Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Agarosevæskegeler dannet ved forskydningsbehandling under gelering til suspenderet 3D-bioprint

Published: May 26, 2023 doi: 10.3791/64458
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4, 1, 2
1Department of Pharmacy, University of Huddersfield, 2School of Chemical Engineering, University of Birmingham, 3Chemical and Biological Engineering, University of Colorado Boulder, 4School of Biological Sciences, University of Manchester
* These authors contributed equally

Summary

Forskydningsbehandling under hydrogeldannelse resulterer i produktion af mikrogelsuspensioner, der forskydningstynde, men hurtigt omstruktureres efter fjernelse af forskydningskræfter. Sådanne materialer er blevet anvendt som en understøttende matrix til bioprinting komplekse, cellebelastede strukturer. Her beskrives metoder, der anvendes til fremstilling af støttesengen og kompatible bioblæk.

Abstract

Brugen af granulære matricer til at understøtte dele under bioprintprocessen blev først rapporteret af Bhattacharjee et al. i 2015, og siden da er der udviklet flere tilgange til forberedelse og anvendelse af understøttende gelsenge i 3D-bioprint. Dette papir beskriver en proces til fremstilling af mikrogelsuspensioner ved hjælp af agarose (kendt som flydende geler), hvor partikeldannelse styres af påføring af forskydning under gelering. En sådan behandling producerer omhyggeligt definerede mikrostrukturer med efterfølgende materialeegenskaber, der giver klare fordele som indlejring af trykte medier, både kemisk og mekanisk. Disse omfatter at opføre sig som viskoelastiske faste materialer ved nulforskydning, begrænse langtrækkende diffusion og demonstrere den karakteristiske forskydningsfortyndingsadfærd af flokkulerede systemer.

Ved fjernelse af forskydningsspænding har væskegeler imidlertid kapacitet til hurtigt at genvinde deres elastiske egenskaber. Denne mangel på hysterese er direkte forbundet med de definerede mikrostrukturer, der tidligere blev hentydet til; På grund af behandlingen letter reaktive, ikke-gelerede polymerkæder ved partikelgrænsefladen interpartikelinteraktioner - svarende til en velcroeffekt. Denne hurtige genvinding af elastiske egenskaber muliggør bioprint af dele med høj opløsning fra biomaterialer med lav viskositet, da hurtig reformation af støttelejet fanger bioblækket in situ og bevarer sin form. Desuden er en fordel ved agarosevæskegeler de asymmetriske gelerings-/smelteovergange (geleringstemperatur på ~30 °C og smeltetemperatur på ~90 °C). Denne termiske hysterese af agarose gør det muligt at udskrive og dyrke den bioprintede del in situ uden at den understøttende væskegel smelter. Denne protokol viser, hvordan man fremstiller agarosevæskegeler og demonstrerer deres anvendelse til at understøtte produktionen af en række komplekse hydrogeldele inden for additivfremstilling med suspenderet lag (SLAM).

Introduction

Hydrogels er perfekte materialer til brug som understøtninger til cellevækst1. Afhængigt af det anvendte materiale gelerer de via blide mekanismer, der ikke kompromitterer cellelevedygtigheden 2,3. Det høje vandindhold (typisk >90%) betyder, at næringsstoffer og ilt let kan diffundere ind i materialet, og affaldsprodukter fra cellemetabolisme diffundererud 4. Som sådan har cellelevedygtighed vist sig at være bevaret i perioder på over 1 år5, og der er nu eksempler på, at hydrogeler bruges til at opbevare eller "pause" celler til fremtidig terapeutisk brug6. De har været meget udbredt inden for vævsteknik til fremstilling af vævslignende strukturer, men deres anvendelse har tendens til at være begrænset af vanskeligheden ved at kontrollere både materialets struktur og sammensætning. Historisk set er hydrogelstyrken forholdsvis lav (i forhold til mange hårde væv) på grund af det høje vandindhold og lave volumener, der optages af polymermatrixen, der danner strukturen. Desuden tilbyder mange veje til gelering (termisk, ionotropisk, fibrillogenese) rimelig langsom kinetik, hvilket betyder, at deres mekaniske egenskaber har tendens til at udvikle sig støt med tiden. Med undtagelse af interpenetrerende netværk resulterer lav mekanisk stivhed og langsomme hærdningstider ofte i bioblæk, der ikke er i stand til at stå frit ved aflejring, hvilket har tendens til at "falde" og miste definition, når de oprindeligt ekstruderes.

