이는 항체의 유무에 관계없이 빠르고 민감하며 처리량이 높은 방식으로 생물막 생존율을 측정할 수 있습니다.
XTT 분석은 세포 생존력, 세포 증식 및 세포 독성20의 지표로서 세포 대사 활성을 측정하는 데 사용됩니다. 이 비색 분석은 황색 테트라졸륨 염, 나트륨 3'-[1-(페닐아미노카르보닐)-3,4-테트라졸륨]-비스(4-메톡시-6-니트로)벤젠술폰산 수화물(XTT)을 대사 활성 세포에 의한 주황색 포르마잔 염료로 환원시키는 것을 기반으로 합니다. 생존 가능한 세포 만이 XTT를 감소시킬 수 있기 때문에, 감소 된 XTT 포르 마잔의 양은 색의 강도 및 세포 생존력에 비례한다. 형성된 포르마잔 염료는 수용성이며 플레이트 리더를 사용하여 직접 정량됩니다. 수용성 특성으로 인해 XTT 분석은 생물막 구조를 방해하지 않고 손상되지 않은 생물막을 연구하고 생물막 약물 감수성을 검사할 수 있습니다(21). 또한이 방법은 사용 용이성, 속도, 정확성, 높은 처리량 및 높은 재현성 7,22로 인해 칸디다 곰팡이 생존력 평가에서 구현됩니다.
XTT 감소 분석 외에도 생물막 양 측정을 위한 수많은 대체 기술이 확인되었습니다. 이들 중 일부에는 MTT 환원 분석, 크리스탈 바이올렛 염색, DNA 정량화, 정량적 PCR, 단백질 정량화, 건조 세포 중량 측정 및 생존 가능한 콜로니 계수의 사용이 포함됩니다. 이러한 절차는 시간 및 비용 요구 사항 측면에서 매우 다양합니다. Taff 등은 7개의 서로 다른 칸디다 생물막 정량 분석의 비교 분석을 수행했으며 XTT 분석이 C. albicans의 생물막23의 정량적 추정을 위한 가장 재현 가능하고 정확하며 효율적인 방법을 제공한다는 것을 발견했습니다. 크리스탈 바이올렛과 같은 염색 기술에는 특정 제한이 있습니다. 크리스탈 바이올렛 테스트는 크리스탈 바이올렛 염색 생물막 매트릭스 및 세포의 광학 밀도를 측정하여 간접적으로 생물막의 양을 결정합니다. 크리스탈 바이올렛 분석은 생물막 질량의 양호한 측정을 제공하지만, 미생물 세포 및 세포외 매트릭스(24) 모두를 염색하기 때문에 생물막 생존율의 척도를 제공하지 않는다. Dhale 등은 XTT 환원 분석이 크리스탈 바이올렛 분석25와 비교하여 생물막 생성을 검출하는 가장 민감하고 재현 가능하며 정확하고 효율적이며 구체적인 방법이라고 추가로 보고했습니다. 문헌 보고서에 따르면 XTT 분석은 CFU 계수 방법의 CFU/mL 매개변수와 잘 연관되어 있습니다. 그러나 XTT 분석에 비해 CFU 방법은 노동 집약적이며 느립니다26. 더욱이, 분리된 살아있는 세포의 분획은 초기 생물막 집단(27)을 대표하지 않을 수 있다. XTT 감소 분석이 생존력을 정량화하는 데 가장 적합한 옵션으로 보이지만 이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. XTT 방법은 하나의 곰팡이 균주와 관련된 비교에 유용하지만 다른 곰팡이 균주 및 종을 비교할 때 사용이 제한될 수 있습니다. 균주 간 비교는 상세한 표준화가 없을 때 어려울 수 있는데, 이는 상이한 균주가 상이한 능력21을 갖는 기질을 대사하기 때문이다.
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Protocol
BALB/c 마우스는 IIT Roorkee의 Small Animal Facility에 보관되었습니다. 모든 동물은 25°C에서 12h:12h 빛:다크 주기로 유지되었고, 펠릿 식이 및 물 adlibitum이 제공되었다. 모든 동물 절차는 IIT Roorkee의 기관 동물 윤리위원회 (IAEC)의 승인을 받았습니다.
