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Termografia a infrarossi per la rilevazione di cambiamenti nell'attività del tessuto adiposo bruno

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64463
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 2,3
1MKP Ltd., 2Croatian Institute for Brain Research, University of Zagreb, School of Medicine, 3Department of Physiology, University of Zagreb, School of Medicine

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per misurare l'attività del tessuto adiposo bruno dopo un pasto negli esseri umani e negli animali da laboratorio.

Abstract

La misurazione dell'attività del tessuto adiposo bruno (BAT) mediante tomografia computerizzata ad emissione di positroni (PET-CT) attraverso l'accumulo di 18F-fluorodesossiglucosio (FDG) dopo un pasto o in pazienti obesi o diabetici fallisce come metodo di scelta. La ragione principale è che 18F-FDG compete con l'alta concentrazione plasmatica di glucosio postprandiale per lo stesso trasportatore di glucosio sulla membrana delle cellule BAT. Inoltre, BAT utilizza anche acidi grassi come fonte di energia, che non è visibile con PET-CT e potrebbe essere modificata insieme alla concentrazione di glucosio nei pazienti obesi e diabetici. Pertanto, per stimare l'importanza fisiologica delle BAT negli animali e nell'uomo, viene applicato un nuovo metodo di termografia a infrarossi utilizzato in recenti pubblicazioni.

Dopo il digiuno notturno, l'attività BAT è stata misurata mediante termografia a infrarossi prima e dopo un pasto in volontari umani e topi selvatici femmina. Il software della fotocamera calcola la temperatura dell'oggetto utilizzando la distanza dall'oggetto, l'emissività della pelle, la temperatura ambiente riflessa, la temperatura dell'aria e l'umidità relativa. Nei topi, l'area rasata sopra il BAT era una regione di interesse per la quale sono state misurate le temperature medie e massime. La fase del ciclo estrale nei topi femmina è stata determinata dopo un esperimento con strisci vaginali colorati con soluzione di colorazione di viola cresil (0,1%). Nei volontari sani, sono state selezionate due aree cutanee del collo: l'area sopraclavicolare (sopra la clavicola, dove sono presenti le cellule BAT) e l'area interclavicolare (tra le clavicole, dove non è stato rilevato tessuto BAT). L'attività BAT è determinata dalla sottrazione di questi due valori. Inoltre, le temperature medie e massime delle aree della pelle potrebbero essere determinate negli animali e nei partecipanti umani.

I cambiamenti nell'attività BAT dopo un pasto misurati dalla termografia a infrarossi, un metodo non invasivo e più sensibile, hanno dimostrato di essere sesso, età e fase del ciclo estrale dipendenti negli animali da laboratorio. Come parte della termogenesi indotta dalla dieta, l'attivazione delle BAT negli esseri umani ha anche dimostrato di dipendere dal sesso, dall'età e dall'indice di massa corporea. Determinare ulteriormente i cambiamenti fisiopatologici nell'attività BAT dopo un pasto sarà di grande importanza per i partecipanti con alte concentrazioni plasmatiche di glucosio (obesità e diabete mellito di tipo 2), nonché in diversi animali da laboratorio (topi knock-out). Questo metodo è anche uno strumento variabile per determinare possibili farmaci attivanti che potrebbero ringiovanire l'attività delle BAT.

Introduction

Il tessuto adiposo bruno (BAT), a differenza del tessuto adiposo bianco (WAT), non immagazzina ma piuttosto spende energia. Dopo la stimolazione simpatica, BAT utilizza acidi grassi e glucosio e produce calore mediante l'attivazione della proteina disaccoppiante 1 (UCP1). La funzione di UCP1 è quella di utilizzare un gradiente H + tra due membrane mitocondriali per produrre calore invece di ATP. La funzione delle BAT è quella di aumentare la produzione di calore in condizioni di freddo, il che porta ad un aumento del dispendio energetico1. Dopo l'esposizione al freddo, gli input sensoriali dalla pelle inibiscono i neuroni sensibili al caldo nel nucleo preottico mediano (MnPO) dell'area preottica ipotalamica (POA), che diminuisce l'effetto inibitorio dei neuroni POA sul raphe pallido rostrale (rRPa). L'attivazione dei neuroni rRPa aumenta l'attività simpatica, seguita da un aumento dell'attività BAT 2,3. L'attivazione BAT indotta dal freddo migliora la sensibilità all'insulina nell'uomo4 e questa attività è diminuita negli esseri umani con aumento dell'indice di massa corporea (BMI) e dell'età 1,5,6,7.