I et forsøg på at overvinde dette nøgleproblem er der udviklet indlejrede trykteknikker, der yder støtte under udskrivning, mens konstruktionens mekaniske egenskaber udvikler 7,8. Når gelens mikrostruktur er fuldt udviklet, og de mekaniske egenskaber når et optimalt, kan støttematrixen fjernes, typisk gennem skånsom vask eller smeltning af støttefasen. Det indledende arbejde med denne fremgangsmåde udnyttede en viskøs pluronisk dispersion, hvori den sekundære fase blev fordelt9. For nylig brugte Bhattacharjee et al. geler i form af granuleret carbopol til at demonstrere, at arrays af celler kunne suspenderes i støttegelen10. Efterfølgende rapporterede Hinton et al. om ekstrudering af gelbaserede materialer indeholdende celler i en støtteseng, der bestod af en mikrogelsuspension dannet af granulær gelatine11. Efter ekstrudering af den celleholdige hydrogel og dens efterfølgende hærdning blev gelatinen fjernet ved forsigtig opvarmning af støttebadet, hvilket muliggjorde smeltning af gelatinen. Desværre har denne proces stadig flere begrænsninger. For eksempel er den kemiske struktur af gelatine sammenlignet med kollagen (følgelig at det er en hydrolyseret form for kollagen) sådan, at mange kemiske dele på tværs af rygraden kan interagere med biologiske enheder; En reststøttematrix kan således interferere med biologiske processer nedstrøms. Desuden udgør animalske produkter restriktiv anvendelse, når man ser på oversætteligheden af en teknologi. Dette skaber udfordringer, hvis den fremstillede del er beregnet til at blive brugt klinisk, eller endda hvis den skal bruges til at besvare grundlæggende biologiske spørgsmål, hvor denne overfladeforurening kan forårsage et væsentligt problem.

Vi har efterfølgende skabt en raffineret proces, der muliggør suspenderet fremstilling af hydrogeler inden for en støttende matrix, der ikke har nogen ladning under fysiologiske forhold og er dannet af ikke-animalske materialer. Selvom processen kan anvendes med en række biopolymere understøtninger, giver agarose et materiale, der er inert over for biologiske interaktioner, da det er sukkerbaseret og neutralt ladet ved fysiologisk pH12,13. I stedet for at fragmentere en allerede eksisterende gel dannes støttematerialet ved påføring af forskydning under gelering14,15,16. Dette producerer en matrix af partikler, der udviser dendronlignende træk på deres overflade og dispergeres i en sekundær matrix af ugeleret polymer17,18. Resultatet er et materiale med interessante materialeegenskaber 19,20,21,22, der kan fortyndes på samme måde som tidligere rapporterede granulerede geler, men har tendens til at genvinde viskositeten hurtigere, når forskydning fjernes 23. Når det cellebærende materiale, der ekstruderes ind i bærematrixen, er fuldt modnet, kan støttematrixen fjernes gennem blid omrøring, før den placeres i kultur. Det har vist sig, at det er muligt at bruge denne proces til at producere materialer med komplekse strukturer og rekapitulere de biologiske strukturer i både hud og osteochondral region23,24,25. Dette metodepapir beskriver detaljeret, hvordan man fremstiller støttematerialet og fremhæver passende bioblæk, der anvendes inden for en række komplekse strukturer.

Protocol

BEMÆRK: Se materialetabellen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser, udstyr og software, der anvendes i denne protokol.

1. Fremstilling af væskegelophængssengen

  1. Forbered 1.000 ml dispergeret agarose (0,5% w/v) ved at tilsætte 5 g agarosepulver til 1.000 ml ultrarent vand (type 1, >18 mΩ·cm-1) i en 2.000 ml glasflaske.
  2. Tilsæt en 70 mm magnetisk omrørerstang til den vandige blanding, og fastgør flaskehætten ved først at stramme helt og derefter løsne med en kvart omdrejning.
  3. Blandingen opløses og steriliseres ved at lægge glasflasken i autoklavens kurv, lukke låget og køre et program i 15 minutter ved 121 °C og 1 Bar.
    BEMÆRK: Denne protokol bruges altid til autoklavering af løsninger i yderligere trin.
  4. Flasken tages ud af autoklaven, når autoklaven er afkølet til 80 °C, og anbringes på en magnetomrører (uopvarmet) under omrøringen indstillet til 800 omdr./min.
    FORSIGTIG: Flasken og væsken forbliver varme.
  5. Solen afkøles under omgivende forhold, samtidig med at der opretholdes konstant omrøring, indtil temperaturen er lavere end T-gelen (geleringspunktet), 32 °C.
  6. Tag flasken ud af rørevingen, og opbevar den ved 4 °C.
    BEMÆRK: Den flydende gel kan opbevares indtil behov.

