Summary
Vi rapporterer et stage-top, fleksibelt miljøkammer til time-lapse-billeddannelse af levende celler ved hjælp af opretstående stimuleret Raman-spredningsmikroskopi med transmitteret signaldetektion. Lipiddråber blev afbildet i SKOV3-celler behandlet med oliesyre i op til 24 timer med et tidsinterval på 3 minutter.
Abstract
Stimuleret Ramanspredning (SRS) mikroskopi er en etiketfri kemisk billeddannelsesteknologi. Levende cellebilleddannelse med SRS er blevet demonstreret til mange biologiske og biomedicinske anvendelser. Imidlertid er langvarig tidsforløbs-SRS-billeddannelse af levende celler ikke blevet bredt vedtaget. SRS-mikroskopi bruger ofte et vandnedsænkningsmål med høj numerisk blænde (NA) og en kondensator med høj NA-olienedsænkning for at opnå billeddannelse med høj opløsning. I dette tilfælde er afstanden mellem målet og kondensatoren kun få millimeter. Derfor kan de fleste kommercielle miljøkamre ikke bruges til SRS-billeddannelse på grund af deres store tykkelse med et stift glasdæksel. Dette papir beskriver design og fremstilling af et fleksibelt kammer, der kan bruges til time-lapse live-cellebilleddannelse med transmitteret SRS-signaldetektion på en opretstående mikroskopramme. Kammerets fleksibilitet opnås ved at bruge et blødt materiale - en tynd naturgummifilm. Det nye kabinet og kammerdesign kan nemt føjes til en eksisterende SRS-billedopsætning. Testen og de foreløbige resultater viser, at det fleksible kammersystem muliggør stabil, langsigtet SRS-billeddannelse med time-lapse af levende celler, som kan bruges til forskellige bioimaging-applikationer i fremtiden.
Introduction
Optisk mikroskopi bruges til at observere mikrostrukturerne af prøver. Optisk billeddannelse er hurtig, mindre invasiv og mindre destruktiv end andre teknologier1. Levende cellebilleddannelse med optisk mikroskopi er udviklet til at fange dynamikken i dyrkede levende celler over en lang periode2. Forskellige typer optiske kontraster giver tydelig information om biologiske prøver. For eksempel viser optisk fasemikroskopi den subtile forskel i brydningsindekserne på tværs af prøven3. Fluorescensmikroskopi bruges i vid udstrækning til at afbilde specifikke biomolekyler eller cellulære organeller. Imidlertid resulterer bredbåndsexcitations- og emissionsspektrene for fluorescens normalt i spektral overlapning, når flerfarvet billeddannelse udføres4. Fluorescerende molekyler er lysfølsomme og kan bleges efter langvarig, periodisk lyseksponering. Derudover kan fluorescensmærkning ændre biofordelingen af molekylerne i celler5. SRS-mikroskopi er en etiketfri kemisk billeddannelsesteknologi6. Kontrasten af SRS er afhængig af vibrationsovergangen af specifikke kemiske bindinger. Vibrationsfrekvensen af en kemisk binding udviser ofte en smal spektral båndbredde, hvilket gør det muligt at afbilde flere Raman-bånd i de samme prøver7. SRS-mikroskopi er et unikt værktøj til billeddannelse af levende celler, der giver flere kemiske kontraster på en etiketfri måde8.
Mens SRS-billeddannelse af ufarvede celler er blevet brugt til mange undersøgelser, er langvarig tidsforløbs-SRS-billeddannelse af levende celler ikke blevet bredt vedtaget. En af grundene er, at kommercielle åbne kamre ikke kan bruges direkte til SRS-billeddannelse på grund af deres store tykkelse 9,10,11,12. Disse kamre med et glaslåg er for det meste designet til brightfield- eller fluorescensbilleddannelse ved hjælp af et enkelt højt NA-mål med et baguddetektionsskema. SRS-billeddannelse foretrækker imidlertid transmitteret detektion ved hjælp af både et højt NA-mål og en høj NA-kondensator, hvilket kun efterlader et meget kort mellemrum (typisk et par millimeter) mellem målet og kondensatoren. For at overvinde dette problem designede vi et fleksibelt kammer ved hjælp af et blødt materiale for at muliggøre time-lapse SRS-billeddannelse af levende celler ved hjælp af en opretstående mikroskopramme. I dette design blev vanddyppemålet indesluttet i det bløde kammer og kan frit bevæge sig i tre dimensioner til fokuserings- og billeddannelsesformål.
