Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantificering af cirkulære RNA'er ved hjælp af digital dråbe-PCR

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64464
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1
1Institute of Life Sciences, 2School of Biotechnology, KIIT University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver den detaljerede metode til digital dråbe PCR (dd-PCR) til præcis kvantificering af cirkulære RNA (circRNA) niveauer i celler ved hjælp af divergerende primere.

Abstract

Digital dråbepolymerasekædereaktion (dd-PCR) er en af de mest følsomme kvantificeringsmetoder; det opdeler reaktionen i næsten 20.000 vand-i-olie-dråber, og PCR forekommer i de enkelte dråber. dd-PCR har flere fordele i forhold til konventionel qPCR i realtid, herunder øget nøjagtighed ved påvisning af mål med lav forekomst, udeladelse af referencegener til kvantificering, eliminering af tekniske replikater for prøver og viser høj modstandsdygtighed over for hæmmere i prøverne. For nylig er dd-PCR blevet en af de mest populære metoder til nøjagtig kvantificering af mål-DNA eller RNA til genekspressionsanalyse og diagnostik. Cirkulære RNA'er (circRNA'er) er en stor familie af nyligt opdagede kovalent lukkede RNA-molekyler, der mangler 5 'og 3' ender. De har vist sig at regulere genekspression ved at fungere som svampe for RNA-bindende proteiner og mikroRNA'er. Desuden udskilles circRNA'er i kropsvæsker, og deres modstand mod exonukleaser får dem til at fungere som biomarkører til sygdomsdiagnose. Denne artikel har til formål at vise, hvordan man udfører divergerende primerdesign, RNA-ekstraktion, cDNA-syntese og dd-PCR-analyse for nøjagtigt at kvantificere specifikke cirkulære RNA (circRNA) niveauer i celler. Afslutningsvis demonstrerer vi den nøjagtige kvantificering af circRNA'er ved hjælp af dd-PCR.

Introduction

Nylige fremskridt inden for RNA-sekventeringsteknologier og nye beregningsalgoritmer har opdaget et nyt medlem af den voksende familie af ikke-kodende RNA'er, kaldet cirkulært RNA (circRNA)1. Som navnet antyder, er circRNA'er en familie af enkeltstrengede RNA-molekyler uden frie ender. De er dannet ved ikke-kanonisk head-to-tail splejsning kaldet back-splejsning, hvor det opstrøms splejsningsacceptorsted forbinder kovalent med det nedstrøms splejsningsdonorsted for at danne en stabil RNA-cirkel 1,2. Denne proces kan medieres af flere faktorer, herunder inverterede Alu gentagne elementer, der er til stede i opstrøms og nedstrøms for cirkulariserede exoner, eller kan medieres af nogle splejsningsfaktorer eller RNA-bindende proteiner (RBP'er)2,3. Cirkulære RNA'er, der udelukkende genereres fra exonic eller intronic-sekvensen, klassificeres som exonic circRNA og cirkulære intronic RNA'er eller ci-RNA'er, mens nogle exonic circRNA'er bevarer intron og kaldes exon-intron circRNA'er (EIcircRNA'er)3,4. Funktionerne i circRNA'er er mangefacetterede, herunder sponging miRNA og / eller RBP, regulering af transkription og regulering af cellulær funktion ved at oversætte til peptider 3,5,6,7. Flere rapporter har fremhævet betydningen af circRNA'er i forskellige sygdomme og fysiologiske processer8. Desuden gør vævsspecifikke ekspressionsmønstre og resistens over for exonukleasefordøjelse det til en funktionel biomarkør til sygdomsdiagnose, og det kan også bruges som et passende terapeutisk mål8. I betragtning af dets betydning for regulering af sundhed og sygdomme er den nøjagtige kvantificering af circRNA-ekspression timens behov.