2. Fremstilling af bioblæk

  1. Forbered en gellanbaseret bioink ved hjælp af en 1% (w / w) sol af lav acylgellangummi i ultrarent vand (Type 1, >18 mΩ·cm-1).
    1. Vej 0,5 g gellanpulver ud i en vejebåd.
    2. Tilsæt 49,5 g ultrarent vand i en 100 ml glasflaske sammen med en magnetisk omrører.
    3. Fold vejebåden med gellankraft på midten, og tilsæt pulveret langsomt til vandet under konstant omrøring.
    4. Solen opløses og steriliseres ved hjælp af en autoklave og afkøles til 20 °C.
    5. Opbevar bioblækket ved 4 °C indtil yderligere brug.
  2. Forbered en pektin-kollagen blandet bioblæk i ultrarent vand (Type 1, >18 mΩ·cm-1).
    1. Forbered lager 5% (w / v) lav-methoxy pektin opløsninger ved at veje 2,5 g pektinpulver i en vejebåd.
    2. Tilsæt 50 ml ultrarent vand i en 100 ml glasflaske sammen med en magnetisk omrører.
    3. Fold vejebåden med pektinkraft på midten og tilsæt pulveret langsomt til vandet under konstant omrøring.
    4. Den vandige blanding autoklaves og afkøles til 20 °C.
    5. Forbered 1: 1 og 2: 1 pektin-kollagenblandinger ved enten at tilsætte 3 ml pektinopløsning til 3 ml kollagenopløsning eller ved at tilsætte 4 ml pektinopløsning til henholdsvis 2 ml kollagenopløsning. Bland forsigtigt blandingerne ved hjælp af en pipette ved at trække blandingen ud og dispensere den 10x.
      BEMÆRK: Denne procedure udføres bedst ved hjælp af kolde materialer på is for at forhindre for tidlig gelering af kollagen. Forkøling af pektin og kollagen kan opnås ved opbevaring ved 4 °C før blanding.
    6. Opbevares ved 4 °C indtil yderligere brug.
  3. Forbered en alginat-kollagen blandet bioblæk i ultrarent vand (Type 1, >18 mΩ·cm-1).
    1. 2 g alginatpulver afvejes i en vejebåd.
    2. Tilsæt 50 ml ultrarent vand i en 100 ml glasflaske sammen med en magnetisk omrører.
    3. Fold vejebåden med alginatkraft på midten, og tilsæt pulveret langsomt til vandet under konstant omrøring.
    4. Dispersionen opvarmes til 60 °C under konstant omrøring, indtil alginatet er helt opløst (klar, let brun væske), og afkøles derefter til 20 °C.
    5. Alginatopløsningen fortyndes med cellekulturmedium, såsom Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) ved at tilsætte 25 ml alginatopløsning til 25 ml DMEM.
    6. Forbered alginat-kollagenblandinger (1: 1) ved at tilsætte 3 ml alginat/DMEM-opløsningen til 3 ml kollagenopløsning. Bland forsigtigt blandingerne ved hjælp af en pipette ved at trække blandingen ud og dispensere den 10x og opbevar den ved 4 °C.
      BEMÆRK: Denne procedure udføres bedst ved hjælp af kolde materialer på is for at forhindre for tidlig gelering af kollagen. Forkøling af pektin og kollagen kan opnås ved opbevaring ved 4 °C før blanding.

3. Rheologisk karakterisering af bioblæk

  1. Tænd rheometeret, indsæt 40 mm savtakkede geometrier, og lad det stå i 30 min.
  2. Nulstil reometerets mellemrumshøjde ved hjælp af nul-mellemrumshøjdefunktionen.
  3. Tilføj ~ 2 ml prøve på bundpladen, og sænk den øverste geometri for at skabe en mellemrumshøjde på 1 mm.
  4. Prøven trimmes ved at fjerne overskydende materiale, der er udstødt mellem pladerne. For at gøre dette skal du bruge en flad, ikke-slibende kant til at trække overskydende væske væk fra hullet og opsuge med silkepapir.
    BEMÆRK: Trin 3.2-3.4 gentages for at ændre prøven før hvert af følgende trin.
  5. Der foretages viskometriprofiler for at bestemme bioblækkets injicerbarhed.
    1. Vælg viskometritest fra brugerindstillingerne .
    2. Indtast parametrene for en forskydningshastighedsstyret rampetest: 0,1 til 500 s-1 med en rampetid på 1 min.
    3. Viskometrirampeprøven gentages på nye prøveemner under spændingskontrol ved hjælp af de øvre og nedre spændinger, der bestemmes ud fra den forskydningshastighedsstyrede rampeprøve i trin 3.5.2.
  6. Foretag små deformationstest for at bestemme bioblækkets geleringsegenskaber.
    1. Vælg oscillerende test fra brugerindstillingerne .
    2. Indtast parametre i en enkelt frekvenstest under konstant belastning: frekvens 1 Hz, belastning 0,5% over 1 time, mens blækgelen.
  7. Der foretages in situ-amplitude- og frekvensmålinger på gelerede prøver.
    1. Vælg oscillerende test fra brugerindstillingerne .
    2. Vælg amplitudefejning, og indtast parametrene for en amplitudefejningstest, der er belastningsreguleret: 0,01 til 500% ved en konstant frekvens på 1 Hz .
    3. Indlæs en ny prøve, og vælg oscillerende test fra brugerindstillingerne . Vælg derefter frekvenstest og indgangsfrekvensparametre mellem 0,01 og 10 Hz og en stamme, der ligger inden for spektrenes lineære viskoelastiske område (LVR) bestemt ud fra amplitudefejningsdataene opnået i trin 3.7.2 (typisk en værdi mellem 50% og 80% af LVR).