1. C. 트로피칼리스의 제조
알림: 곰팡이 칸디다 트로피칼리스는 위험 그룹 2 병원체에 속하며 BSL2 미생물로 분류됩니다. 칸디다 종으로 작업 할 때는 항상 인증 된 클래스 II 생물 안전 캐비닛을 사용하십시오. C. tropicalis 로 작업하는 동안 무균 및 멸균 기술을 연습하고이 병원체의 적절한 폐기를 위해 권장되는 생물 안전 절차를 따르십시오.
- 줄무늬 C. 트로피칼리스 (ATCC 750 균주)를 사부라우 덱스트로스(SAB) 한천 플레이트 상으로.
- SAB 한천 플레이트의 단일 콜로니를 SAB 배지 10mL가 포함된 멸균 50mL 원뿔형 튜브에 접종하여 C. tropicalis 의 하룻밤 성장 배양물을 준비합니다. 또는 C. tropicalis 의 냉동 글리세롤 스톡을 사용하고 100μL의 글리세롤 스톡을 50mL의 SAB 배지가 포함된 멸균 250mL 원추형 플라스크에 접종합니다.
- C. tropicalis 배양물을 오비탈 셰이커에서 30°C에서 180rpm으로 24-48시간 동안 배양합니다.
- 진균 배양물(대수상의 세포)을 2,150 × g 에서 21°C에서 15분 동안 원심분리한다.
- 상청액을 버리고 50mL의 멸균 1x PBS를 펠릿에 추가합니다. 부드러운 와류로 멸균 된 1x PBS에서 펠릿을 세척하고 재현 탁하십시오.
- 2,150 × g 에서 21°C에서 15분 동안 다시 원심분리한다. 상청액을 버리고 진균 펠릿을 멸균 1x PBS 10mL에 재현탁시킨다.
- 혈구 측정기로 계산하여 세포의 농도를 계산하십시오.
- RPMI 1640 모르폴린프로판술폰산(MOPS) 배지에서 1.0 × 106 cells/mL의 최종 밀도로 진균 스톡을 준비합니다. 단계 1.6의 세포 현탁액을 즉시 사용하십시오.
알림: 하나의 96웰 플레이트를 설정하기 위해 필요한 총 곰팡이 스톡 부피는 10mL(100μL/웰)입니다. 필요에 따라 크기를 조정합니다.
2. C. 트로피칼리스 생물막 형성
- 앞서 설명한 대로 96웰 평평한 바닥 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트에서 칸디다 생물막을 준비합니다(그림 1)28,29.
- 100μL의 C. tropicalis 배양액(10개의6 개 세포/mL 스톡에서 추출, 위와 같이 준비)을 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가합니다(그림 2A). 마지막 두 열(11 및 12)을 곰팡이 세포를 추가하지 않고 '곰팡이 및 혈청 없음' 및 '곰팡이 및 혈청 없음' 음성 대조군으로 유지합니다. 컬럼 11과 12를 100μL의 RPMI 1640 MOPS 배지만으로 채웁니다.
- 마이크로타이터 플레이트를 뚜껑과 알루미늄 호일로 덮습니다. 플레이트를 정지 조건 하에 37°C에서 24시간 동안 배양한다.
- 다음날, 다중 채널 피펫을 사용하여 배지를 조심스럽게 흡인합니다 (생물막을 만지거나 방해하지 않음). 블로팅 시트의 거꾸로 된 위치에서 플레이트를 부드럽게 두드려 잔류 매체를 제거합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 200μL의 1x PBS(웰당)로 플레이트를 세척합니다. 생물막이 파괴되지 않도록 우물의 측벽을 따라 PBS를 매우 부드럽게 첨가하십시오. 다중 채널 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡입합니다. PBS 세척을 2회 반복합니다(총 3회 세척).
- 과도한 PBS를 제거하려면 생물학적 안전 캐비닛 내부의 실온에서 30분 동안 플레이트(뚜껑 제외)를 자연 건조합니다.
3. 항체에 의한 생물막 처리
참고: 이제 항체에 의한 생물막 성숙의 억제를 평가하기 위해 생물막을 처리할 수 있습니다. 뮤린 혈청을 다클론 항체의 공급원으로 사용하였다. 가짜 면역화된 마우스와 함께 Sap2-면역화된 Sap2-면역화된 다른 그룹(Sap2-알비칸스, Sap2-트로피칼리스 및 Sap2-파라프실로증)을 역-궤도로 출혈시키고 혈청을 앞서19에 설명된 바와 같이 분리하였다. 항-Sap2 항체의 존재는 앞서19에 기재된 바와 같이 Sap2-특이적 ELISA를 사용하여 확인하였다.
