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Immunology and Infection

Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf Candida tropicalis-Biofilme

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64425
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee
* These authors contributed equally

Summary

Ein 96-Well-Mikrotiterplatten-basiertes Protokoll unter Verwendung eines 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Reduktionstests wird hierin beschrieben, um die Auswirkungen von Antikörpern auf Biofilme zu untersuchen, die von C. tropicalis gebildet werden. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Abstract

Candida-Arten sind die vierthäufigste Ursache für systemische nosokomiale Infektionen. Die systemische oder invasive Candidiasis beinhaltet häufig die Bildung von Biofilmen auf implantierten Geräten oder Kathetern, was mit einer erhöhten Virulenz und Mortalität einhergeht. Biofilme, die von verschiedenen Candida-Arten produziert werden, zeigen eine erhöhte Resistenz gegen verschiedene Antimykotika. Daher besteht die Notwendigkeit, wirksame Immuntherapien oder Zusatzbehandlungen gegen Candida-Biofilme zu entwickeln. Während die Rolle der zellulären Immunität im Anti-Candida-Schutz gut etabliert ist, wurde die Rolle der humoralen Immunität weniger untersucht.

Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Hemmung der Biofilmbildung und -reifung eine der Hauptfunktionen schützender Antikörper ist, und Candida albicans Keimrohrantikörper (CAGTA) haben gezeigt, dass sie das In-vitro-Wachstum und die Biofilmbildung von C. albicans früher unterdrücken. Dieser Artikel skizziert ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der Rolle von Antikörpern auf Biofilmen, die von C. tropicalis gebildet werden. Die Methodik für dieses Protokoll beinhaltet die C. tropicalis-Biofilmbildung in 96-Well-Mikrotiterplatten, die dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen-spezifischen Antikörpern inkubiert wurden, gefolgt von einem 2,3-Bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-carboxanilid-2H-tetrazolium (XTT)-Assay zur Messung der metabolischen Aktivität von Pilzzellen im Biofilm.

Die Spezifität wurde durch geeignete Serumkontrollen, einschließlich Sap2-spezifischem Antikörper-depleted Serum, bestätigt. Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die im Serum immunisierter Tiere vorhanden sind, die Candida-Biofilmreifung in vitro hemmen können. Zusammenfassend liefert dieser Artikel wichtige Erkenntnisse über das Potenzial von Antikörpern bei der Entwicklung neuartiger Immuntherapien und synergistischer oder ergänzender Behandlungen gegen Biofilme während der invasiven Candidiasis. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen.

Introduction

Die systemische Candidiasis ist die vierte Hauptursache für nosokomiale Infektionen, die weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten einhergehen. Weltweit betrifft die systemische Candidiasis etwa 700.000 Personen1. Candida-Arten, nämlich C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata und C. auris, sind die häufigste Ursache für invasive Candida-Infektionen 2. Candida-Arten sind opportunistische Krankheitserreger, die Biofilme produzieren3. Biofilme sind überwiegend mit Candida-Virulenz assoziiert, und Candida kann oxidativen und osmotischen Stressbedingungen standhalten, indem es die Biofilmbildung induziert4. Biofilme modulieren die Expression von Virulenzfaktoren und Zellwandkomponenten weiter und bilden eine exopolymere Schutzmatrix, die Candida hilft, sich an verschiedene Wirtsnischen anzupassen4. Biofilme tragen zur Hefehaftung auf Wirtsgewebe und medizinischen Instrumenten bei5. Daher ist die Biofilmbildung mit einem Vorteil für Hefen verbunden, da Hefezellen innerhalb der Biofilme der Immunantwort des Wirts ausweichen können6. Die Biofilmbildung schützt auch die pathogenen Hefen vor der Wirkung von Antimykotika5. Eine verminderte Empfindlichkeit von C. albicans-Biofilmen gegenüber Amphotericin B wurde von Pierce et al.7,8 nachgewiesen. Darüber hinaus zeigen Biofilme eine antimykotische Arzneimittelresistenz gegen Fluconazol, was die effektive Behandlung der systemischen Candidiasis beeinträchtigt 9,10.

Mikroben haben eine intrinsische Tendenz, an verschiedenen biotischen und abiotischen Oberflächen zu haften, was zur Biofilmbildung führt. Candida albicans, ein dimorpher Pilz, existiert in Hefe- und Hyphenformen, und seine Biofilmbildung wurde in verschiedenen in vitro und in vivo Modellsystemen charakterisiert11. Die Schritte der Biofilmbildung umfassen die Adhäsion von Candida-Zellen am Substrat, die Filamentierung, die Proliferation und die Biofilmreifung11. Zunächst haftet die Hefeform von C. albicans an Substraten, einschließlich medizinischer Geräte und menschlichem Gewebe, gefolgt von der Filamentierung und Proliferation von C. albicans in Hyphen- und Pseudohyphalformen und schließlich der Reifung von Biofilmen, die in die extrazelluläre Matrix11 eingebettet sind. Die Biofilmbildung trägt wesentlich zu den Pathogenesemechanismen von C. albicans bei12. Candida-Arten bilden arzneimittelresistente Biofilme, was ihre Ausrottung schwierig macht13. Eine kleine Untergruppe der C. albicans-Biofilm-produzierenden Population wurde als sehr resistent gegen die Antimykotika Amphotericin B und Chlorhexidin14 beschrieben. Bemerkenswert ist, dass Hefezellen in Biofilmen im Vergleich zu Hefezellen in der Planktonphase und Proliferationsphase14 eine hohe Resistenz gegen Multidrug-Therapie aufweisen. Es wurde vorgeschlagen, dass Hefezellen, die in Biofilmen vorhanden sind, sehr tolerant gegenüber Antimykotika sind, was zum Überleben von C. albicans in Biofilmen beiträgt14. Es wurde berichtet, dass diese vorhandenen Zellen phänotypische Varianten von C. albicans und keine Mutanten sind14. Darüber hinaus sind Zellen von Candida-Biofilmen, die als "Persister-Zellen" bekannt sind, tolerant gegenüber hohen Dosen der Amphotericin-B-Behandlung und tragen zum Überleben von Candida bei, wodurch eine große Belastung durch wiederkehrende systemische Candida-Infektionen bei Hochrisikopersonen darstellt15.

