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Bioengineering

निलंबित 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए गेलेशन के दौरान कतरनी प्रसंस्करण द्वारा गठित एगारोस फ्लूइड जैल

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/64458
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 2
1Department of Pharmacy, University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering, University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering, University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences, University of Manchester
* These authors contributed equally

Summary

हाइड्रोगेल गठन के दौरान कतरनी प्रसंस्करण के परिणामस्वरूप माइक्रोगेल निलंबन का उत्पादन होता है जो कतरनी बलों को हटाने के बाद कतरनी-पतला लेकिन तेजी से पुनर्गठन करता है। ऐसी सामग्रियों का उपयोग बायोप्रिंटिंग कॉम्प्लेक्स, सेल से लदी संरचनाओं के लिए सहायक मैट्रिक्स के रूप में किया गया है। यहां, सहायक बिस्तर और संगत बायोइंक के निर्माण के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का वर्णन किया गया है।

Abstract

बायोप्रिंटिंग प्रक्रिया के दौरान भागों का समर्थन करने के लिए दानेदार मैट्रिसेस का उपयोग पहली बार 2015 में भट्टाचार्जी एट अल द्वारा रिपोर्ट किया गया था, और तब से, 3 डी बायोप्रिंटिंग में सहायक जेल बेड की तैयारी और उपयोग के लिए कई दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। यह पेपर अगारोस (द्रव जैल के रूप में जाना जाता है) का उपयोग करके माइक्रोजेल निलंबन बनाने की एक प्रक्रिया का वर्णन करता है, जिसमें कण गठन गेलेशन के दौरान कतरनी के आवेदन से नियंत्रित होता है। इस तरह के प्रसंस्करण सावधानीपूर्वक परिभाषित माइक्रोस्ट्रक्चर का उत्पादन करते हैं, जिसमें बाद के भौतिक गुण होते हैं जो रासायनिक और यांत्रिक रूप से प्रिंट मीडिया को एम्बेड करने के रूप में अलग-अलग फायदे प्रदान करते हैं। इनमें शून्य कतरनी पर विस्कोस्टिक ठोस जैसी सामग्री के रूप में व्यवहार करना, लंबी दूरी के प्रसार को सीमित करना और फ्लोकुलेटेड सिस्टम के विशिष्ट कतरनी-पतले व्यवहार का प्रदर्शन करना शामिल है।

कतरनी तनाव को हटाने पर, हालांकि, द्रव जैल में उनके लोचदार गुणों को तेजी से पुनर्प्राप्त करने की क्षमता होती है। हिस्टैरिसीस की यह कमी सीधे परिभाषित माइक्रोस्ट्रक्चर से जुड़ी हुई है जिसे पहले संदर्भित किया गया था; प्रसंस्करण के कारण, कण इंटरफ़ेस पर प्रतिक्रियाशील, गैर-गेल्ड बहुलक श्रृंखलाएं वेल्क्रो प्रभाव के समान इंटरपार्टिकल इंटरैक्शन की सुविधा प्रदान करती हैं। लोचदार गुणों की यह तेजी से वसूली कम-चिपचिपाहट बायोमैटेरियल्स से उच्च-रिज़ॉल्यूशन भागों को बायोप्रिंट करने में सक्षम बनाती है, क्योंकि सपोर्ट बेड का तेजी से सुधार बायोइंक को सीटू में फंसाता है, इसके आकार को बनाए रखता है। इसके अलावा, अगारोस द्रव जैल का एक लाभ असममित गेलिंग / पिघलने संक्रमण (~ 30 डिग्री सेल्सियस का गेलेशन तापमान और ~ 90 डिग्री सेल्सियस का पिघलने का तापमान) है। अगारोस का यह थर्मल हिस्टैरिसीस सहायक द्रव जेल पिघलने के बिना सीटू में बायोप्रिंटेड भाग को प्रिंट और कल्चर करना संभव बनाता है। यह प्रोटोकॉल दिखाता है कि अगारोस द्रव जैल का निर्माण कैसे किया जाए और निलंबित-परत योजक निर्माण (एसएलएएम) के भीतर जटिल हाइड्रोगेल भागों की एक श्रृंखला के उत्पादन का समर्थन करने के लिए उनके उपयोग को प्रदर्शित करता है।

Introduction

हाइड्रोगेल सेल विकास के लिए समर्थन के रूप में उपयोग करने के लिए एकदम सही सामग्री हैं। उपयोग की जाने वाली सामग्री के आधार पर, वे कोमल तंत्र के माध्यम से जेल करते हैं जो सेल व्यवहार्यता 2,3 से समझौता नहीं करते हैं। उच्च जल सामग्री (आमतौर पर >90%) का मतलब है कि पोषक तत्व और ऑक्सीजन आसानी से सामग्री में फैल सकते हैं और सेल चयापचय के अपशिष्ट उत्पादफैल सकते हैं। जैसे, सेल व्यवहार्यता को 1 वर्ष5 से अधिक की अवधि के लिए संरक्षित दिखाया गया है, और अब भविष्य के चिकित्सीय उपयोग के लिए कोशिकाओं को स्टोर या "रोकने" के लिए हाइड्रोगेलका उपयोग करने के उदाहरण हैं। ऊतक जैसी संरचनाओं के उत्पादन के लिए ऊतक इंजीनियरिंग में उनका व्यापक रूप से उपयोग किया गया है, लेकिन उनका उपयोग सामग्री की संरचना और संरचना दोनों को नियंत्रित करने में कठिनाई से सीमित होता है। ऐतिहासिक रूप से, हाइड्रोगेल की ताकत तुलनात्मक रूप से कम है (कई कठोर ऊतकों के संबंध में), संरचना बनाने वाले बहुलक मैट्रिक्स द्वारा कब्जा किए गए उच्च जल सामग्री और कम मात्रा के कारण। इसके अलावा, गेलेशन (थर्मल, आयोनोट्रोपिक, फाइब्रिलोजेनेसिस) के कई मार्ग काफी धीमी गति से कैनेटीक्स प्रदान करते हैं, जिसका अर्थ है कि उनके यांत्रिक गुण समय के साथ लगातार विकसित होते हैं। इंटरपेनिट्रेटिंग नेटवर्क के अपवाद के साथ, कम यांत्रिक कठोरता और धीमी गति से इलाज के समय के परिणामस्वरूप अक्सर बायोइंक होते हैं जो जमाव पर मुक्त होने में असमर्थ होते हैं, "मंदी" का इरादा रखते हैं और शुरू में एक्सट्रूडेड होने पर परिभाषा खो देते हैं।