- 억제 활성에서 보체의 역할을 배제하기 위해 사용하기 전에 30분 동안 56°C에서 혈청(다클론 항체 공급원)의 열 불활성화를 수행합니다. 혈청 희석을 하기 전에 혈청을 열 비활성화합니다.
참고: 가짜 면역화된 마우스, 전면역 마우스 및 Sap2-특이적 항체가 고갈된 혈청의 혈청을 추가 대조군으로 사용하십시오19. 항체-고갈된 혈청은 이전 연구19에 따라 제조되었다. 이 프로토콜에서 시험된 혈청에 대한 연속 희석물(1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1,600, 1:3,200, 1:6,400 및 1:12,800) 중에서, 생물막 성숙의 억제는 1:25, 1:50, 및 1:100에서 관찰되었다; 따라서 억제와 혈청 소비 사이의 균형을 맞추기 위해 1:50을 선택했습니다. - 멸균 RPMI 1640 MOPS 배지(1:50)에서 열 불활성화된 혈청 샘플의 연속 희석을 준비합니다. 생물막 성숙의 억제에 대해 시험될 모든 혈청 샘플에 대해 일반적인 혈청 희석(1:50)을 사용한다(30).
- 선택된 혈청 희석액 100μL를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 각 샘플에 대해 첨부된 레이아웃에 따라 혈청 희석액을 중복으로 추가합니다(그림 2B).
- 열 10에서 혈청 희석액을 추가하지 마십시오. 곰팡이 전용 양성 대조군에 대해 RPMI 1640 MOPS 배지만 추가합니다.
참고: 열 10, G1-G8 및 H1-H8 행은 처음에 RPMI-MOPS에 진균 세포를 가졌습니다. 그러나 RPMI-MOPS는 24시간 후에도 열 10에 추가되었지만 G1-G8행은 PBS 대조군으로, H1-H8행은 24시간 후에도 무혈청 대조군으로 사용되었습니다. - 열 11에서 모든 웰에 1:50 희석된 혈청을 추가하여 무균 플러스 혈청 음성 대조군 역할을 합니다.
- 열 12에서는 혈청 희석액을 우물에 첨가하지 마십시오. 이것을 곰팡이 없음 혈청 음성 대조군으로 유지하십시오.
- 열 10에서 혈청 희석액을 추가하지 마십시오. 곰팡이 전용 양성 대조군에 대해 RPMI 1640 MOPS 배지만 추가합니다.
- 뚜껑과 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오. 플레이트를 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
4. 생물막 대사 활성 추정
- 다음날, 다중 채널 피펫을 사용하여 혈청을 조심스럽게 흡인합니다 (생물막을 만지거나 방해하지 않음). 블로팅 시트의 거꾸로 된 위치에서 플레이트를 부드럽게 두드려 잔류 혈청을 제거합니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 200μL의 1x PBS(웰당)로 플레이트를 세척하고 생물막이 파괴되지 않도록 웰의 측벽을 따라 PBS를 추가합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 흡입하고 PBS 세척을 2회 반복합니다(총 3회 세척). 플레이트(뚜껑 제외)를 실온에서 30분 동안 자연 건조시키고 생물학적 안전 캐비닛 내부에서 과도한 PBS를 건조시킵니다.
- XTT / 메나 디온의 제조 :
- XTT를 멸균 링거 젖산염에 0.5g/L 용액으로 준비합니다. 25mg의 XTT를 필터 멸균된 링거 젖산 50mL에 녹입니다. 알루미늄 호일로 덮인 별도의 튜브에 10mL를 분취하고 -80°C에서 보관합니다.
- 메나디온을 10mM 스톡으로 준비합니다. 8.6mg의 메나디온을 5mL의 아세톤에 녹이고 50μL를 100개의 개별 마이크로튜브에 분배합니다. 분취량을 -80°C에서 보관하십시오.
- XTT 10mL를 취하고 1μL의 메나디온을 추가하여 사용 직전에 XTT/메나디온 용액을 준비하여 1μM 작업 용액을 얻습니다.
- 96웰 마이크로타이터 플레이트의 웰당 XTT/메나디온 용액 100μL를 추가합니다. 뚜껑과 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오. 플레이트를 암실에서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- 각 웰에서 착색된 상청액 80μL를 새로운 96웰 플레이트로 옮깁니다. 490 nm에서 플레이트를 읽습니다.
- 컬럼 10(곰팡이 전용 양성대조군)에서 웰의 흡광도 값의 평균을 계산하고, 이는 수학식 1을 이용하여 각 혈청 시료에 의한 생물막 억제율을 계산하기 위한 기준값으로 작용한다.
생물막 억제율 % = 100 -
× 100 (1)
× 100 (1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
칸디다 트로피칼리스 생물막은 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 성장시키고 도립 현미경을 사용하여 40x에서 이미징했습니다(그림 1A). 생물막을 크리스탈 바이올렛을 사용하여 추가로 염색하고 도립 현미경을 사용하여 40x에서 관찰했습니다 (그림 1B). 주사 전자 현미경은 C. tropicalis 생물막의 대표 이미지를 보여줍니다 (그림 1C). 생물막 억제 분석을 수행하기 위해, 레이아웃에 따라 시간 0에서 칸디다균의10 5 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다(도 2A). 24시간 후, 플레이트를 세척하고, 혈청 샘플을 예비형성된 생물막에 첨가하였다. 파일럿 연구 및 이전에 발표된 보고서 30에 따라 Sap2 면역화 및 가짜 면역화된 마우스의 다른 그룹으로부터 얻은 상이한 혈청 샘플을 비교하기 위해 1:50의 일반적인 혈청 희석을 선택하였다.
레이아웃(그림 2B)에 따라 다른 혈청 샘플을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 추가하고 이중으로 평가했습니다. 그룹당 3마리의 마우스(Sap2-알비칸스 면역화, Sap2-트로피칼리스 면역화, Sap2-파라실로시스 면역화, 가짜 면역화 그룹, 예비면역 마우스, 및 Sap2-고갈된 대조군 샘플)로부터 면역화 후 30일째에 수득한 혈청을 1:50 희석액에서 분석하였다. 플레이트를 혈청의 존재 또는 부재 하에 형성된 C. 트로피칼리스 생물막에 대한 XTT-비색 판독값(OD490 값)을 얻기 위해 ELISA 판독기를 사용하여 490nm 파장에서 판독하였다(표 1). 음성 블랭크는 열 11 및 12의 평균(0.04)을 사용하여 계산하였다. 양성 대조군은 곰팡이 전용 웰의 평균을 계산하여 계산하였다(컬럼 10; 0.8165). 계산 전에, 컬럼 11 및 12에서 대조군 웰의 평균 흡광도 값(0.04)을 실험 웰의 흡광도 측정에서 뺀 값이었다. 따라서, 생물막 양성 대조군(컬럼 10)의 기준값은 0.7765(= 0.8165 - 0.04)로 설정되었다.
그런 다음 실험 웰에 대해 얻은 값(평균 마이너스 블랭크)을 이 양성 대조군(0.7765)으로 나누고 백분율을 100을 곱하여 얻었습니다. 생물막 억제율은 100에서 얻은 값을 더 빼서 계산하였다. 막대 그래프는 표시된 모든 값을 보여줍니다(그림 3). 통상적인 일원 분산 분석에 이어 다중 비교를 위한 Dunnett의 사후 검정을 사용하여 서로 다른 혈청 그룹 간의 통계적 차이를 평가하기 위한 p 값을 계산했습니다. <0.05의 p 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. Sap2-파라실로시스 면역화된 마우스의 혈청은 Sap2-알비칸스(45%) 및 Sap2-트로피칼리스(55%) 면역화된 마우스의 혈청과 비교하여 미리 형성된 C. 트로피칼리스 생물막의 성숙을 65% 방지할 수 있습니다. 일반적으로 Sap2 면역 혈청에 의한 생물막 억제는 각각 가짜 면역 혈청(16%) 및 전면역 혈청(13%)에 의한 것보다 유의하게 높았다. 다른 곳에서 설명한 바와 같이 혈청으로부터 Sap2-특이적 항체를 고갈시키면 생물막 억제능이 10%로 감소하였다. 생물막 억제는 PBS (5 %) 및 무 혈청 대조군 (5 %)을 사용했을 때 무시할 수있는 수준에 가까웠다.