Oltre al suo ruolo nella termogenesi indotta dal freddo, dopo un pasto, l'assorbimento di glucosio nella BAT aumenta nella popolazione maschile magra, contribuendo alla termogenesi indotta dalla dieta (DIT), che è più alta nei soggetti maschi BAT positivi 8,9. La tecnica all'avanguardia utilizzata per misurare l'attività BAT è la tomografia computerizzata ad emissione di positroni, nota come PET-CT. Questo metodo determina l'attività BAT misurando l'accumulo del fluorodesossiglucosio radiotracciante (18F-FDG). Tuttavia, la PET-CT fallisce come metodo di scelta per rilevare l'attivazione di BAT dopo un pasto. Uno dei motivi è che, dopo un pasto, 18F-FDG compete con l'iperglicemia postprandiale per lo stesso trasportatore del glucosio, il che lo rende inadatto a determinare l'attivazione di BAT dopo un pasto, specialmente quando si confronta l'attività BAT in partecipanti sani e diabetici con possibili differenze nelle concentrazioni di glucosio nel sangue. Inoltre, il BAT utilizza gli acidi grassi come fonte di energia per la produzione di calore che non è visibile con la PET-CT. 18 L'accumulo di F-FDG in BAT dopo un pasto è appena visibile10 ed è, quindi, interpretato come un risultato negativo nella maggior parte dei casi. Non sorprende che, recentemente, sia stato suggerito che l'attivazione delle BAT sia più pronunciata nella popolazione umana di quanto si pensasse in precedenza; pertanto, è necessario un nuovo approccio per rilevare l'attività delle BAT e il suo coinvolgimento nei disturbi metabolici7. Un tentativo di risolvere questo problema è misurare il volume di BAT con risonanza magnetica (MRI) in pazienti prediabetici e pazienti con diabete mellito di tipo 2 (T2DM) con insulino-resistenza11. Tuttavia, il volume delle BAT misurato mediante risonanza magnetica non è un indicatore sufficiente per stimare la funzione quotidiana e l'utilizzo di glucosio e acidi grassi da parte delle BAT. Pertanto, per stimare le reali differenze nell'attività delle BAT nei pazienti sani rispetto ai pazienti con DMT2, è necessario un nuovo approccio che offra la possibilità di scoprire il meccanismo patologico del malfunzionamento delle BAT nei pazienti con DMT2.

Per determinare l'attivazione del BAT, abbiamo eseguito misurazioni della produzione di calore BAT prima e dopo un pasto utilizzando la termografia a infrarossi (IR) (Figura 1) 12,13. Stabilire la termografia IR come metodo di scelta per misurare l'attività BAT dopo un pasto in individui sani e obesi o pazienti con diabete mellito avrà un enorme impatto sul campo. Ad oggi, la termografia IR viene utilizzata per la determinazione dell'attivazione indotta dal freddo di BAT13,14,15. Nella storia umana recente, l'attività BAT indotta dal freddo non è più molto pronunciata (a causa del corretto riscaldamento degli habitat, abbigliamento adeguato), mentre l'attivazione delle BAT dopo un pasto si verifica ogni giorno. Inoltre, la regolazione fisiologica di queste due funzioni BAT attraverso l'ipotalamo è completamente diversa. Dopo un pasto, l'attivazione dei neuroni che esprimono proopiomelanocortina (POMC) nel nucleo arcuato ipotalamico (Arc) porta ad un aumento dell'attività del nervo simpatico tramite rRPa16. L'attivazione indotta dal freddo di BAT misurata mediante termografia IR o PET-CT è impropria se utilizzata come misura per l'attività quotidiana di BAT. L'aumento dell'attività BAT dopo un pasto è seguito dall'utilizzo del glucosio, che è in definitiva importante per mantenere l'omeostasi del glucosio, la sensibilità all'insulina e la regolazione giornaliera della concentrazione di glucosio. L'attivazione postprandiale della BAT porta ad un aumento del consumo di glucosio postprandiale, seguito da un aumento della produzione di calore e della temperatura corporea (DIT). Questo è stato dimostrato essere sesso, età e BMI dipendente12. Differenze di genere simili nell'attivazione delle BAT dopo un pasto sono state osservate nei topi di laboratorio maschi e femmine17. Questi risultati corrispondono alle differenze di genere recentemente scoperte nella regolazione della BAT da Burke et al., che hanno dimostrato che la regolazione ipotalamica del BAT browning attraverso una sottopopolazione di neuroni POMC differisce nei topi maschi e femmine18. L'attivazione postprandiale della BAT è minore nelle donne, nelle popolazioni anziane e nelle persone obese. La mancanza di attivazione delle BAT dopo un pasto (diminuzione dell'utilizzo del glucosio) potrebbe portare ad una maggiore prevalenza di ridotta tolleranza al glucosio nelle donne 19,20,21,22. Sfortunatamente, la maggior parte degli studi sull'attivazione delle BAT sono stati condotti solo sugli uomini. Attivando la BAT dopo un pasto, l'assorbimento di glucosio aumenta nella popolazione maschile magra. Non sorprende che, dopo l'attivazione della BAT, il DIT sia più alto nei soggetti maschi BAT positivi 8,9. Inoltre, il trapianto di BAT nei topi maschi migliora la tolleranza al glucosio, aumenta la sensibilità all'insulina e diminuisce il peso corporeo e la massa grassa23.

