Summary
O modelo aberto de impacto do côndilo femoral medial em coelhos é confiável para estudar a osteoartrite pós-traumática (PTOA) e novas estratégias terapêuticas para mitigar a progressão da PTOA. Este protocolo gera um defeito cartilaginoso isolado do côndilo femoral medial posterior em coelhos utilizando uma torre de queda baseada em carruagem com cabeça de impacto.
Abstract
A osteoartrite pós-traumática (PTOA) é responsável por 12% de todos os casos de osteoartrite nos Estados Unidos. A PTOA pode ser iniciada por um único evento traumático, como uma carga de alto impacto atuando na cartilagem articular, ou por instabilidade articular, como ocorre com a ruptura do ligamento cruzado anterior. Atualmente, não existem terapêuticas eficazes para prevenir a PTOA. O desenvolvimento de um modelo animal confiável de PTOA é necessário para entender melhor os mecanismos pelos quais o dano cartilaginoso procede e investigar novas estratégias de tratamento para aliviar ou prevenir a progressão da PTOA. Este protocolo descreve um modelo de impacto do côndilo femoral de coelho aberto, baseado em torre de queda, para induzir dano cartilaginoso. Este modelo forneceu cargas de pico de 579,1 ± 71,1 N, e tensões de pico de 81,9 ± 10,1 MPa com uma carga de tempo para pico de 2,4 ± 0,5 ms. A cartilagem articular dos côndilos femorais mediais impactados (CFMs) apresentou maiores taxas de células apoptóticas (p = 0,0058) e possuía escores mais altos na Osteoarthritis Research Society International (OARSI) de 3,38 ± 1,43 em comparação com as CFMs contralaterais não impactadas (0,56 ± 0,42) e outras superfícies cartilaginosas do joelho impactado (p < 0,0001). Não foram detectadas diferenças nos escores do OARSI entre as superfícies articulares não impactadas (p > 0,05).
Introduction
A osteoartrite pós-traumática (OTP) é uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo, sendo responsável por 12%-16% da osteoartrite (OA) sintomática1. O padrão-ouro atual para o tratamento da OA terminal é a artroplastia total de joelho e quadril2 ou artrodese, como no caso da artrite tíbio-talar ou subtalar em estágio terminal. Apesar de amplamente bem sucedida, a artroplastia pode apresentar complicações dispendiosas e mórbidas3. Além disso, a artroplastia é menos desejável em pacientes com menos de 50 anos, dada a baixa sobrevida livre de revisões do implante de 77%-83%4,5. Atualmente, não existem tratamentos aprovados pela FDA para prevenir ou mitigar a progressão da PTOA.
A PTOA afeta toda a articulação, incluindo o tecido sinovial, o osso subcondral e a cartilagem articular. Caracteriza-se por degeneração da cartilagem articular, inflamação sinovial, remodelação óssea subcondral e formação de osteófitos6,7. O fenótipo da PTOA se desenvolve através de um complexo processo de interação entre cartilagem, sinóvia e osso subcondral. O entendimento atual é que a lesão da cartilagem leva à liberação de componentes da matriz extracelular (MEC), como colágeno tipo 2 (COL2) e agrecan (ACAN). Esses fragmentos componentes da MEC são pró-inflamatórios e causam aumento da produção de IL-6, IL-1β e espécies reativas de oxigênio. Esses mediadores atuam nos condrócitos, causando upregulation das metaloproteinases da matriz (MMPs), como as MMP-13, que degradam a cartilagem articular ao mesmo tempo em que diminuem a síntese da matriz, levando a um ambiente catabólico global para a cartilagemarticular8. Além disso, há evidências de aumento da apoptose de condrócitos na osteoartrite primária e na PTOA 9,10. A disfunção mitocondrial ocorre após carga suprafisiológica da cartilagem 11,12,13,14, o que pode levar ao aumento da apoptose dos condrócitos 12,15. O aumento da apoptose dos condrócitos tem sido associado ao aumento da depleção de proteoglicanos e do catabolismo cartilaginoso e tem demonstrado preceder alterações na remodelação da cartilagem e do osso subcondral16,17,18.
Como acontece com a maioria das doenças humanas, modelos confiáveis e translacionais de PTOA são necessários para entender melhor a fisiopatologia da doença e testar novas terapêuticas. Animais de grande porte, como suínos e caninos, têm sido utilizados em modelos de fratura intra-articular e impacto de PTOA17,19, mas são dispendiosos. Modelos animais menores, como camundongos, ratos e coelhos, são menos dispendiosos e utilizados para estudar a PTOA gerada pela desestabilização articular, que tipicamente envolve transecção cirúrgica do ligamento cruzado anterior (LCA) e/ou ruptura do menisco medial20,21,22,23,24,25. Embora o trauma articular possa levar a várias consequências, incluindo lesão ligamentar26, a sobrecarga mecânica da cartilagem ocorre em quase todos os casos.
Há evidências emergentes de que a patologia por trás do desenvolvimento da PTOA após instabilidade ligamentar (como na transecção do LCA) e lesão condral aguda é devida a mecanismos distintos27. Portanto, o desenvolvimento de modelos de lesão direta da cartilagem é importante. Atualmente, há um número limitado de modelos de impacto que geram lesão osteocondral ou condral em ratos ecamundongos28,29. No entanto, a cartilagem murina não é adequada para gerar defeitos condrais isolados. Isso ocorre porque a cartilagem articular murina tem apenas 3-5 camadas de células de espessura e não possui zonas organizadas de cartilagem superficial, radial e de transição, bem como a espessa camada de cartilagem calcificada encontrada em humanos e animais maiores. Modelos murinos também apresentam resolução espontânea de defeitos parciais da cartilagem30,31. Assim, escolhemos o coelho para este modelo de impacto, pois sua espessura e organização da cartilagem são semelhantes às dos seres humanos, e é o menor modelo animal que permitirá a entrega de um impacto condral consistente que resulta em PTOA. Modelos cirúrgicos abertos prévios de impacto do côndilo femoral em coelhos empregaram um pêndulo32, um dispositivo portátil de impactação de cartilagem carregado com mola 33 e uma torre de queda que permitiu a criação de impactores específicos para coelhos34. No entanto, esses estudos careciam de dados in vivo. Outros relataram dados in vivo com dispositivos de impacto baseados em pêndulo35, pneumáticos36 e37 carregados com mola10, e esses estudos mostram uma alta taxa de variabilidade nas taxas de pico de tensão e carregamento entre os métodos. Ainda assim, o campo carece de uma abordagem consistente para modelar de forma confiável o trauma agudo da cartilagem in vivo.
O protocolo atual emprega um sistema baseado em torre de queda para fornecer um impacto consistente no côndilo medial posterior do joelho do coelho. Uma abordagem posterior do joelho é empregada para expor o côndilo femoral medial posterior. Um pino de Steinman é então colocado através dos côndilos femorais de medial para lateral em linha com a superfície articular e fixado à plataforma. Uma vez fixada, uma carga é entregue ao côndilo femoral medial posterior. Este método permite que danos consistentes na cartilagem sejam administrados à superfície de sustentação de peso do fêmur distal do coelho.
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Protocol
O procedimento a seguir foi realizado com aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana. Todas as cirurgias de sobrevida foram realizadas em condições estéreis, conforme descrito pelas diretrizes do NIH. Os riscos de dor e infecção foram manejados com analgésicos e antibióticos adequados para otimizar os resultados bem-sucedidos. Coelhos machos da raça Nova Zelândia Brancos, esqueleticamente maduros, pesando entre 3,0 e 4,0 kg, foram utilizados para o presente estudo.
1. Fabricação de torre de queda
- Gere desenhos CAD para componentes da torre de queda, plataforma base e mecanismo para fixar o pino de Steinman (Figuras Suplementares 1-14).
- Compre componentes disponíveis comercialmente (Consulte a Tabela de Materiais).
- Adquira as peças da máquina do dispositivo ou dê desenhos CAD a um maquinista para fabricação.
NOTA: Um maquinista de alta precisão com capacidade de fabricação de ferramentas é necessário para fabricar a ponta do pêndulo de 3 mm de diâmetro (Figura Suplementar 1, parte 20 e Figuras Complementares 13,14). A face impactante da cabeça do pêndulo apresentava curvaturas de 7,14 mm e 5,56 mm nos planos sagital e coronal, respectivamente, para se adequar à curvatura do côndilo medial do coelho35 (Figuras Suplementares 13,14). - Montar peças de tal forma que a torre de queda consista em um carro viajando sobre duas hastes verticais através de rolamentos lineares de esferas de alinhamento fixo, e a plataforma de base suporta o coelho e prende o pino de Steinman (Figura 1 e Figura 2).
NOTA: A viga transversal do carro deste projeto tem uma rigidez à flexão igual à de uma torre de queda anterior38 com um nível de vibração aceitável.
2. Preparação dos animais
- Pesar o coelho e anestesiar-o com 2,5 mg/kg de alfaxalone e 0,15 mg/kg de midazolam IM (ver Tabela de Materiais). Aplique pomada ocular em ambos os olhos após a indução. Manter a anestesia com ~2%-3% de isoflurano. Administrar buprenorfina SR (0,1 mg/kg) SQ para analgesia e enrofloxacina (10 mg/kg) SQ perioperatória. No lugar da Buprenorfina, AINEs como Carprofeno, 4mg/kg ou Meloxicam, 0,2 – 0,3mg/kg ou Cetoprofeno, 3mg/kg podem ser administrados como injeções SQ.
- Faça a barba do membro posterior do coelho do tornozelo até os quartos traseiros. Recomenda-se cuidado extra na depilação de coelhos para evitar a contaminação da incisão. Usar um conjunto de cortadores de cabelo de coelho dedicados e afiados é importante.
- Coloque o bloco da perna dianteira de aço inoxidável (Figura Suplementar 1, parte nº 2 e Figura Suplementar 4) sob a extremidade da plataforma de impacto e cubra a plataforma com uma almofada de aquecimento. Coloque o esternal do coelho (ou seja, prono) sobre a almofada de aquecimento. Coloque uma saliência acolchoada sob o quadril contralateral.
- Certifique-se de que a extremidade operatória tenha o joelho centralizado e apoiado no bloco de polietileno (Figura 2A1). Use fita de seda para retrair suavemente a cauda superior e contralateral à extremidade operatória.
- Limpe o local cirúrgico com cloroexidina e gaze estéril embebida em álcool a 70%. Esfregar o sítio cirúrgico, começando pela região posterior do joelho, com varredura circular para fora. Repita pelo menos 3 vezes com esfoliantes frescos, terminando com álcool a 70%.
- Coloque uma luva estéril sobre o pé operatório até ao tornozelo e envolva-o com um invólucro estéril.
- Cobrir estérilmente o local cirúrgico com três campos: um diretamente sob a extremidade operatória e os outros dois para cobrir o resto do corpo. Prenda as cortinas com abraçadeiras de toalha.
3. Exposição cirúrgica
NOTA: Antes da cirurgia e do impacto, o peso e a altura da queda que causam danos visíveis na cartilagem sem fratura do osso subcondral devem ser determinados empiricamente para a cepa, idade e sexo específicos do coelho.
- Palpar a posição da patela anteriormente para estimar a posição da articulação do joelho, que está localizada distal à patela. Com uma lâmina de 15, faça uma incisão de 3 a 4 cm ao longo da face posterior do joelho estendido a partir do nível do polo superior da patela distalmente.
- Realizar dissecções rombas e nítidas através da fáscia superficial subjacente. Desenvolver o intervalo entre a pele medialmente e o gastrocnêmio medial lateralmente. Coloque um afastador Weitlaner auto-retentor neste intervalo (ver Tabela de Materiais).
- Uma camada fascial secundária tornar-se-á visível logo acima da artéria e veia safenas. Dissecção lateral à safena e retrair a vasculatura medialmente e o complexo gastrocóleo posterior lateralmente.
NOTA: Tome cuidado para não cortar esta vasculatura. Se essa artéria estiver lesada, assegure a ligadura adequada, pois pode ocorrer choque hemorrágico pós-operatório.
- Uma camada fascial secundária tornar-se-á visível logo acima da artéria e veia safenas. Dissecção lateral à safena e retrair a vasculatura medialmente e o complexo gastrocóleo posterior lateralmente.
- Dissecar distalmente até identificar uma pequena fabela móvel sobre o côndilo femoral medial posterior. Realizar uma artrotomia para mobilizar a fabela súperolateral, expondo o côndilo femoral medial subjacente. Remover suavemente os tecidos moles por dissecção romba e afiada para expor a face posterior do côndilo femoral medial. Use um auto-retentor Freer e Cricket (ver Tabela de Materiais) para retrair os tecidos moles neste nível.
- Mantendo o côndilo exposto, avançar um pino de Steinman de 0,062 polegada (ver Tabela de Materiais) através do fêmur distal, começando na face superior do côndilo femoral medial e centrado no sentido anteroposterior do côndilo femoral medial, a cerca de 5 mm da face posterior do côndilo.
- Conduza o fio lateralmente através do osso e da pele lateral paralelamente à superfície articular usando um driver de pino Steinman alimentado por bateria. A palpação do epicôndilo lateral garantirá o trajeto adequado do pino de Steinman.
- Retire os afastadores e feche a pele com uma sutura de polissorb 3-0 (ver Tabela de Materiais) de forma contínua. Cubra a incisão com gaze estéril.
4. Impacto do côndilo femoral
- Remova o drape sob o membro operatório e prenda o pino Steinman a uma plataforma de impacto de altura personalizável e ajustável. Primeiro, coloque o aspecto inferior ajustável em altura do aparelho de fixação do pino de Steinman sob o pino (Figura 2A2). Certifique-se de que o fio esteja paralelo ao terra nesta plataforma, ajustando as alturas do parafuso conforme necessário.
- Depois de garantir que o pino de Steinman esteja paralelo ao solo, coloque o aspecto baseado no parafuso superior da plataforma segura (Figura 2A3) no aspecto inferior baseado no parafuso da peça ajustável em altura. Certifique-se de que o pino Steinman esteja firmemente preso parafusando a barra superior na parte inferior ajustável da altura da plataforma de fixação do pino (Figura 2A2).
- Uma vez que o pino de Steinman esteja preso à plataforma, remova a sutura e reabra a incisão. Expor o côndilo femoral medial com afastadores Weitlaner e críquete auto-retentores. Um Freer adicional pode ser necessário para retrair tecido mole adicional para fora do caminho da ponta do pêndulo (Figura 2B).
- Limpe a torre de queda com um desinfetante aprovado. Conecte a cabeça estéril do pêndulo de 3 mm (Figura 2A4) ao carro da torre de queda. Trazer a torre de queda sobre a extremidade operatória e colocar sua base (Figura 2A6) abaixo da plataforma impactante (Figura 3A).
- Abaixe suavemente o pêndulo (Figura 2 Suplementar, parte 20 e Figura 13 Suplementar) sobre o centro do côndilo femoral medial posterior. Certifique-se de que nenhum tecido mole esteja no caminho do impactor.
- Mova o coelho ou a torre conforme necessário para garantir que a cabeça do pêndulo esteja centrada sobre o côndilo femoral medial posterior (Figura 3B). Sempre que o coelho for movido ou reposicionado, o sítio cirúrgico deve ser avaliado quanto a possíveis quebras para esterilidade e a área re-esterilizada se necessário.
- Uma vez assegurada a trajetória adequada, prenda a torre na plataforma com as braçadeiras de alternância (Figura 2A5, ver Tabela de Materiais).
- Administrar uma dose de alfaxalone intravenoso (0,5-0,7 mg/kg) 5-10 minutos antes do impacto para anestesia mais profunda sem aumentar a anestesia inalante.
OBS: A ausência do reflexo palpebral, da retirada do pedal e do reflexo do pavilhão auricular evidencia uma anestesia mais profunda. Essa anestesia mais profunda ajuda a prevenir possíveis reações dos membros durante a colocação no aparelho e durante o impacto.
CUIDADO: Se administrado muito rapidamente, alfaxalone pode causar apneia transitória e hipóxia em coelhos e deve ser administrado lentamente ao longo de 1-2 min. Se ocorrer hipóxia, assegure-se de oxigenação adequada e restauração dos sinais vitais antes de prosseguir. - Coloque o pêndulo na torre de queda na altura desejada acima do côndilo femoral medial. Para o conjunto de transporte atual, incluindo os rolamentos, com uma massa de 1,41 kg, esta é uma altura de 7 cm.
OBS: A altura da torre de queda foi determinada a partir de estudos piloto em tecido de cadáveres. Essa altura gerou dano visível da cartilagem, mas não fratura do osso subcondral para os coelhos deste estudo. - Clique no botão Iniciar no software de aquisição de dados LabVIEW (Supplementary Coding File 1) antes de liberar a parada do eixo (Figura Suplementar 2, item nº 14) para liberar o carro e permitir que ele caia sob a força da gravidade.
NOTA: O software de aquisição de dados coletará os dados de uma célula de carga (Figura 1, 6) posicionada entre o pêndulo e o carro e um acelerômetro (Figura 1, 7) durante o impacto a 100 kHz usando um laptop conectado a um módulo de aquisição de dados. - Coloque o arquivo txt gerado pelo software de aquisição de dados na mesma pasta com o código de análise de dados Matlab (Supplementary Coding File 2) e execute o código de análise de dados para filtrar dados brutos e calcular parâmetros de impacto.
- Certifique-se de que a carga máxima seja identificada. O ponto de tempo associado é considerado o tempo de deformação máxima e velocidade zero.
Observação : código de análise de dados irá analisar todos os arquivos txt na pasta e relatar os resultados para cada arquivo. O código determinará o início e o fim do impacto com base nas alterações nos dados de tempo de carregamento. Os dados do acelerômetro serão integrados numericamente para calcular a velocidade e integrados novamente para calcular o deslocamento. O código de análise de dados calculará numericamente o impulso, o trabalho e a energia cinética a partir das seguintes fórmulas:
onde F é a força medida pelo sensor de carga, x 0 e t 0 são o deslocamento e o tempo no início do impacto, e x, e tf são o deslocamento e o tempo no final do impacto. A taxa de carregamento será calculada numericamente como a média de dσ/dt na fase de carregamento do impacto. A tensão de pico será calculada dividindo-se a carga de pico pela área de contato da cabeça do pêndulo. - Realizar a visualização da superfície da cartilagem para determinar se ocorreu dano adequado à cartilagem (Figura 4A).
5. Fechamento do sítio cirúrgico
- Remova a torre de queda sobre a extremidade operatória. Coloque todas as ferramentas cirúrgicas usadas de lado e troque por novas luvas estéreis.
NOTA: Dado que a torre de queda não é estéril, todas as ferramentas utilizadas até o impacto devem agora ser consideradas contaminadas. - Reaplique um pano estéril no membro inferior e obtenha afastadores estéreis não utilizados.
- Reexpor o côndilo femoral medial e irrigar completamente o sítio cirúrgico com 50-60 mL de solução salina estéril.
- Fechar a cápsula posterior com uma sutura de polissorção 5-0, seguida de fechamento da pele com uma sutura monossorba 4-0 (ver Tabela de Materiais).
- Injetar 2 mL de lidocaína/bupivacaína para analgesia local ao redor da incisão por via intradérmica.
- Remova o pino de Steinman com um conjunto de drivers de alimentação (consulte a Tabela de Materiais) oscilando para minimizar a lesão de tecidos moles.
- Vestir a ferida com um curativo não adesivo, seguido de fita adesiva. Realizar radiografia da extremidade operatória para garantir que não tenha ocorrido fratura e colocação adequada dos pinos (Figura 4B).
6. Manejo pós-operatório
- Devolva o coelho à sua gaiola e monitore-o em mantas aquecidas até que ele se recupere da anestesia (~25 min).
- Continue monitorando de perto os coelhos por vários dias após a cirurgia para garantir que eles cicatrizem adequadamente e recuperem a mobilidade. Administrar enrofloxacina (10 mg/kg) por 2 dias de pós-operatório para profilaxia de infecção. Administrar analgesia com buprenorfina SR (0,1 mg/kg) por via subcutânea a cada 2-3 dias após a cirurgia e conforme necessário. No lugar da Buprenorfina, AINEs como Carprofeno, 4mg/kg SQ diariamente, Meloxicam, 0,2 – 0,3mg/kg SQ diariamente até 3 dias ou Ketoprofeno, 3mg/kg SQ diariamente podem ser administrados 3-5 dias após a cirurgia e conforme necessário.
OBS: Conseguimos prevenir deiscências pós-operatórias da ferida, por lamber ou mastigar coelhos, com a colocação de calças neonatais humanas sobre os membros pélvicos39. Se o coelho mastigar as calças, pode ser colocado um colar elizabetano (ver Tabela de Materiais) para evitar a mastigação da incisão.
7. Avaliação histológica
- À 16ª semana pós-lesão, colher os joelhos dos coelhos eutanasiados, fixá-los em formalina tamponada a 10% neutra por 48 h, seguida de inclusão em parafina e seccionamento em fatias de 5 μm de espessura.
- Após desparafinização e reidratação, corar os cortes com safranina O verde rápido conforme protocolos padrão40,41.
- Realizar o ensaio de marcação nick end da desoxinucleotidiltransferase terminal dUTP (TUNEL) nas seções usando o kit de detecção de apoptose cromogênica TUNEL seguindo as instruções do fabricante, contracorado com Hematoxilina42 (ver Tabela de Materiais).
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Representative Results
O sucesso desse procedimento foi monitorado imediatamente após o impacto pela visualização do côndilo pelo cirurgião (Figura 4A) e por radiografias para garantir que não ocorresse fratura (Figura 4B). Existe o risco de falha do impacto levando a uma fratura intraoperatória do côndilo. Isso ocorreu tipicamente devido à colocação inadequada do pino de Steinman (Figura 5). Utilizando esse modelo, houve uma taxa de falha da fratura secundária à fratura intraoperatória de 9,0% (6 de 67 cirurgias). O pico médio de estresse de impacto foi de 81,9 ± 10,1 MPa (CV = 12,3%), e a taxa de carga média foi de 36,6 ± 11,0 MPa/ms (CV = 30,1%). Outros parâmetros também foram consistentes, com os CVs variando de 5% a 23,5% (Tabela 1).
Cortes histológicos corados com verde de safranina O-fast das articulações do joelho de n = 8 coelhos foram avaliados quanto à degradação da cartilagem e patologia da osteoartrite usando o sistema de pontuação Osteoarthritis Research Society International (OARSI)43. Não foi observado dano cartilaginoso no côndilo femoral não lesado contralateral (Figura 6A) e localizou-se principalmente no local do impacto (Figura 6B). Os côndilos femorais mediais (CFM) impactados de 16 semanas apresentaram escores OARSI mais elevados de 3,38 ± 1,43 em comparação com os MFCs controles contralaterais com escore OARSI de 0,56 ± 0,42 (p < 0,0001) (Figura 6C). Além disso, as CFMs impactadas do joelho também apresentaram escores mais altos no OARSI do que o platô tibial medial (MTP; 0,71 ± 0,59), platô tibial lateral (LTP; 0,88 ± 0,64) e côndilo femoral lateral (CFC; 0,81 ± 1,00) do mesmo joelho (p < 0,0001) (Figura 6D). Por outro lado, não foram observadas diferenças nos escores do OARSI entre os compartimentos CFM (0,56 ± 0,42), LTP (0,50 ± 0,46), MTP (0,28 ± 0,45) e CFL (0,25 ± 0,46) do joelho contralateral não impactado (p > 0,05) (Figura 6E). Também não houve diferenças significativas entre as superfícies articulares LFC, MTP e LTP impactadas e não impactadas (p >0,05) (Figura 6F).
A cartilagem articular da MFC impactada colhida com 16 semanas apresentou níveis mais elevados de positividade para TUNEL (69,1 ± 14,4%), indicando aumento da apoptose dos condrócitos, em comparação com as CFM não impactadas (53,4% ± 12,4%) (p = 0,0058) (Figura 7).
Figura 1: Aparelho de torre de queda. (1) Hastes verticais. (2) Uma plataforma de alumínio na qual as hastes são prensadas. (3) Uma placa para conter ainda mais as hastes. (4) Rolamentos lineares de esferas de alinhamento fixo. (5) Cabeça do pêndulo montada no carro. (6) Célula de carga. (7) Acelerômetro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Componentes utilizados durante os procedimentos cirúrgicos e colocação do coelho no aparelho de impacto. (A) Aparelho utilizado para gerar lesão de cartilagem e identificação dos componentes: (1) plataforma de impacto de polietileno, (2) porção ajustável em altura do aparelho de fixação do pino de Steinman, (3) aspecto superior do aparelho de fixação do pino de Steinman com regulagem de altura, (4) cabeça do pêndulo estéril de 3 mm de diâmetro, (5) grampos de alternância para prender a plataforma de impacto ao aparelho da torre de queda e (6) base da plataforma de impacto. (B) Posicionamento do membro posterior do coelho com o pino de Steinman (indicado com setas vermelhas) fixado à plataforma antes do impacto do côndilo femoral medial posterior. Drapes foram omitidos dos números para fins de demonstração. Um cadáver foi utilizado para gerar as fotos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Posicionamento adequado do pêndulo no côndilo femoral medial . (A) Aparelho de impacto sobre o membro posterior do coelho que está preso à plataforma. (B) Posicionamento adequado da ponta do pêndulo no côndilo femoral medial antes do impacto. Drapes foram omitidos dos números para fins de demonstração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Defeito de cartilagem bem sucedido . (A) Aspecto macroscópico esperado da lesão cartilaginosa gerada com este modelo. Inset é uma área alargada da superfície da cartilagem impactada, com o defeito delineado com um círculo tracejado. (B) Posição adequada do pino de Steinman no fêmur distal, com pelo menos 5 mm de distância da superfície posterior da cartilagem e próxima ao ângulo da superfície articular (círculo radiolúcido nos côndilos femorais). Barra de escala = 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Defeito de cartilagem malsucedido. Radiografia mostrando pino mal posicionado no côndilo femoral medial, resultando em fratura osteocondral ao impacto. A seta vermelha aponta para o deslocamento do pino de Steinman. A seta preta aponta para a fratura do côndilo medial do fêmur. Barra de escala = 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Aumento da gravidade da osteoartrite no côndilo femoral medial impactado. Representativo (A) cortes contralaterais e (B) impactados de côndilos femorais mediais (CFM) corados com safranina-O (coloração vermelha do conteúdo de proteoglicanos) e Fast Green (coloração azul-esverdeada do tecido conjuntivo com menor conteúdo de proteoglicanos). Ampliação: 400x; barra de escala = 62,3 μm. (C) Pontuação OARSI da MFC impactada e controle. (D) Escores OARSI de todos os compartimentos articulares da articulação do joelho impactada. (E) Escores de OARSI dos compartimentos articulares da articulação contralateral do joelho não impactada. (F) Escores de OARSI dos compartimentos articulares dos joelhos impactados e não impactados. Côndilo femoral medial (CFM), platô tibial medial (PTM), platô tibial lateral (LTP) e côndilo femoral lateral (CFL). As comparações entre os grupos foram realizadas pelo teste t de Student ou ANOVA, seguido pelo teste post-hoc HSD de Tukey. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Condrócitos apoptóticos aumentados na CFM impactada. Imagens representativas mostrando cortes corados pelo TUNEL de (A) MFC contralateral não lesado e (B) MFC lesionado em 16 semanas pós-impacto em aumento de 400x. Barra de escala = 62,3 μm. A positividade do TUNEL é indicada pelos núcleos de cor marrom. (C) Quantificação de células TUNEL-positivas nas MFCs impactadas e controles. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Parâmetros de impacto do estudo. Isso inclui o Pico de Estresse (Megapascals; MPa), Carga de Pico (Newtons; N), Taxa de Carregamento (Megapascals por milissegundo; MPa/ms), Duração do Impacto (milissegundos; ms), Trabalho (Joules; J), Impulso (Newton segundos; N·s), Energia Cinética (Joules; J), Aceleração (metros por segundo ao quadrado; m/s2) e Tempo para Pico de Carga (milissegundos; ms). Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 2: Tempos de cirurgia de impacto. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 3: Vantagens e desvantagens do modelo atualmente descrito. Clique aqui para baixar esta tabela.
Figura suplementar 1: Descrição detalhada das peças e lista de peças da plataforma base. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2: Descrição detalhada das peças e lista de peças da Drop Tower. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 3: Desenho da Parte 01 – Mesa porta-coelhos. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Complementar 4: Desenho da Parte 02 – Perna dianteira. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Complementar 5: Desenho da Parte 03 – Perna principal. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 6: Desenho da base do suporte de fio 04-K da peça. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 7: Desenho da Parte 05 – Suporte de fio K da cabeça do parafuso. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Complementar 8: Desenho da Parte 06 – Placa de Polietileno. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 9: Desenho da Parte 07-Placa. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 10: Desenho da Parte 11 – Suporte superior. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 11: Desenho da Parte 16 – Placa Impactora. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 12: Desenho da Parte 17 – Viga do Impacto. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 13: Desenho da Parte 20 – Ponta do Impactador. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 14: Desenho da curvatura da cabeça da ponta do pêndulo. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 1: DropTestVIManual(1).vi. Clique aqui para baixar este arquivo.
Arquivo de codificação suplementar 2: ImpactAnalysis(1).m. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este procedimento cirúrgico visa gerar danos consistentes da cartilagem à superfície de sustentação de peso do côndilo femoral medial de coelhos em um modelo de PTOA. Uma vantagem desse procedimento é que a abordagem posterior do joelho permite a visualização direta do côndilo femoral medial posterior completo, podendo ser realizada em aproximadamente 37 min (Tabela 2). Deve-se ressaltar também que este é um modelo de lesão aberta e pode levar a alterações inflamatórias agudas além do impacto devido a potenciais danos à sinóvia e cápsula articular17,44. As vantagens e desvantagens do modelo estão resumidas na Tabela 3. Cuidados foram tomados para evitar danos às estruturas ligamentares e meniscais para garantir a estabilidade articular. Como resultado, não foram detectadas diferenças entre os membros controles contralaterais e os membros impactados nos compartimentos articulares fora da zona de impacto (platôs tibiais medial e lateral e côndilos femorais laterais).
O aspecto mais crítico deste protocolo é a geração de uma lesão de cartilagem isolada no côndilo femoral. A trajetória dos pinos de Steinman influencia fortemente o sucesso desse método. Se o fio não estiver paralelo à superfície articular ou se for colocado muito posteriormente em relação ao centro do côndilo femoral medial, pode levar a uma fratura osteocondral do côndilo femoral (Figura 5). O epicôndilo lateral é um ponto consistentemente palpável que pode ser usado para um trajeto adequado do pino.
Animais com fraturas do osso subcondral devem ser retirados do estudo. Para o presente método, tivemos uma taxa de falha secundária à fratura intraoperatória de 9,0% (6 de 67 cirurgias). Essa taxa de fratura é menor do que um modelo recente de impacto baseado em pêndulo aberto da CFM, que teve uma taxa de fratura de 28%45. Recomendamos testar este método com espécimes cadavéricos até que o cirurgião e a equipe do estudo se sintam confortáveis com a abordagem e o resultado. Este método foi testado em espécimes cadavéricos de membros posteriores e coelhos brancos inteiros da Nova Zelândia antes da experimentação in vivo .
Este método é comparável aos métodos de geração de danos agudos da cartilagem lapina publicados anteriormente. A taxa de carregamento desse modelo de impacto de 51,0 ± 16,0 MPa/ms foi superior à de trabalhos anteriores utilizando um pêndulo (em torno de 0,5 a 6 MPa/ms)35,46,47 ou um cilindro pneumático (~0,4 MPa/ms)36 e inferior à de um dispositivo de impacto com mola (~530 MPa/ms)37. A técnica de impacto atual modela uma carga moderada em comparação com os modelos anteriores, resultando em uma tensão de pico de 81,9 ± 10,1 MPa com um CV de 12,3%, que é consistente com os modelos anteriores de cargas pendulares, carregadas por mola e cilindros pneumáticos, com quatro modelos anteriores entregando tensões de 10,1-169 MPa, com CVs variando de 0,85-40,5%36,37, 45,46.
Uma limitação desse modelo é que ele não gerou fraturas osteocondrais e, portanto, não mimetizou completamente as fraturas intra-articulares típicas vistas no cenário clínico17. Observou-se também que a aceleração média do carro da torre de queda antes do impacto foi de 6,4 ± 0,4 m/s 2, menor do que a aceleração gravitacional em queda livre de 9,8 m/s2, provavelmente devido ao atrito dos rolamentos de esferas. Ainda assim, o método permite isolar os efeitos da patogênese da PTOA mediados pela cartilagem impactada, que não são totalmente compreendidos.
Embora vários modelos de lapina descritos proporcionem uma lesão condral, a utilização da abordagem posterior do joelho com o modelo de torre de queda destaca-se como um método simples, eficiente e clinicamente relevante de geração de PTOA, possibilitando o estudo de sua patogênese e testando novas terapêuticas. De modo geral, o modelo de lesão por impacto do côndilo femoral posteromedial aberto da lapina é uma plataforma promissora para estudar os eventos celulares e moleculares associados à PTOA e identificar novos alvos terapêuticos48,49 para prevenir ou mitigar a lesão da cartilagem.
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Disclosures
Roman Natoli dá palestras para a AO Trauma North America, é editor de seção da Current Osteoporosis Reports e recebeu royalties de livros didáticos de Morgan e Claypool. Todd McKinley recebe royalties da Innomed. Os demais autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo DoD Peer Reviewed Medical Research Program - Investigator-Initiated Research Award W81XWH-20-1-0304 da U.S. ARMY MEDICAL RESEARCH ACQUISITION ACTIVITY, pelo NIH NIAMS R01AR076477 e por um Comprehensive Musculoskeletal T32 Training Program do NIH (AR065971) e pelo NIH NIAMS Grant R01 AR069657. Os autores gostariam de agradecer a Kevin Carr por fornecer sua experiência em usinagem e fabricação para este projeto, e a Drew Brown e ao Indiana Center for Musculoskeletal Health Bone Histology Core por ajudar com a histologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flat head screw | McMaster-Carr | 92210A194 | Stainless steel hex drive flat head screw, 8-32, 1/2" |
| #15 scalpel blades | McKesson | 1029066 | Scalpel McKesson No. 15 Stainless Steel / Plastic Classic Grip Handle Sterile Disposable |
| 1/2”-20 threaded rod | McMaster-Carr | 99065A120 | 1/2”-20 threaded rod |
| 10 mL syringe | McKesson | 1031801 | For irrigation; General Purpose Syringe McKesson 10 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety |
| 3 mL syringe | McKesson | 1031804 | For lidocaine/bupiviacaine injection; General Purpose Syringe McKesson 3 mL Blister Pack Luer Lock Tip Without Safety. |
| 3-0 polysorb | Ethicon | J332H | 3-0 Vircryl, CT-2, 1/2 circle, 26 mm, tapered |
| 4-0 monosorb | Ethicon | Z397H | 4-0 PDS 2, FS-2, 3/8 circle, 19mm, cutting edge |
| 5-0 polysorb | Med Vet International | NC9335902 | Med Vet International 5-0 ETHICON COATED VICRYL C-3 |
| Accelerometer | Kistler | 8743A5 | Accelerometer |
| Adson-Browns Forceps | World precision tools | 500177 | Adson-Brown Forceps, 12 cm, Straight, TC Jaws, 7 x 7 Teeth |
| Alfaxalone | Jurox | 49480-002-01 | Alfaxan Multidose by Jurox : 10 mg/mL |
| Buprenorphine | Par Pharmaceuticals | 42023-0179-05 | Buprenorphine HCL injection: 0.3 mg/mL |
| Butorphanol | Zoetis | 54771-2033 | Butorphanol tartrate 10mg/ml by Zoetis |
| Chlorhexidine Hand Scrub | BD | 371073 | BD E-Z Scrub 107 Surgical Scrub Brush/Sponge, 4% CHG, Red |
| Collet | STRYKER | 14023 | Stryker 4100-62 wire Collet 0.28-0.71'' |
| Cordless Driver handpiece | STRYKER | OR-S4300 | Stryker 4300 CD3 Cordless Driver 3 handpiece |
| Cricket Retractors | Novosurgical | G3510 21 | 2x Heiss (Holzheimer) Cross Action Retractor |
| Dissector Scissors | Jorvet labs | J0662 | Aesculap AG, Metzenbaum, Scissors, Straight 5 3/4″ |
| Elizabethian Collar | ElizaSoft | 62054 | ElizaSoft Elizabethan Recovery Collar |
| Enrofloxacin | Custom Meds | Enrofloxacin compounded by Custom Meds | |
| Eye Ointment | Pivetal | 46066-753-55 | Pivetal Articifical Tears- recently recalled |
| Face-mount shaft collar | McMaster-Carr | 5631T11 | Face-mount shaft collar |
| Fast green | Millipore Sigma | F7258 | Fast green |
| Freer | Jorvet labs | J0226Q | Freer elevator |
| Head screw -1 | McMaster-Carr | 91251A197 | Black-oxide alloy steel socket head screw, 8-32, 3/4" |
| Head screw -2 | McMaster-Carr | 92196A194 | Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2" |
| Head screw -3 | McMaster-Carr | 92196A146 | Stainless steel socket head screw, 8-32, 1/2" |
| Head screw -4 | McMaster-Carr | 92196A151 | Stainless steel socket head screw, 6-32, 3/4" |
| Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | Millipore Sigma | GHS132-1L | Hematoxylin Solution, Gill No. 1 |
| Hex nut | McMaster-Carr | 91841A007 | Stainless steel hex nut, 6-32 |
| Hold-down toggle clamp | McMaster-Carr | 5126A71 | Hold-down toggle clamp |
| Impact device | n/a | n/a | custom made |
| Impact platform | n/a | n/a | custom made |
| K-wires | Jorvet Labs | J0250A | JorVet Intramedullary Steinman Pins, Trocar-Trocar 1/16" x 7" |
| Lab View | National Instruments | n/a | n/a |
| Load cell | Kistler | 9712B5000 | Load cell |
| MATLAB | The MathWorks Inc. | n/a | n/a |
| Microscope | Leica | DMi-8 | Leica DMi8 microscope with LAS-X software |
| Midazolam | Almaject | 72611-749-10 | Midazolam Hydrochloride injection: 5mg/ml by Almaject |
| milling machine depth stops | McMaster-Carr | 2949A71 | Clamp-on milling machine depth stops |
| Mobile C-arm | Philips | 718095 | BV Pulsera, Mobile C-arm |
| Mounted linear ball bearing | McMaster-Carr | 9338T7 | Mounted linear ball bearing |
| Needle Driver | A2Z Scilab | A2ZTCIN39 | TC Webster Needle Holder Smooth Jaws 5", Premium |
| Pentobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | Pentobarbital 390 mg/mL by Vortech |
| Safranin O | Millipore Sigma | HT90432 | Safranin O |
| Small Battery pack | STRYKER | NS014036 | 6212 Small Battery pack- 9.6 V |
| Steel rod, 2’ | McMaster-Carr | 89535K25 | Steel rod, 2’ |
| Sterile Saline | ICU Medical | 6139-22 | AquaLite Solution Pour Bottles, 250 mL |
| Stryker 6110-120 System 6 Battery Charger | STRYKER | OR-S6110-120 | |
| Surgical gloves | McKesson | 1044729 | Surgical Glove McKesson Perry Size 6.5 Sterile Pair Latex Extended Cuff Length Smooth Brown Not Chemo Approved |
| Surgical gown | McKesson | 1104452 | Non-Reinforced Surgical Gown with Towel McKesson Large Blue Sterile AAMI Level 3 Disposable |
| Suture scissors | Jorvet Labs | J0910SA | Super Cut Scissors, Mayo, Straight, 5 1/2″ |
| TUNEL staining kit | ABP Bioscience | A049 | TUNEL Chromogenic Apoptosis Detection Kit |
| Weitlaner Retractors | Fine Science Tools | 17012-11 | 2x Weitlaner-Locktite Retractors |
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