그림 1: 칸디다 트로피칼리스 생물막 이미징. (A) 도립 현미경을 사용하여 RPMI 배지를 제거한 후 96웰 마이크로타이터 플레이트의 바닥에 형성된 칸디다 트로피칼리스 생물막의 시각화. 이미지는 명시야 현미경을 사용하여 캡처되었습니다(얼룩은 사용되지 않음). (B) 크리스탈 바이올렛 염색 후 96웰 마이크로타이터 플레이트의 바닥에 형성된 C. tropicalis 생물막의 시각화. (C) 주사 전자 현미경을 사용하여 유리 슬라이드에 형성된 C. tropicalis 생물막의 시각화. 스케일 바 = 100 μm (A, B), 10 μm (C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 96웰 플레이트 형식의 레이아웃. 웰에 (A) 진균 세포 및 (B) 상이한 마우스 그룹으로부터의 혈청 희석액 (Sap2-알비칸스 면역화, Sap2-트로피칼리스 면역화, Sap2-파라실로시스 면역화 및 가짜 면역화; n = 3) 1:50 희석에서 중복으로 평가. 추가 대조군에는 Sap2 고갈 혈청, 전면역 혈청, PBS 및 무혈청 대조군이 포함되었습니다. 컬럼 10에는 혈청이 첨가되지 않았다(진균 세포 존재, 양성 대조군). 컬럼 11에는 진균 세포가 첨가되지 않았다(혈청 존재). 컬럼 12에는 진균 세포가 첨가되지 않았다(혈청 부재). 약어: PBS = 인산염 완충 식염수; Sap2 = 분비 된 아스 파르 틸 프로테이 나제 2. 용어 m1, m2 및 m3은 각 그룹의 다른 마우스를 나타냅니다 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미리 형성된 C. 트로피칼리스 생물막에 대한 Sap2 특이적 다클론 항체의 효과를 보여주는 그래프. 면역 혈청의 공급원은 x 축에 표시되고 C. tropicalis 생물막 성숙의 억제 비율은 y 축에 표시됩니다. 막대는 SEM± 평균을 나타냅니다(n=3). 일반 일원 분산 분석에 이어 다중 비교에 대한 Dunnett의 사후 검정을 사용하여 p 값을 계산했습니다. 막대 및 기호는 Sap2-면역화된 마우스 그룹과 가짜 면역화된 마우스 사이의 차이를 나타낸다. , p < 0.0001. 약어: PBS = 인산염 완충 식염수; Sap2 = 분비 된 아스 파르 틸 프로테이 나제 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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| A | 0.475 | 0.4141 | 0.0441 | 0.4637 | 0.485 | 0.0484 | 0.5179 | 0.4068 | 0.0442 | 0.8826 | 0.0452 | 0.0404 |
| B | 0.3848 | 0.3773 | 0.0428 | 0.369 | 0.3781 | 0.0465 | 0.4105 | 0.3773 | 0.0447 | 0.8428 | 0.0426 | 0.041 |
| C | 0.2754 | 0.2728 | 0.0427 | 0.305 | 0.3083 | 0.0415 | 0.3531 | 0.3213 | 0.0432 | 0.9661 | 0.0444 | 0.0453 |
| D | 0.6965 | 0.7185 | 0.043 | 0.6681 | 0.6711 | 0.0403 | 0.6346 | 0.728 | 0.0433 | 0.8643 | 0.0384 | 0.0358 |
| E | 0.7031 | 0.7117 | 0.0481 | 0.7806 | 0.688 | 0.0521 | 0.7095 | 0.6998 | 0.0525 | 0.7883 | 0.0491 | 0.0416 |
| F | 0.7588 | 0.7441 | 0.0456 | 0.7173 | 0.7233 | 0.0437 | 0.7733 | 0.6808 | 0.0462 | 0.7256 | 0.0468 | 0.0354 |
| G | 0.7681 | 0.7708 | 0.0435 | 0.7949 | 0.7496 | 0.0445 | 0.7695 | 0.7898 | 0.0451 | 0.7335 | 0.0429 | 0.0371 |
| H | 0.7652 | 0.7855 | 0.0469 | 0.7818 | 0.7766 | 0.0428 | 0.7592 | 0.7765 | 0.0445 | 0.7295 | 0.044 | 0.0341 |
표 1: 96웰 마이크로타이터 플레이트에 대한 490nm에서의 흡광도 판독값. 흡광도 판독값을 얻기 위해 표준 플레이트 리더(Tecan)를 사용했으며 판독값은 그림 2에 설명된 레이아웃과 일치했습니다. 후속 계산은 이러한 데이터를 사용하여 수행되었습니다.