इस प्रमुख मुद्दे को दूर करने के प्रयास में, एम्बेडेड प्रिंटिंग तकनीकों को विकसित किया गया है जो मुद्रण के दौरान सहायता प्रदान करते हैं, जबकि निर्माण के यांत्रिक गुण 7,8 विकसित हो रहे हैं। एक बार जब जेल का माइक्रोस्ट्रक्चर पूरी तरह से विकसित हो जाता है और यांत्रिक गुण इष्टतम तक पहुंच जाते हैं, तो समर्थन मैट्रिक्स को हटाया जा सकता है, आमतौर पर कोमल धोने या समर्थन चरण के पिघलने के माध्यम से। इस दृष्टिकोण पर प्रारंभिक कार्य में एक चिपचिपा प्लूरोनिक फैलाव का उपयोग किया गया था जिसमें द्वितीयक चरण9 वितरित किया गया था। हाल ही में, भट्टाचार्जी एट अल ने दानेदार कार्बोपोल के रूप में जैल का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया कि सहायक जेल10 में कोशिकाओं के सरणी को निलंबित किया जा सकता है। इसके बाद, हिंटन एट अल ने जेल-आधारित सामग्रियों के एक्सट्रूज़न पर एक समर्थन बिस्तर में कोशिकाओं की सूचना दी जिसमें दानेदार जिलेटिन11 से गठित माइक्रोगेल निलंबन शामिल था। सेल युक्त हाइड्रोगेल के एक्सट्रूज़न और इसके बाद के इलाज के बाद, जिलेटिन को समर्थन स्नान के कोमल हीटिंग द्वारा हटा दिया गया था, जिससे जिलेटिन पिघलने में सक्षम था। दुर्भाग्य से, यह प्रक्रिया अभी भी कई सीमाएं प्रस्तुत करती है। उदाहरण के लिए, कोलेजन की तुलना में जिलेटिन की रासायनिक संरचना (परिणामस्वरूप यह कोलेजन का हाइड्रोलाइज्ड रूप है) ऐसी है कि इसकी रीढ़ की हड्डी में कई रासायनिक गुण जैविक संस्थाओं के साथ बातचीत कर सकते हैं; इस प्रकार, एक अवशिष्ट समर्थन मैट्रिक्स डाउनस्ट्रीम जैविक प्रक्रियाओं में हस्तक्षेप कर सकता है। इसके अलावा, पशु-व्युत्पन्न उत्पाद एक तकनीक की हस्तांतरणीयता की ओर देखते समय प्रतिबंधात्मक उपयोग करते हैं। यह चुनौतियां पैदा करता है यदि निर्मित भाग को चिकित्सकीय रूप से उपयोग करने का इरादा है, या भले ही इसका उपयोग मौलिक जैविक प्रश्नों के उत्तर देने के लिए किया जाना है, जहां यह सतह संदूषण एक महत्वपूर्ण मुद्दा पैदा कर सकता है।

हमने बाद में एक परिष्कृत प्रक्रिया बनाई है जो एक सहायक मैट्रिक्स के भीतर हाइड्रोगेल के निलंबित निर्माण की अनुमति देती है, जिसमें शारीरिक परिस्थितियों के तहत कोई शुल्क नहीं है और गैर-पशु सामग्री से बनता है। यद्यपि प्रक्रिया का उपयोग बायोपॉलीमेरिक समर्थन की एक श्रृंखला के साथ किया जा सकता है, अगारोस एक ऐसी सामग्री प्रदान करता है जो जैविक बातचीत के लिए निष्क्रिय है क्योंकि यह चीनी आधारित है और शारीरिक पीएच12,13 पर तटस्थ रूप से चार्ज किया जाता है। पहले से मौजूद जेल को खंडित करने के बजाय, समर्थन सामग्रीगेलेशन 14,15,16 के दौरान कतरनी के आवेदन के माध्यम से बनती है। यह कणों का एक मैट्रिक्स पैदा करता है जो उनकी सतह पर डेंड्रोन जैसी विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं और अनजेल्ड बहुलक17,18 के द्वितीयक मैट्रिक्स में फैले होते हैं। परिणाम 19,20,21,22 दिलचस्प सामग्री गुणों वाली एक सामग्री है जो पहले रिपोर्ट किए गए दानेदार जैल के समान तरीके से कतरनी-पतली हो सकती है, लेकिनकतरनी को हटाने पर चिपचिपाहट को अधिक तेजी से ठीक करती है। एक बार जब सहायक मैट्रिक्स में बाहर निकाली गई सेल-असर सामग्री पूरी तरह से परिपक्व हो जाती है, तो समर्थन मैट्रिक्स को संस्कृति में रखे जाने से पहले कोमल आंदोलन के माध्यम से हटाया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि जटिल संरचनाओं के साथ सामग्री का उत्पादन करने और त्वचा और ओस्टियोकॉन्ड्रल क्षेत्र23,24,25 दोनों की जैविक संरचनाओं को पुन: उत्पन्न करने के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग करना संभव है। यह विधि पेपर विस्तार से वर्णन करता है कि सहायक सामग्री का निर्माण कैसे किया जाए और विभिन्न जटिल संरचनाओं के भीतर उपयोग किए जाने वाले उपयुक्त बायोइंक पर प्रकाश डाला जाए।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, अभिकर्मकों, उपकरणों और सॉफ़्टवेयर से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. द्रव जेल निलंबन बिस्तर की तैयारी