Den optimale temperatur til dyrkning af de fleste pattedyrceller er 37 °C, mens rumtemperaturen altid er 10° lavere end dette. Temperatur højere eller lavere end 37 °C har en dramatisk effekt på cellevæksthastigheden13. Derfor kræves temperaturkontrol af cellekulturmiljøet i et levende cellebilleddannelsessystem. Det er kendt, at temperaturstabilitet vil føre til defokuseringsproblemer under langvarig billeddannelse14. For at opnå et stabilt miljø på 37 °C byggede vi et stort kabinetkammer til at dække hele mikroskoprammen, inklusive et varmeisoleringslag under mikroskopet (figur 1). I det store temperaturkontrolkammer hjælper det lille fleksible kammer med nøjagtigt at opretholde den fysiologiske fugtighed og pH via den regulerede luftstrøm suppleret med 5% CO 2 (figur 2). Kamrenes temperatur og fugtighed blev målt for at bekræfte, at dobbeltkammerdesignet gav den optimale cellekulturtilstand for cellevækst under langvarig, periodisk SRS-billeddannelse (figur 3). Vi demonstrerede derefter anvendelsen af systemet til time-lapse-billeddannelse og sporing af lipiddråber (LD'er) i SKOV3-kræftceller (figur 4, figur 5 og figur 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Byg mikroskopets miljøkabinet
BEMÆRK: Dette store mikroskopmiljøkabinet bruges til at kontrollere temperaturen i mikroskoplegemet og billeddannelsesmiljøet, der skal stabiliseres ved 37 ° C (figur 1A).
- Marker placeringen af fødderne på SRS-mikroskoprammen og det motoriserede trin ved hjælp af en markørpen på det optiske bord. Monter to irismembraner foran mikroskopets galvanometerscanner, og juster for at få pumpen og Stokes-laserstrålerne til at passere gennem midten af irismembranerne.
- Fjern mikroskoprammen og scenen fra det optiske bord.
- Læg silikonegummipladen (størrelse: 31 x 29 tommer, tykkelse: 1/8 tomme) på det optiske bord (figur 1B).
- Skær silikonegummiet langs mærkerne ved hjælp af en kniv, fjern små gummistykker, og placer de firkantede MICA-keramiske plader (størrelse: 6 x 6 tommer, tykkelse: 1/4 tommer) på de samme steder.
BEMÆRK: MICA-keramik er et materiale, der er let at bearbejde15. Det er lige så hårdt som aluminium, men er en fremragende termisk isolator. MICA keramiske plader blev brugt til at stoppe varmeoverførslen fra metalmikroskopets ramme og scene til det optiske bord i rustfrit stål. Der skal bores et par gennemgående huller på MICA-pladerne for at tillade brug af 1/4-20 skruer til montering af rammens fødder og scenen. - Flyt mikroskoprammen og scenen tilbage til det optiske bord, og juster forsigtigt fødderne på Mica-keramikpladerne langs markørlinjerne. Brug 1/4-20 skruer til at montere rammen og scenen på bordet.
- Juster den optiske SRS-sti igen. Juster spejlbeslagene på spejl 1 og spejl 2 for at få laserstrålen til at passere gennem midten af de to forudmonterede irismembraner (figur 2).
BEMÆRK: Tekniske detaljer om det laboratoriebyggede SRS-mikroskop, der anvendes til det nuværende arbejde med levende cellebilleddannelse, er beskrevet tidligere16. Pulsbredden på pumpen og Stokes-bjælkerne er ~ 3-4 ps med glasstangdispersion. Systemet styres ved hjælp af ScanImage17-softwaren . - Oven på dette varmeisoleringsfundament skal du samle miljøkabinettet for at dække hele mikroskoprammen ved hjælp af fem stykker store polykarbonatark (størrelse: 31 x 29 x 28 tommer, tykkelse: 0,25 tommer).
BEMÆRK: Størrelsen på kabinetboksen bestemmes ud fra mikroskoprammens og scenens dimensioner. Frontpanelet på mikroskopets kabinetboks skal fjernes midlertidigt for at installere det fleksible kammer og indlæse cellekulturskålen.- For at samle kabinettet skal du udføre simpelt bearbejdningsarbejde, herunder skæring, boring og gevindskæring af skruehuller på hver kant af polykarbonatarkene. Skær to store huller med en diameter på 2,6 tommer til højre og venstre ark i kabinettet, så de passer til henholdsvis indløbs- og udløbsrøret. Skær et lille hul med en diameter på 5 mm på bagsiden, så laserstrålerne kan komme ind i kabinettet.
- Forsegl kassens kanter og grænseflader ved hjælp af aluminiumsfolietape.
- Tilslut den fleksible kanalslange til indløbs- og udløbsportene i kabinetboksen for at tillade cirkuleret varm luftstrøm, der pumpes og styres af varmemodulet. Placer varmemodulets termiske sensor i det fleksible kammer, hvor cellerne dyrkes og afbildes. Indstil den ønskede temperatur til 37 °C.
BEMÆRK: En diffusor kan bruges til at få en mere ensartet luftstrømsfordeling i miljøkabinettet.
2. Saml det fleksible kammer
- Monter det bearbejdede hule cylindriske aluminiumsstykke 1 (materiale: aluminium 6061) på målets næsestykke ved hjælp af tre sæt skruer (figur 2).
- Monter det bearbejdede hule cylindriske aluminiumsstykke 2 på prøveholderen ved hjælp af fire 1/4-20 skruer (figur 2).
BEMÆRK: Prøveholderen skal ændres, så den indeholder 50 mm dækslet med cellekulturskål med glasbund. Bor et gennemgående hul i midten af prøveholderen ved hjælp af en 1-7/8 tommer hulsav. Modbor hullet ved hjælp af en 50 mm hulsav, og hold dybden af det gennemgående hul ~ 1 mm. - Monter prøveholderen med aluminiumsstykket 2 på den motoriserede scene, og monter den ved hjælp af skruer.
- Placer filmhylsteret af naturgummi (tykkelse: 0,01 tommer; limet med cyanoacrylatklæbemiddel) mellem de to bearbejdede aluminiumsstykker, og monter det ved hjælp af elastikker i hver ende.
- Tilslut den komprimerede CO2 -cylinder til gasblandemodulet ved hjælp af korrekt slange og stik. Indstil CO2 indgangstrykket til 20-25 psi. Brug en indbygget CO2 -sensor og en controller til at sikre, at luftblandermodulet kan regulere og blande 5% CO2 i luftstrømmen. Brug inline-filtre til at rense luftstrømmen.
- Brug korrekt slange og stik til at lede den blandede luft (med 5% CO2) til den præsteriliserede vandflaske, der er placeret på varmepladen, og før derefter den befugtede luft til det fleksible kammer. Sæt kogepladen ved 37 °C. Boble luftstrømmen i det varme vand for at øge luftfugtigheden.
3. Forberedelse til time-lapse live-cell SRS-billeddannelseseksperimenter
- Tør alle dele af det fleksible kammer af med 70 % ethanol, herunder næsestykket, målet for vanddypning og prøveholderen.
- Dekontaminer hele kabinetsystemet ved hjælp af en UV-lampe placeret i kabinettet i 20 til 30 minutter.
BEMÆRK: Bliv ikke i laboratorierummet under UV-desinfektionsprocessen af sikkerhedsmæssige årsager. - Kultur SKOV3 celler i en 50 mm glasbundet petriskål i 12 timer under normale fysiologiske forhold i en almindelig inkubator.
BEMÆRK: Start SKOV3 cellekultur18 i et standard biosikkerhedsskab. - Afbryd det bearbejdede aluminiumsstykke 2 fra prøveholderen ved at fjerne skruerne.
BEMÆRK: Dette er måden at åbne det fleksible kammer for at indlæse cellekulturskålen. - Ilæg cellekulturskålen. Husk at tilføje nedsænkningsolie på toppen af kondensatoren, inden du placerer cellekulturskålen. Fjern dækslet på skålen og immobiliser skålen ved hjælp af klemmerne.
BEMÆRK: For at undgå kontaminering skal alle operationer udføres med handsker. - Sænk målet ned i cellekulturmediet for grov fokusering. Sænk aluminiumsstykket 2 for at omslutte det fleksible kammer og monter det på prøveholderen ved hjælp af skruer.
BEMÆRK: En 2 mm silikone gummipude er fastgjort til bunden af aluminiumsstykket 2 for at forsegle hullet tæt. - Indstil lufttilførslen med 5% CO 2 og 19% O2 til normal cellekultur med en luftstrømningshastighed på 200 cc / min.
BEMÆRK: Der kan anvendes en lavere luftmængde. Det afhænger af, hvor godt det fleksible kammer er forseglet.
4. Udfør time-lapse live-cell SRS-billeddannelseseksperimenter
- Indstil laserbølgelængden til 805 nm for at målrette 2854 cm-1 Raman-skiftet , som tilskrives vibrationen afCH2 kemiske bindinger. Brug lav lasereffekt til at reducere fotoskader på cellerne. For at følge denne protokol skal du bruge ~ 15 mW gennemsnitlig effekt af pumpelaseren og ~ 7.5 mW af Stokes-laseren (fastgjort til 1.045 nm) til langvarig levende cellebilleddannelse.
BEMÆRK: Højere lasereffekt giver bedre SRS-billedkvalitet. Imidlertid vil for høj lasereffekt fremkalde fotoskader på levende celler. Der er en afvejning mellem billedkvalitet og fotoskader. - Juster og fokuser målet for at opnå god SRS-billeddannelse af cellerne ved hjælp af FOCUS-knappen på MAIN CONTROLS-panelet i softwaren. Hvis du vil udføre hurtig fokusering, skal du indstille pixeltallet til 512 × 512 pixel med en pixelopholdstid på 4,8 μs på panelet CONFIGURATION .
- Indstil indgangsområdet for låseforstærkeren (typisk 5 mV) til at være dobbelt så høj som den maksimale signalspænding. Indstil lavpasfilteret til at være det samme som pixelopholdstiden (4,8 μs).
BEMÆRK: Forskellige laboratoriebyggede SRS-systemer kan bruge forskellige indstillinger for dataindsamling. - Når du har opnået god fokusering, skal du indstille billedopløsningen til 2.048 × 2.048 pixels for et synsfelt på 175 μm2 til erhvervelse af billeder i høj kvalitet. Kontroller funktionen GEM i panelet MAIN CONTROLS , og kontroller SRS-kanalen i panelet CHANNELS . Indstil intervaltiden mellem to billeder til at være 180 s (3 min) på kanalen MAIN CONTROLS. Indstil anskaffelsesnummeret til 480 for time-lapse-billeddannelse over 24 timer.
BEMÆRK: En lavere billedopløsning kan anvendes baseret på formålet med eksperimenterne. - Start automatisk billedoptagelse ved hjælp af LOOP-funktionen på panelet MAIN CONTROLS .
BEMÆRK: Kontroller, om der er fokal drift på grund af temperaturstabilitet i den første times billeddannelse. Den første times billeddannelse er muligvis ikke stabil. Kontroller fokusering hver 2-3 time under time-lapse-billedbehandlingssessionen. - Behandl de indsamlede billeder ved hjælp af ImageJ19. Brug følgende to metoder til LD-kvantificering: (i) LD/celle-kropsarealforholdet og (ii) den gennemsnitlige SRS-intensitet af samlede LD'er. Mål cellekropsarealet ved at tærskelere og nulstille de ikke-cellulære pixels i SRS-billederne ved 2,854 cm-1. Mål LD-området og intensiteten ved at tærskeloverskride og nulstille de ikke-LD-pixels i SRS-billederne.
BEMÆRK: Flere detaljer om SRS-billedbehandling blev rapporteret tidligere16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi fremstillede og samlede det fleksible kammersystem til time-lapse SRS-billeddannelse (figur 1 og figur 2) og evaluerede derefter systemets ydeevne. Temperaturen inde i mikroskopets miljøkabinet nåede de forventede 37 °C inden for 1 time, hvilket ikke påvirkede rumtemperaturen signifikant (figur 3A). Temperaturen i det fleksible kammer nåede 37 °C på 1,5 time, og den blev stabilt holdt på 37 °C i mindst 24 timer (figur 3B). Den relative luftfugtighed i det fleksible kammer kunne nå 85% på 1 time og derefter opretholdes i mindst 24 timer (figur 3C). De målte temperatur- og fugtighedsdata bekræfter, at dette system kan give et optimalt miljø for langsigtet cellevækst.
Levende cellebilleddannelse med SRS er blevet anvendt til mange biologiske og biomedicinske undersøgelser 20,21,22,23,24. Især SRS-billeddannelse af etiketfrie LD'er i levende celler for at forstå lipidmetabolisme i kræft har tiltrukket sig stor opmærksomhed16,25,26. Ved hjælp af det designede fleksible kammersystem udførte vi først time-lapse SRS-billeddannelse af levende SKOV3-celler i 24 timer med et tidsinterval på 3 minutter (figur 4). Videodataene viste den hurtige og aktive bevægelse af intracellulære LD'er med en tidsmæssig opløsning på 3 min. Ved afslutningen af 24 timers billeddannelsessession viste cellerne stadig normal morfologi og tæthed, hvilket indikerer, at cellerne var sunde. Vi afbildede derefter SKOV3-celler behandlet med oliesyre (OA) og sporede den dynamiske proces med LD-akkumulering inden for 10 timer (figur 5A).
LD-mængderne blev kvantificeret i de OA-behandlede SKOV3-celler på to måder (LD til celle kropsarealforhold og total SRS-intensitet af LD'erne) ved hjælp af ImageJ19. Resultaterne indikerer, at mængden af LD'er (i størrelse og antal) fortsatte med at stige over 10 timer (figur 5B). Vi demonstrerede også samtidig fremadrettet SRS-billeddannelse af LD'er (pseudofarvegrøn) og bagud to-fotonfluorescens (TPF) billeddannelse af lysosomer (pseudofarvet rød) mærket med et fluorescensfarvestof DND-189 (figur 6). Det bemærkes, at SRS / TPF dual-modalitetsbilleddannelse kan bruges til at analysere colokalisering af to cellulære rum. I dette eksperiment blev der observeret en meget lav grad af colokalisering af LD'er og lysosomer, hvilket blev indikeret af de små gule regioner. Samlet set viser disse resultater, at det fleksible kammersystem muliggør stabil, langsigtet, time-lapse SRS-billeddannelse af levende celler, som kan bruges til forskellige billeddannelsesapplikationer i fremtiden.
Figur 1: Det fleksible kammersystem til time-lapse SRS-billeddannelse af levende celler. (A) Skematisk oversigt over det fleksible kammersystem til time-lapse SRS-billeddannelse af levende celler. (B) Billedet til venstre viser det varmeisolerende lag ved hjælp af en silikonegummiplade og Mica-keramiske puder under mikroskoprammen og scenen. Billedet til højre viser miljømikroskopkabinettet og det fleksible kammer. Forkortelser: SRS = stimuleret Raman-spredning; CCM = kubikcentimeter pr. min. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk og billeder af det fleksible kammer med SRS optiske vej, der tillader tredimensionel fri bevægelse af vanddyppemålet til fokusering og billeddannelse. De venstre billeder viser de to bearbejdede aluminiumsmoduler forbundet til et kommercielt objektiv næsestykke og en modificeret prøveholder. De nederste billeder viser samlingens fleksible kammersystem. Forkortelse: SRS = stimuleret Raman-spredning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Temperatur- og fugtighedsdata for mikroskopets kabinet og det fleksible kammer. A) De målte temperaturdata for mikroskopets kabinet og laboratoriets rumtemperatur i op til 12 timer. B) De målte temperaturdata (gennemsnit ved 37 °C) i det fleksible kammer op til 24 timer. C) data for målt relativ luftfugtighed (gennemsnit på 85 %) i det fleksible kammer op til 24 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative 24 rammer for time-lapse SRS-billeddannelse. Time-lapse SRS-billeddannelse (ved 2.854 cm-1) af levende SKOV3-celler ved hjælp af det fleksible kammer, op til 24 timer. I dette eksperiment blev der registreret 480 billeder med et fast tidsinterval på 3 min. Celler blev dyrket under normale forhold. Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Time-lapse SRS-billeddannelse og kvantificering af lipiddråber. (A) Repræsentative 10 billeder af time-lapse SRS-billeddannelse (ved 2,854 cm-1) af levende SKOV3-celler behandlet med 500 μM OA op til 10 timer ved hjælp af det fleksible kammer. I dette eksperiment blev der registreret 200 billeder med et fast tidsinterval på 3 min. Skalabjælke = 50 μm. (B) Mængden af LD'er versus tid (0-10 timer) blev kvantificeret på to måder (LD/celle body area ratio og total SRS intensitet af LDs) ved hjælp af tærskelfunktionen og partikelanalysefunktionerne i ImageJ. Forkortelser: SRS = stimuleret Raman-spektroskopi; OA = oliesyre; LD'er = lipiddråber. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Time-lapse, samtidig SRS og to-foton fluorescens billeddannelse for LD'er og lysosomer. Time-lapse, samtidig SRS (ved 2.854 cm-1) og to-foton fluorescensbilleddannelse for LD'er (pseudofarve grøn) og lysosomer (rød), op til 2 timer. Celler blev behandlet med et fluorescensfarvestof (LysoSensor DND-189, 1 μM) i 1 time før billeddannelse. Billeder blev taget hvert 3. minut. Skalabjælke = 50 μm. En lav grad af colokalisering af LD'er og lysosomer blev observeret, angivet med den gule farve. Forkortelser: SRS = stimuleret Raman-spektroskopi; LD'er = lipiddråber. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Time-lapse live-cell SRS-mikroskopi er en alternativ billeddannelsesteknik til molekylesporing på en etiketfri måde. Sammenlignet med fluorescensmærkning er SRS-billeddannelse fri for fotoblegning, hvilket muliggør langsigtet overvågning af molekyler. Til dato er det levende cellebilleddannelsessystem på en opretstående SRS-mikroskopi imidlertid ikke kommercielt tilgængeligt. I dette arbejde blev der udviklet et levende cellebilleddannelsessystem med en stabil termisk isoleret mikroskopkabinetboks og et fleksibelt indre blødt kammer for at muliggøre transmitteret SRS time-lapse-billeddannelse. I denne opsætning opretholder den store kabinetboks temperaturstabilitet ved 37 °C, mens det indre bløde kammer leverer befugtet luft for at etablere et optimalt cellekulturmiljø. Det fleksible åbne kammer, der demonstreres i dette arbejde, muliggør en enkel arbejdsgang til langsigtet SRS-billeddannelse af levende celler. Celler, der er podet i en skål med glasbund, kan først tilberedes og dyrkes i en almindelig inkubator, inden de overføres til det fleksible kammer på scenen til billeddannelse. En alternativ løsning til at udføre live-celle SRS-billeddannelse er at bruge en lukket flowcelle, herunder mikrofluidiske og flowcytometriplatforme27,28,29,30. Det er muligt at designe en flowcelle med en lavere tykkelse. Imidlertid kan dyrkning af celler i et perfusionskammer være teknisk udfordrende31.
Fokal drift er et almindeligt problem i levende cellebilleddannelse32. Som en multifotonproces kræver SRS-signalgenerering en tæt fokusering af laserstrålerne, og derfor er SRS-mikroskopi meget følsom over for fokaldrift. Temperaturstabilitet er en væsentlig faktor i at fremkalde fokaldrift. For at forbedre termisk stabilitet blev hele mikroskopet lukket med varmeisolerende materialer. I nogle billeddannelsessessioner oplevede vi dog stadig fokaldrift efter 2-3 timers billeddannelse. SRS mikroskopisk billeddannelse er også følsom over for vibrationer, hvilket kan ødelægge fokusering. Et anti-vibrations optisk bord hjælper med at reducere vibrationer for at opnå stabil billeddannelse. For at løse problemet med fokal drift kan autofokusteknologier anvendes i fremtidige eksperimenter33.
Desinfektionsproceduren for billeddannelsessystemet er afgørende for at undgå forurening af cellerne, især for målet om nedsænkning i vand, som direkte kommer i kontakt med cellekulturmediet. Det skal være sikkert at bruge 70% ethanol til rengøring af linsen. Fordi UV-lys kun effektivt kan desinficere overfladen af genstandene, blev fire UV-lamper monteret forskellige steder i kabinetboksen for at udføre desinfektion i disse eksperimenter. UV-lyset kan dog nedbryde plastkomponenterne i billeddannelsessystemet. I dette tilfælde kan man bruge aluminiumsfolie til at pakke og dække plastdelene. Til levende cellebilleddannelse anbefales antibiotika (normalt 100 enheder / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin i dyrkningsmedierne) stærkt.
Vi afbildede og kvantificerede LD'erne i levende kræftceller i disse eksperimenter. For disse eksperimenter var et tidsinterval på 3 minutter rimeligt. Det bemærkes, at billedtidsintervallet kan ændres afhængigt af forskningsprojektets behov. For eksempel, for at spore en enkelt LD i en levende celle, kan der kræves et mindre end 1 minuts tidsinterval. I modsætning hertil er et længere tidsinterval på et par minutter tilstrækkeligt til at spore langsomme biologiske processer34.
SRS-billeddannelse bruger højere laserkraft til excitation end mange andre optiske billeddannelsesteknologier, hvilket kan være udfordrende for langvarig tidsforløbs-SRS-billeddannelse af levende celler. SRS-billeddannelse af de indfødte biomolekyler er endnu mere udfordrende på grund af det lille Raman-tværsnit af de kemiske bindinger35. I disse eksperimenter blev der anvendt en 15 mW pumpelaser ved 805 nm og 7,5 mW Stokes-laser ved 1.045 nm, og der blev ikke observeret nogen signifikant fotoskade i 24 timer med et 3 minutters tidsinterval. Brug af følsomme Raman-tags kan reducere lasereffekten yderligere36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza og James Walsh) ved Binghamton University for design, fremstilling og test af mikroskopets kabinetboks. Vi takker Scott Hancock, Olga Petrova og Fabiola Moreno Olivas på Binghamton University for nyttige diskussioner. Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health under tildelingsnummer R15GM140444.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A lab-built SRS microscope | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| HF2LI 50 MHz lock-in amplifer | Zurich Instruments | HF2LI | |
| Iris diaphragm | Thorlabs Inc | SM1D12 | |
| Kinematic mirror mount | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Microscope frame | Nikon Inc | FN-1 | |
| Motorized microscopy stage | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Oil-immersion condenser (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Water-immersion objective (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materials and parts for the microscope enclosure (31'' x 29'' x 28'' L x W x H) | |||
| Airtherm heater module | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Airtherm heater controller, CO2 and humidity monitor | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Air/CO2 mixer module | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Flexible duct hose (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| High-temperature glass-mica ceramic, easy-to-machine (6'' x 6'', 1/4'' thickness) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Polycarbonate sheets (thickness 0.25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Silicone rubber sheets (36'' x 36'', thickness 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materials and parts for the Flexible chamber | |||
| Hot plate | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| High-purity inline filter, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Hole saw (cutting diameter 1-7/8 inch) | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Hole saw (cutting diameter 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| High-temperature silicone rubber tubing, soft, 2 mm ID, 5 mm OD | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Inline filter (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (1/8'' wall thickness, 4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum round tube (3/4'' wall thickness, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (12'' x 12'', thickness 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multipurpose 6061 Aluminum bar (8'' x 8'', thickness 3/8'') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Objective nosepiece (single) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Sample holder (modified) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Ultra-thin natural rubber film (thickness 0.01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Vacuum-sealable glass jar | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | SRS imaging software | |
| Materials for live-cell imaging | |||
| Cover glass bottom sterile culture dishes (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 70674-02 | |
| DMEM cell culture medium | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor fluorescent dye DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Oleic acid | MilliporeSigma | 364525 | |
| SKOV3 cell line | ATCC | HTB-77 |
References
- Mertz, J. Introduction to Optical Microscopy. , Cambridge University Press. (2019).
- Ettinger, A., Wittmann, T.
- Park, Y., Depeursinge, C., Popescu, G.
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
- lamo, P., et al. Fluorescent dye labeling changes the biodistribution of tumor-targeted nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1004 (2020).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), aaa870 (2015).
- Lu, F. K., et al. Label-free DNA imaging in vivo with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11624-11629 (2015).
- Hill, A. H., Fu, D. Cellular imaging using stimulated Raman scattering microscopy. Analytical Chemistry. 91 (15), 9333-9342 (2019).
- Buđa, R., Vukušić, K., Tolić, I. Methods in Cell Biology. (139), Elsevier. 81-101 (2017).
- Chiarelli, T. J., Grieshaber, N. A., Grieshaber, S. S. Live-cell forward genetic approach to identify and isolate developmental mutants in Chlamydia trachomatis. Journal of Visualized Experiments. (160), e61365 (2020).
- Lemon, W. C., McDole, K. Live-cell imaging in the era of too many microscopes. Current Opinion in Cell Biology. 66, 34-42 (2020).
- Birk, S. E., et al. Management of oral biofilms by nisin delivery in adhesive microdevices. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 167, 83-88 (2021).
- Watanabe, I., Okada, S. Effects of temperature on growth rate of cultured mammalian cells (L5178Y). Journal of Cell Biology. 32 (2), 309-323 (1967).
- Lac, A., Lam, A. L., Heit, B. Fluorescent Microscopy. , Springer. 57-73 (2022).
- Grossman, D. G. Machinable glass-ceramics based on tetrasilicic mica. Journal of the American Ceramic Society. 55 (9), 446-449 (1972).
- Yuan, Y., Shah, N., Almohaisin, M. I., Saha, S., Lu, F. Assessing fatty acid-induced lipotoxicity and its therapeutic potential in glioblastoma using stimulated Raman microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 1-14 (2021).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomedical Engineering Online. 2 (1), 1-9 (2003).
- Sun, M. W., Yuan, Y. H., Lu, F. K., Di Pasqua, A. J. Physicochemical factors that influence the biocompatibility of cationic liposomes and their ability to deliver DNA to the nuclei of ovarian cancer SK-OV-3 cells. Materials. 14 (2), 416 (2021).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ozeki, Y., Itoh, K. Stimulated Raman scattering microscopy for live-cell imaging with high contrast and high sensitivity. Laser Physics. 20 (5), 1114-1118 (2010).
- Zhang, X., et al. Label-free live-cell imaging of nucleic acids using stimulated Raman scattering microscopy. ChemPhysChem. 13 (4), 1054-1059 (2012).
- Stiebing, C., et al. Real-time Raman and SRS imaging of living human macrophages reveals cell-to-cell heterogeneity and dynamics of lipid uptake. Journal of Biophotonics. 10 (9), 1217-1226 (2017).
- Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
- Brzozowski, K., et al. Stimulated Raman scattering microscopy in chemistry and life science -Development, innovation, perspectives. Biotechnology Advances. 60, 108003 (2022).
- Hislop, E. W., Tipping, W. J., Faulds, K., Graham, D. Label-free imaging of lipid droplets in prostate cells using stimulated Raman scattering microscopy and multivariate analysis. Analytical Chemistry. 94 (25), 8899-8908 (2022).
- Chen, T., Yavuz, A., Wang, M. C. Dissecting lipid droplet biology with coherent Raman scattering microscopy. Journal of Cell Science. 135 (5), jcs252353 (2022).
- Cao, C., Zhou, D., Chen, T., Streets, A. M., Huang, Y. Label-Free digital quantification of lipid droplets in single cells by stimulated Raman microscopy on a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 88 (9), 4931-4939 (2016).
- Zhang, C., et al. Stimulated Raman scattering flow cytometry for label-free single-particle analysis. Optica. 4 (1), 103-109 (2017).
- Suzuki, Y., et al. Label-free chemical imaging flow cytometry by high-speed multicolor stimulated Raman scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (32), 15842-15848 (2019).
- Gala de Pablo, J., Lindley, M., Hiramatsu, K., Goda, K. High-throughput Raman flow cytometry and beyond. Accounts of Chemical Research. 54 (9), 2132-2143 (2021).
- Cole, R.
- Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048 (1), 321-330 (2005).
- Firestone, L., Cook, K., Culp, K., Talsania, N., Preston Jr, K. Comparison of autofocus methods for automated microscopy. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 12 (3), 195-206 (1991).
- Van Helvert, S., Storm, C., Friedl, P.
- Zong, C., et al. Plasmon-enhanced stimulated Raman scattering microscopy with single-molecule detection sensitivity. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
- Wei, L., et al.