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Discussion
칸디다 종에 의한 곰팡이 감염은 전 세계적으로 높은 이환율 및 사망률과 관련이 있습니다. 침습성 곰팡이 감염의 위협이 증가함에 따라 생명을 위협하는 질병의 조기 관리가 필요합니다. 대부분의 칸디다 감염은 다양한 의료 기기에 부착되고 병원 환경에서 곰팡이 감염의 지속과 재발을 담당하는 생물막의 형성을 포함합니다31. 생물막은 효모 또는 균사 세포로 구성되며, 이들은 대부분의 종래의 항진균제에 대해 상당한 내성을 나타낸다32. 칸디다 생물막에 의한 항진균 내성은 항진균 침투 감소, 세포외 기질의 존재, 약물-유출 펌프의 과발현, 변경된 세포막 스테롤 조성, 느린 성장 및 공간적 이질성, 다양한 신호 경로의 활성화, 및 약물 내성 지속성 세포의 존재를 포함하는 여러 메커니즘에 기인합니다33,34. 칸디다 유착 및 생물막 형성의 억제는 칸디다 감염을 예방하는 가장 중요한 전략입니다.
세포 생존율 분석, 마이크로타이터 플레이트 분석 및 건조 중량 측정 분석과 같은 다양한 시험관내 분석이 생물막23의 특정 시점 평가에 기초하는 칸디다 생물막 형성을 연구하기 위해 활용되었습니다. 마이크로유체 장치-기반 분석과 같은 보다 진보된 분석이 개발되었으며, 이는 실시간 생물막 형성(35)을 평가하는데 활용될 수 있다. 지금까지 생물막 형성은 시험관 내 분석을 사용하여 연구되었지만 생체 내 조건 하에서 생물막 형성의 동적 과정을 이해할 필요가 있습니다36,37. 현재 대부분의 생물막 억제 연구는 C. albicans에 적용되며 비 알비 칸다 균 생물막의 박멸에 대한 연구는 거의 없습니다. 칸디다 감염의 스펙트럼은 지난 수십 년 동안 점진적으로 변화했으며 신흥 비 알비 칸다 종은 전 세계적으로 이환율과 사망률에 높은 부담을 안겨줍니다. 따라서, 생물막 형성을 제어하기 위한 새로운 전략의 개발 및 비알비칸스 칸디다 종에 초점을 맞춘 생물막 억제 분석의 개발이 시급히 요구되고 있다. 면역 요법, 특히 항체는 생물막 형성을 억제 할 수있는 큰 잠재력을 가지며 전신 칸디다 감염을 치료하는 데 사용될 수 있습니다38. 몇몇 보고는 생물막 형성의 초기 단계에서 생물막 억제에서 항체의 역할을 입증했습니다. 토끼에서 보체 수용체 3 관련 단백질 (CR3-RP, 진균 부착에 잠재적 인 역할을 가짐) 면역화에 반응하여 생성 된 폴리 클로 날 항체가 협측 상피 세포에서 C. albicans의 순응도 및 생물막 형성을 감소시키는 것으로보고되었다39. 또한, 카테터 분리물을 포함하는 칸디다 균주를 다클론 항-CR3-RP 항체 및 단클론 항체 OKM1과 함께 사전 배양하여 부착 및 생물막 형성을 감소시켰다. C. albicans의 세포 생존율은 부착 단계 및 생물막 형성 단계40 동안 XTT 분석을 사용하여 평가되었습니다. 비 알비 칸다 종 생물막 형성에 대한 항체의 역할을 평가 한 연구는 거의 없습니다. Chupacova 외. XTT 분석을 사용하여 C. dubliniensis와 함께 C. albicans에 대한 폴리 클로날 항 -CR3-RP 항체의 효과를 평가했습니다. 다클론 항 -CR3-RP 항체는 C. albicans와 C. dubliniensis41 모두의 부착 및 생물막 형성을 억제했다.
이 연구에서는 생물막 성숙 및 발달에 대한 항체의 효과를 평가하기 위한 간단하고 신속하며 사용자 친화적인 프로토콜이 설명됩니다. 이 96웰 마이크로타이터 플레이트 기반 XTT 감소 분석은 생물막에서 생존 가능한 세포의 대사 활성을 측정하며 이전 연구 7,8에서 채택되었습니다. 본원에 기재된 XTT 분석은 생존가능한 생물막 성장을 추정하기 위해 광범위하게 사용된다. 빠르고 편리하며 96웰 플레이트와 같은 고처리량 형식으로 사용할 수 있기 때문에 일반적으로 사용되는 세포 생존율 테스트가 되었습니다. 또한, 효모 및 균사 형태의 칸디다 생물막을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 의료 기기 (예 : 카테터) 및 콘택트 렌즈와 같은 다양한 기질에서 칸디다 생물막의 측정에 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계 중 일부는 진균 응집을 피하기 위해 모든 단계에서 피펫팅하기 전에 세포 현탁액을 격렬하게 소용돌이치는 것을포함합니다7. 불량한 생물막은 세포 밀도가 너무 높거나 낮을 때 발생할 수 있습니다. 따라서 사용자는 초기 접종 물7에서 이상적인 곰팡이 세포 밀도를 따라야합니다. 세척 단계는 매우 중요하며 생물막(22)의 파괴를 방지하기 위해 과도한 세포 세척을 피해야 합니다. 생물막의 바닥층은 세척 과정에서 방해받지 않아야합니다. 분석은 항상 어두운 조건에서 수행되어야하며 다중 반복 실험22를 포함해야합니다. XTT의 신선한 용액은 매번 사용 직전에 준비해야합니다. 두 반응 사이의 시간 차이가 결과를 왜곡시킬 수 있기 때문에, 사용자는 XTT 용액을 96-웰 플레이트(42)의 첫 번째 및 마지막 웰에 추가할 때 최소 시간 차이를 보장하기 위해 빠르게 작업해야 한다. 증발을 방지하기 위해 호일 또는 파라 필름을 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 여러 문제 해결 단계를 수행할 수 있습니다. 생물막 성장이 없거나 만족스럽지 않은 경우 적절한 파종 접종 희석 및 계산을 사용해야합니다. 더 나은 생물막 형성을 위해 계대 배양 조건을 변경할 수 있으며 다른 표면 재료를 사용하여 생물막 성장을 시도 할 수 있습니다. XTT 분석의 민감도를 크게 향상시키기 위해 생물막 형성에 필요한 시간을 줄이거나, 항진균제의 농도를 높이거나, 분석의 잠복기를 단축할 수 있습니다7. 생물막의 파괴를 피하기 위해, 과도한 세포 세척은 피해야 한다(22). 분석 제제가 빛에 노출되는 것을 방지하기 위해 외부 웰을 피하거나 외부 웰에 액체를 추가하여 약제가 내부 웰에서 증발하는 것을 방지할 수 있습니다. 세척 중에 생물막이 파괴되는 경우 부드럽게 세척해야합니다22. 이 프로토콜은 생물막 성숙의 억제를 평가하기 위해 24시간 미리 형성된 생물막에 대한 혈청의 효과를 테스트하는 반면, 사용자는 이전 보고서30에 따라 생물막 형성 억제를 평가하기 위해 시간 0에 혈청을 추가하도록 이 프로토콜을 수정할 수도 있습니다.
생물막 성장을 정량화하기 위한 다른 대체 방법과 비교할 때 XTT 방법은 가장 민감하고 재현 가능하며 정확하고 비용 효율적이며 구체적인 방법입니다. XTT 분석은 생물막을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 빠르고 쉬운 기술이지만 특정 제한 사항이 있습니다. 단일 종으로부터의 생물막에서 다양한 제제의 투여량 또는 효과를 결정하는데 유용하지만, 분리물들 사이의 대사 가변성으로 인해 다수의 분리물을 동시에 비교하는 것은 주의해서 사용되어야 한다(21). 균주 간 생물막 비교를 위해서는 상세한 기술 표준화가 수행되어야한다21. 더욱이, XTT 포르마잔 생성물이 용액에 쉽게 용해되는 반면, 일부 균주는 세포(21) 내에 일정량을 보유할 수 있다. 배지 선택, 생물막 발달 시간 및 혈청의 특성과 같은 변수와 관련된 명확성이 부족하기 때문에 XTT 분석 외에도 생물막 두께/바이오매스 측정(크리스탈 바이올렛 사용) 또는 세포 생존율(CFU 방법 사용)43과 같은 확인 생물학적 분석을 수행하는 것이 좋습니다. 참고로, 이 XTT 분석의 결과는 크리스탈 바이올렛 분석 및 CFU 방법과 잘 상관관계가 있습니다(데이터는 표시되지 않음). 상기 언급된 제한에도 불구하고, 이 방법은 상이한 그룹의 혈청 샘플 (폴리클로날 항체의 공급원), 모노클로날 항체, 또는 보조 면역요법을 평가하기 위해 외삽될 수 있다. 여기에 제시된 XTT 감소 프로토콜은 C. tropicalis 생물막에 대한 항체의 효과만을 보여주지만, 연구자들에 의해 C. auris 생물막에 대한 항체의 효과를 연구하는 데 사용되었습니다18. 또한이 프로토콜은 C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis 및 C. auris와 같은 다른 칸디다 종에 대해 수행 된 이전 연구에서 파생되며,이 프로토콜을 Candida 16,41,44,45,46,47 속으로 확장 할 수 있습니다.