Flere biokemiske metoder er blevet udviklet til kvantificering af circRNA'er i biologiske prøver9. En af de mest bekvemme og bredt accepterede metoder til circRNA-kvantificering er omvendt transkription efterfulgt af kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) ved anvendelse af divergerende primerpar10. Imidlertid er størstedelen af circRNA'er i lav overflod sammenlignet med lineære mRNA'er, hvilket gør det udfordrende at kvantificere dem11. For at løse dette problem forsøgte vi at bruge digital dråbe-PCR (dd-PCR) til at kvantificere antallet af circRNA'er i en given prøve nøjagtigt. dd-PCR er en avanceret PCR-teknologi, der følger mikrofluidikprincippet; det genererer flere vandige dråber i olie, og PCR forekommer i hver dråbe som en individuel reaktion12. Reaktionen forekommer i individuelle dråber og analyseres ved hjælp af en dråbelæser, som giver antallet af positive eller negative dråber for genet af interesse12. Det er den mest følsomme teknik til nøjagtigt at kvantificere et gen af interesse, selvom der kun er en enkelt kopi i en given prøve. Nedsat følsomhed over for hæmmere, bedre præcision og udeladelse af referencegenet til kvantificering gør det mere fordelagtigt end konventionel qPCR13,14,15. Det er blevet brugt i vid udstrækning som et forsknings- og diagnostisk værktøj til absolut kvantificering af et gen af interesse16,17. Her beskriver vi den detaljerede dd-PCR-protokol til circRNA-kvantificering ved differentiering af mus C2C12 myorør og prolifererende mus C2C12 myoblaster ved hjælp af divergerende primere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

RNA er følsomt over for RNaser; derfor bør alle reagenser, instrumenter og arbejdsområder være RNase-fri og håndteres med omhu.

1. Divergerende primerdesign til circRNA (se figur 1)

  1. Hent den modne sekvens fra circRNA-annotationsdata ved hjælp af BEDTools eller fra UCSC-genombrowseren ved at slutte sig til exon / intron-sekvensen, der er til stede mellem backsplice-forbindelseskoordinaterne18,19.
  2. Forbered en PCR-skabelonsekvens på 200 nukleotider i længden ved at forbinde de sidste 100 nukleotider af den samlede circRNA-sekvenslængde til de første 100 nukleotider af circRNA-sekvensen10.
    BEMÆRK: Hvis circRNA-længden er mindre end 200 nukleotider, skal du dele den i to lige store halvdele og slutte sig til nukleotiderne fra sidste halvdel til begyndelsen af første halvdel.
  3. Brug ovenstående skabelonsekvens til primerdesign ved hjælp af Primer3-webværktøjet og indstille en PCR-produktlængde fra 120-180 nukleotider i længden20.
  4. Brug standardindstillingerne for Primer3 til andre parametre såsom Tm og primerlængde. Primersekvenserne for circBnc2 er anført i tabel 1.
  5. Bestil de divergerende primersekvenser til syntese fra ethvert oligosyntetiseringsfirma.

2. RNA-isolering

BEMÆRK: Isoler total RNA fra musens C2C12-celler ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits eller intern RNA-isolationsmetode. Den interne RNA-isolationsmetode, der anvendes her, er tidligere beskrevet21. De magnetiske silicaperler fremstilles i laboratoriet ved hjælp af den tidligere offentliggjorte protokol22. Disse magnetiske perler kan også købes fra forskellige leverandører.