Die Zunahme der antimykotischen Arzneimittelresistenz bei Candida-Stämmen erfordert die Erforschung neuer Antimykotika und Immuntherapien. Wie aus den oben genannten Studien hervorgeht, zeigen Candida-Biofilme eine verminderte Anfälligkeit für Antimykotika. Daher besteht ein Bedarf an verbesserten Immuntherapien, um die Bildung von Candida-Biofilmen zu kontrollieren. Frühere Studien haben gezeigt, dass CAGTA einen wirksamen Schutz vor systemischen Candida-Infektionen bieten kann, indem es die Biofilmbildung von C. albicans in vitrohemmt 16. Eine andere Studie berichtete, dass die Immunisierung von Mäusen mit C. albicans rAls3-N-Protein hohe Antikörpertiter induziert, die die Biofilmbildung von C. albicans in vitro17 stören. Anti-Als3-N-Antikörper übten auch eine hemmende Wirkung auf die Ausbreitung von C. albicans aus Biofilmenaus 17. Der NDV-3A-Impfstoff auf Basis von C. albicans befindet sich derzeit in der klinischen Prüfung und es wurde auch festgestellt, dass Anti-NDV-3A-Seren die Biofilmbildung von C. auris reduzieren18. Eine kürzlich durchgeführte Studie identifizierte die Hemmung der Biofilmbildung durch Sap2-Antikörper als Schutzmechanismus in einem murinen Modell der systemischen Candidiasis19.

Dieser Artikel skizziert ein detailliertes In-vitro-Protokoll zur Bewertung der Wirkung von antigenspezifischen Antikörpern, die in polyklonalem Serum aus verschiedenen Gruppen von Sap2-geimpften Mäusen auf vorgeformten Candida tropicalis-Biofilmen vorhanden sind. Um dies zu erreichen, wurde eine auf einem XTT-Reduktionsassay basierende Methode optimiert und im Labor entwickelt, die die Biofilmlebensfähigkeit schnell, empfindlich und mit hohem Durchsatz in Gegenwart oder Abwesenheit von Antikörpern messen kann.

Der XTT-Assay wird verwendet, um die zelluläre Stoffwechselaktivität als Indikator für Zelllebensfähigkeit, Zellproliferation und Zytotoxizität zu messen20. Dieser kolorimetrische Assay basiert auf der Reduktion eines gelben Tetrazoliumsalzes, Natrium 3'-[1-(phenylaminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzolsulfonsäurehydrat (XTT) zu einem orangefarbenen Formazanfarbstoff durch metabolisch aktive Zellen. Da nur lebensfähige Zellen XTT reduzieren können, ist die Menge an reduziertem XTT-Formazan proportional zur Intensität der Farbe und Zelllebensfähigkeit. Der gebildete Formazan-Farbstoff ist wasserlöslich und wird direkt mit einem Plattenleser quantifiziert. Aufgrund seiner wasserlöslichen Natur ermöglicht der XTT-Assay die Untersuchung intakter Biofilme sowie die Untersuchung der Empfindlichkeit von Biofilmarzneimitteln ohne Störung der Biofilmstruktur21. Darüber hinaus wird diese Methode aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Geschwindigkeit, Genauigkeit, ihres hohen Durchsatzes und ihres hohen Reproduzierbarkeitsgrades in Candida-Pilzlebensfähigkeitsbewertungen implementiert 7,22.

Neben dem XTT-Reduktionstest wurden auch zahlreiche alternative Techniken zur Messung der Biofilmmenge identifiziert. Einige davon umfassen die Verwendung des MTT-Reduktionsassays, die Kristallviolettfärbung, die DNA-Quantifizierung, die quantitative PCR, die Proteinquantifizierung, die Messung des Trockenzellgewichts und die Zählung lebensfähiger Kolonien. Diese Verfahren unterscheiden sich stark in Bezug auf ihren Zeit- und Kostenaufwand. Taff et al. führten eine vergleichende Analyse von sieben verschiedenen Candida-Biofilm-Quantifizierungsassays durch und stellten fest, dass der XTT-Assay die reproduzierbarste, genaueste und effizienteste Methode für die quantitative Schätzung von C. albicans-Biofilmen darstellte23. Färbetechniken wie Kristallviolett haben bestimmte Einschränkungen; Der Kristallvioletttest bestimmt indirekt die Menge an Biofilm, indem er die optische Dichte der kristallviolett gefärbten Biofilmmatrix und -zellen misst. Obwohl der kristallviolette Assay ein gutes Maß für die Biofilmmasse liefert, gibt er kein Maß für die Biofilmlebensfähigkeit, da er sowohl mikrobielle Zellen als auch die extrazelluläre Matrix färbt24. Dhale et al. berichteten weiter, dass der XTT-Reduktionstest die empfindlichste, reproduzierbarste, genaueste, effizienteste und spezifischste Methode zum Nachweis der Biofilmproduktion im Vergleich zum kristallvioletten Assay25 war. Literaturberichte haben gezeigt, dass der XTT-Assay gut mit dem CFU/mL-Parameter in der CFU-Zählmethode korreliert. Im Vergleich zum XTT-Assay ist die CFU-Methode jedoch arbeitsintensiv und langsam26. Darüber hinaus ist der Anteil abgelöster lebender Zellen möglicherweise nicht repräsentativ für die ursprüngliche Biofilmpopulation27. Obwohl der XTT-Reduktionstest die beste verfügbare Option zur Quantifizierung der Lebensfähigkeit zu sein scheint, gibt es einige Einschränkungen dieser Technik. Während die XTT-Methode für Vergleiche mit einem Pilzstamm nützlich ist, kann ihre Verwendung beim Vergleich verschiedener Pilzstämme und -arten begrenzt sein. Vergleiche zwischen Stämmen können ohne detaillierte Standardisierung schwierig sein, da verschiedene Stämme Substrate mit unterschiedlichen Fähigkeiten metabolisieren21.