생물막 정량화 분석의 최적화, 표준화 및 정기적인 개선은 정확도, 처리량 및 재현성을 향상시킬 수 있습니다. 이 프로토콜의 기반이 되는 XTT 감소 분석은 생물막의 대사 활성 및 생존력 평가에 널리 사용되었습니다. 칸디다 생물막은 종종 항진균제에 내성이 있기 때문에 신약 및 새로운 조합의 탐색이 시급합니다33. 생물막 관련 감염의 문제를 해결하기 위해, 생물막 스크리닝 분석법(48)을 사용하여 더 많은 항생물막 화합물을 탐색해야 한다. 이 시험관 내 프로토콜은 생물막에서 칸디다 종 세포의 대사 활성에 대한 잠재적 인 새로운 항진균 화합물의 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 항체 기반 면역 요법과 관련된 XTT 감소 분석의 표준화 및 개선을 기반으로 한 향후 연구는 효과적인 질병 관리 및 제어를 위한 개선된 치료제 개발에 도움이 될 수 있습니다.
Sap2-특이적 항체에 의한 생물막 억제는 C. tropicalis19에 의해 유발된 쥐 전신 칸디다증 동안 Sap2-백신 매개 보호에서 항체-매개 보호 메커니즘으로서 보고되었다. 이전 연구에서는 잠재적으로 Sap 항원을 인식하는 CAGTA가 시험관 내16에서 C. albicans의 성장과 생물막 형성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 또 다른 연구에서, Sap2-결실된 돌연변이체는 펩스타틴 A49의 존재하에 생물막 성장 결함을 나타내었다. 추가적으로, 생물막 형성 동안, Sap2 항원은 Cek1 미토겐-활성화 단백질 키나아제 신호전달 경로50을 통해 매개된 뮤신 Msb2의 단백질 분해 처리에 역할을 하였다. 따라서, Msb2 처리는 생물막 완전성에 영향을 미치는 항체-매개 Sap2 중화에 의해 억제되는 것으로 추측될 수 있다. 요약하면, 이 기사는 C. tropicalis 생물막 성숙 및 발달에서 혈청 항체의 역할을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제공하며, 이는 다양한 곰팡이 균주 또는 항체 공급원을 사용하여 다양한 환경에서 생물막 대사 활성을 측정하는 데 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Ramalingaswami 보조금 DBT-843-BIO (인도 정부 생명 공학부) 및 조기 경력 연구 상 SER-1058-BIO (인도 정부 과학 및 공학 연구위원회)의 지원을 받았습니다. 저자는 PC에 대한 ICMR-JRF 보조금과 PS에 대한 DBT-JRF 보조금을 인정합니다. 저자는 SEM 기간 동안 Pradeep Singh Thakur 씨의 원고 및 기술 지원에 대한 제안에 대해 Ravikant Ranjan 박사에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS | - | Prepared in lab | NaCl : 4 g KCl : 0.1 g Na2HPO4: 0.72 g KH2PO4 : 0.12 g Water 500 mL. Adjust pH to 7.4 |
| 50 mL conical centrifuge tubes | BD Falcon | 546041 | |
| 96-well microtiter plates | Nunc | 442404 | |
| Incubator | Generic | ||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate Reader | Generic | ||
| Multichannel pipette and tips | Generic | ||
| Petri dishes | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactate | - | Prepared in lab | sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Broth | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
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