  1. Tag en 10 cm skål indeholdende ca. 5 x 106 prolifererende C2C12 myoblastceller og en 4-dages differentieret C2C12 myotube til RNA-isolering.
  2. Cellerne vaskes med 10 ml 1x PBS tre gange, og PBS kasseres ved hjælp af en pipette.
  3. Cellerne skrabes i 1 ml 1x PBS ved hjælp af en celleskraber, centrifugeres ved 4 °C i 5 minutter ved 750 x g, og PBS kasseres ved hjælp af en pipette.
  4. Tilsæt 1 ml RNA-isolationsreagens (RIR) og lys cellerne ved kraftig pipettering21.
  5. Der tilsættes 200 μL (1/5 af RIR-volumenet) chloroform og hvirvel i 15 s. Rør centrifugeres ved 4 °C i 10 minutter ved 12.000 x g.
  6. Tag 400 μL af det øverste vandige lag, læg det på en silicasøjle, og centrifuger i 1 minut ved 12.000 x g ved stuetemperatur. Tag gennemstrømningen til et nyt rør og tilsæt 600 μL 100% ethanol.
  7. Tilsæt 20 μL magnetiske silicaperler, og anbring røret på en termomixer, der er indstillet til 25 °C og 1.200 o/min i 5 minutter.
    BEMÆRK: Perlevolumenet kan øges eller formindskes afhængigt af de indledende cellenumre, der tages til lysis. Magnetiske silicaperler kan købes fra kommercielle leverandører.
  8. Placer røret på et magnetisk stativ i 30 s, eller indtil opløsningen bliver klar. Kassér supernatanten forsigtigt ved hjælp af en pipette.
  9. De magnetiske silicaperler gensuspenderes i en 500 μL vaskebuffer indeholdende 90 % ethanol. Placer røret på magnetstativet i 30 s. Drej røret to gange på magnetstativet for at vaske perlerne. Lad perlerne sætte sig mod magneten og kassér bufferen ved hjælp af en pipette.
  10. Gentag trin 2.9 to gange. Efter vasken skal du kort dreje røret og placere det tilbage på magnetstativet i 30 s. Kassér den resterende vaskebuffer. Lufttør røret ved 50 °C i 3 minutter på en termomixer, og hold låget åbent.
  11. Tilsæt 20 μL nukleasefrit vand og suspender perlerne igen.
    BEMÆRK: RNA-elueringsvolumenet kan reduceres ned til 10 μL for at opskalere RNA-koncentrationen.
  12. Placer rørene i 2-3 minutter ved stuetemperatur. Placer røret tilbage på magnetstativet og lad det sidde i 30 s. Det opløste RNA samles i et nyt rør til kvantitets- og kvalitetsvurdering ved hjælp af et spektrofotometer.
    BEMÆRK: RNA kan opbevares ved -20 °C eller -80 °C til langtidsopbevaring. For at få et optimalt resultat anbefales det at fortsætte med cDNA-syntesetrinnet den næste dag.

3. cDNA-syntese

  1. Mål RNA-koncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer og tag 1 μg RNA til cDNA-syntese.
  2. Bland 1 μg total RNA med 1 μL dNTP-blanding (10 mM hver af dATP, dTTP, dGTP og dCTP), 4 μL 5x omvendt transkriptase (RT) buffer, 2 μL 10x RT tilfældig primer, 0,25 μL omvendt transkriptaseenzym (200 U / μL) og 0,5 μL RNasehæmmer (40 U / μL), og fyld volumenet op til 20 μL ved hjælp af nukleasefrit vand.
    BEMÆRK: Det omvendte transkriptaseenzymvolumen kan ændres afhængigt af den indledende RNA-koncentration taget til cDNA-syntese.
  3. Tryk på røret for at blande reaktionen og dreje kort. Røret anbringes ved 25 °C i 10 minutter efterfulgt af ved 50 °C i 1 time.
  4. For at inaktivere enzymet anbringes røret ved 85 °C i 5 minutter.
  5. Isn røret afkøles i 2 minutter og tilsæt 480 μL nukleasefrit vand til røret for at gøre cDNA-koncentrationen til 2 ng / μL.
    BEMÆRK: cDNA kan opbevares ved -20 °C eller anvendes straks til dd-PCR-analyse.

4. Digital dråbe PCR (dd-PCR) arbejdsgang

BEMÆRK: Arbejdsgangen for dd-PCR involverer flere trin, startende fra prøveforberedelse, efterfulgt af dråbegenerering, PCR-forstærkning, dråbetælling og dataanalyse. Hvert trin er afgørende for nøjagtig datagenerering, da dd-PCR involverer absolut kvantificering af produkter og ikke har brug for nogen standardkurve. Derfor er hvert af de forskellige trin i dd-PCR beskrevet nedenfor.