  1. 2,000 एमएल ग्लास बोतल में 1,000 एमएल अल्ट्राप्योर पानी (टाइप 1, >18 मीटर सेमी -1) में 5 ग्राम अगारोस पाउडर जोड़कर 1,000 एमएल छितरी हुई अगारोस (0.5% डब्ल्यू / वी) तैयार करें।
  2. जलीय मिश्रण में 70 मिमी चुंबकीय स्टिरर बार जोड़ें और बोतल की टोपी को पहले पूरी तरह से कसकर और फिर एक चौथाई मोड़ से ढीला करके सुरक्षित करें।
  3. कांच की बोतल को आटोक्लेव की टोकरी में रखकर, ढक्कन बंद करके और 121 डिग्री सेल्सियस और 1 बार पर 15 मिनट के लिए चक्र चलाकर मिश्रण को घोलें और निष्फल करें।
    नोट: यह प्रोटोकॉल हमेशा आगे के चरणों में ऑटोक्लेविंग समाधान के लिए उपयोग किया जाता है।
  4. एक बार जब ऑटोक्लेव 80 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाता है तो बोतल को ऑटोक्लेव से निकालें और इसे चुंबकीय स्टिरर (बिना गर्म) पर रखें, जिसमें 800 आरपीएम पर सरगर्मी सेट हो।
    चेतावनी: बोतल और तरल गर्म रहते हैं।
  5. लगातार सरगर्मी बनाए रखते हुए, परिवेश की परिस्थितियों में सोल को ठंडा करें, जब तक कि तापमान इसके टीजेल (गेलिंग पॉइंट), 32 डिग्री सेल्सियस से कम न हो।
  6. बोतल को स्टिरर से निकालें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: तरल पदार्थ जेल को आवश्यकता होने तक संग्रहीत किया जा सकता है।

2. बायोइंक की तैयारी

  1. अल्ट्राप्योर पानी (टाइप 1, >18 m.cm-1) में कम एसाइल गेलन गम के 1% (w / w) सोल का उपयोग करके एक गेलन-आधारित बायोइंक तैयार करें।
    1. एक वजन वाली नाव में 0.5 ग्राम गेलन पाउडर का वजन करें।
    2. चुंबकीय हलचल के साथ, 100 एमएल ग्लास बोतल में 49.5 ग्राम अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें।
    3. गेलन शक्ति युक्त वजन वाली नाव को आधे में मोड़ें और पाउडर को धीरे-धीरे पानी में डालें, लगातार हिलाते हुए।
    4. एक ऑटोक्लेव का उपयोग करके सोल को घोलें और निष्फल करें और इसे 20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
    5. बायोइंक को आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. अल्ट्राप्योर पानी (टाइप 1, >18 m.cm-1) में पेक्टिन-कोलेजन मिश्रित बायोइंक तैयार करें।
    1. एक वजन नाव में 2.5 ग्राम पेक्टिन पाउडर का वजन करके स्टॉक 5% (डब्ल्यू / वी) कम-मेथॉक्सी पेक्टिन समाधान तैयार करें।
    2. चुंबकीय हलचल के साथ, 100 एमएल ग्लास बोतल में 50 एमएल अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें।
    3. पेक्टिन शक्ति युक्त वजन वाली नाव को आधे में मोड़ें और पाउडर को धीरे-धीरे पानी में डालें, लगातार हिलाते हुए।
    4. जलीय मिश्रण को ऑटोक्लेव करें और 20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
    5. 1: 1 और 2: 1 पेक्टिन-कोलेजन मिश्रणों को तैयार करें या तो 3 एमएल कोलेजन समाधान में पेक्टिन समाधान के 3 एमएल जोड़कर या क्रमशः 2 एमएल कोलेजन समाधान में पेक्टिन समाधान के 4 एमएल जोड़कर। मिश्रण को 10 गुना वापस लेकर और वितरित करके, पिपेट का उपयोग करके मिश्रणों को धीरे से मिलाएं।
      नोट: कोलेजन के समय से पहले गेलेशन को रोकने के लिए बर्फ पर ठंड सामग्री का उपयोग करके यह प्रक्रिया सबसे अच्छी तरह से की जाती है। मिश्रण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करके पेक्टिन और कोलेजन की प्रीकूलिंग प्राप्त की जा सकती है।
    6. आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. अल्ट्राप्योर पानी (टाइप 1, >18 m.cm-1) में एक एल्गिनेट-कोलेजन मिश्रित बायोइंक तैयार करें।
    1. एक वजन नाव में 2 ग्राम एल्गिनेट पाउडर का वजन करें।
    2. चुंबकीय हलचल के साथ, 100 एमएल ग्लास बोतल में 50 एमएल अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें।
    3. एल्गिनेट पावर युक्त वजन वाली नाव को आधे में मोड़ें और पाउडर को धीरे-धीरे पानी में डालें, लगातार हिलाते हुए।
    4. फैलाव को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें, निरंतर सरगर्मी के तहत, जब तक कि एल्गिनेट पूरी तरह से भंग न हो जाए (स्पष्ट, थोड़ा भूरा तरल), और फिर 20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो जाए।
    5. डीएमईएम के 25 एमएल में 25 एमएल एल्गिनेट समाधान जोड़कर सेल कल्चर माध्यम जैसे कि डलबेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के साथ एल्जिनेट समाधान को पतला करें।
    6. 3 एमएल कोलेजन समाधान में 3 एमएल एल्गिनेट/डीएमईएम घोल जोड़कर एल्गिनेट-कोलेजन मिश्रण (1: 1) तैयार करें। मिश्रण को 10 गुना वापस लेकर और वितरित करके पिपेट का उपयोग करके मिश्रणों को धीरे से मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: कोलेजन के समय से पहले गेलेशन को रोकने के लिए बर्फ पर ठंड सामग्री का उपयोग करके यह प्रक्रिया सबसे अच्छी तरह से की जाती है। मिश्रण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण करके पेक्टिन और कोलेजन की प्रीकूलिंग प्राप्त की जा सकती है।

3. बायोइंक के रियोलॉजिकल लक्षण वर्णन

  1. रिओमीटर चालू करें, 40 मिमी सेरेटेड ज्यामिति डालें, और 30 मिनट तक खड़े रहने दें।
  2. शून्य-अंतराल ऊंचाई फ़ंक्शन का उपयोग करके रिओमीटर की अंतराल ऊंचाई को शून्य करें।
  3. नीचे की प्लेट पर ~ 2 एमएल नमूना जोड़ें और 1 मिमी की अंतर ऊंचाई बनाने के लिए शीर्ष ज्यामिति को कम करें।
  4. प्लेटों के बीच से निष्कासित अतिरिक्त सामग्री को हटाकर नमूने को ट्रिम करें। ऐसा करने के लिए, अतिरिक्त तरल पदार्थ को अंतराल से दूर खींचने और टिशू पेपर के साथ भिगोने के लिए एक सपाट, गैर-अपघर्षक किनारे का उपयोग करें।
    नोट: चरण 3.2-3.4 निम्न चरणों में से प्रत्येक से पहले नमूना बदलने के लिए दोहराया जाता है।
  5. बायोइंक की इंजेक्टेबिलिटी निर्धारित करने के लिए विस्कोमेट्री प्रोफाइल करें।
    1. उपयोगकर्ता विकल्पों से विस्कोमेट्री परीक्षण का चयन करें।
    2. कतरनी दर-नियंत्रित रैंप परीक्षण के लिए मापदंडों को इनपुट करें: 1 मिनट रैंप समय के साथ 0.1 से 500 एस -1।
    3. चरण 3.5.2 में कतरनी दर-नियंत्रित रैंप परीक्षण से निर्धारित ऊपरी और निचले तनाव का उपयोग करके तनाव नियंत्रण के तहत नए नमूनों पर विस्कोमेट्री रैंप परीक्षण दोहराएं।
  6. बायोइंक की गेलिंग विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए छोटे विरूपण परीक्षण करें।
    1. उपयोगकर्ता विकल्पों से ऑसिलेटरी परीक्षण का चयन करें।
    2. निरंतर तनाव के तहत एकल आवृत्ति परीक्षण में इनपुट पैरामीटर: आवृत्ति 1 हर्ट्ज, 1 घंटे से अधिक तनाव 0.5%, जबकि स्याही जैल।
  7. गेल्ड नमूनों पर सीटू आयाम और आवृत्ति माप करें।
    1. उपयोगकर्ता विकल्पों से ऑसिलेटरी परीक्षण का चयन करें।
    2. आयाम स्वीप का चयन करें और आयाम स्वीप परीक्षण के लिए मापदंडों को इनपुट करें जो तनाव-नियंत्रित है: 0.01 से 500%, एक स्थिर 1 हर्ट्ज आवृत्ति पर।
    3. एक नया नमूना लोड करें और उपयोगकर्ता विकल्पों से ऑसिलेटरी परीक्षण का चयन करें। फिर, 0.01 और 10 हर्ट्ज के बीच आवृत्ति परीक्षण, और इनपुट आवृत्ति मापदंडों का चयन करें और चरण 3.7.2 (आमतौर पर एलवीआर के 50% और 80% के बीच का मान) में प्राप्त आयाम स्वीप डेटा से निर्धारित स्पेक्ट्रा के रैखिक विस्कोस्टिक क्षेत्र (एलवीआर) के भीतर एक तनाव है।

4. 3 डी बायोप्रिंटर का उपयोग करके 3 डी संरचनाओं को डिजाइन और प्रिंट करना

  1. सीएडी मॉडल की पीढ़ी शुरू करने के लिए सीएडी सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
    1. उपकरण का चयन करें | चुने हुए बायोइंक के लिए मुद्रण मापदंडों को परिभाषित करने के लिए सीएडी सॉफ्टवेयर में सामग्री।
    2. उपयोग किए जा रहे प्रिंटर के लिए प्रासंगिक इनपुट प्रिंटिंग पैरामीटर; उदाहरण के लिए, 3 डी डिस्कवरी के लिए, प्रत्येक परत की जेड मोटाई निर्धारित करने के लिए मोटाई टैब में अनुमानित फिलामेंट व्यास (~ 200-500 μm अधिकांश बायोइंक के लिए) इनपुट करें।
      नोट: अंतिम निर्माण का डिलेमिनेशन मोटाई मूल्य को बढ़ाने की आवश्यकता का संकेत है, जबकि रिज़ॉल्यूशन का नुकसान मोटाई को कम करने की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है।
    3. सॉफ्टवेयर में लेयर टैब का उपयोग करके वांछित संरचना परत दर परत डिजाइन करें। समूह टैब का उपयोग करके परतों को समूहीकृत करें और स्तर टैब का उपयोग करके प्रत्येक परत को Z विमान पर एक स्तर पर असाइन करें ।
      1. उदाहरण के लिए, एक जाली संरचना उत्पन्न करने के लिए (चरण 2.3 में तैयार एक एल्गिनेट-कोलेजन मिश्रित बायोइंक का उपयोग करके), एक्स अक्ष के साथ फिलामेंट्स के साथ एक परत बनाएं और वाई अक्ष के साथ फिलामेंट्स के साथ एक दूसरी परत बनाएं। दोनों को एक अलग स्तर पर असाइन करें।
    4. समूह टैब के तहत, संरचना में दोहराई गई इकाइयों की संख्या का चयन करके निर्माण ऊंचाई निर्धारित करें।
    5. डिज़ाइन के लिए G-कोड बनाने के लिए जनरेट टूल क्लिक करें और संरचना का 3D रेंडर देखें.
  2. बायोकैड बंद करें और मुद्रण प्रक्रिया शुरू करने के लिए 3 डी डिस्कवरी मानव-मशीन इंटरफ़ेस (एचएमआई) सॉफ्टवेयर लॉन्च करें।
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रिंटहेड को इकट्ठा करें। चुने हुए एक्सट्रूज़न नोजल में माइक्रोवाल्व को प्रिंटहेड और स्क्रू पर माउंट करें।
    2. प्रिंटहेड को कैलिब्रेट करने के लिए सुई लंबाई माप फ़ंक्शन पर क्लिक करें।
    3. मुद्रण मंच पर एक संस्कृति पोत (जैसे, एक 6-वेल प्लेट) लोड करें।
    4. बायोइंक को प्रिंटिंग कार्ट्रिज में और स्क्रू को माइक्रो-वाल्व के ऊपर प्रिंटहेड में डालें।
    5. इकट्ठे प्रिंटहेड को वायवीय दबाव प्रणाली से कनेक्ट करें और संलग्न करने के लिए एचएमआई पर प्रिंटहेड का चयन करें।
    6. एक्सट्रूज़न दबाव की ट्यूनिंग की अनुमति देने के लिए चेक प्रेशर पर क्लिक करें।
    7. एक बार एक उपयुक्त दबाव का चयन हो जाने के बाद (वांछित रिज़ॉल्यूशन के आधार पर ~ 30-120 केपीए ), पहले उत्पन्न जी-कोड खोलें और मुद्रण प्रक्रिया शुरू करने के लिए रन पर क्लिक करें।

5. त्वचा एनालॉग्स की तैयारी

  1. डीएमईएम में मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट्स (एचडीएफ) और वसा-व्युत्पन्न स्टेम सेल (एडीएससी) को भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (10%), एचईपीईएस बफर (2.5%), और टी 75 फ्लास्क में पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) के साथ पूरक किया जाता है जब तक कि 90% कंफ्लुएंसी तक नहीं पहुंच जाता है। केराटिनोसाइट ग्रोथ मीडिया (केजीएम) में मानव एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स (एचईके) को 70% -80% कंफ्लुएंसी तक पहुंचने तक संस्कृति करें। संस्कृति के दौरान एक इनक्यूबेटर में सभी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 95% हवा की शर्तों के तहत रखें।
  2. त्वचीय और वसा बायोइंक के लिए एचडीएफ और एडीएससी की तैयारी के लिए, फ्लास्क में 3 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) को धीरे से पाइप करके कोशिकाओं को धोएं, कोशिकाओं पर पीबीएस को घुमाने के लिए फ्लास्क को झुकाएं, और एस्पिरेट करें, इस बात का ध्यान रखते हुए कि संलग्न कोशिकाओं को परेशान न किया जाए।
    1. कोशिकाओं को उठाने के लिए, कोशिकाओं को कवर करने के लिए फ्लास्क में 3 एमएल 1 एक्स सेल पृथक्करण एंजाइम होता है और फ्लास्क को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में रखता है, कोशिकाओं को हटाने के लिए हाथ की हथेली के खिलाफ फ्लास्क को मजबूती से टैप करता है। पूर्ण डीएमईएम के 6 एमएल का उपयोग करके एंजाइम की कार्रवाई को बेअसर करें।
      नोट: टैपिंग के बाद कोशिकाएं संलग्न रहती हैं तो 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. त्वचीय और वसा बायोइंक की तैयारी के लिए, सेल निलंबन को अलग-अलग 15 एमएल ट्यूबों में विभाजित करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल गिनती के लिए प्रत्येक से 10 μL लें। कोशिकाओं को पेलेट करने के लिए 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर शेष सेल सस्पेंशन को सेंट्रीफ्यूज करें।
    3. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, गोली को परेशान न करने के लिए सावधान रहें, उपयुक्त बहुलक समाधान जोड़ें (चरण 2.2 में तैयार), और निम्नलिखित घनत्व पर पाइपिंग द्वारा कोमल उत्तेजना का उपयोग करके मिश्रण करें:
      1. वसा परत के लिए, पिपेट 5 × 105 एडीएससी एमएल -1 प्रति 1: 1 कोलेजन से पेक्टिन मिश्रण।
      2. पैपिलरी परत के लिए, पिपेट 3 × 106 एचडीएफ एमएल -1 प्रति 2: 1 कोलेजन से पेक्टिन मिश्रण।
      3. जालीदार परत के लिए, पिपेट 1.5 × 106 एचडीएफ एमएल -1 प्रति 2: 1 कोलेजन से पेक्टिन मिश्रण।
  3. प्रिंट करने के लिए, प्रत्येक बायोइंक को एक अलग कारतूस में लोड करें और अनुभाग 4 में दिए गए निर्देशों के अनुसार ग्लास पेट्री डिश में सहायक द्रव जेल में निर्माण को प्रिंट करें।
    1. एक बार मुद्रण पूरा हो जाने के बाद, निर्माण के चारों ओर 200 mM CaCl2:2H 2O के 2 mL और 3 mL एडिपोजेनिक मीडिया (पूर्ण DMEM के साथ पूरक 500 μM isobutyl-methylxanthine [IBMX], 50 μM इंडोमेथासिन, और 1 μM dexamethasone) को सिरिंज और सुई का उपयोग करके द्रव जेल में इंजेक्ट करें। रात भर एक इनक्यूबेटर में रखें।
    2. अगले दिन, स्पैटुला का उपयोग करके समर्थन स्नान से निर्माण को हटा दें, धीरे से पीबीएस में धो लें, और 6-वेल प्लेट में एडिपोजेनिक माध्यम में 14 दिनों के लिए कल्चर करें।
    3. 14 दिनों के बाद, निर्माण की सतह पर एक वायु-तरल इंटरफ़ेस बनाने के लिए पर्याप्त माध्यम निकालें और एपिडर्मल परत बनाने के लिए निर्माण के ऊपर 2 × 106 केराटिनोसाइट्स बीज लें।
    4. विश्लेषण से पहले 1 सप्ताह के लिए संस्कृति।

6. कैरोटिड धमनी मॉडल की तैयारी

  1. गेलन गम बायोइंक समाधान (जैसा कि चरण 2.1 में तैयार किया गया है) को प्रिंटर कारतूस में लोड करें।
  2. अनुभाग 4 में मुद्रण निर्देशों के अनुसार द्रव जेल समर्थन सामग्री वाले पेट्री डिश के भीतर कैरोटिड धमनी मॉडल को प्रिंट करें।
  3. एक बार मुद्रण पूरा हो जाने के बाद, सिरिंज और सुई का उपयोग करके निर्माण के चारों ओर200 mM CaCl 2:2H 2O के 2 एमएल इंजेक्ट करें।
  4. कम से कम 3 घंटे के बाद, स्पैटुला का उपयोग करके समर्थन स्नान से निर्माण को हटा दें और धीरे से पीबीएस में धो लें।

Representative Results

एल्गिनेट और टाइप 1 कोलेजन बायोइंक
प्रिंट रिज़ॉल्यूशन (फिलामेंट व्यास के कार्य के रूप में दर्ज) को एक्सट्रूज़न दबाव (चित्रा 1 ए-सी) में परिवर्तन के माध्यम से सीधे अक्षम पाया गया था। एक्सट्रूज़न दबाव और प्रिंट रिज़ॉल्यूशन सीधे 30 केपीए के एक्सट्रूज़न दबाव पर मुद्रण के माध्यम से उत्पन्न सबसे छोटे फिलामेंट व्यास से संबंधित थे। दिलचस्प बात यह है कि 30 kPa के एक्सट्रूज़न दबाव पर, एक्सट्रूज़न नोजल के आंतरिक व्यास से मेल खाने वाले फिलामेंट्स उत्पन्न किए जा सकते हैं (औसत फिलामेंट व्यास: 323 μm ± 50 μm; नोजल व्यास: 300 μm), यह सुझाव देते हुए कि "अधिकतम रिज़ॉल्यूशन" प्राप्त किया जा सकता है। इसके अलावा, इस संकल्प के लिए मुद्रण मापदंडों को सफलतापूर्वक एक एल्गिनेट / कोलेजन संवहनी ट्यूब की पीढ़ी पर लागू किया जा सकता है जिसे निकाला और संक्रमित किया जा सकता है (चित्रा 1 डी)।

Figure 1
चित्रा 1: स्लैम का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रिंट की पीढ़ी। कोलेजन लैटिस के प्रिंट रिज़ॉल्यूशन को (ए) 30 केपीए, (बी) 60 केपीए, और (सी) 120 केपीए पर एक्सट्रूज़न के माध्यम से फिलामेंट व्यास के कार्य के रूप में तैयार करना। (डी) एक एल्गिनेट / कोलेजन संवहनी ट्यूब का उत्पादन। स्केल सलाखों = 400 μm (A-C), 10 mm (D)। संक्षिप्त नाम: एसएलएएम = निलंबित-परत योजक निर्माण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

त्वचा एनालॉग्स
एसएलएएम का उपयोग कोलेजन आई और पेक्टिन के मिश्रण से गठित बायोइंक का उपयोग करके त्वचा जैसी संरचना (चित्रा 2 ए) बनाने के लिए भी किया गया था। त्वचा में पाए जाने वाले यांत्रिक गुणों के ढाल को प्राप्त करने के लिए, पेक्टिन और कोलेजन के विभिन्न अनुपातों का उपयोग त्वचीय (5% डब्ल्यू / डब्ल्यू पेक्टिन को 5 मिलीग्राम - एमएल -1 कोलेजन स्टॉक के साथ 2: 1 पर मिश्रित) और हाइपोडर्मल (5% डब्ल्यू / डब्ल्यू पेक्टिन को 5 मिलीग्राम एमएल -1 कोलेजन स्टॉक के साथ 1: 1 पर मिश्रित) परतों में किया गया था। परिणामी संरचना (चित्रा 2बी-बीआईआई) डीएमईएम में विसर्जन के बाद अच्छी तरह से एकीकृत की गई थी, जिसमें डिलेमिनेशन का कोई संकेत नहीं था। महत्वपूर्ण रूप से, संस्कृति के 14 दिनों की अवधि के बाद संरचना में सेल व्यवहार्यता का एक उच्च स्तर था (चित्रा 2बीiii)। दिलचस्प बात यह है कि संस्कृति की अवधि में, सामग्री24 तक कठोर हो गई, जो सामग्री के रीमॉडेलिंग का संकेत देती है।

Figure 2
चित्र 2: त्वचा जैसी संरचना का उत्पादन. (A) एक योजनाबद्ध यह दर्शाता है कि मानव त्वचीय फाइब्रोब्लास्ट के साथ एम्बेडेड एक स्तरित संरचना का उत्पादन करने के लिए स्लैम प्रक्रिया का उपयोग कैसे किया गया था. यहां निलंबित बिस्तर अगारोस से बने कणों से निर्मित किया गया था, जबकि हाइपोडर्मल और त्वचीय परतें पेक्टिन और कोलेजन I के अलग-अलग अनुपात से बनी थीं। इस संरचना (ii) को दोहराने में सफलता के साथ, पूरे नमूने में सेल व्यवहार्यता के उच्च स्तर का उल्लेख किया गया था, जैसा कि कैल्सीन-एएम स्टेनिंग (iii) द्वारा दिखाया गया है। स्केल बार = 5 मिमी (बीआईआई)। संक्षिप्त नाम: एसएलएएम = निलंबित-परत योजक निर्माण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्रीवा धमनी
विधि की सीमाओं को आगे बढ़ाने के लिए, अधिक जटिल प्रिंटों का चयन किया गया था। ऐसे ही एक उदाहरण में, एक विभाजित कैरोटिड धमनी को 1% गेलन बायोइंक (चित्रा 3 ए) का उपयोग करके मुद्रित किया गया था, जिसे तब द्रव जेल बिस्तर (चित्रा 3 बी) के भीतर200 एमएम सीएसीएल 2 के एक्सट्रूज़न द्वारा क्रॉसलिंक किया गया था और बस गेलेशन (चित्रा 3 सी) के बाद समर्थन से उठाया गया था। कम चिपचिपाहट का प्रदर्शन करने वाले अग्रदूत मुद्रण समाधानों के बावजूद, सहायक बिस्तर जटिल ज्यामिति के उत्पादन को सक्षम करने में सफल रहा। अतिरिक्त मचान को शामिल करने के लिए प्रिंट कोड को संशोधित करने की आवश्यकता के बिना, धमनी ने जमाव, क्रॉसलिंकिंग और निष्कर्षण (चित्रा 3) के दौरान अपनी संरचना को बनाए रखा।

Figure 3
(ए) प्रिंटिंग के दौरान द्रव जेल बिस्तर के भीतर गेलन का एक्सट्रूज़न, (बी) क्रॉसलिंकिंग के दौरान द्रव जेल के भीतर कैरोटिड धमनी प्रिंट पूरा किया, और (सी) द्रव जेल समर्थन से पुनर्प्राप्ति के बाद अंतिम कैरोटिड धमनी मॉडल। स्केल पट्टियाँ = 10 मिमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

सहायक बिस्तर के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्रियों के चयन पर विचार
विकास चरण के दौरान, सहायक बिस्तर की विभिन्न विशेषताओं की आवश्यकता थी। इन विशेषताओं में शामिल हैं: i) एक्सट्रूडेड सामग्री को निलंबित करने के लिए पर्याप्त संरचना बनाए रखना; ii) प्रिंटहेड को सहायक सामग्री के माध्यम से स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने की अनुमति देने के लिए कतरनी पतली क्षमता; iii) तेजी से पुनर्गठन (आत्म-उपचार गुण), जमा बायोइंक के आसपास समर्थन बनाना; iv) कमरे के तापमान और शारीरिक तापमान दोनों पर थर्मल रूप से स्थिर; v) तटस्थ (यानी, अनचार्ज्ड) सामग्री जो पीएच और इलेक्ट्रोलाइट्स (आयनिक प्रजातियों और सांद्रता) की एक श्रृंखला में अपेक्षाकृत बायोइनर्ट है, कोशिकाओं और चार्ज बायोइंक के साथ बातचीत को रोकती है; vi) गैर विषैले; और, vii) अधिमानतः एक गैर-पशु स्रोत से।

यद्यपि कई बायोपॉलिमर सामग्री हैं जो इन अंतर्निहित विशेषताओं में से कई को बनाए रखती हैं, इन सभी विशेषताओं 11,26,27 के अनुरूप निलंबित 3 डी योजक निर्माण करने की क्षमता के साथ, यहां इरादा एक सहायक बिस्तर का उत्पादन करना था जो अन्य सहायक सामग्रियों से जुड़े कुछ व्यावहारिक मुद्दों को दूर करेगा। अगारोस के रासायनिक गुणों के कारण और विशेष रूप से, जब कण द्रव जेल के रूप में तैयार किया जाता है, तो इन सभी विशेषताओं को प्राप्त किया जा सकता है। इसने एक सहायक बिस्तर को सक्षम किया जिसका उपयोग विभिन्न प्रकार के बायोइंक 23,24,25,28 में किया जा सकता है। दरअसल, सामग्री की जैवअक्षर प्रकृति ने पूरे संस्कृति में सीटू में मुद्रित संरचना को बनाए रखने की क्षमता प्रदान की, जिससे जीव विज्ञान में बदलाव के बिना कई अलग-अलग बायोइंक को पूरी तरह से विकसित करने के लिए पर्याप्त टाइमस्केल की अनुमति मिली। इसके अलावा, कण, पतली प्रकृति ने अंतिम मुद्रित निर्माण से हटाने में आसानी की अनुमति दी, जबकि गैर विषैले, गैर-पशु मूल नैतिक और नियामक आवश्यकताओं से संबंधित बाधाओं पर काबू पाने के लिए क्लिनिक की ओर तेजी से अनुवाद की क्षमता की अनुमति देता है।

बायोइंक के लिए सामग्री के चयन में विचार
डायरेक्ट-एक्सट्रूज़न बायोप्रिंटिंग में, बायोइंक को 2 डी प्रिंट बेड पर जमा किया जाता है। यह फायदेमंद है कि मोनोमर बायोइंक समाधानों में कतरनी-पतला व्यवहार होता है; हालांकि, शारीरिक रूप से प्रासंगिक आयामों के साथ उच्च-निष्ठा संरचनाओं का उत्पादन करने के लिए, उनके पास कम थिक्सोट्रोपी होना चाहिए और पर्याप्त रूप से उच्च चिपचिपाहट तक ठीक होना चाहिए ताकि वेजमाव पर ठोस फिलामेंट्स बना सकें। बढ़ी हुई चिपचिपाहट के साथ, एक्सट्रूज़न के लिए आवश्यक दबाव बहुत अधिक है, अक्सर एनकैप्सुलेटेड सेल व्यवहार्यता31,32 को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। सस्पेंशन बायोप्रिंटिंग इस सीमा को हटा देता है, क्योंकि एक्सट्रूडेड सामग्री को क्रॉसलिंकिंग के दौरान निलंबन स्नान द्वारा समर्थित किया जाता है। यह विकास बायोइंक योगों की सीमा को काफी बढ़ाता है जिनका उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हाल के काम ने कम सांद्रता वाले कोलेजन समाधानों के उपयोग को हृदय की आंतरिक संरचना 33,34,35 के अनुरूप अत्यधिक जटिल ज्यामिति में मुद्रित किया है। इस पद्धति में उल्लिखित अनुप्रयोगों में, एम्बेडेड प्रिंटिंग ने बायोमटेरियल स्याही को शारीरिक वातावरण को सर्वोत्तम रूप से दोहराने के लिए चुनने की अनुमति दी, जिसके लिए उनका इरादा था, बजाय उनके मुद्रित होने की क्षमता के लिए।

संरचना के आकार में सीमाएं
बायोफैब्रिकेशन साहित्य के दौरान, यह प्रदर्शित किया गया है कि वैकल्पिक प्रिंटहेड प्रौद्योगिकियों द्वारा संचालित विभिन्न प्रकार के बायोप्रिंटर को एम्बेडेड विनिर्माण तकनीकों में शामिल किया जा सकता है। यहां प्रदर्शित तकनीक अलग नहीं है, उदाहरणों के साथ जिसमें एक वायवीय माइक्रो-एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर (INKREDIBLE) शामिल है, जैसा कि सीनियर एट अल द्वारा प्रदर्शित किया गया है, और नियंत्रणीय माइक्रोवाल्व्स (3 डी डिस्कवरी) 23 के साथ एक्सट्रूज़न-आधारित बायोप्रिंटर। यद्यपि यह तकनीक को उन उपयोगकर्ताओं की एक श्रृंखला के लिए सुलभ बनाता है जो पहले से ही बायोप्रिंटर के मालिक हो सकते हैं, संरचना के प्राप्य आकार पर सीमाएं अंततः बायोप्रिंटर विनिर्देशों पर निर्भर हैं। प्रारंभ में, बड़ी संरचनाओं की पीढ़ी पर मुख्य प्रतिबंध को प्रिंट बेड के आकार, एक्स, वाई और जेड प्रक्षेपवक्रों की सीमाओं और उस पोत के आकार से भी परिभाषित किया जाता है जिसमें सहायक द्रव जेल निहित होता है।

समाधान में सीमाएं
जटिल, माइक्रोमीटर आकार की संरचनाओं का निर्माण करते समय, परिणामी रिज़ॉल्यूशन प्रिंटर की सटीकता (चरण आकार पर नियंत्रण, एक्सट्रूज़न की डिग्री), प्रिंट नोजल के आंतरिक व्यास और प्रिंट गति, प्रिंट दबाव और प्रवाह वेग36 सहित समायोज्य सॉफ़्टवेयर मापदंडों की एक श्रृंखला पर अत्यधिक निर्भर होता है। इसके अलावा, ड्रॉपलेट आकार पर नियंत्रण उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचनाओं की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए महत्वपूर्ण प्रतीत होता है, जिसमें नियंत्रणीय माइक्रोवाल्व के साथ एक्सट्रूज़न प्रिंटर में सबसे अच्छे परिणाम देखे जाते हैं। अंततः, जब सभी मापदंडों को अनुकूलित किया जाता है, तो माइक्रोमीटर स्केल37 के क्रम पर जमा फिलामेंट के साथ, एक्सट्रूज़न नोजल के आंतरिक व्यास से मेल खाने के लिए प्रिंट रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जा सकता है, या उससे भी कम हो सकता है। हालांकि, यह पहले उल्लिखित सभी मुद्रण मापदंडों के अनुकूलन पर निर्भर है, और रिज़ॉल्यूशन मुद्रण तंत्र और परिशुद्धता द्वारा काफी सीमित हो सकता है। उदाहरण के लिए, वायवीय एक्सट्रूज़न, एक नियंत्रणीय माइक्रोवाल्व के साथ एक्सट्रूज़न के समान मुद्रण संकल्प की अनुमति नहीं देता है। इसलिए, अधिकतम मुद्रण संकल्प प्राप्त करने के लिए एक संभावित लागत निहितार्थ है, क्योंकि ऐसे सिस्टम उपयोगकर्ता के लिए काफी अधिक खर्च उठाते हैं।

भविष्य का दृष्टिकोण और क्षमता
फिलहाल, एम्बेडेड कोशिकाओं वाले जटिल नरम संरचनाओं के उत्पादन की अनुमति देने के लिए निलंबित विनिर्माण प्रक्रियाओं के उपयोग के आसपास बहुत रुचि है, और आने वाले वर्षों में निस्संदेह महत्वपूर्ण प्रगति होगी। प्रिंट रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने में निरंतर प्रगति दी गई है, हालांकि यह देखा जाना बाकी है कि यह कितना आवश्यक होगा, यह देखते हुए कि अधिकांश जैविक प्रणालियां आणविक स्तर पर खुद को पुनर्व्यवस्थित करने में सक्षम हैं। जबकि मीडिया में रुचि का ध्यान चोट या बीमारी के बाद सीधे मानव ऊतकों को बदलने के लिए 3 डी मुद्रित ऊतकों के उपयोग के आसपास है, इन प्रक्रियाओं द्वारा सक्षम कोई भी मजबूत चिकित्सा प्रक्रिया कुछ साल दूर है। यह अधिक संभावना है कि इन जटिल संस्कृति प्रणालियों का प्रभाव दवाओं की स्क्रीनिंग में होगा या यहां तक कि जैविक प्रक्रियाओं की हमारी समझ को बढ़ाने के लिए उपकरण के रूप में भी उपयोग कियाजाएगा। विशेष रूप से, विकासात्मक जीव विज्ञान यहां बहुत लाभ उठा सकता है, जहां अणुओं के विशेष जमाव पर सटीक नियंत्रण शोधकर्ताओं को ऊतक विकास प्रक्रियाओं पर बहुक्रियाशील प्रणालियों की भूमिका का पता लगाने की अनुमति देगा।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक इस काम को वित्त पोषित करने और समर्थन करने के लिए ईपीएसआरसी (ईपी / एल016346/1), एमआरसी और डॉक्टरेट ट्रेनिंग एलायंस बायोसाइंसेज फॉर हेल्थ को धन्यवाद देना चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Discovery Bioprinter RegenHU BIOFACTORY Microvalve extrusion bioprinter
Agarose  Merck 9012-36-6 Material used to create fluid gel support baths 
Benchtop autoclave Prestige Medical B8L75814 Classic
Brilliant Blue G Merck 6104-58-1 Dye used to stain structures 
Calcium Chloride Dihydrate Merck  10035-04-8 Used to reticulate printed structures 
Dexamethasone Merck  D4902-25MG Used in adipogenic media
DMEM Merck D6429 Cell culture media
Duran  bottle  Merck Z305219 glass bottle 
EVOS XL Core Imaging System EVOS™ AMEX1000 Brightfield microscope with phase contrast
FBS Fisher Scientific 10500-064 Cell culture media supplement
Gellan gum Special Ingredients 5060341112638 Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model
HEPES buffer Merck H9897-10PAK Buffer for cell culture media
Indomethacin Merck I7378 Used in adipogenic media
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) Merck I7018-100MG Used in adipogenic media
Keratinocyte growth medium Lonza 00192060 Used as media to culture keratinocytes
Low Methoxy Pectin CP Kelco LM-5CS Pectin used to make pectin/collagen blends
Penicillin-streptomycin Merck P4333-100ML Used to inhibit bacterial growth
PureCol EZ Gel solution Merck 5074 Collagen solution used to make alginate/collagen blends
Sodium Alginate Merck 9005-38-3 Alginate powder used to make alginate/collagen blends 
TrypLE select  Fisher Scientific 12563011 cell dissociation enzyme
T75 Flasks StarLab CC7682-4175 Used for culturing cells

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 195
निलंबित 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए गेलेशन के दौरान कतरनी प्रसंस्करण द्वारा गठित एगारोस फ्लूइड जैल
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