La PET-CT fallisce come metodo di scelta per misurare l'attività delle BAT, specialmente dopo un pasto. Pertanto, è stato sviluppato un metodo non invasivo e più sensibile. La termografia IR consente di stimare l'attività delle BAT in diversi animali da laboratorio (topi knock-out), nonché in partecipanti umani, indipendentemente dal sesso, dall'età o dagli effetti di diverse condizioni patologiche sull'attività delle BAT. Un ulteriore vantaggio di questo metodo è la semplicità per i partecipanti e gli animali da laboratorio, che ci consente di stimare i potenziali benefici della terapia di richiamo BAT. I recenti studi che utilizzano la termografia IR per determinare il comportamento fisiologico del BAT dopo l'esposizione al freddo o un pasto sono descritti nella recente pubblicazione di Brasil et al.24.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali su animali da laboratorio sono state approvate dal Comitato Etico Nazionale e dal Ministero dell'Agricoltura (EP 185/2018). Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con il Codice etico della Società croata per la scienza degli animali da laboratorio e le linee guida ARRIVE. Tutte le procedure eseguite negli studi che coinvolgono partecipanti umani erano conformi alla Dichiarazione di Helsinki e approvate dal Comitato Etico dell'Università di Zagabria, Facoltà di Medicina (UP/I-322-01/18-01/56). In questo studio, presentiamo i risultati di tre partecipanti di sesso femminile (BMI: 29 kg / m 2 ± 5 kg / m2). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i volontari umani per la loro partecipazione allo studio e per la presentazione dei dati.

1. Misurare l'attivazione del tessuto adiposo bruno dopo un pasto nell'uomo

NOTA: Eseguire gli esperimenti durante l'estate quando la temperatura giornaliera non è inferiore a 22 °C per mantenere l'attività basale delle BAT il più bassa possibile.

  1. Scegliere attentamente i partecipanti sani di controllo (se l'attività BAT deve essere stimata in condizioni patologiche) poiché l'attività BAT è sesso, età, BMI e persino la fase di dipendenza dal ciclo estrale.
    1. Per stimare la fase del ciclo mestruale delle partecipanti femminili, fai loro domande su quanto è lungo il loro ciclo mestruale medio e la data del primo giorno della loro ultima mestruazione. Non dimenticare di segnare la data degli esperimenti.
      NOTA: La corretta selezione dei soggetti di controllo corrispondenti è la parte più difficile degli studi clinici poiché i controlli sani e i partecipanti con condizioni patologiche dovrebbero essere il più simili possibile e differire solo nella malattia studiata.
  2. Chiedere ai partecipanti di riposare bene, di non fare colazione (digiuno-nessun apporto di calorie), di riunirsi nelle ore del mattino per gli esperimenti e di riposare per almeno 30 minuti per evitare possibili attivazioni di BAT durante l'attività muscolare tramite attivazione simpatica.
  3. Chiedere ai partecipanti di rimuovere gli indumenti superiori 15 minuti prima delle misurazioni per evitare i possibili effetti del riscaldamento della superficie della pelle (effetti termici dei vestiti) mentre si determina l'attività BAT di base. Eseguire misurazioni a temperatura ambiente appropriata (22-27 °C).
  4. Eseguire misurazioni a infrarossi.
    1. Mentre i partecipanti sono a riposo, montare la termocamera (tipo di rivelatore: microbolometro non raffreddato; passo del rilevatore: 17 μm; gamma spettrale della fotocamera: 7,5-14,0 μm; sensibilità termica: 20 mK a 30 °C; obiettivi: 36 mm; risoluzione: 1024 pixel x 768 pixel; campo visivo istantaneo [IFOV]: 0,47 mRad) sul treppiede e posizionarlo a 1 m di distanza dal punto in cui il partecipante sarà seduto.
      NOTA: Se le misurazioni vengono eseguite in condizioni climatiche più fredde (temperature dell'aria esterna inferiori a 15 °C al 50% di umidità), posizionare la fotocamera a temperatura ambiente e accenderla per almeno 1 ora prima di eseguire le misurazioni. Gli strumenti freddi possono dare risultati diversi dopo il riscaldamento a temperatura ambiente a causa dell'autocalibrazione.
    2. Collegare la termocamera a un computer e software come indicato dal produttore. Registrare un foglio di alluminio (foglio di alluminio accartocciato e poi allungato) a una distanza focale di 1 m per determinare la temperatura riflessa della stanza, presentata come temperatura misurata. Nel software della fotocamera, immettere la distanza di 0 m e l'emissività di 1.
      NOTA: La temperatura apparente riflessa è un parametro ottenuto quando l'emissività della telecamera è impostata su 1,0 e la distanza a 0 m e le misurazioni vengono effettuate su un foglio di alluminio accartocciato e poi allungato. La temperatura apparente riflessa rappresenta un'approssimazione della radiazione infrarossa incidente totale sul rivelatore dall'ambiente.
    3. Poco prima di iniziare le misurazioni, determinare la temperatura dell'aria ambiente e l'umidità dell'aria (necessarie per analisi successive). Invece di scattare un'immagine termica, registra un filmato. Dal filmato, in seguito scegli il miglior fotogramma possibile per l'analisi per ridurre la possibilità di perdere dati preziosi.
    4. Prima di iniziare la registrazione, impostare i seguenti parametri: la durata della registrazione video a 10-15 s (o qualsiasi altro valore desiderato), il frame rate a 5 fps (fotogrammi al secondo) o qualsiasi altro valore (nelle nostre mani, 5 fps è il massimo necessario) e una posizione sul disco in cui verrà salvato il filmato, come descritto di seguito.
      1. Nel software sopra la finestra principale della fotocamera, scegli la terza icona da sinistra. Nel menu a comparsa, scegli Modifica impostazioni record, dopodiché si aprirà una nuova finestra.
      2. In modalità di registrazione, selezionare Record to Disk e, al di sotto di esso, impostare Record for This Duration (Record for This Duration ) all'ora desiderata. Nelle opzioni di registrazione della stessa finestra, limitare la frequenza di registrazione a 5 (Hz) e scegliere la posizione in cui verranno salvate le registrazioni.
      3. Per impostare la frequenza dei fotogrammi, chiudi la finestra esistente, apri Modifica nel menu principale e seleziona Preferenze. Nella parte destra della finestra aperta, inserisci 5 in Target Frame Rate. Nella stessa finestra sottostante, selezionare Tasto di scelta rapida / Avvio remoto può interrompere la registrazione e, dal menu a discesa, selezionare In modalità Start / Stop.
        NOTA: prova a creare i filmati più brevi possibili con la frequenza fotogrammi più bassa possibile poiché consuma memoria. Con queste impostazioni, un record avrà circa 100 Mb.
  5. Posizionare il partecipante in modo che l'area sopraclavicolare del collo, sopra la clavicola in cui si trova BAT (Figura 1), sia a una distanza focale di 1 m e registrare un breve filmato (10-15 s) a un frame rate di 5 fps premendo il tasto F5 . La registrazione si interromperà all'ora stabilita.
  6. Nella stanza al momento delle misurazioni, assicurarsi che siano presenti solo il partecipante e la persona che sta eseguendo le misurazioni. Evitare il movimento dell'aria o le correnti d'aria (ad esempio, dall'aria condizionata). Assicurati che i partecipanti siano lontani da correnti d'aria fredde, luce solare (diretta o indiretta) o qualsiasi fonte di calore come le lampadine.
  7. Se necessario, misurare le concentrazioni di glucosio nel sangue capillare dalla punta delle dita con un glucometro standard e la temperatura corporea utilizzando un termometro ascellare.
  8. Assicurati che tutti i partecipanti mangino lo stesso pasto. Prestare attenzione alle restrizioni alimentari e alle esigenze dei soggetti testati (ad esempio, il pasto per i pazienti diabetici). Tutti i partecipanti, comprese le persone di controllo (sane) e i partecipanti con disturbi metabolici, dovrebbero mangiare lo stesso pasto.
    NOTA: Per maggiori dettagli sui pasti che i pazienti diabetici possono consumare, contattare un endocrinologo locale o discuterne con i partecipanti affetti da diabete mellito.
  9. All'ora desiderata dopo un pasto, effettuare la nuova registrazione premendo F5 utilizzando gli stessi valori di impostazione. Non ripetere il protocollo impostato per le registrazioni. Ripetere le misurazioni a 30 min, 1 h, 2 h e 3 h dopo un pasto12. Per il tuo disegno di studio specifico, il tempo dopo un pasto potrebbe essere più breve o più lungo, ma raccomandiamo almeno i primi tre punti temporali.
    NOTA: La limitazione del numero di partecipanti è da quattro a sei, anche se le misurazioni vengono eseguite velocemente. Con un numero maggiore di partecipanti, il tempo di ritardo per alcuni sarà troppo lungo.

2. Misurare l'attivazione del tessuto adiposo bruno dopo un pasto in animali da laboratorio

NOTA: Poiché gli animali sono alloggiati in una struttura per animali con temperatura ambiente regolata e un ciclo giorno/notte di 12 h/12 h, gli esperimenti possono essere eseguiti durante qualsiasi stagione. La temperatura ambiente durante gli esperimenti deve essere compresa tra 22 °C e 27 °C. In questo studio sono stati esaminati sei femmine in diestrus e sei maschi wild-type (WT) C57Bl/6NCrl.

  1. Anestetizzare gli animali secondo le linee guida etiche dell'istituzione. In questo studio, l'anestesia è stata eseguita utilizzando iniezioni i.p. di ketamina / xilazina (80-100 mg / kg e 6-8 mg / kg, rispettivamente). Applicare il gel per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale durante l'anestesia. Rasare le regioni interscapolari degli animali da esperimento un giorno prima degli esperimenti (la regione della pelle tra le scapole) usando un piccolo trimmer per animali.
  2. Il giorno prima degli esperimenti, determinare anche la fase del ciclo estrale negli animali femmina.
    NOTA: La fase del ciclo estrale è determinata da strisci vaginali.
    1. Immergere un batuffolo di cotone in soluzione salina sterile a temperatura ambiente (0,9% NaCl) e inserirlo nella vagina. Raschiare delicatamente la parete vaginale con il tampone, distribuire le cellule attaccate su un vetrino e lasciarlo asciugare all'aria.
    2. Rimetti gli animali nelle loro gabbie. Macchiare le cellule con 500 μL di acetato di violetto cresil allo 0,1% per 1 minuto, dopo di che sciacquarle 3 volte con acqua.
    3. Visualizza le cellule al microscopio ottico con ingrandimento 100x e illuminazione in campo luminoso. Determinare la fase del ciclo estrale in base al numero di leucociti e cellule epiteliali nucleate e cornificate osservate nello striscio25.
  3. Rimuovere il cibo degli animali la sera prima degli esperimenti (digiuno durante la notte) con acqua ad libitum. Il modo migliore è trasferire gli animali in nuove gabbie pulite per evitare possibili resti di cibo nelle gabbie.
  4. La mattina della giornata sperimentale, preparare la termocamera e le impostazioni di registrazione come fatto per testare i partecipanti umani.
  5. Non disturbare o causare stress agli animali prima di eseguire misurazioni IR. Posizionare con cura l'animale in una gabbia pulita (assicurarsi che non ci siano effetti del profumo di altri animali sul sistema simpatico dell'animale). Posizionare la gabbia sotto la termocamera a una distanza focale di 1 m. Registrare un filmato premendo F5.
  6. Pesare il pellet di cibo prima di darlo a ciascun animale in modo che l'assunzione di cibo possa essere calcolata. Lasciare che l'animale mangi per 30 minuti nella sua gabbia e pesare di nuovo il pellet di cibo dopo il pasto. In questo studio, le femmine hanno mangiato 0,038 ± 0,004 g di cibo / peso corporeo.
    NOTA: Se si decide di misurare le concentrazioni di glucosio nel sangue, eseguire le misurazioni prima di un pasto ma dopo le misurazioni IR per assicurarsi che ciò non porti all'attivazione di BAT da parte del sistema simpatico.
  7. Ripetere le misurazioni IR all'ora desiderata dopo aver iniziato un pasto (di solito 30 min, 1 h e 2 h dopo un pasto)17,26.
  8. Dopo che tutti gli esperimenti sono stati completati, testare nuovamente la fase del ciclo estrale nelle femmine come descritto sopra (le femmine possono uscire dalla fase desiderata del ciclo estrale prima del previsto).

3. Analisi delle registrazioni termiche

NOTA: il software della termocamera calcola la temperatura dell'oggetto utilizzando cinque variabili.

  1. Impostare le seguenti variabili nel software prima dell'analisi: emissività della pelle, e = 0,9815,27, temperatura ambiente riflessa (calcolata dall'immagine del foglio di alluminio), temperatura dell'aria, umidità relativa, distanza dall'oggetto = 1 m. Eseguire l'analisi utilizzando il software con questi valori.
    NOTA: la tavolozza dei colori preferita è l'arcobaleno poiché utilizza più tonalità, il che consente un rilevamento più facile di BAT sopra la clavicola.
  2. Per ogni filmato, inserisci le variabili elencate nel software della fotocamera sul lato destro della finestra principale. Selezionare il fotogramma (immagine) adatto dal filmato spostando la testina di riproduzione nella parte inferiore dello schermo o premendo il pulsante Pausa .
  3. Selezionare la regione di interesse (ROI) scegliendo la forma desiderata dell'area sul lato sinistro della finestra principale. Scegli la forma che meglio corrisponde all'area della pelle sopra o tra le clavicole.
  4. Quando viene scelto il ROI, le temperature minime, massime e medie del ROI vengono visualizzate sul lato destro. Nell'immagine, il triangolo rosso rappresenta il punto di temperatura massima registrata e il triangolo blu rappresenta la temperatura minima registrata. Ripetete questo passaggio per diversi fotogrammi per assicurarvi che la temperatura misurata sia stabile durante alcuni secondi della registrazione.
  5. Sottrarre le temperature massime dell'area cutanea al di sopra del BAT prima di un pasto dalle temperature massime dopo un pasto per determinare l'aumento dell'attività postprandiale delle BAT negli animali da laboratorio.

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Representative Results

Il modo più semplice per determinare l'attività delle BAT è sottrarre la temperatura massima della pelle al di sopra della BAT prima e dopo un pasto nei soggetti umani. Un modo migliore per calcolare l'attività delle BAT è selezionare due regioni di interesse: l'area cutanea sopra il BAT, che si trova nell'area sopraclavicolare, e l'area interclavicolare della pelle in cui non si trova tessuto BAT nell'uomo, designata come area di riferimento (secondo PET-CT; Figura 1). L'attività BAT è quindi facilmente determinata dalla sottrazione di queste due temperature. Come mostrato nella figura 1, l'attività BAT è stata determinata come 1,8 °C. Per determinare l'attivazione della BAT dopo l'alimentazione, questo è stato ripetuto in punti temporali designati dopo un pasto12. In questo studio, abbiamo eseguito esperimenti con tre partecipanti di sesso femminile. Risultati simili sono stati ottenuti dal partecipante 1 e dal partecipante 2 con BMI di 23 kg / m 2 e 34 kg / m2, rispettivamente. Il partecipante 3 aveva il BMI più basso (18 kg / m2) e il più alto aumento dell'attività BAT dopo un pasto (Figura 1B, a sinistra). La temperatura massima sulla zona sopraclavicolare della pelle non è una buona rappresentazione dell'attività BAT poiché non vi è alcuna diminuzione della temperatura cutanea anche 3 ore dopo un pasto (Figura 1B, a destra). A causa delle differenze nell'attività delle BAT tra la popolazione umana, l'analisi dei risultati deve essere effettuata individualmente e/o la scelta del partecipante allo studio deve essere effettuata con molta attenzione. Non vi è una tale differenza nell'attività delle BAT negli animali da laboratorio poiché sono strettamente correlati.

Il primo vantaggio di questo metodo rispetto all'uso del PET-CT (18F-FDG) è che misura l'attività BAT indipendentemente dalla fonte di calore. Per questo motivo, la termografia IR è molto più sensibile e rappresenta in modo più veritiero l'attività BAT in diverse condizioni fisiologiche o fisiopatologiche. Questo metodo può essere utilizzato per determinare le condizioni fisiologiche che portano a cambiamenti nell'attività delle BAT, come età, sesso o fase del ciclo estrale. Nell'uomo, un ulteriore vantaggio è la capacità di determinare i cambiamenti fisiopatologici nell'attività delle BAT nelle malattie metaboliche come l'obesità e il diabete mellito di tipo 2. Un vantaggio speciale potrebbe essere visto quando si confronta l'attività BAT di persone con alta concentrazione di glucosio nel sangue con controlli sani poiché, nella PET-CT, il glucosio radioattivo compete con gli stessi trasportatori di glucosio del glucosio nel corpo, portando a risultati falsi negativi o rappresentazioni errate dell'attività BAT.

Una possibile preoccupazione sono le differenze nello spessore della pelle, in particolare il tessuto adiposo bianco sottocutaneo, che possono alterare la temperatura cutanea al di sopra del BAT in diversi soggetti28. Questo problema può essere evitato confrontando l'attivazione BAT prima e dopo un pasto. Solitamente, l'attività e la conseguente importanza per le diverse condizioni fisiopatologiche sono determinate dall'attivazione delle BAT dopo esposizione al freddo. Tuttavia, questo tipo di attivazione delle BAT è stagionale e, negli esseri umani (rispetto agli animali nelle aree selvagge), non molto importante. Per determinare gli effetti dell'attività BAT sulla vita di tutti i giorni, così come l'omeostasi del glucosio, l'attivazione delle BAT dopo un pasto seguita dall'utilizzo di glucosio e acidi grassi è il modo corretto.

Si dovrebbe prestare attenzione alle misurazioni eseguite in ambienti caldi o troppo presto dopo l'attività muscolare. L'attività muscolare aumenta la temperatura corporea, che porta alla vasodilatazione della pelle (Figura 2). Quando non vi è alcuna area cutanea più calda visibile sopra il BAT rispetto alle aree cutanee circostanti, escludere le registrazioni dallo studio.

L'attività delle BAT negli animali da laboratorio è determinata dalla temperatura massima della BAT situata tra la scapola (BAT interscapolare, iBAT) e dalla temperatura media della pelle al di sopra dell'iBAT. È più facile misurare la temperatura media della pelle al di sopra del BAT negli animali da laboratorio poiché è più localizzata che nell'uomo (Figura 3). In questo studio, i cambiamenti nell'attività delle BAT dopo un pasto sono stati misurati in femmine di animali WT in diestrus (28,2 ± 0,5 settimane di età). Come mostrato nella Figura 3, variazioni statisticamente significative nell'attività delle BAT sono state determinate 30 minuti dopo un pasto, ma solo quando è stata misurata la temperatura massima (p < 0,05). Quando l'attività BAT è stata presentata come variazioni delle temperature medie, la variazione non è stata significativa (p = 0,066). Pertanto, presentare l'attività BAT attraverso i cambiamenti nella temperatura massima dell'area della pelle interscapolare è un modo migliore per presentare i risultati. Questo cambiamento nell'attività BAT era positivamente correlato con la quantità di cibo ingerito (r = 0,65).

Le principali preoccupazioni per entrambi i gruppi di soggetti sono le differenze biologiche nell'attivazione delle BAT negli animali maschi e femmine e giovani e anziani, nonché le differenze nell'attività delle BAT durante il ciclo estrale17. Un'attenzione particolare dovrebbe essere prestata alla quantità di tempo trascorso dall'ultimo pasto, che sarà difficile da stimare se il protocollo di cui sopra non viene seguito. Eseguire esperimenti alla stessa ora al mattino non è abbastanza preciso17.

Un'ulteriore preoccupazione durante la misurazione dell'attività delle BAT è quella di evitare il più possibile lo stress negli animali. Qualsiasi disturbo aumenterà l'attività simpatica e, quindi, l'attività BAT16. Inoltre, la maggior parte degli errori che coinvolgono le registrazioni della temperatura possono apparire se l'area interscapolare dei topi non viene rasata correttamente, il che può portare a misurare l'area sbagliata della pelle.

Figure 1
Figura 1: Termografia a infrarossi. (A) Vengono selezionate due aree cutanee: una sopra il tessuto adiposo bruno (BAT; area sopraclavicolare) e la seconda nell'area interclavicolare (nessun tessuto BAT presente sotto la cute di questo punto di riferimento dell'area). La posizione BAT è presentata come l'area più calda sopra la clavicola. La rappresentazione schematica della posizione BAT nel collo secondo PET-CT è presentata nella figura a sinistra. Le temperature sono temperature massime misurate in aree cutanee circondate. La barra rappresenta 5 cm. (B) Le differenze tra le temperature massime in entrambe le aree della pelle sono presentate per ciascun partecipante, mostrando l'aumento dell'attività BAT 2 ore dopo un pasto (a sinistra). L'attività BAT non può essere presentata dalle temperature massime della pelle al di sopra della BAT (a destra). I risultati sono presentati come errore medio ± standard della media. * p < 0,05 rispetto al valore iniziale (ANOVA). Abbreviazione: SC = soprascapolare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Le condizioni in cui l'attività BAT non può essere misurata. La figura rappresenta le condizioni in cui non è possibile determinare l'attività BAT a causa dell'aumentata vasodilatazione dei vasi sanguigni della pelle. La barra rappresenta 5 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Tessuto adiposo bruno nei topi di laboratorio. (A,B) Il tessuto adiposo bruno interscapolare (BAT) viene attivato dopo esposizione al freddo e solo allora mostrato come accumulo di 18F-FDG da parte di PET-CT. L'attività di BAT potrebbe essere vista con una termocamera senza esposizione al freddo. (C) La posizione della BAT nella scansione termica corrisponde alla BAT presentata nell'immagine PET-CT da una freccia. L'area rasata è più grande del BAT per poter vedere tutti i cambiamenti di temperatura (la posizione del Tmax non poteva essere perfettamente prevista e, in alcuni studi, la temperatura media può essere misurata). La barra rappresenta 1 cm. (D) Vengono presentate le temperature massime e medie misurate della pelle al di sopra del BAT per sei topi femmina in diestro. I risultati sono presentati come errore medio ± standard della media. * p < 0,05 rispetto al valore iniziale (ANOVA). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

Studi recenti presentano prove crescenti per quanto riguarda la regolazione fisiologica e l'importanza dell'attività delle BAT nell'uomo adulto e negli animali nello sviluppo dell'obesità e del diabete mellito. Inoltre, la possibile attivazione delle BAT da parte di attivatori esogeni sta diventando un obiettivo per le aziende farmaceutiche. Per poter stimare la regolazione fisiologica e l'importanza fisiopatologica delle BAT in patologie molto gravose, nonché scoprire un potenziale approccio terapeutico, la termografia a infrarossi sta diventando il metodo di scelta. Anche se la tecnologia IR sta emergendo come un nuovo metodo di scelta per misurare l'attività BAT 12,13,14,15,17, particolare attenzione dovrebbe essere prestata non al metodo applicato in sé, ma agli attributi fisiologici dell'attivazione delle BAT. Si dovrebbe prestare particolare attenzione al sesso, all'età, alla fase del ciclo estrale, allo stato di alimentazione e al possibile stress nei partecipanti umani e negli animali da laboratorio.

Le misurazioni dell'aumento dell'attività BAT dopo un pasto eseguito su esseri umani e animali da laboratorio sono abbastanza simili12,17. I passaggi critici nella conduzione di queste misurazioni includono l'evitamento dello stress e dell'attività muscolare (gli animali non devono essere disturbati prima di eseguire le misurazioni). Per le partecipanti di sesso femminile, devono essere prese in considerazione le differenze funzionali nell'attività delle BAT durante il ciclo estrale (mestruale). Inoltre, la pelle dovrebbe essere nuda (gli animali dovrebbero essere rasati il giorno prima che vengano eseguiti esperimenti per evitare stress inutili). Inoltre, è molto importante impostare correttamente il software della fotocamera per ottenere la migliore risoluzione termica possibile. Per presentare i dati come immagini termiche, il modo migliore è scegliere una tavolozza di colorazione adeguata che si adatti allo studio particolare. Se il protocollo viene seguito correttamente, c'è meno possibilità di commettere errori nell'esecuzione della termografia IR.

Il limite del metodo è che non è possibile, senza una leggera preoccupazione, confrontare l'attività BAT tra persone con diverse quantità di grasso sottocutaneo (o animali obesi con animali con peso corporeo normale). Per evitare questo problema, lo stesso soggetto dovrebbe essere utilizzato come controllo misurando l'attività BAT prima e dopo un pasto. Il calcolo dell'aumento dell'attività BAT dopo un pasto eliminerà le differenze nella distribuzione del calore dal BAT sottocutaneo alla superficie della pelle.

Segnalare l'attività delle BAT attraverso i cambiamenti tra le temperature massime della pelle di entrambe le aree cutanee è, dal nostro punto di vista, un modo migliore poiché elimina le differenze nelle dimensioni delle BAT e/o nell'area cutanea designata nei risultati ottenuti dalle misurazioni della temperatura media29.

Come accennato in precedenza, il metodo di scelta per misurare l'attività BAT fino ad oggi è PET-CT utilizzando glucosio radioattivo (18F-FDG). Questo metodo, nel tempo, si è dimostrato non abbastanza sensibile, il suo utilizzo di materiale radioattivo è preoccupante ed è molto costoso. La PET-CT è inutile nel determinare l'attivazione delle BAT dopo un pasto. 18 L'accumulo di F-FDG in BAT dopo un pasto è appena visibile10 e considerato un risultato negativo. Recentemente, è stato suggerito che l'attivazione delle BAT è più pronunciata nella popolazione umana e, quindi, è sempre più importante nello sviluppo e nella diffusione delle malattie metaboliche7. Un tentativo di risolvere questo problema è misurare il volume BAT mediante risonanza magnetica in pazienti prediabetici e con T2DM con insulino-resistenza11. Tuttavia, la quantità di BAT non fornisce alcuna informazione sull'attività di BAT e sull'utilizzo di glucosio e acidi grassi, che è importante nei pazienti diabetici.

Stabilire la termografia IR come metodo di scelta per misurare l'attività delle BAT, specialmente nei soggetti umani con alta concentrazione di glucosio nel sangue, avrà un enorme impatto sul campo. La termografia IR viene utilizzata per la determinazione dell'attivazione indotta dal freddo di BAT 13,14,15 e, recentemente, dell'attivazione di BAT dopo un pasto in volontari sani 12 e animali da laboratorio 17. L'attivazione postprandiale della BAT è minore nelle femmine e nei soggetti più anziani, indipendentemente dalla specie. Sfortunatamente, la maggior parte delle ricerche sull'attivazione delle BAT e sugli studi metabolici sono state eseguite solo su soggetti maschi (animali da laboratorio maschi o uomini). Il problema con questo approccio è che ignora l'effetto della fase del ciclo estrale sull'attività BAT30.

Infine, la termografia IR consentirà di indagare l'importanza fisiologica e fisiopatologica delle BAT in diverse popolazioni umane, specialmente nelle donne in pre- e postmenopausa, studi per i quali mancano.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo studio è stato finanziato dalla borsa di ricerca della Fondazione scientifica croata (IP-2018-01- 7416).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% cresyl violet acetate  Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity Kesterl Kestrel 4200 Certificat of conformity
External data storage Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides Commonly used
Small cotton tip swab  Urethral swabs
Software for analysis FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA FLIR Tools
Software for meassurements FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA ResearchIR software FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA FLIR T-1020

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Medicina Numero 187 Termografia soggetti umani e animali da laboratorio attivazione postprandiale del tessuto adiposo bruno tomografia computerizzata ad emissione di positroni (PET-CT)
Termografia a infrarossi per la rilevazione di cambiamenti nell'attività del tessuto adiposo bruno
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Kordić, M., Dugandžić, J., Ratko, M., Habek, N., Dugandžić, A. Infrared Thermography for the Detection of Changes in Brown Adipose Tissue Activity. J. Vis. Exp. (187), e64463, doi:10.3791/64463 (2022).

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