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Protocol

BALB/c-Mäuse wurden in der Kleintiereinrichtung des IIT Roorkee untergebracht. Alle Tiere wurden in einem 12 h:12 h Hell-Dunkel-Zyklus bei 25 °C gehalten und mit einem Pelletfutter und Wasser ad libitum versorgt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Ethics Committee (IAEC) des IIT Roorkee genehmigt.

1. Zubereitung von C. tropicalis

HINWEIS: Der Pilz Candida tropicalis gehört zu den Erregern der Risikogruppe 2 und wird als BSL2-Mikroorganismus eingestuft. Verwenden Sie bei der Arbeit mit Candida-Arten immer zertifizierte biologische Sicherheitswerkbänke der Klasse II. Üben Sie aseptische und sterile Techniken während der Arbeit mit C. tropicalis und befolgen Sie die empfohlenen Biosicherheitsverfahren für die ordnungsgemäße Entsorgung dieses Erregers.

  1. Streifen Sie C. tropicalis (Stamm ATCC 750) auf eine Sabouraud Dextrose (SAB) Agarplatte.
  2. Bereiten Sie eine über Nacht gewachsene Kultur von C. tropicalis vor, indem Sie eine einzelne Kolonie von der SAB-Agarplatte in ein steriles 50-ml-konisches Röhrchen mit 10 ml SAB-Brühemedium impfen. Alternativ können Sie eine gefrorene Glycerinbrühe von C. tropicalis verwenden und 100 μL der Glycerinbrühe in einen sterilen 250-ml-Konikenkolben mit 50 ml SAB-Brühemedium inokulieren.
  3. C. tropicalis-Kultur in einem Orbitalschüttler bei 180 U/min bei 30 °C für 24-48 h inkubieren.
  4. Zentrifugieren Sie die Pilzkultur (Zellen in logarithmischer Phase) bei 2.150 × g für 15 min bei 21 °C.
  5. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 50 mL steriles 1x PBS zum Pellet. Waschen und resuspendieren Sie das Pellet in sterilem 1x PBS mit leichtem Wirbel.
  6. Erneut bei 2.150 × g für 15 min bei 21 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pilzpellet in 10 ml sterilem 1x PBS.
  7. Berechnen Sie die Konzentration der Zellen durch Zählen mit einem Hämozytometer.
  8. Pilzbestände mit einer Enddichte von 1,0 × 106 Zellen/ml in RPMI 1640 Morpholinepropansulfonsäure (MOPS) -Medium vorbereiten. Verwenden Sie die Zellsuspension aus Schritt 1.6 sofort.
    HINWEIS: Um eine 96-Well-Platte einzurichten, beträgt das gesamte benötigte Pilzvolumen 10 ml (100 μL / Well). Skalieren Sie nach Bedarf.

2. C. tropicalis Biofilmbildung

  1. Candida-Biofilme werden in einer 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatte mit flachem Boden hergestellt, wie zuvor beschrieben (Abbildung 1)28,29.
  2. 100 μL C. tropicalis-Kultur (aus 106 Zellen/ml, wie oben vorbereitet) unter Verwendung einer Mehrkanalpipette zu einer 96-Well-Mikrotiterplatte geben (Abbildung 2A). Halten Sie die letzten beiden Spalten (11 und 12) als "kein Pilz plus Serum" und "kein Pilz und kein Serum" Negativkontrollen, indem Sie keine Pilzzellen hinzufügen. Füllen Sie die Spalten 11 und 12 allein mit 100 μL RPMI 1640 MOPS medium.
  3. Decken Sie die Mikrotiterplatte mit einem Deckel und Aluminiumfolie ab. Die Platte 24 h bei 37 °C unter stationären Bedingungen inkubieren.
  4. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab (ohne die Biofilme zu berühren oder zu stören). Klopfen Sie die Platte vorsichtig in umgekehrter Position auf die Löschbleche, um das restliche Medium zu entfernen.
  5. Waschen Sie die Platte mit 200 μL 1x PBS (pro Vertiefung) mit einer Mehrkanalpipette. Fügen Sie PBS sehr vorsichtig entlang der Seitenwände des Bohrlochs hinzu, um zu vermeiden, dass Biofilme gestört werden. Saugen Sie das PBS vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche 2x (insgesamt drei Wäschen).
  6. Um überschüssiges PBS zu entfernen, trocknen Sie die Platte (ohne Deckel) 30 Minuten bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft.

3. Behandlung von Biofilm mit Antikörpern

HINWEIS: Biofilme können nun verarbeitet werden, um die Hemmung der Biofilmreifung durch Antikörper zu beurteilen. Murines Serum wurde als Quelle für polyklonale Antikörper verwendet. Verschiedene Gruppen von Sap2-immunisierten (Sap2-albicans, Sap2-tropicalis und Sap2-Parapsilose) zusammen mit scheinimmunisierten Mäusen wurden retroorbital geblutet und das Serum wurde wie zuvor beschrieben isoliert19. Das Vorhandensein von Anti-Sap2-Antikörpern wurde mit Sap2-spezifischem ELISA bestätigt, wie zuvor beschrieben19.

  1. Führen Sie vor der Anwendung eine Hitzeinaktivierung des Serums (Quelle polyklonaler Antikörper) bei 56 °C für 30 min durch, um die Rolle des Komplements bei der hemmenden Aktivität auszuschließen. Inaktivieren Sie das Serum vor der Serumverdünnung.
    HINWEIS: Verwenden Sie Serum von scheinimmunisierten Mäusen, präimmunen Mäusen und Sap2-spezifischem Antikörper-depletiertem Serum als zusätzliche Kontrollen19. Das serumreicherte Serum mit Antikörpermangel wurde gemäß einer früheren Studiehergestellt 19. Unter den seriellen Verdünnungen (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 und 1:12.800) für Serum, das in diesem Protokoll getestet wurde, wurde eine Hemmung der Biofilmreifung bei 1:25, 1:50 und 1:100 beobachtet; Daher wurde 1:50 ausgewählt, um ein Gleichgewicht zwischen Hemmung und Serumkonsum zu finden.
  2. Bereiten Sie serielle Verdünnungen von hitzeinaktivierten Serumproben in sterilem RPMI 1640 MOPS-Medium (1:50) vor. Verwenden Sie eine übliche Serumverdünnung (1:50) für alle zu testenden Serumproben auf Hemmung der Biofilmreifung30.
  3. Fügen Sie 100 μL der ausgewählten Serumverdünnung zu jeder Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu. Fügen Sie für jede Probe die Serumverdünnungen in zweifacher Ausfertigung gemäß dem beigefügten Layout hinzu (Abbildung 2B).
    1. In Spalte 10 keine Serumverdünnung hinzufügen; Fügen Sie nur RPMI 1640 MOPS medium für die reine Pilz-Positivkontrolle hinzu.
      HINWEIS: Spalte 10, Zeilen G1-G8 und H1-H8 hatten ursprünglich Pilzzellen in RPMI-MOPS. Während RPMI-MOPS jedoch auch nach 24 h in Spalte 10 hinzugefügt wurde, dienten die Reihen G1-G8 als PBS-Kontrolle und die Reihen H1-H8 als No-Serum-Kontrolle nach 24 h.
    2. Fügen Sie in Spalte 11 eine 1:50-Verdünnung Serum in alle Vertiefungen hinzu, um als Negativkontrolle ohne Pilz plus Serum zu dienen.
    3. In Spalte 12 keine Serumverdünnung in eine Vertiefung geben; Halten Sie dies als die keine Pilz kein Serum Negativkontrolle.
  4. Decken Sie die Platte mit einem Deckel und Aluminiumfolie ab. Die Platte 24 h bei 37 °C inkubieren.

4. Abschätzung der Biofilm-Stoffwechselaktivität

  1. Am nächsten Tag saugen Sie das Serum vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab (ohne die Biofilme zu berühren oder zu stören). Klopfen Sie die Platte vorsichtig in umgekehrter Position auf die Löschblätter, um das restliche Serum zu entfernen.
  2. Waschen Sie die Platte mit 200 μL 1x PBS (pro Vertiefung) mit einer Mehrkanalpipette und fügen Sie das PBS entlang der Seitenwände des Bohrlochs hinzu, um eine Störung der Biofilme zu vermeiden. Saugen Sie das PBS vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette ab und wiederholen Sie die PBS-Wäsche 2x (insgesamt drei Wäschen). Trocknen Sie die Platte (ohne Deckel) 30 Minuten lang an der Luft bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank, um überschüssiges PBS zu trocknen.
  3. Vorbereitung von XTT / Menadion:
    1. Bereiten Sie XTT in sterilem Ringers Lactate als 0,5 g/L Lösung vor. 25 mg XTT werden in 50 ml filtersterilisiertem Ringers-Laktat gelöst. Aliquot 10 mL in separaten Röhrchen mit Aluminiumfolie abdecken und bei -80 °C lagern.
    2. Menadione als 10 mM Vorrat vorbereiten. Lösen Sie 8,6 mg Menadion in 5 ml Aceton auf und verteilen Sie 50 μL in 100 separaten Mikroröhrchen. Lagern Sie die Aliquots bei -80 °C.
    3. Bereiten Sie XTT / Menadion-Lösung kurz vor Gebrauch vor, indem Sie 10 ml XTT nehmen und 1 μL Menadion hinzufügen, um eine 1 μM Arbeitslösung zu erhalten.
  4. Fügen Sie 100 μL der XTT/Menadion-Lösung pro Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu. Decken Sie die Platte mit einem Deckel und Aluminiumfolie ab. Die Platte 2 h bei 37 °C im Dunkeln ausbrüten.
  5. 80 μL des farbigen Überstands aus jeder Vertiefung in eine frische 96-Well-Platte überführen. Lesen Sie die Platte bei 490 nm.
  6. Berechnen Sie den Mittelwert der Absorptionswerte der Vertiefungen in Spalte 10 (reine Pilz-Positivkontrolle), der als Referenzwert für die Berechnung der prozentualen Biofilmhemmung durch jede Serumprobe unter Verwendung von Gleichung (1) dient.
    % Biofilmhemmung = 100 - Equation 1× 100 (1)

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Representative Results

Candida tropicalis Biofilme wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten gezüchtet und mit einem inversen Mikroskop 40x abgebildet (Abbildung 1A). Der Biofilm wurde weiter mit Kristallviolett angefärbt und 40x mit einem inversen Mikroskop beobachtet (Abbildung 1B). Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt ein repräsentatives Bild des Biofilms von C. tropicalis (Abbildung 1C). Zur Durchführung des Biofilm-Inhibitionstests wurden 105 Zellen von Candida zum Zeitpunkt 0 gemäß dem Layout in die Vertiefungen der 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben (Abbildung 2A). Nach 24 h wurde die Platte gewaschen und Serumproben zu den vorgeformten Biofilmen gegeben. Eine übliche Serumverdünnung von 1:50 wurde ausgewählt, um verschiedene Serumproben verschiedener Gruppen von Sap2-immunisierten und scheinimmunisierten Mäusen gemäß einer Pilotstudie und einem zuvor veröffentlichten Bericht30 zu vergleichen.

Verschiedene Serumproben wurden der 96-Well-Mikrotiterplatte gemäß Layout hinzugefügt (Abbildung 2B) und doppelt ausgewertet. Seren, die am Tag 30 nach der Immunisierung von drei Mäusen pro Gruppe erhalten wurden (Sap2-albicans immunisiert, Sap2-tropicalis immunisiert, Sap2-Parapsilose immunisiert, scheinimmunisierte Gruppe, präimmunisierte Mäuse und Sap2-abgereicherte Kontrollprobe) wurden in einer Verdünnung von 1:50 analysiert. Die Platte wurde bei 490 nm Wellenlänge mit einem ELISA-Reader gelesen, um XTT-kolorimetrische Messwerte (OD490-Werte ) für C. tropicalis-Biofilme zu erhalten, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Serum gebildet wurden (Tabelle 1). Der negative Leerwert wurde anhand des Durchschnitts der Spalten 11 und 12 (0,04) berechnet. Die Positivkontrolle wurde berechnet, indem ein Durchschnitt der reinen Pilzbohrungen berechnet wurde (Spalte 10; 0,8165). Vor den Berechnungen wurde der mittlere Extinktionswert der Kontrollbohrungen in den Spalten 11 und 12 (0,04) von den Absorptionsmessungen der Versuchsbohrungen subtrahiert. So wurde der Referenzwert der Biofilm-Positivkontrolle (Spalte 10) auf 0,7765 (= 0,8165 − 0,04) festgelegt.

Die für die Versuchsbohrungen erhaltenen Werte (Mittelwert minus Leerwert) wurden dann durch diese Positivkontrolle dividiert (0,7765) und der Prozentsatz durch Multiplikation mit 100 erhalten. Die prozentuale Biofilmhemmung wurde berechnet, indem der Wert von 100 weiter subtrahiert wurde. Ein Balkendiagramm zeigt alle dargestellten Werte (Abbildung 3). Gewöhnliche Einweg-ANOVA, gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche, wurde verwendet, um p-Werte zur Bewertung statistischer Unterschiede zwischen verschiedenen Serumgruppen zu berechnen. Ein p-Wert von <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Serum von Sap2-Parapsilose-immunisierten Mäusen konnte die Reifung von vorgeformten C . tropicalis-Biofilmen um 65% verhindern, verglichen mit Serum von Sap2-albicans (45%) und Sap2-tropicalis (55%) immunisierten Mäusen. Im Allgemeinen war die Biofilmhemmung durch Sap2-Immunserum signifikant höher als durch Scheinimmunserum (16%) bzw. Präimmunserum (13%). Beim Abbau von Sap2-spezifischen Antikörpern aus dem Serum, wie an anderer Stelle beschrieben19, wurde die Biofilmhemmungsfähigkeit auf 10% reduziert. Die Biofilmhemmung war bei Verwendung von PBS (5%) und Nicht-Serumkontrolle (5%) nahezu vernachlässigbar.

Figure 1
Abbildung 1: Bildgebung des Biofilms Candida tropicalis . (A) Visualisierung des Candida tropicalis-Biofilms , der auf dem Boden einer 96-Well-Mikrotiterplatte nach Entfernung des RPMI-Mediums unter Verwendung eines inversen Mikroskops gebildet wurde. Das Bild wurde mittels Hellfeldmikroskopie aufgenommen (es wurde keine Färbung verwendet). (B) Visualisierung des C. tropicalis-Biofilms , der sich auf dem Boden einer 96-Well-Mikrotiterplatte nach kristallvioletter Färbung gebildet hat. (C) Visualisierung von C. tropicalis-Biofilmen , die auf Objektträgern gebildet werden, mittels Rasterelektronenmikroskopie. Maßstabsbalken = 100 μm (A,B), 10 μm (C). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Layout des 96-Well-Plattenformats. Zugabe von (A) Pilzzellen zu den Vertiefungen und (B) Serumverdünnungen aus verschiedenen Mäusegruppen (Sap2-albicans immunisiert, Sap2-tropicalis immunisiert, Sap2-Parapsilose immunisiert und scheinimmunisiert; n = 3) doppelt bewertet bei einer Verdünnung von 1:50. Weitere Kontrollen umfassten Sap2-abgereichertes Serum, Präimmunserum, PBS und No-Serum-Kontrolle. Spalte 10 wurde kein Serum zugesetzt (Pilzzellen vorhanden, Positivkontrolle). Säule 11 enthielt keine hinzugefügten Pilzzellen (Serum vorhanden). In Spalte 12 wurden keine Pilzzellen hinzugefügt (Serum fehlt). Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; Sap2 = sezernierte Aspartylproteinase 2. Die Begriffe m1, m2 und m3 beziehen sich auf verschiedene Mäuse in jeder Gruppe (n = 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Grafik zur Wirksamkeit von Sap2-spezifischen polyklonalen Antikörpern gegen vorgeformte C. tropicalis-Biofilme. Die Quelle des Immunserums ist auf der x-Achse dargestellt, während der Prozentsatz der Hemmung der C. tropicalis-Biofilmreifung auf der y-Achse angezeigt wird. Balken stellen den Mittelwert ± SEM dar (n = 3). Zur Berechnung der p-Werte wurde eine gewöhnliche Einweg-ANOVA gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche verwendet. Balken und Symbole repräsentieren die Unterschiede zwischen Sap2-immunisierten Mäusegruppen und scheinimmunisierten Mäusen. , p < 0,0001. Abkürzungen: PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; Sap2 = sezernierte Aspartylproteinase 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

<> 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ein 0.475 0.4141 0.0441 0.4637 0.485 0.0484 0.5179 0.4068 0.0442 0.8826 0.0452 0.0404
B 0.3848 0.3773 0.0428 0.369 0.3781 0.0465 0.4105 0.3773 0.0447 0.8428 0.0426 0.041
C 0.2754 0.2728 0.0427 0.305 0.3083 0.0415 0.3531 0.3213 0.0432 0.9661 0.0444 0.0453
D 0.6965 0.7185 0.043 0.6681 0.6711 0.0403 0.6346 0.728 0.0433 0.8643 0.0384 0.0358
E 0.7031 0.7117 0.0481 0.7806 0.688 0.0521 0.7095 0.6998 0.0525 0.7883 0.0491 0.0416
F 0.7588 0.7441 0.0456 0.7173 0.7233 0.0437 0.7733 0.6808 0.0462 0.7256 0.0468 0.0354
G 0.7681 0.7708 0.0435 0.7949 0.7496 0.0445 0.7695 0.7898 0.0451 0.7335 0.0429 0.0371
H 0.7652 0.7855 0.0469 0.7818 0.7766 0.0428 0.7592 0.7765 0.0445 0.7295 0.044 0.0341

Tabelle 1: Absorptionswerte bei 490 nm für die 96-Well-Mikrotiterplatte. Zur Ermittlung der Absorptionswerte wurde ein Standard-Plattenleser (Tecan) verwendet, und die Messwerte wurden an das in Abbildung 2 beschriebene Layout angepasst. Anhand dieser Daten wurden nachfolgende Berechnungen durchgeführt.

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Discussion

Pilzinfektionen, die durch Candida-Arten verursacht werden, sind weltweit mit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten verbunden. Die wachsende Bedrohung durch invasive Pilzinfektionen erfordert die frühzeitige Behandlung solcher lebensbedrohlichen Erkrankungen. Die meisten Candida-Infektionen beinhalten die Bildung von Biofilmen, die an einer Vielzahl von Medizinprodukten haften und für die Persistenz und das Wiederauftreten von Pilzinfektionen in Krankenhäusern verantwortlich sind31. Biofilme bestehen aus Hefe- oder Hyphenzellen und weisen eine beträchtliche Resistenz gegen die meisten herkömmlichen Antimykotika auf32. Antimykotische Resistenz durch Candida-Biofilme wurde mehreren Mechanismen zugeschrieben, darunter verminderte antimykotische Penetration, Vorhandensein extrazellulärer Matrix, Überexpression von Arzneimittel-Effluxpumpen, veränderte Zellmembransterinzusammensetzung, langsames Wachstum und räumliche Heterogenität, Aktivierung verschiedener Signalwege und das Vorhandensein von arzneimitteltoleranten Persisterzellen33,34. Die Hemmung der Candida-Adhäsion und die Biofilmbildung sind die wichtigsten Strategien, um eine Candida-Infektion zu verhindern.

Verschiedene In-vitro-Assays, wie Zelllebensfähigkeitstests, Mikrotiterplattentests und Trockengewichtsmessassays, wurden verwendet, um die Candida-Biofilmbildung zu untersuchen, die auf der spezifischen Zeitpunktbewertung von Biofilmen basieren23. Es wurden fortschrittlichere Assays wie mikrofluidische Geräte-basierte Assays entwickelt, die zur Beurteilung der Echtzeit-Biofilmbildung verwendet werden können35. Bisher wurde die Biofilmbildung mit in vitro Assays untersucht, aber es besteht die Notwendigkeit, den dynamischen Prozess der Biofilmbildung auch unter in vivo Bedingungen zu verstehen36,37. Derzeit gelten die meisten Biofilmhemmungsstudien für C. albicans und nur wenige Studien sind für die Eradikation von Nicht-Albicans Candida-Biofilmen verfügbar. Das Spektrum der Candida-Infektionen hat sich in den letzten Jahrzehnten allmählich verändert, und neu auftretende Candida-Arten stellen weltweit eine hohe Belastung durch Morbidität und Mortalität dar. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung neuartiger Strategien zur Kontrolle der Biofilmbildung und der Entwicklung von Biofilmhemmungsassays, die sich auf Nicht-Albicans-Candida-Arten konzentrieren. Immuntherapien, insbesondere Antikörper, haben ein großes Potenzial zur Hemmung der Biofilmbildung und können zur Behandlung einer systemischen Candida-Infektion eingesetzt werden38. Mehrere Berichte haben die Rolle von Antikörpern bei der Biofilmhemmung in früheren Stadien der Biofilmbildung gezeigt. Es wurde berichtet, dass polyklonale Antikörper, die als Reaktion auf die Immunisierung des Komplementrezeptor-3-verwandten Proteins (CR3-RP, das eine potenzielle Rolle bei der Pilzadhärenz spielt) bei Kaninchen erzeugt wurden, die Adhärenz und Biofilmbildung von C. albicans auf bukkalen Epithelzellen reduzierten39. Darüber hinaus wurden Candida-Stämme einschließlich Katheterisolate mit polyklonalen Anti-CR3-RP-Antikörpern und monoklonalen Antikörpern OKM1 vorinkubiert, was die Adhärenz und Biofilmbildung reduzierte. Die Zelllebensfähigkeit von C. albicans wurde mit dem XTT-Assay während der Adhärenzphase und der Biofilmbildungsphase40 bewertet. Nur wenige Studien haben die Rolle von Antikörpern gegen die Biofilmbildung von Candida-Arten untersucht. Chupacova et al. untersuchten die Wirksamkeit von polyklonalen Anti-CR3-RP-Antikörpern gegen C. albicans zusammen mit C. dubliniensis unter Verwendung des XTT-Assays. Polyklonale Anti-CR3-RP-Antikörper hemmten die Adhärenz und Biofilmbildung von C. albicans und C. dubliniensis41.

In dieser Studie wird ein einfaches, schnelles und benutzerfreundliches Protokoll beschrieben, um die Wirkung von Antikörpern auf die Biofilmreifung und -entwicklung zu bewerten. Dieser 96-Well-Mikrotiterplatten-basierte XTT-Reduktionsassay misst die metabolische Aktivität lebensfähiger Zellen in Biofilmen und wurde aus früheren Studienangepasst 7,8. Der hierin beschriebene XTT-Assay wird ausgiebig zur Abschätzung des lebensfähigen Biofilmwachstums verwendet. Es ist zu einem häufig verwendeten Zelllebensfähigkeitstest geworden, da es schnell und bequem ist und im Hochdurchsatzformat wie einer 96-Well-Platte verwendet werden kann. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um sowohl Hefe- als auch Hyphenformen von Candida-Biofilmen zu quantifizieren. Es kann auch für die Messung von Candida-Biofilmen auf einer Vielzahl von Substraten wie medizinischen Geräten (z. B. Kathetern) und Kontaktlinsen verwendet werden.

Einige der kritischen Schritte dieses Protokolls umfassen das kräftige Wirbeln der Zellsuspensionen vor dem Pipettieren in allen Schritten, um eine Pilzaggregation zu vermeiden7. Schlechte Biofilme entstehen wahrscheinlich, wenn die Zelldichten entweder zu hoch oder zu niedrig sind. Daher sollten Anwender die ideale Pilzzelldichte im initialen Inokulum7 befolgen. Die Waschschritte sind sehr kritisch und übermäßiges Zellwaschen sollte vermieden werden, um eine Störung des Biofilms22 zu vermeiden. Die untere Schicht des Biofilms sollte während des Waschvorgangs nicht gestört werden. Der Assay sollte immer unter dunklen Bedingungen durchgeführt werden, und es ist notwendig, mehrere Replikate22 einzubeziehen. Eine frische Lösung von XTT sollte jedes Mal kurz vor Gebrauch zubereitet werden. Da der Zeitunterschied zwischen zwei Reaktionen die Ergebnisse verzerren kann, sollten Benutzer schnell arbeiten, um einen minimalen Zeitunterschied zu gewährleisten, wenn die XTT-Lösung in die erste und letzte Vertiefung der 96-Well-Platte42 gegeben wird. Die Verwendung von Folie oder Parafilm wird empfohlen, um Verdunstung zu verhindern. Bei Bedarf können mehrere Schritte zur Fehlerbehebung durchgeführt werden. Falls das Biofilmwachstum fehlt oder nicht zufriedenstellend ist, sollten geeignete Inokulumverdünnungen und Berechnungen für die Aussaat verwendet werden. Für eine bessere Biofilmbildung können Subkulturbedingungen verändert und das Biofilmwachstum mit verschiedenen Oberflächenmaterialien versucht werden. Um die Empfindlichkeit des XTT-Assays signifikant zu verbessern, könnte man die Zeit für die Bildung des Biofilms verringern, die Konzentration des Antimykotikums erhöhen oder die Inkubationszeit des Assays verkürzen7. Um eine Störung des Biofilms zu vermeiden, sollte eine übermäßige Zellwäsche vermieden werden22. Man kann entweder die äußeren Vertiefungen vermeiden, um zu verhindern, dass die Assay-Mittel Licht ausgesetzt werden, oder Flüssigkeit in die äußeren Vertiefungen geben, um zu verhindern, dass die Mittel aus den inneren Vertiefungen verdampfen. Sanfte Waschungen sollten gegeben werden, wenn der Biofilm während des Waschens gestört wird22. Während dieses Protokoll die Wirkung von Serum auf 24 h vorgeformte Biofilme testet, um die Hemmung der Biofilmreifung zu beurteilen, können Benutzer dieses Protokoll auch modifizieren, um Serum zum Zeitpunkt 0 hinzuzufügen, um die Hemmung der Biofilmbildung zu beurteilen, wie in einem früheren Bericht30 beschrieben.

Im Vergleich zu anderen alternativen Methoden zur Quantifizierung des Biofilmwachstums ist die XTT-Methode die empfindlichste, reproduzierbarste, genaueste, kostengünstigste und spezifischste Methode. Obwohl der XTT-Assay eine häufig verwendete schnelle und einfache Technik zur Bewertung von Biofilmen ist, hat er bestimmte Einschränkungen. Während es nützlich ist, die Dosierung oder Wirkung verschiedener Wirkstoffe in einem Biofilm von einer einzigen Spezies zu bestimmen, sollte es aufgrund der metabolischen Variabilität zwischen Isolaten mit Vorsicht verwendet werden, mehrere Isolate gleichzeitig zu vergleichen21. Für Biofilmvergleiche zwischen Stämmen sollte eine detaillierte Technikstandardisierung durchgeführt werden21. Während sich das XTT-Formazan-Produkt leicht in Lösung auflöst, können einige Stämme eine gewisse Menge in der Zelle21 zurückhalten. Da es an Klarheit in Bezug auf Variablen wie die Wahl des Mediums, den Zeitpunkt der Biofilmentwicklung und die Besonderheiten des Serums mangelt, ist es ratsam, zusätzlich zum XTT-Assay konfirmatorische Bioassays durchzuführen, beispielsweise die Messung der Biofilmdicke/Biomasse (unter Verwendung von Kristallviolett) oder der Zelllebensfähigkeit (unter Verwendung der CFU-Methode)43. Bemerkenswert ist, dass die Ergebnisse dieses XTT-Assays gut mit dem Kristallviolett-Assay und der CFU-Methode korrelierten (Daten nicht gezeigt). Ungeachtet der oben genannten Einschränkungen kann diese Methode extrapoliert werden, um verschiedene Gruppen von Serumproben (Quelle polyklonaler Antikörper), monoklonaler Antikörper oder begleitender Immuntherapien zu bewerten. Obwohl das hier vorgestellte XTT-Reduktionsprotokoll nur die Wirkung von Antikörpern auf C. tropicalis-Biofilme zeigt, wurde es von Forschern verwendet, um die Wirkung von Antikörpern auf C. auris-Biofilme zu untersuchen18. Darüber hinaus stammt dieses Protokoll aus früheren Studien, die mit anderen Candida-Arten wie C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. dubliniensis, C. tropicalis und C. auris durchgeführt wurden, was die Erweiterung dieses Protokolls auf die Gattung Candida 16,41,44,45,46,47 rechtfertigen kann.

Optimierung, Standardisierung und regelmäßige Verbesserung von Biofilm-Quantifizierungsassays können die Genauigkeit, den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit verbessern. Der XTT-Reduktionstest, auf dem dieses Protokoll basiert, wurde häufig zur Beurteilung der metabolischen Aktivität und Lebensfähigkeit von Biofilmen verwendet. Da Candida-Biofilm oft resistent gegen antimykotische Medikamente ist, ist die Erforschung neuer Medikamente und neuer Kombinationen eine dringende Notwendigkeit33. Um das Problem der Biofilm-assoziierten Infektionen zu bekämpfen, müssen mehr Antibiofilmverbindungen mit Biofilm-Screening-Assaysuntersucht werden 48. Dieses In-vitro-Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung potenzieller neuer antimykotischer Verbindungen auf die metabolische Aktivität von Candida-Spezies-Zellen in Biofilmen zu überprüfen. Zukünftige Forschung, die auf der Standardisierung und Verbesserung des XTT-Reduktionstests mit Antikörper-basierten Immuntherapien basiert, könnte bei der Entwicklung verbesserter Therapeutika für ein effektives Krankheitsmanagement und eine wirksame Krankheitskontrolle helfen.

Die Biofilmhemmung durch Sap2-spezifische Antikörper wurde als Antikörper-vermittelter Schutzmechanismus beim Sap2-Impfstoff-vermittelten Schutz während der durch C. tropicalis19 verursachten systemischen Candidiasis der Maus berichtet. Eine frühere Studie zeigte auch, dass CAGTA, die möglicherweise Saft-Antigene erkennt, das Wachstum und die Biofilmbildung von C. albicans in vitro16 reduziert. In einer anderen Studie zeigten Sap2-gelöschte Mutanten einen Biofilmwachstumsdefekt in Gegenwart von Pepstatin A49. Darüber hinaus spielte das Sap2-Antigen während der Biofilmbildung eine Rolle bei der proteolytischen Verarbeitung des Mucins Msb2, das durch den Cek1-Mitogen-aktivierten Proteinkinase-Signalwegvermittelt wird 50. Daher kann spekuliert werden, dass die Msb2-Verarbeitung durch Antikörper-vermittelte Sap2-Neutralisation gehemmt wird, was die Biofilmintegrität beeinträchtigt. Zusammenfassend bietet dieser Artikel ein detailliertes Protokoll zur Bewertung der Rolle von Serumantikörpern bei der Reifung und Entwicklung von C. tropicalis-Biofilmen , das zur Bestimmung der Biofilmstoffwechselaktivität in verschiedenen Umgebungen unter Verwendung verschiedener Pilzstämme oder Antikörperquellen angewendet werden kann.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch das Ramalingaswami-Stipendium DBT-843-BIO (Department of Biotechnology, Government of India) und den Early Career Research Award SER-1058-BIO (Science and Engineering Research Board, Government of India) an S.R. Die Autoren erkennen einen ICMR-JRF-Zuschuss an P.C. und DBT-JRF-Zuschuss an P.S. Die Autoren danken Dr. Ravikant Ranjan für die Vorschläge zum Manuskript und die technische Unterstützung durch Herrn Pradeep Singh Thakur während des SEM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546021
1x PBS - Prepared in lab NaCl : 4 g
KCl : 0.1 g
Na2HPO4:  0.72 g
KH2PO4 : 0.12 g
Water 500 mL. Adjust pH to 7.4
50 mL conical centrifuge tubes BD Falcon 546041
96-well microtiter plates Nunc 442404
Incubator Generic
Menadione Sigma M5625
Microtiter Plate Reader Generic
Multichannel pipette and tips Generic
Petri dishes Tarson 460090
Ringers Lactate - Prepared in lab sodium chloride 0.6 g sodium lactate 0.312 g potassium chloride 0.035 g calcium chloride 0.027 g Water 100 mL. Adjust to pH 7.0 
RPMI 1640 MOPS Himedia AT180
Sabouraud dextrose Agar SRL 24613
Sabouraud dextrose Broth SRL 24835
XTT  Invitrogen X6493

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Immunologie und Infektion Ausgabe 187
Ein löslicher Tetrazolium-basierter Reduktionstest zur Bewertung der Wirkung von Antikörpern auf <em>Candida tropicalis-Biofilme</em>
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Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. … More

Chandley, P., Subba, P., Rohatgi, S. A Soluble Tetrazolium-Based Reduction Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilms. J. Vis. Exp. (187), e64425, doi:10.3791/64425 (2022).

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