4. Design og udskrivning af 3D-strukturer ved hjælp af en 3D-bioprinter

  1. Start CAD-software for at starte genereringen af en CAD-model .
    1. Vælg Værktøjer | Materialer i CAD-softwaren til at definere udskrivningsparametrene for det valgte bioblæk.
    2. Inputudskrivningsparametre, der er relevante for den anvendte printer; for eksempel til 3D Discovery skal du indtaste den estimerede filamentdiameter (~ 200-500 μm for de fleste bioblæk) i tykkelsesfanen for at bestemme Z-tykkelsen for hvert lag.
      BEMÆRK: Delaminering af den endelige konstruktion indikerer et behov for at øge tykkelsesværdien, mens tab af opløsning fremhæver behovet for at reducere tykkelsen.
    3. Design den ønskede struktur lag for lag ved hjælp af lagfanerne i softwaren. Gruppér lagene ved hjælp af fanen Gruppe, og tildel hvert lag til et niveau på Z-planet ved hjælp af fanen Niveau .
      1. For eksempel, for at generere en gitterstruktur (ved hjælp af en alginat-kollagen blandet bioblæk fremstillet i trin 2.3), skal du oprette et lag med filamenterne langs x-aksen og et andet lag med filamenterne langs y-aksen. Tildel begge til et separat niveau.
    4. Under fanen Gruppe skal du bestemme byggehøjden ved at vælge antallet af gentagne enheder i strukturen.
    5. Klik på værktøjet Generer for at oprette en G-kode til designet og få vist en 3D-gengivelse af strukturen.
  2. Luk BioCAD , og start 3D Discovery HMI-softwaren (human-machine interface ) for at starte udskrivningsprocessen.
    1. Saml skrivehovedet i henhold til producentens anvisninger. Monter mikroventilen på skrivehovedet og skru den valgte ekstruderingsdyse i.
    2. Klik på funktionen Måling af nålelængde for at kalibrere skrivehovedet.
    3. Læg et kulturkar (f.eks. en plade med 6 brønde) på trykplatformen.
    4. Alikvote bioblækket i blækpatronen og skru ind i skrivehovedet over mikroventilen.
    5. Tilslut det samlede printhoved til det pneumatiske tryksystem, og vælg skrivehoved på HMI'en, der skal tilkobles.
    6. Klik på kontroltryk for at tillade indstilling af ekstruderingstrykket.
    7. Når der er valgt et passende tryk (~30-120 kPa afhængigt af den ønskede opløsning), skal du åbne den tidligere genererede G-kode og klikke på Kør for at starte udskrivningsprocessen.

5. Forberedelse af hudanaloger

  1. Dyrkning af humane dermale fibroblaster (HDF'er) og fedtafledte stamceller (ADSC'er) i DMEM suppleret med føtalt bovint serum (FBS) (10%), HEPES-buffer (2,5%) og penicillin / streptomycin (1%) i T75-kolber, indtil 90% sammenløb er nået. Kultur humane epidermale keratinocytter (HEK'er) i keratinocytvækstmedier (KGM), indtil 70% -80% sammenløb er nået. Opbevar alle celler under betingelser på 37 ° C, 5% CO2 og 95% luft i en inkubator under dyrkning.
  2. Til fremstilling af HDF og ADSC'er til dermal og fedtholdig bioblæk vaskes cellerne ved forsigtigt at pipettere 3 ml fosfatbufret saltvand (PBS) i kolber, vippe kolben for at hvirvle PBS hen over cellerne og aspirere, idet man sørger for ikke at forstyrre de vedhæftede celler.
    1. For at løfte cellerne pipetteres 3 ml 1x celledissociationsenzym ind i kolben for at dække cellerne og placeres kolben i en inkubator i 3 min, idet kolben bankes fast mod håndfladen for at løsne cellerne. Neutralisere enzymets virkning ved hjælp af 6 ml komplet DMEM.
      BEMÆRK: Inkuber i yderligere 2 minutter, hvis cellerne forbliver fastgjort efter tapning.
    2. Til fremstilling af dermal og fedtbioblæk pipetteres cellesuspensionerne i separate 15 ml rør og udtages 10 μL fra hver til celletælling ved hjælp af et hæmocytometer. De resterende cellesuspensioner centrifugeres ved 300 × g i 5 minutter for at pelletere cellerne.
    3. Supernatanten suges til sig, idet pelletsen ikke forstyrres, tilsættes den passende polymeropløsning (fremstillet i trin 2.2), og blandingen blandes med let stimulering ved pipettering ved følgende densiteter:
      1. For fedtlaget pipetteres 5 × 105 ADSC'er ml-1 pr. 1: 1 kollagen til pektinblanding.
      2. For papillærlaget pipetteres 3 × 106 HDF'er ml-1 pr. 2:1 kollagen til pektinblanding.
      3. For det retikulære lag pipetteres 1,5 × 106 HDF'er ml-1 pr. 2:1 kollagen til pektinblanding.
  3. For at udskrive skal du lægge hver bioblæk i en separat patron og udskrive konstruktionen i den understøttende væskegel i en petriskål af glas i henhold til instruktionerne i afsnit 4.
    1. Når udskrivningen er færdig, injiceres 2 ml 200 mM CaCl 2∙2H2 O omkring konstruktionen og3 ml adipogent medie (komplet DMEM suppleret med 500 μM isobutylmethylxanthin [IBMX], 50 μM indomethacin og 1 μM dexamethason) i væskegelen ved hjælp af en sprøjte og kanyle. Placer i en inkubator natten over.
    2. Den følgende dag fjernes konstruktionen fra støttebadet ved hjælp af en spatel, vaskes forsigtigt i PBS og dyrkes i 14 dage i adipogent medium i en 6-brønds plade.
    3. Efter 14 dage fjernes nok medium til at skabe en luft-væske-grænseflade på overfladen af konstruktionen og frø 2 × 106 keratinocytter oven på konstruktionen for at skabe et epidermalt lag.
    4. Kultur yderligere i 1 uge før analyse.

6. Forberedelse af halspulsåremodel

  1. Læg gellangummi bioink-opløsningen (som forberedt i trin 2.1) i en printerpatron.
  2. Udskriv halspulsåremodellen i en petriskål, der indeholder det flydende gelstøttemateriale i henhold til udskrivningsinstruktionerne i punkt 4.
  3. Når udskrivningen er færdig, injiceres 2 ml 200 mM CaCl 2∙2H2 O omkring konstruktionen vedhjælp af en sprøjte og kanyle.
  4. Efter mindst 3 timer fjernes konstruktionen fra støttebadet med en spatel og vaskes forsigtigt i PBS.

Representative Results

Alginat og type I kollagen bioink
Udskriftsopløsning (registreret som funktion af glødetråddiameter) blev observeret at være direkte justerbar via ændringer i ekstruderingstryk (figur 1A-C). Ekstruderingstryk og udskriftsopløsning var direkte relateret til de mindste filamentdiametre, der blev genereret via udskrivning ved et ekstruderingstryk på 30 kPa. Interessant nok kunne der ved et ekstruderingstryk på 30 kPa genereres filamenter, der matchede ekstruderingsdysens indre diameter (gennemsnitlig filamentdiameter: 323 μm ± 50 μm; dysediameter: 300 μm), hvilket tyder på, at der kunne opnås en "maksimal opløsning". Desuden kunne udskrivningsparametrene for denne opløsning med succes anvendes til generering af et alginat/kollagenvaskulært rør, der kan ekstraheres og perfuseres (figur 1D).

Figure 1
Figur 1: Generering af udskrifter i høj opløsning ved hjælp af SLAM. Tilpasning af printopløsning af alginat-/kollagengitter som funktion af glødetråddiameteren via ekstrudering ved (A) 30 kPa, (B) 60 kPa og (C) 120 kPa. D) Dannelse af et alginat/kollagenvaskulært rør. Skalastænger = 400 μm (A-C), 10 mm (D). Forkortelse: SLAM = additivfremstilling i suspenderet lag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Hudanaloger
SLAM blev også brugt til at skabe en hudlignende struktur (figur 2A) ved hjælp af et bioblæk dannet af en blanding af kollagen I og pektin. For at opnå en gradient af mekaniske egenskaber svarende til dem, der findes i huden, blev forskellige proportioner af pektin og kollagen anvendt i dermale (5% w / w pektin blandet ved 2: 1 med en 5 mg∙mL-1 kollagenstamme) og hypodermal (5% w / w pektin blandet ved 1: 1 med en 5 mg∙mL-1 kollagenbestand) lag. Den resulterende struktur (figur 2Bi-Bii) blev godt integreret efter nedsænkning i DMEM uden tegn på delaminering. Det er vigtigt, at der var et højt niveau af cellelevedygtighed i hele strukturen (figur 2Biii) efter en periode på 14 dages dyrkning. Interessant nok stivnede materialerne i løbet af kulturperioden24, hvilket indikerer en ombygning af materialet.

Figure 2
Figur 2: Fremstilling af en hudlignende struktur. (A) Et skema, der viser, hvordan SLAM-processen blev brugt til at fremstille en lagdelt struktur indlejret med humane dermale fibroblaster. Den suspenderende seng her blev fremstillet af partikler dannet af agarose, mens de hypodermale og dermale lag blev dannet af varierende proportioner af pektin og kollagen I. (B) Den lagdelte struktur var beregnet til at repræsentere hudens trelagede struktur (i). Med succes med at replikere denne struktur (ii) blev der noteret høje niveauer af cellelevedygtighed gennem prøverne, som vist ved calcein-AM-farvning (iii). Skalabjælke = 5 mm (Bii). Forkortelse: SLAM = additivfremstilling i suspenderet lag. Klik her for at se en større version af denne figur.

Carotidarterie
For at skubbe grænserne for metoden blev der produceret et udvalg af mere komplekse udskrifter. I et sådant eksempel blev en bifurcated carotisarterie trykt ved hjælp af 1% gellan bioink (figur 3A), som derefter blev krydsbundet ved ekstrudering af 200 mM CaCl2 i væskegellejet (figur 3B) og simpelthen løftet fra støtten efter gelering (figur 3C). På trods af prækursorudskrivningsløsninger, der udviser lav viskositet, lykkedes det at understøtte produktionen af den komplekse geometri. Arterien bevarede sin struktur under aflejring, tværbinding og ekstraktion (figur 3) uden behov for at ændre udskriftskoder for at inkorporere yderligere stilladser.

Figure 3
Figur 3: Fabrikationsproces af gellan carotisarterie ved hjælp af SLAM . (A) Ekstrudering af gellan i væskegellejet under udskrivning, (B) afsluttet halspulsåretryk i væskegelen under tværbinding, og (C) endelig halspulsåremodel efter udtagning fra væskegelstøtte. Vægtstænger = 10 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Overvejelse af valg af materialer, der anvendes til støttesengen
I udviklingsfasen var der forskellige egenskaber, der kræves af støttesengen. Disse egenskaber omfattede: i) opretholdelse af tilstrækkelig struktur til at suspendere det ekstruderede materiale; ii) forskydningsudtyndingskapacitet, så skrivehovedet kan bevæge sig frit gennem støttematerialet iii) hurtig omstrukturering (selvhelende egenskaber), der danner støtte omkring det deponerede bioblæk; iv) termisk stabil ved både stuetemperatur og fysiologiske temperaturer v) neutralt (dvs. uladet) materiale, der er relativt bioinert på tværs af et interval af pH og elektrolytter (ioniske arter og koncentrationer), hvilket forhindrer interaktioner med celler og ladede bioblæk vi) giftfri og vii) helst fra en kilde, der ikke stammer fra dyr.

Selvom der er mange biopolymermaterialer, der opretholder flere af disse iboende egenskaber, med en kapacitet til at udføre suspenderet 3D-additivfremstilling uden at overholde alle disse egenskaber 11,26,27, var hensigten her at producere en understøttende seng, der ville overvinde visse praktiske problemer forbundet med andre understøttende materialer. På grund af agaroses kemiske egenskaber og især når de formuleres som en partikelvæskegel, kunne alle disse egenskaber opnås. Dette muliggjorde en støtteseng, der kunne bruges på tværs af en lang række bioblæk23,24,25,28. Faktisk gav materialets bioinerte natur potentialet til at opretholde den trykte struktur in situ gennem hele kulturen, hvilket tillod tilstrækkelige tidsskalaer til, at mange forskellige bioblæk kunne udvikle sig fuldt ud uden ændringer i biologien. Desuden gjorde den partikelformede, tyndere natur det let at fjerne fra den endelige trykte konstruktion, mens den ikke-giftige, ikke-animalske oprindelse giver mulighed for hurtig oversættelse til klinikken og overvinder barrierer vedrørende etiske og lovgivningsmæssige krav.

Overvejelser i valget af materialer til bioblækket
Ved bioprint med direkte ekstrudering deponeres bioblæk på en 2D-printseng. Det er gavnligt, at monomere bioink-opløsninger har forskydningsfortyndende adfærd; For at producere high-fidelity-konstruktioner med fysiologisk relevante dimensioner skal de imidlertid have lav thixotropi og komme sig til tilstrækkeligt høje viskositeter, så de danner faste filamenter ved aflejring 29,30,31. Med øget viskositet er det tryk, der kræves til ekstrudering, meget højere, hvilket ofte påvirker den indkapslede cellelevedygtighednegativt 31,32. Suspension bioprinting fjerner denne begrænsning, da det ekstruderede materiale understøttes af suspensionsbadet under tværbinding. Denne udvikling øger i høj grad udvalget af bioblækformuleringer, der kan bruges. For eksempel har nyere arbejde vist brugen af kollagenopløsninger med lav koncentration, der udskrives i meget komplekse geometrier, der er analoge med hjertets indre struktur33,34,35. I de applikationer, der er nævnt i denne metode, gjorde indlejret udskrivning det muligt at vælge biomaterialeblæk for bedst at replikere det fysiologiske miljø, som de var beregnet til, i stedet for for deres evne til at blive trykt.

Begrænsninger i strukturstørrelse
Gennem hele biofabrikationslitteraturen er det blevet påvist, at forskellige typer bioprintere, drevet af alternative printhovedteknologier, kan inkorporeres i indlejrede fremstillingsteknikker. Den teknologi, der demonstreres her, er ikke anderledes med eksempler, der omfatter en pneumatisk mikroekstruderingsbaseret bioprinter (INKREDIBLE), som demonstreret af Senior et al., og ekstruderingsbaserede bioprintere med kontrollerbare mikroventiler (3D Discovery)23. Selvom dette gør teknologien tilgængelig for en række brugere, der måske allerede ejer en bioprinter, afhænger begrænsningerne i strukturens opnåelige størrelse i sidste ende af de pågældende bioprinterspecifikationer. Indledningsvis defineres hovedbegrænsningen for generering af store strukturer af størrelsen på printsengen, grænserne for X-, Y- og Z-baner og også størrelsen af beholderen, hvori understøtningsvæskegelen er indeholdt.