  1. Fremstilling af dd-PCR-reaktionen.
    1. Opsæt PCR-reaktionen på 22 μL i 0,2 ml PCR-rør eller -strimler sammen med et negativt kontrolrør og NTC-rør (ikke-skabelonkontrol).
      BEMÆRK: Hvert forskelligt divergerende primerpar til påvisning af forskellige circRNA'er skal have en NTC-reaktion sammen med testprøver.
    2. Tilsæt 11 μL dd-PCR master-mix (f.eks. EvaGreen Supermix) og 11 μL nukleasefrit vand for at opsætte det negative kontrolreaktionsrør.
      BEMÆRK: Optø dd-PCR-masterblandingen ved stuetemperatur efterfulgt af en kort hvirvel for at lave en homogen blanding. Brug det samme nukleasefrie vand til at opsætte det negative kontrolreaktionsrør og NTC-rør, der blev brugt til fortynding af cDNA.
    3. Tilsæt 11 μL dd-PCR-masterblanding, 5,5 μL circRNA-specifik fremadgående og omvendt primerblanding med 1 μM koncentration og 5,5 μL nukleasefrit vand for at opsætte NTC-reaktionsrørene.
      BEMÆRK: Fortynd de fremadgående og omvendte cirkulære RNA-specifikke divergerende primere af 100 μM lager og bland for at forberede en 1 μM arbejdskoncentration af fremadgående og omvendt circRNA-primerblanding; således er den endelige primerkoncentration 250 nM i 22 μL-reaktionen.
    4. Der tilsættes 11 μL dd-PCR-mastermix, 5,5 μL circRNA-specifik fremadgående og omvendt primerblanding med 1 μM koncentration og 5,5 μL cDNA (2 ng/μL) for at opsætte reagensreaktionsrørene.
    5. Vortex grundigt efterfulgt af kort centrifugering af alle reaktionsrørene for at få en homogen reaktionsblanding i bunden af rørene.
  2. Dråbe generation.
    1. Overfør 20 μL PCR-blandingen fra 0,2 ml PCR-rør til prøvebrøndene i dråbegeneratorpatronen.
    2. Tilsæt 70 μL dråbegenereringsolie til dråbegeneratorpatronens oliebrønde omhyggeligt ved hjælp af en flerkanalspipette.
      BEMÆRK: Inkuber dråbegenereringsolien ved stuetemperatur i 15 minutter før brug.
    3. Dæk dråbegeneratorpatronen med gummipakningen, og læg den i dråbegeneratormaskinen for at få prøve-olie-dråbeblandingen, der genereres i patronens dråbebrønde.
  3. PCR-forstærkning.
    1. Overfør 40 μL af prøve-olie-dråbeblandingen fra dråbegeneratorpatronens dråbebrønde til en 96-brønds PCR-plade ved hjælp af en flerkanalspipette.
      BEMÆRK: Overfør forsigtigt prøve-olie-dråbeblandingen, mens du laver en vinkel på brøndene gennem spidserne på flerkanalspipetten for at undgå at bryde dråberne, mens de overføres til dd-PCR 96-brøndpladen.
    2. Forsegl PCR-pladen med 96 brønde med aluminiumsfolieforsegleren, læg den i pladeforseglermaskinblokken, der er forvarmet ved 80 ° C, og klikforsegling til tætning af PCR-pladen.
    3. Placer nu pladen i dd-PCR termisk cyklist og indstil programmet som nævnt i tabel 2 med lågtemperaturen indstillet til 105 ° C og en rampehastighed på 2 ° C / s.
  4. Tæller dråbe.
    1. Når PCR er overstået, skal du placere pladen på dd-PCR-dråbetællermaskinen med pladeholderen i den rigtige position til tælling af dråberne.
    2. Åbn dråbeanalysesoftwaren, og konfigurer kørslen ved at give input til eksempeloplysningerne.
    3. Klik på opsætningsindstillingen. Klik derefter på skabelonindstillingen for at åbne en ny skabelon.
    4. Definer hver brønd ved at sætte detaljerne i eksperimentet, såsom prøvenavn (cDNA brugt eller negativ kontrol eller NTC), målnavn (circRNA-primernavn) og type (ukendt) og eksperimenttype som ABS (absolut kvantificering) og Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) brugt osv.
    5. Til sidst skal du gemme skabelonen og starte kørslen ved at klikke på kørselsindstillingen og vælge optælling efter række eller kolonnevis. Lad maskinen fuldføre dråbetællingen, hvilket tager ca. 1 min/brønd.
    6. Klik på knappen Analysér for at analysere dataene efter afslutningen af dråbeaflæsningen.
    7. Klik på knappen 1D-amplitude for at se de positive og negative dråber
    8. For at adskille de positive dråber fra de negative dråber skal du sætte en fælles tærskellinje for alle prøver med samme mål.
      BEMÆRK: De samlede dråber i hver prøve skal være over 10.000 for at komme i betragtning til absolut kvantificering. NTC bør ikke vise positive dråbetællinger. Tilstedeværelsen af positive dråber i NTC indikerer forurening af reagenserne eller forstærkning af primerdimerne. Det er svært at finde ud af, om de positive dråber har primerdimerer eller ikke-specifikke produkter i NTC. Det tilrådes at kontrollere primerne og undgå forurening af reagenserne som en generel praksis for enhver PCR inklusive dd-PCR.
    9. Klik på knappen Eksporter for at eksportere circRNA-tælledataene som en .csv fil. De eksporterede data viser antallet af circRNA'er, der er til stede i hver prøve.
    10. Beregn manuelt antallet af circRNA'er i hver prøve pr. nanogram RNA ved at overveje den samlede mængde cDNA, der anvendes i hver reaktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det absolutte antal circRNA'er i hver prøve kan udledes af de eksporterede dd-PCR-data. Kvantitativ PCR-analyse i realtid foreslog differentiel ekspression af circBnc2 i de differentierede C2C12 myotuber (data ikke vist). Her ønskede vi at kontrollere det absolutte kopinummer af circBnc2 i prolifererende C2C12 myoblaster og myotubes. Da ekspressionen af circBnc2 sammenlignes under to betingelser, er det virkelig vigtigt at behandle alle prøver til RNA-isolering, cDNA-syntese og PCR samtidigt ved hjælp af de samme reagenser og procedure. For at udføre den absolutte kvantificering af circRNA'er ved anvendelse af dd-PCR-reaktionen skal der anvendes en lige stor mængde indledende total RNA til cDNA-syntese for at beregne det nøjagtige antal mål-RNA-molekyler pr. nanogram total RNA. For eksempel blev 1 μg total RNA anvendt til cDNA-syntese og fortyndet til 500 μL ved hjælp af nukleasefrit vand for at få en endelig koncentration på 2 ng / μL, før dd-PCR-analysen blev udført (figur 1).

Som vist i figur 2A blev cDNA fra 10 ng RNA fra prolifererende C2C12 myoblastceller (MB) og et 4-dages differentieret myotube (MT) brugt til at kontrollere forskellen i ekspression af circBnc2 under disse to betingelser. Prøverne blev behandlet for at generere dråben og udføre PCR efterfulgt af at tælle de positive og negative dråber ved hjælp af dråbeanalysesoftwaren i henhold til producentens anvisninger (figur 2B). Da primere kan forstærke ikke-specifikke produkter og danne primerdimerer, bør NTC bruges til alle primersæt. Ideelt set bør NTC ikke have nogen positive dråbetællinger.

Som vist i figur 3A viste alle prøver undtagen MT1 mere end 12.000 dråbetællinger. Da det samlede dråbeantal var lavt i MT1, blev denne prøve ikke taget i betragtning til endelig dataanalyse. Det lave samlede dråbeantal kan skyldes en fejl i dråbegenerering, brud på dråberne under overførsel til PCR-pladen eller pipetteringsproblemer. Interessant nok var der en klar forskel i ekspressionsmønsteret for circBnc2 i den 4-dages differentierede myotube-tilstand sammenlignet med myoblastcellerne. Analysen af circBnc2 overflod med hensyn til kopiantal viste, at de tre replikater af C2C12 myoblaster havde 76,8, 67 og 46 kopier / ng af RNA, mens de to myotubeprøver havde 558 og 610 kopier / ng RNA (figur 3B). Da en myotubeprøve ikke fungerede godt, er det bedre at have et større antal biologiske replikater for at studere de statistiske forskelle i deres ekspressionsmønstre under de to betingelser.

Figure 1
Figur 1: Skematisk gengivelse af det divergerende primerdesign til PCR-forstærkning af circBnc2. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: DD-PCR-arbejdsgangen til circRNA-kvantificering. Den komplette dd-PCR-arbejdsgang inkluderer mange trin: (A) RNA-isolering og cDNA-forberedelse fra C2C12 myoblast og 4-dages differentierede myotubeceller, PCR-blandingsforberedelse, (B) dråbegenerering, PCR-amplifikation, dråbetælling og dataanalyse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Dataanalyse ved hjælp af QuantaSoft-software. (A) Dataanalyse omfatter identifikation af positive og negative dråber ved hjælp af kvantificeringssoftwaren. (B) Beregning af antallet af circRNA'er/ng af RNA i C2C12 myoblaster (MB) og myotubes (MT). Dataene i panelet B-søjlediagrammet repræsenterer gennemsnittet ± STDEV af to til tre biologiske replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Primer Navn Sekvens
circBnc2 Fremad primer AAAGAGATGCACGTCTGCAC
circBnc2 Omvendt primer AACCGCAGAAACTGCTGAAG

Tabel 1: Divergerende primersekvenser, der anvendes til forstærkning af circBnc2.

Skridt Temperatur (°C) Tidspunkt Antal cyklusser Rampehastighed
Aktivering af enzymer 95 10 minutter 1 ~ 2 °C/s
Denaturering 94 30 s 40 ~ 2 °C/s
Udglødning/udvidelse 60 1 minut 40 ~ 2 °C/s
Signalstabilisering 4 5 minutter 1 ~ 2 °C/s
Signalstabilisering 90 5 minutter 1 ~ 2 °C/s

Tabel 2: Betingelser for PCR-forstærkning af circBnc2 på en termisk cyklist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CircRNA-forskning er vokset i det sidste årti med opdagelsen af high-throughput sekventeringsteknologier. Som et resultat er det blevet betragtet som et potentielt molekyle til fremtidige RNA-terapier. Derudover er det kendt for at fungere som en biomarkør i flere sygdomme, herunder kræft og hjerte-kar-sygdomme 4,8. Imidlertid er identifikationen af circRNA vanskelig på grund af dens lave overflod, og den har kun en specifik backsplice-krydssekvens, der adskiller den fra forældrenes mRNA9. RT-PCR ved hjælp af divergerende primere har været guldstandardteknikken til validering af circRNA siden opdagelsen 9,10. Selvom der er udviklet flere molekylære metoder til circRNA-kvantificering, er det udfordrende at måle circRNA-ekspressioner nøjagtigt på grund af deres lave overflod. Da dd-PCR kan forstærke meget lavabundant RNA / DNA-molekyler fra en given prøve14, er det en af de bedste metoder til nøjagtig kvantificering af circRNA'er.

DD-PCR er et slutpunktsassay, der giver absolut kvantificering af målgenet15. I modsætning til konventionel qPCR er det tidskrævende, kedeligt og dyrt, hvilket gør det mindre accepteret sammenlignet med PCR i realtid selv et årti efter dets opdagelse15. Det giver dog flere fordele i forhold til den meget anvendte qPCR til at studere genekspressionsændringer13,23. For det første kan dd-PCR give det nøjagtige antal kopier af DNA, der er til stede i en given prøve. For det andet ændrer en ændring i husholdningsgenekspression beregningen af målgenpopulationen i en given prøve. Dette kan undgås i dd-PCR, som ikke afhænger af standardkurver eller husholdningsgener til kvantificering af mål-DNA15. For det tredje, da PCR-reaktionen forekommer i små rum, giver den højere fleksibilitet over for tilstedeværelsen af ikke-specifikke hæmmere eller baggrunds-DNA, hvilket gør det til en mere præcis metode til kvantificering af målgener23,24.

Vi brugte dd-PCR-teknologien til at kvantificere circBnc2-ekspression i prolifererende C2C12-myoblaster og differentierede myorør ved hjælp af divergerende primere. Imidlertid skal specifik circRNA-amplifikation med divergerende primerpar uden primer-dimers kontrolleres i almindelig PCR, før der udføres dd-PCR. DD-PCR-protokollen skal også følges nøje for nøjagtig måling af circRNA-ekspression. Arbejdsgangen, der præsenteres her, kan let tilpasses til kvantificering af ethvert circRNA af interesse. Nylige undersøgelser har fremhævet de diagnostiske værdier af circRNA'er, der er til stede i væv og kropsvæsker til påvisning af sygdomme8. Sammen vil denne metode være et vigtigt redskab i forsknings- og diagnostikindustrien og vil fremskynde circRNA-forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af intramural finansiering fra Institute of Life Sciences, DBT-forskningsbevillingen (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) og Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2/504017] tildelt Amaresh C. Panda. Vi takker andre laboratoriemedlemmer for korrekturlæsning af artiklen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml microcentifuge tube Tarson 500010
0.2 ml tube strips with cap Tarson 610020, 510073
Filter Tips Tarson 528104
DNase/RNase-Free Distilled Water Thermo Fisher Scientific 10977023
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma P4417
Cell scrapper HiMedia TCP223
Chloroform SRL 96764
DNA diluent HiMedia MB228
Random primers Thermo Fisher Scientific 48190011
dNTP set Thermo Fisher Scientific R0181
Murine RNase inhibitor NEB M0314S
Maxima reverse transcriptase Thermo Fisher Scientific EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix Bio-Rad 1864033
Droplet generation oil for Evagreen Bio-Rad 1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio-Rad 1814040
DG8 Cartridges and Gaskets Bio-Rad 1864007
DG8 Cartridge holder Bio-Rad 1863051
QX200 Droplet Generator Bio-Rad 1864002
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
PX1 PCR Plate Sealer Bio-Rad 1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module Bio-Rad 1851197
QX200 Droplet Reader Bio-Rad 1864003
Quantasoft Software Bio-Rad 1864011
Silica column Umbrella Life Science 38220090
UCSC Genome Browser https://genome.ucsc.edu/
Primer 3 https://primer3.ut.ee/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
  2. Chen, L. L., Yang, L. Regulation of circRNA biogenesis. RNA Biology. 12 (4), 381-388 (2015).
  3. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  4. Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
  5. Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
  6. Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
  7. Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C. Emerging role of circular RNA-protein interactions. Non-Coding RNA. 7 (3), 48 (2021).
  8. Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
  9. Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
  10. Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
  11. Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
  12. Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
  13. Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
  14. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
  15. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  16. Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
  17. Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  18. Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
  19. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  20. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), 115 (2012).
  21. Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
  22. Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
  23. Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
  24. Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).

Tags

Biologi udgave 187 cirkulær RNA RT-PCR divergerende primere absolut kvantificering
Kvantificering af cirkulære RNA'er ved hjælp af digital dråbe-PCR
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Das, A., Das, D., Panda, A. C.… More

Das, A., Das, D., Panda, A. C. Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR. J. Vis. Exp. (187), e64464, doi:10.3791/64464 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter