Summary
İletilen sinyal algılamalı dik uyarılmış Raman saçılma mikroskobu kullanılarak canlı hücrelerin hızlandırılmış görüntülenmesi için sahne üstü, esnek bir çevre odası sunuyoruz. Lipid damlacıkları, oleik asit ile muamele edilen SKOV3 hücrelerinde, 3 dakikalık bir zaman aralığıyla 24 saate kadar görüntülendi.
Abstract
Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir. SRS ile canlı hücre görüntüleme, birçok biyolojik ve biyomedikal uygulama için gösterilmiştir. Bununla birlikte, canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi yaygın olarak benimsenmemiştir. SRS mikroskopisi genellikle yüksek çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için yüksek sayısal açıklıklı (NA) suya daldırma hedefi ve yüksek NA yağ daldırma kondenseri kullanır. Bu durumda, amaç ile kondenser arasındaki boşluk sadece birkaç milimetredir. Bu nedenle, çoğu ticari sahne üstü çevre odası, sert bir cam kapaklı büyük kalınlıkları nedeniyle SRS görüntüleme için kullanılamaz. Bu makalede, dik bir mikroskop çerçevesi üzerinde iletilen SRS sinyal tespiti ile hızlandırılmış canlı hücre görüntülemesi için kullanılabilecek esnek bir odanın tasarımı ve üretimi açıklanmaktadır. Odanın esnekliği, yumuşak bir malzeme kullanılarak elde edilir - ince bir doğal kauçuk film. Yeni muhafaza ve bölme tasarımı, mevcut bir SRS görüntüleme kurulumuna kolayca eklenebilir. Test ve ön sonuçlar, esnek oda sisteminin, gelecekte çeşitli biyogörüntüleme uygulamaları için kullanılabilecek canlı hücrelerin kararlı, uzun vadeli, hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağladığını göstermektedir.
Introduction
Optik mikroskopi, örneklerin mikroyapılarını gözlemlemek için kullanılır. Optik görüntüleme hızlı, daha az invaziv ve diğer teknolojilerden daha az yıkıcıdır1. Optik mikroskopi ile canlı hücre görüntüleme, kültürlenmiş canlı hücrelerin dinamiklerini uzun bir süre boyunca yakalamak için geliştirilmiştir2. Farklı optik kontrast türleri, biyolojik örnekler hakkında farklı bilgiler sağlar. Örneğin, optik faz mikroskobu, örnek3 boyunca kırılma indekslerindeki ince farkı gösterir. Floresan mikroskopi, spesifik biyomolekülleri veya hücresel organelleri görüntülemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, floresanın geniş bant uyarımı ve emisyon spektrumları genellikle çok renkli görüntüleme yapıldığında spektral örtüşmeye neden olur4. Floresan molekülleri ışığa duyarlıdır ve uzun süreli, periyodik ışığa maruz kaldıktan sonra ağartılabilir. Ek olarak, floresan etiketleme, hücrelerdeki moleküllerin biyolojik dağılımını değiştirebilir5. SRS mikroskopisi etiketsiz bir kimyasal görüntüleme teknolojisidir6. SRS'nin kontrastı, belirli kimyasal bağların titreşimsel geçişine dayanır. Bir kimyasal bağın titreşim frekansı genellikle dar bir spektral bant genişliği sergiler ve bu da aynı örneklerde birden fazla Raman bandının görüntülenmesini mümkün kılar7. SRS mikroskopisi, canlı hücre görüntülemesi için benzersiz bir araçtır ve etiketsiz bir şekilde çoklu kimyasal kontrastlar sağlar8.
Boyanmamış hücrelerin SRS görüntülemesi birçok çalışma için kullanılmış olsa da, canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi yaygın olarak benimsenmemiştir. Bunun bir nedeni, ticari açık odaların 9,10,11,12 kalınlıkları nedeniyle SRS görüntüleme için doğrudan kullanılamamasıdır. Cam kapaklı bu odalar çoğunlukla geriye doğru algılama şemasına sahip tek bir yüksek NA hedefi kullanılarak parlak alan veya floresan görüntüleme için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, SRS görüntüleme, hem yüksek NA hedefi hem de yüksek NA kondenseri kullanılarak iletilen algılamayı tercih eder, bu da amaç ile kondenser arasında sadece çok kısa bir boşluk (tipik olarak birkaç milimetre) bırakır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, dik bir mikroskop çerçevesi kullanarak canlı hücrelerin hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağlamak için yumuşak bir malzeme kullanarak esnek bir oda tasarladık. Bu tasarımda, suya daldırma hedefi yumuşak odaya yerleştirilmiştir ve odaklama ve görüntüleme amacıyla üç boyutta serbestçe hareket edebilir.
Çoğu memeli hücresinin kültürlenmesi için en uygun sıcaklık 37 ° C'dir, oda sıcaklığı ise her zaman bundan 10 ° daha düşüktür. 37 ° C'den yüksek veya daha düşük sıcaklık, hücre büyüme hızı üzerinde dramatik bir etkiye sahiptir13. Bu nedenle canlı hücre görüntüleme sisteminde hücre kültürü ortamının sıcaklık kontrolü gereklidir. Sıcaklık kararsızlığının uzun süreli görüntüleme sırasında bulanıklaştırma sorunlarına yol açacağı bilinmektedir14. Kararlı bir 37 °C ortam elde etmek için, mikroskopun altında bir ısı yalıtım tabakası da dahil olmak üzere tüm mikroskop çerçevesini kaplayacak büyük bir muhafaza odası inşa ettik (Şekil 1). Büyük sıcaklık kontrol odası içindeki küçük esnek oda, %5 CO 2 ile desteklenen düzenlenmiş hava akışı yoluyla fizyolojik nemin ve pH'ın doğru bir şekilde korunmasına yardımcı olur (Şekil 2). Odaların sıcaklığı ve nemi, çift odacıklı tasarımın uzun süreli, periyodik SRS görüntüleme altında hücre büyümesi için en uygun hücre kültürü koşulunu sağladığını doğrulamak için ölçülmüştür (Şekil 3). Daha sonra sistemin SKOV3 kanser hücrelerinde hızlandırılmış görüntüleme ve lipit damlacıklarının (LD'ler) izlenmesi için uygulanmasını gösterdik (Şekil 4, Şekil 5 ve Şekil 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikroskop çevre muhafazasını inşa edin
NOT: Bu büyük mikroskop çevresel muhafazası, mikroskop gövdesinin sıcaklığını ve 37 ° C'de stabilize edilecek görüntüleme ortamını kontrol etmek için kullanılır (Şekil 1A).
- SRS mikroskop çerçevesinin ayaklarının yerlerini ve motorlu sahneyi optik masadaki bir işaretleyici kalem kullanarak işaretleyin. Mikroskobun Galvanometre tarayıcısının önüne iki İris Diyaframı monte edin ve pompanın ve Stokes lazer ışınlarının İris Diyaframlarının ortasından geçmesini sağlamak için ayarlayın.
- Mikroskop çerçevesini ve sahne alanını optik tablodan çıkarın.
- Silikon kauçuk levhayı (boyut: 31 x 29 inç, kalınlık: 1/8 inç) optik tablanın üzerine yerleştirin (Şekil 1B).
- Silikon kauçuğu bir bıçak kullanarak işaretler boyunca kesin, küçük kauçuk parçalarını çıkarın ve kare MICA seramik levhaları (boyut: 6 x 6 inç, kalınlık: 1/4 inç) aynı yerlere yerleştirin.
NOT: MICA seramik, işlenmesi kolay bir malzemedir15. Alüminyum kadar serttir ancak mükemmel bir ısı yalıtkanıdır. MICA seramik levhalar, metal mikroskop çerçevesinden ve sahneden paslanmaz çelik optik masaya ısı transferini durdurmak için kullanıldı. Çerçevenin ve sahnenin ayaklarını monte etmek için 1/4-20 vidanın kullanılmasına izin vermek için MICA levhaları üzerinde birkaç geçiş deliği açılmalıdır. - Mikroskop çerçevesini ve sahneyi optik masaya geri getirin ve ayakları işaretleyici çizgileri boyunca MICA seramik levhalara dikkatlice hizalayın. Çerçeveyi ve sahneyi masaya monte etmek için 1/4-20 vida kullanın.
- SRS optik yolunu yeniden hizalayın. Lazer ışınının önceden monte edilmiş iki İris Diyaframının ortasından geçmesini sağlamak için Ayna 1 ve Ayna 2'nin ayna yuvalarını ayarlayın (Şekil 2).
NOT: Mevcut canlı hücre görüntüleme çalışmaları için kullanılan laboratuvar yapımı SRS mikroskobunun teknik detayları daha önceaçıklanmıştır 16. Pompanın ve Stokes kirişlerinin darbe genişliği, cam çubuk dağılımı ile ~ 3-4 ps'dir. Sistem ScanImage17 yazılımı kullanılarak kontrol edilir. - Bu ısı yalıtım temelinin üzerine, beş parça büyük polikarbonat levha (boyut: 31 x 29 x 28 inç, kalınlık: 0,25 inç) kullanarak tüm mikroskop çerçevesini kaplayacak şekilde çevre muhafazasını monte edin.
NOT: Kasa kutusunun boyutu, mikroskop çerçevesinin ve sahne alanının boyutlarına göre belirlenir. Esnek odayı takmak ve hücre kültürü kabını yüklemek için mikroskop muhafaza kutusunun ön panelinin geçici olarak çıkarılması gerekecektir.- Muhafazayı monte etmek için, polikarbonat levhaların her bir kenarındaki vida deliklerini kesme, delme ve kılavuz çekme dahil olmak üzere basit işleme işleri yapın. Giriş ve çıkış borusuna uyacak şekilde sırasıyla muhafazanın sağında ve solunda 2,6 inç çapında iki büyük delik açın. Lazer ışınlarının muhafazaya girmesine izin vermek için arka tabakada 5 mm çapında küçük bir delik açın.
- Alüminyum folyo bant kullanarak kutunun kenarlarını ve arayüzlerini kapatın.
- Isıtıcı modülü tarafından pompalanan ve kontrol edilen sirkülasyonlu sıcak hava akışına izin vermek için esnek kanal hortumunu muhafaza kutusunun giriş ve çıkış portlarına bağlayın. Isıtıcı modülünün termal sensörünü, hücrelerin kültürlendiği ve görüntülendiği esnek odaya yerleştirin. Hedeflenen sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
NOT: Çevresel muhafazada daha düzgün bir hava akışı dağılımı elde etmek için bir difüzör kullanılabilir.
2. Esnek odayı monte edin
- İşlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 1'i (malzeme: alüminyum 6061) üç set vida kullanarak hedefin burun parçasına monte edin (Şekil 2).
- İşlenmiş içi boş silindirik alüminyum parça 2'yi dört 1/4-20 vida kullanarak numune tutucuya monte edin (Şekil 2).
NOT: Numune tutucu, 50 mm'lik cam tabanlı hücre kültürü kabını tutacak şekilde değiştirilmelidir. 1-7/8 inçlik bir delik testeresi kullanarak numune tutucunun ortasına bir delik açın. 50 mm'lik bir delik testeresi kullanarak deliği karşı delik açın ve geçiş deliğinin derinliğini ~1 mm olarak tutun. - Numune tutucuyu alüminyum parça 2 ile motorlu aşamaya takın ve vidalar kullanarak monte edin.
- Doğal kauçuk film manşonunu (kalınlık: 0.01 inç; siyanoakrilat yapıştırıcı ile yapıştırılmış) işlenmiş iki alüminyum parça arasına yerleştirin ve her iki ucunda lastik bantlar kullanarak monte edin.
- Sıkıştırılmış CO2 silindirini uygun boru ve konektörleri kullanarak gaz karıştırıcı modülüne bağlayın. CO2 giriş basıncını 20-25 psi'ye ayarlayın. Hava karıştırıcı modülünün %5 CO 2'yi düzenleyebilmesini ve hava akışına karıştırabilmesini sağlamak için dahili bir CO2 sensörü ve bir kontrolör kullanın. Hava akışını temizlemek için hat içi filtreler kullanın.
- Uygun boru ve konektörleri kullanarak, karışık havayı (% 5 CO2 ile) sıcak plakaya yerleştirilen önceden sterilize edilmiş su şişesine yönlendirin ve ardından nemlendirilmiş havayı esnek odaya yönlendirin. Sıcak plakayı 37 °C'ye ayarlayın. Hava akışının nemini artırmak için ılık sudaki hava akışını kabarcıklandırın.
3. Hızlandırılmış canlı hücre SRS görüntüleme deneylerine hazırlık
- Burun parçası, suya daldırma hedefi ve numune tutucu dahil olmak üzere esnek haznenin tüm kısımlarını %70 etanol ile silin.
- Muhafazaya yerleştirilmiş bir UV lambası kullanarak tüm muhafaza sistemini 20 ila 30 dakika boyunca dekontamine edin.
NOT: Güvenlik nedeniyle UV dezenfeksiyon işlemi sırasında laboratuvar odasında kalmayın. - Kültür SKOV3 hücreleri, normal bir inkübatörde normal fizyolojik koşullar altında 12 saat boyunca 50 mm'lik cam tabanlı bir Petri kabında.
NOT: SKOV3 hücre kültürü18'i standart bir biyogüvenlik kabininde başlatın. - Vidaları sökerek işlenmiş alüminyum parça 2'yi numune tutucudan ayırın.
NOT: Bu, hücre kültürü kabını yüklemek için esnek odayı açmanın yoludur. - Hücre kültürü kabını yükleyin. Hücre kültürü kabını yerleştirmeden önce kondenserin üstüne daldırma yağı eklemeyi unutmayın. Çanağın kapağını çıkarın ve kelepçeleri kullanarak çanağı hareketsiz hale getirin.
NOT: Kontaminasyonu önlemek için, tüm işlemler eldivenlerle yapılmalıdır. - Kaba odaklama için hedefi hücre kültürü ortamına indirin. Esnek hazneyi kapatmak için alüminyum parça 2'yi indirin ve vidaları kullanarak numune tutucuya monte edin.
NOT: Boşluğu sıkıca kapatmak için alüminyum parça 2'nin tabanına 2 mm'lik bir silikon kauçuk yastık pedi tutturulmuştur. - Hava beslemesini, 200 cc/dak hava akış hızına sahip normal hücre kültürü için %5 CO2 ve %19O2 ile ayarlar.
NOT: Daha düşük bir hava akış hızı kullanılabilir. Esnek odanın ne kadar iyi kapatıldığına bağlıdır.
4. Hızlandırılmış canlı hücre SRS görüntüleme deneyleri yapın
- CH2 kimyasal bağlarının titreşimine atfedilen 2854 cm-1 Raman kaymasını hedeflemek için lazer dalga boyunu 805 nm'ye ayarlayın. Hücrelere verilen fotohasarı azaltmak için düşük lazer gücü kullanın. Bu protokolü takip etmek için, uzun süreli canlı hücre görüntülemesi için pompa lazerinin ~ 15 mW ortalama gücünü ve ~ 7,5 mW Stokes lazerini (1.045 nm'de sabitlenmiş) kullanın.
NOT: Daha yüksek lazer gücü, daha iyi SRS görüntüleme kalitesi sağlayacaktır. Bununla birlikte, çok yüksek lazer gücü canlı hücrelere fotohasara neden olacaktır. Görüntü kalitesi ve fotohasar arasında bir denge vardır. - Yazılımın ANA KONTROLLER panelindeki FOCUS düğmesini kullanarak hücrelerin iyi SRS görüntülemesini elde etmek için hedefi ayarlayın ve odaklayın. Hızlı netleme gerçekleştirmek için YAPILANDIRMA panelinde piksel sayısını 512 × 512 piksel olacak şekilde ayarlayın ve piksel bekleme süresi 4,8 μsn olarak ayarlayın.
- Kilitli amplifikatör giriş aralığını (tipik olarak 5 mV) maksimum sinyal voltajının iki katı olacak şekilde ayarlayın. Düşük geçirgen filtreyi, piksel bekleme süresiyle (4,8 μs) aynı olacak şekilde ayarlayın.
NOT: Laboratuvarda oluşturulan farklı SRS sistemleri farklı veri toplama ayarları kullanabilir. - İyi odaklama elde ettikten sonra, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için görüntüleme çözünürlüğünü 175μm2 görüş alanı için 2.048 × 2.048 piksel olarak ayarlayın. ANA KONTROLLER panelindeki KAYDET işlevini ve KANALLAR panelindeki SRS kanalını kontrol edin. İki kare arasındaki aralık süresini MAIN CONTROLS kanalında 180 s (3 dakika) olarak ayarlayın. 24 saatten uzun süreli hızlandırılmış görüntüleme için edinme sayısını 480 olarak ayarlayın.
NOT: Deneylerin amacına bağlı olarak daha düşük bir görüntüleme çözünürlüğü kullanılabilir. - ANA KONTROLLER panelindeki LOOP işlevini kullanarak otomatik görüntüleme alımını başlatın.
NOT: Görüntülemenin ilk saatinde sıcaklık kararsızlığı nedeniyle fokal kayma olup olmadığını kontrol edin. İlk saat görüntüleme stabil olmayabilir. Hızlandırılmış görüntüleme seansı sırasında her 2-3 saatte bir odaklanmayı kontrol edin. - ImageJ19 kullanarak toplanan görüntüleri işleyin. LD ölçümü için aşağıdaki iki yöntemi kullanın: (i) LD / hücre gövdesi alan oranı ve (ii) toplam LD'lerin ortalama SRS yoğunluğu. SRS görüntülerindeki hücresel olmayan pikselleri 2.854 cm-1'de eşik ve sıfırlayarak hücre gövdesi alanını ölçün. SRS görüntülerindeki LD olmayan pikselleri eşik oluşturup sıfırlayarak LD alanını ve yoğunluğunu ölçün.
NOT: SRS görüntü işleme hakkında daha fazla ayrıntı daha önce16 olarak bildirilmişti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hızlandırılmış SRS görüntüleme için esnek oda sistemini ürettik ve monte ettik (Şekil 1 ve Şekil 2) ve ardından sistemin performansını değerlendirdik. Mikroskop çevre muhafazası içindeki sıcaklık, 1 saat içinde beklenen 37 ° C'ye ulaştı ve bu da oda sıcaklığını önemli ölçüde etkilemedi (Şekil 3A). Esnek odadaki sıcaklık 1,5 saatte 37 ° C'ye ulaştı ve en az 24 saat boyunca 37 ° C'de sabit bir şekilde korundu (Şekil 3B). Esnek odadaki bağıl nem 1 saatte %85'e ulaşabilir ve daha sonra en az 24 saat boyunca muhafaza edilebilir (Şekil 3C). Ölçülen sıcaklık ve nem verileri, bu sistemin uzun süreli hücre büyümesi için en uygun ortamı sağlayabileceğini doğrulamaktadır.
SRS ile canlı hücre görüntülemesi birçok biyolojik ve biyomedikal çalışmaya uygulanmıştır 20,21,22,23,24. Özellikle kanserde lipid metabolizmasını anlamak için canlı hücrelerdeki etiketsiz LD'lerin SRS görüntülemesi çok dikkat çekmiştir16,25,26. Tasarlanan esnek oda sistemini kullanarak, ilk olarak canlı SKOV3 hücrelerinin 3 dakikalık bir zaman aralığında 24 saat boyunca hızlandırılmış SRS görüntülemesini gerçekleştirdik (Şekil 4). Video verileri, hücre içi LD'lerin hızlı ve aktif hareketini 3 dakikalık bir zamansal çözünürlükle gösterdi. 24 saatlik görüntüleme seansının sonunda, hücreler hala normal morfoloji ve yoğunluk gösterdi, bu da hücrelerin sağlıklı olduğunu gösteriyordu. Daha sonra oleik asit (OA) ile muamele edilen SKOV3 hücrelerini görüntüledik ve 10 saat içinde LD birikiminin dinamik sürecini izledik (Şekil 5A).
LD miktarları, OA ile tedavi edilen SKOV3 hücrelerinde ImageJ19 kullanılarak iki şekilde (LD-hücre vücut alanı oranı ve LD'lerin toplam SRS yoğunluğu) ölçüldü. Sonuçlar, LD miktarının (boyut ve sayı olarak) 10 saatten fazla artmaya devam ettiğini göstermektedir (Şekil 5B). Ayrıca, LD'lerin (psödo-renk yeşili) eşzamanlı ileri-SRS görüntülemesini ve floresan boya DND-189 ile etiketlenmiş lizozomların (sahte renk kırmızısı) geriye doğru iki foton floresan (TPF) görüntülemesini gösterdik (Şekil 6). SRS/TPF dual-modalite görüntülemenin iki hücresel bölmenin kolokalizasyonunu analiz etmek için kullanılabileceği belirtilmektedir. Bu deneyde, küçük sarı bölgelerle gösterilen LD'lerin ve lizozomların çok düşük bir kolokalizasyon derecesi gözlenmiştir. Toplu olarak, bu sonuçlar esnek oda sisteminin, gelecekte çeşitli görüntüleme uygulamaları için kullanılabilecek canlı hücrelerin kararlı, uzun vadeli, hızlandırılmış SRS görüntülemesini sağladığını göstermektedir.
Resim 1: Canlı hücrelerin hızlandırılmış SRS görüntülemesi için esnek oda sistemi. (A) Canlı hücrelerin hızlandırılmış SRS görüntülemesi için esnek oda sisteminin şeması. (B) Soldaki resim, mikroskop çerçevesinin ve sahnenin altında silikon kauçuk bir levha ve MICA seramik pedler kullanılarak ısı yalıtım katmanını göstermektedir. Sağdaki görüntü çevresel mikroskop muhafazasını ve esnek odayı göstermektedir. Kısaltmalar: SRS = uyarılmış Raman saçılması; CCM = dakikada santimetre küp. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SRS optik yolu ile esnek odanın şematik ve görüntüleri, odaklama ve görüntüleme için suya daldırma hedefinin üç boyutlu serbest dolaşımını sağlar. Soldaki resimler, ticari amaçlı bir burun parçasına ve modifiye edilmiş bir numune tutucuya bağlı iki işlenmiş alüminyum modülü göstermektedir. Alttaki resimler montaj esnek hazne sistemini göstermektedir. Kısaltma: SRS = uyarılmış Raman saçılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Mikroskop mahfazasının ve esnek odanın sıcaklık ve nem verileri. (A) Mikroskop muhafazasının ölçülen sıcaklık verileri ve laboratuvar odası sıcaklığı, 12 saate kadar. (B) Esnek oda içinde ölçülen sıcaklık verileri (ortalama 37 °C), 24 saate kadar. (C) Esnek oda içinde ölçülen bağıl nem verileri (ortalama %85), 24 saate kadar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Temsili 24 karelik hızlandırılmış SRS görüntüleme. Esnek odayı kullanarak canlı SKOV3 hücrelerinin hızlandırılmış SRS görüntülemesi (2.854 cm-1'de), 24 saate kadar. Bu deneyde, 3 dakikalık sabit bir zaman aralığında 480 kare kaydedildi. Hücreler normal şartlar altında kültürlendi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hızlandırılmış SRS görüntüleme ve lipid damlacık ölçümü. (A) Esnek oda kullanılarak 10 saate kadar 500 μM OA ile muamele edilmiş canlı SKOV3 hücrelerinin 10 karelik hızlandırılmış SRS görüntülemesini (2.854 cm-1'de) temsil eder. Bu deneyde, 3 dakikalık sabit bir zaman aralığında 200 kare kaydedildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (B) Zamana karşı LD miktarı (0-10 saat), ImageJ'deki eşik fonksiyonu ve parçacık analizi fonksiyonları kullanılarak iki şekilde (LD / hücre gövdesi alan oranı ve LD'lerin toplam SRS yoğunluğu) ölçülmüştür. Kısaltmalar: SRS = uyarılmış Raman spektroskopisi; OA = oleik asit; LDs = lipit damlacıkları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: LD'ler ve lizozomlar için hızlandırılmış, eşzamanlı SRS ve iki fotonlu floresan görüntüleme. Hızlandırılmış, eşzamanlı SRS (2.854 cm-1'de) ve LD'ler (sahte renk yeşili) ve lizozomlar (kırmızı) için 2 saate kadar iki fotonlu floresan görüntüleme. Hücreler, görüntülemeden önce 1 saat boyunca floresan boya (LysoSensor DND-189, 1 μM) ile muamele edildi. Görüntüler her 3 dakikada bir çekildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. LD'lerin ve lizozomların düşük derecede kolokalizasyonu gözlendi ve sarı renkle belirtildi. Kısaltmalar: SRS = uyarılmış Raman spektroskopisi; LDs = lipit damlacıkları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hızlandırılmış canlı hücreli SRS mikroskopisi, molekül takibi için etiketsiz bir şekilde alternatif bir görüntüleme tekniğidir. Floresan etiketleme ile karşılaştırıldığında, SRS görüntüleme fotobeyazlatma içermez ve moleküllerin uzun süreli izlenmesini sağlar. Bununla birlikte, bugüne kadar, dik SRS mikroskobu üzerindeki canlı hücre görüntüleme sistemi ticari olarak mevcut değildir. Bu çalışmada, iletilen SRS hızlandırılmış görüntülemeyi sağlamak için kararlı bir termal yalıtımlı mikroskop muhafaza kutusu ve esnek bir iç yumuşak odaya sahip bir canlı hücre görüntüleme sistemi geliştirilmiştir. Bu kurulumda, büyük muhafaza kutusu 37 ° C'de sıcaklık stabilitesini korurken, dahili yumuşak oda optimum hücre kültürü ortamı oluşturmak için nemlendirilmiş hava sağlar. Bu çalışmada gösterilen esnek açık oda, canlı hücrelerin uzun süreli SRS görüntülemesi için basit bir iş akışı sağlar. Cam tabanlı bir tabağa ekilen hücreler, görüntüleme için esnek sahne odasına aktarılmadan önce önce normal bir inkübatörde hazırlanabilir ve kültürlenebilir. Canlı hücre SRS görüntülemesi yapmak için alternatif bir çözüm, mikroakışkan ve akış sitometri platformları27,28,29,30 dahil olmak üzere kapalı bir akış hücresi kullanmaktır. Daha düşük kalınlıkta bir akış hücresi tasarlamak mümkündür. Bununla birlikte, bir perfüzyon odasındaki hücrelerin kültürlenmesi teknik olarak zor olabilir31.
Fokal sürüklenme, canlı hücre görüntülemede yaygın bir sorundur32. Çok fotonlu bir süreç olarak, SRS sinyal üretimi lazer ışınlarının sıkıca odaklanmasını gerektirir ve bu nedenle SRS mikroskobu odak sürüklenmesine karşı oldukça hassastır. Sıcaklık instabilitesi, odak kaymasını indüklemede önemli bir faktördür. Isıl kararlılığı artırmak için, tüm mikroskop ısı yalıtım malzemeleri ile kapatılmıştır. Bununla birlikte, bazı görüntüleme seanslarında, 2-3 saatlik görüntülemeden sonra hala fokal sürüklenme yaşadık. SRS mikroskobik görüntüleme ayrıca odaklanmayı tahrip edebilecek titreşime karşı hassastır. Titreşim önleyici optik tabla, kararlı görüntüleme elde etmek için titreşimi azaltmaya yardımcı olur. Odak sürüklenmesi problemini çözmek için, gelecekteki deneylerde, otomatik odaklama teknolojileri benimsenebilir33.
Görüntüleme sisteminin dezenfeksiyon prosedürü, hücrelerin kirlenmesini önlemek için, özellikle de hücre kültürü ortamına doğrudan temas edecek olan suya daldırma hedefi için kritik öneme sahiptir. Lens üst temizliği için% 70 etanol kullanmak güvenli olmalıdır. UV ışığı sadece nesnelerin yüzeyini etkili bir şekilde dezenfekte edebildiğinden, bu deneylerde dezenfeksiyon yapmak için muhafaza kutusunun farklı yerlerine dört UV lambası monte edildi. Bununla birlikte, UV ışığı görüntüleme sistemindeki plastik bileşenleri bozabilir. Bu durumda, plastik parçaları sarmak ve örtmek için alüminyum folyo kullanılabilir. Canlı hücre görüntülemesi için, antibiyotikler (genellikle kültür ortamında 100 ünite / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin) şiddetle tavsiye edilir.
Bu deneylerde canlı kanser hücrelerindeki LD'leri görüntüledik ve ölçtük. Bu deneyler için 3 dakikalık bir zaman aralığı makuldü. Görüntüleme zaman aralığının, araştırma projesinin ihtiyaçlarına bağlı olarak değiştirilebileceği belirtilmektedir. Örneğin, canlı bir hücredeki tek bir LD'yi izlemek için 1 dakikadan az bir zaman aralığı gerekebilir. Buna karşılık, yavaş biyolojik süreçleri izlemek için birkaç dakikalık daha uzun bir zaman aralığı yeterlidir34.
SRS görüntüleme, uyarma için diğer birçok optik görüntüleme teknolojisinden daha yüksek lazer gücü kullanır, bu da canlı hücrelerin uzun süreli hızlandırılmış SRS görüntülemesi için zor olabilir. Doğal biyomoleküllerin SRS görüntülemesi, kimyasal bağların küçük Raman kesiti nedeniyle daha da zordur35. Bu deneylerde, 805 nm'de 15 mW pompa lazer ve 1.045 nm'de 7.5 mW Stokes lazer kullanılmış ve 3 dakikalık bir zaman aralığında 24 saatte önemli bir fotohasar gözlenmemiştir. Hassas Raman etiketlerinin kullanımı lazer gücünü daha da azaltabilir36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Binghamton Üniversitesi'ndeki 2019 Lisans Kıdemli Tasarım Ekibine (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza ve James Walsh) mikroskop muhafaza kutusunun tasarımı, üretimi ve testi için teşekkür etmek istiyoruz. Binghamton Üniversitesi'nden Scott Hancock, Olga Petrova ve Fabiola Moreno Olivas'a yararlı tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından R15GM140444 Ödül Numarası altında desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R.
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P.
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al.