Begrænsninger i opløsning
Ved fremstilling af indviklede strukturer i mikrometerstørrelse afhænger den resulterende opløsning meget af printerens præcision (kontrol over trinstørrelse, ekstruderingsgrad), printdysens indvendige diameter og en række justerbare softwareparametre, herunder udskrivningshastighed, udskrivningstryk og flowhastighed36. Derudover synes kontrol over dråbestørrelsen at være afgørende for at lette genereringen af strukturer med høj opløsning, med de bedste resultater observeret i ekstruderingsprintere med en kontrollerbar mikroventil. I sidste ende, når alle parametre er optimeret, kan udskriftsopløsninger opnås for at matche eller endda være mindre end den indvendige diameter af ekstruderingsdyser med det aflejrede filament i størrelsesordenenmikrometerskalaen 37. Dette afhænger dog af optimeringen af alle de tidligere nævnte printparametre, og opløsningen kan begrænses betydeligt af printmekanismen og præcisionen. Pneumatisk ekstrudering synes for eksempel ikke at tillade den samme udskrivningsopløsning som ekstrudering med en kontrollerbar mikroventil. Der er derfor en potentiel omkostningsmæssig implikation for at opnå den maksimale udskrivningsopløsning, da sådanne systemer medfører en betydeligt øget udgift for brugeren.

Fremtidsudsigter og potentiale
I øjeblikket er der stor interesse omkring brugen af suspenderede fremstillingsprocesser for at muliggøre produktion af komplekse bløde strukturer, der indeholder indlejrede celler, og der vil utvivlsomt være betydelige fremskridt i de kommende år. Der gives løbende fremskridt med at forbedre udskriftsopløsningen, selvom det stadig er at se, hvor nødvendigt dette vil være, da størstedelen af biologiske systemer er i stand til at omarrangere sig selv på molekylært niveau. Mens fokus for interesse i medierne er omkring brugen af 3D-printet væv til direkte erstatning af humant væv efter skade eller sygdom, er alle robuste medicinske procedurer, der er muliggjort af disse processer, nogle år væk38,39. Det er mere sandsynligt, at virkningen af disse komplekse kultursystemer vil være i screening af lægemidler eller endda brugt som værktøjer til at forbedre vores forståelse af biologiske processer38. Især udviklingsbiologi kunne have stor gavn her, hvor præcis kontrol over den særlige aflejring af molekyler vil give forskere mulighed for at udforske multifaktorielle systemers rolle på vævsudviklingsprocesser.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke EPSRC (EP/L016346/1), MRC og Doctoral Training Alliance Biosciences for Health for finansiering og støtte til dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3D Discovery Bioprinter RegenHU BIOFACTORY Microvalve extrusion bioprinter
Agarose  Merck 9012-36-6 Material used to create fluid gel support baths 
Benchtop autoclave Prestige Medical B8L75814 Classic
Brilliant Blue G Merck 6104-58-1 Dye used to stain structures 
Calcium Chloride Dihydrate Merck  10035-04-8 Used to reticulate printed structures 
Dexamethasone Merck  D4902-25MG Used in adipogenic media
DMEM Merck D6429 Cell culture media
Duran  bottle  Merck Z305219 glass bottle 
EVOS XL Core Imaging System EVOS™ AMEX1000 Brightfield microscope with phase contrast
FBS Fisher Scientific 10500-064 Cell culture media supplement
Gellan gum Special Ingredients 5060341112638 Low Acyl Gellan gum used to make the bioink for the corotid artery model
HEPES buffer Merck H9897-10PAK Buffer for cell culture media
Indomethacin Merck I7378 Used in adipogenic media
Isobutyl-methylxanthine (IBMX) Merck I7018-100MG Used in adipogenic media
Keratinocyte growth medium Lonza 00192060 Used as media to culture keratinocytes
Low Methoxy Pectin CP Kelco LM-5CS Pectin used to make pectin/collagen blends
Penicillin-streptomycin Merck P4333-100ML Used to inhibit bacterial growth
PureCol EZ Gel solution Merck 5074 Collagen solution used to make alginate/collagen blends
Sodium Alginate Merck 9005-38-3 Alginate powder used to make alginate/collagen blends 
TrypLE select  Fisher Scientific 12563011 cell dissociation enzyme
T75 Flasks StarLab CC7682-4175 Used for culturing cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, K. Y., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering. Chemical Reviews. 101 (7), 1869-1880 (2001).
  2. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  3. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  4. Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
  5. Iordachescu, A., et al. An in vitro model for the development of mature bone containing an osteocyte network. Advanced Biosystems. 2 (2), 1700156 (2018).
  6. Zhang, C., et al. Hydrogel cryopreservation system: an effective method for cell storage. International Journal of Molecular Sciences. 19 (11), 3330 (2018).
  7. McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
  8. Cheng, W., Zhang, J., Liu, J., Yu, Z. Granular hydrogels for 3D bioprinting applications. View. 1 (3), 20200060 (2020).
  9. Lieben, L. The future of 3D printing of human tissues is taking shape. Nature Reviews Rheumatology. 12 (4), 191 (2016).
  10. Bhattacharjee, T., et al. Writing in the granular gel medium. Science Advances. 1 (8), 1500655 (2015).
  11. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
  12. Zarrintaj, P., et al. Agarose-based biomaterials for tissue engineering. Carbohydrate Polymers. 187, 66-84 (2018).
  13. te Nijenhuis, K. Thermoreversible Networks: Viscoelastic Properties and Structure of Gels. , Springer. Berlin. 194-202 (1997).
  14. Norton, I. T., Jarvis, D. A., Foster, T. J. A molecular model for the formation and properties of fluid gels. International Journal of Biological Macromolecules. 26 (4), 255-261 (1999).
  15. Fernández Farrés, I., Moakes, R. J. A., Norton, I. T. Designing biopolymer fluid gels: A microstructural approach. Food Hydrocolloids. 42, 362-372 (2014).
  16. Cooke, M. E., et al. Structuring of hydrogels across multiple length scales for biomedical applications. Advanced Materials. 30 (14), 1705013 (2018).
  17. Foster, N. C., Allen, P., El Haj, A. J., Grover, L. M., Moakes, R. J. A. Tailoring therapeutic responses via engineering microenvironments with a novel synthetic fluid gel. Advanced Healthcare Materials. 10 (16), 2100622 (2021).
  18. Ellis, A. L., Norton, A. B., Mills, T. B., Norton, I. T. Stabilisation of foams by agar gel particles. Food Hydrocolloids. 73, 222-228 (2017).
  19. Ghebremedhin, M., Seiffert, S., Vilgis, T. A. Physics of agarose fluid gels: Rheological properties and microstructure. Current Research in Food Science. 4, 436-448 (2021).
  20. Garrec, D. A., Norton, I. T. Understanding fluid gel formation and properties. Journal of Food Engineering. 112 (3), 175-182 (2012).
  21. Garrec, D. A., Guthrie, B., Norton, I. T. Kappa carrageenan fluid gel material properties. Part 1: Rheology. Food Hydrocolloids. 33 (1), 151-159 (2013).
  22. Adams, S., Frith, W. J., Stokes, J. R. Influence of particle modulus on the rheological properties of agar microgel suspensions. Journal of Rheology. 48 (6), 1195-1213 (2004).
  23. Senior, J. J., Cooke, M. E., Grover, L. M., Smith, A. M. Fabrication of complex hydrogel structures using suspended layer additive manufacturing (SLAM). Advanced Functional Materials. 29 (49), 1904845 (2019).
  24. Moakes, R. J. A., et al. A suspended layer additive manufacturing approach to the bioprinting of tri-layered skin equivalents. APL Bioengineering. 5 (4), 046103 (2021).
  25. Moxon, S. R., et al. Suspended manufacture of biological structures. Advanced Materials. 29 (13), 1605594 (2017).
  26. Noor, N., et al. 3D Printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
  27. Compaan, A. M., Song, K., Huang, Y. Gellan fluid gel as a versatile support bath material for fluid extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (6), 5714-5726 (2019).
  28. Moxon, S. R., et al. Blended alginate/collagen hydrogels promote neurogenesis and neuronal maturation. Materials Science and Engineering: C. 104, 109904 (2019).
  29. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
  30. Chimene, D., Lennox, K. K., Kaunas, R. R., Gaharwar, A. K. Advanced bioinks for 3D printing: a materials science perspective. Annals of Biomedical Engineering. 44 (6), 2090-2102 (2016).
  31. Schwab, A., et al. Printability and shape fidelity of bioinks in 3D bioprinting. Chemical Reviews. 120 (19), 11028-11055 (2020).
  32. Rutz, A. L., Lewis, P. L., Shah, R. N. Toward next-generation bioinks: Tuning material properties pre- and post-printing to optimize cell viability. MRS Bulletin. 42 (8), 563-570 (2017).
  33. Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering. Biomedical Materials. 10 (3), 034002 (2015).
  34. Zhou, K., Sun, Y., Yang, J., Mao, H., Gu, Z. Hydrogels for 3D embedded bioprinting: a focused review on bioinks and support baths. Journal of Materials Chemistry B. 10 (12), 1897-1907 (2022).
  35. Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
  36. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-Sabah, A., Whitaker, I. S. Printability' of candidate biomaterials for extrusion based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), 1700264 (2017).
  37. Hinton, T. J., Lee, A., Feinberg, A. W. 3D bioprinting from the micrometer to millimeter length scales: Size does matter. Current Opinion in Biomedical Engineering. 1, 31-37 (2017).
  38. Seoane-Viaño, I., Trenfield, S. J., Basit, A. W., Goyanes, A. Translating 3D printed pharmaceuticals: From hype to real-world clinical applications. Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 553-575 (2021).
  39. Jovic, T. H., Combellack, E. J., Jessop, Z. M., Whitaker, I. S. 3D bioprinting and the future of surgery. Frontiers in Surgery. 7, 609836 (2020).

Tags

Bioengineering nr. 195
Agarosevæskegeler dannet ved forskydningsbehandling under gelering til suspenderet 3D-bioprint
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Senior, J. J., Moakes, R. J. A.,… More

Senior, J. J., Moakes, R. J. A., Cooke, M. E., Moxon, S. R., Smith, A. M., Grover, L. M. Agarose Fluid Gels Formed by Shear Processing During Gelation for Suspended 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (195), e64458, doi:10.3791/64458 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter