Summary
يصف هذا البروتوكول الطريقة التفصيلية لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية (dd-PCR) من أجل التحديد الكمي الدقيق لمستويات الحمض النووي الريبي الدائري (circRNA) في الخلايا باستخدام بادئات متباينة.
Abstract
يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل للقطرات الرقمية (dd-PCR) أحد أكثر طرق القياس الكمي حساسية. يقسم التفاعل إلى ما يقرب من 20000 قطرة ماء في زيت ، ويحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل في القطرات الفردية. يتميز تفاعل البوليميراز المتسلسل dd-PCR بالعديد من المزايا مقارنة ب qPCR التقليدي في الوقت الفعلي ، بما في ذلك زيادة الدقة في اكتشاف الأهداف منخفضة الوفرة ، وحذف الجينات المرجعية للقياس الكمي ، والقضاء على التكرارات التقنية للعينات ، وإظهار مرونة عالية للمثبطات في العينات. في الآونة الأخيرة ، أصبح dd-PCR أحد أكثر الطرق شيوعا لتحديد كمية الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المستهدف بدقة لتحليل التعبير الجيني والتشخيص. الحمض النووي الريبي الدائري (circRNAs) هي عائلة كبيرة من جزيئات الحمض النووي الريبي المغلقة تساهميا المكتشفة مؤخرا والتي تفتقر إلى نهايات 5 'و 3'. لقد ثبت أنها تنظم التعبير الجيني من خلال العمل كإسفنج للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي الميكروي. علاوة على ذلك ، يتم إفراز circRNAs في سوائل الجسم ، ومقاومتها للإكسونوكلياز تجعلها بمثابة مؤشرات حيوية لتشخيص المرض. تهدف هذه المقالة إلى توضيح كيفية إجراء تصميم التمهيدي المتباعد ، واستخراج الحمض النووي الريبي ، وتوليف الحمض النووي المكمل ، وتحليل dd-PCR لتحديد مستويات الحمض النووي الريبي الدائري المحدد (circRNA) بدقة في الخلايا. في الختام ، نوضح التحديد الكمي الدقيق ل circRNAs باستخدام dd-PCR.
Introduction
اكتشفت التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الحمض النووي الريبي والخوارزميات الحسابية الجديدة عضوا جديدا في العائلة المتنامية من الحمض النووي الريبي غير المشفر ، يسمى الحمض النووي الريبي الدائري (circRNA)1. كما يوحي الاسم ، فإن circRNAs هي عائلة من جزيئات الحمض النووي الريبي أحادية الشريط بدون نهايات حرة. يتم تشكيلها عن طريق الربط غير المتعارف عليه من الرأس إلى الذيل يسمى الربط الخلفي ، حيث ينضم موقع مستقبل لصق المنبع تساهميا مع موقع مانح لصق المصب لتشكيل دائرة RNA مستقرة 1,2. يمكن التوسط في هذه العملية من خلال عدة عوامل ، بما في ذلك عناصر Alu المتكررة المقلوبة الموجودة في المنبع والمصب من exons الدائرية ، أو يمكن التوسط فيها بواسطة بعض عوامل الربط أو بروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RBPs)2,3. تصنف الحمض النووي الريبي الدائري المتولد حصريا من التسلسل الخارجي أو التسلسل الحلقي على أنه سيرك رنان خارجي و الحمض النووي الريبي الدائري أو الحمض النووي الريبي الدائري ، في حين أن بعض الحمض النووي الريبي الحلقي (EIcircRNAs)3,4. وظائف circRNAs متعددة الأوجه ، بما في ذلك الإسفنجة miRNA و / أو RBP ، وتنظيم النسخ ، وتنظيم الوظيفة الخلوية عن طريق الترجمة إلى الببتيدات3،5،6،7. أبرزت العديد من التقارير أهمية circRNAs في مختلف الأمراض والعمليات الفسيولوجية8. علاوة على ذلك ، فإن أنماط التعبير الخاصة بالأنسجة ومقاومة الهضم بالإكسونوكلياز تجعله علامة حيوية وظيفية لتشخيص المرض ويمكن استخدامه أيضا كهدف علاجي مناسب8. بالنظر إلى أهميتها في تنظيم الصحة والأمراض ، فإن القياس الكمي الدقيق لتعبير circRNA هو حاجة الساعة.
تم تطوير العديد من الطرق البيوكيميائية لتحديد كمية circRNAs في العينات البيولوجية9. واحدة من أكثر الطرق ملاءمة ومقبولة على نطاق واسع لقياس كمية circRNA هي النسخ العكسي متبوعا بتفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (RT-qPCR) باستخدام أزواج أولية متباينة10. ومع ذلك ، فإن غالبية circRNAs منخفضة الوفرة مقارنة ب mRNAs الخطية ، مما يجعل من الصعب تحديدها كميا11. للتغلب على هذه المشكلة ، سعينا إلى استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية (dd-PCR) لتحديد عدد circRNAs في عينة معينة بدقة. DD-PCR هي تقنية PCR متقدمة تتبع مبدأ الموائع الدقيقة. يولد قطرات مائية متعددة في الزيت ، ويحدث تفاعل البوليميراز المتسلسل في كل قطرة كتفاعل فردي12. يحدث التفاعل في قطرات فردية ويتم تحليله باستخدام قارئ قطرات ، والذي يعطي عدد القطرات الإيجابية أو السلبية للجين محل الاهتمام12. إنها التقنية الأكثر حساسية لتحديد الجين محل الاهتمام بدقة ، حتى لو كانت هناك نسخة واحدة فقط في عينة معينة. انخفاض الحساسية تجاه المثبطات ، وتحسين الدقة ، وحذف الجين المرجعي للقياس الكمي يجعله أكثر فائدة من qPCRالتقليدي 13،14،15. لقد تم استخدامه على نطاق واسع كأداة بحث وتشخيص للقياس الكمي المطلق للجين محل الاهتمام16,17. هنا ، نصف بروتوكول dd-PCR المفصل لقياس كمية circRNA في التمييز بين الأنابيب العضلية للفأر C2C12 وتكاثر الأرومات العضلية للفأر C2C12 باستخدام البادئات المتباينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الحمض النووي الريبي حساس ل RNases. لذلك ، يجب أن تكون جميع الكواشف والأدوات ومساحات العمل خالية من RNase ويتم التعامل معها بعناية.
1. تصميم التمهيدي المتباعد ل circRNA (انظر الشكل 1)
- استرجع التسلسل الناضج من بيانات التعليقات التوضيحية circRNA باستخدام BEDTools أو من متصفح جينوم UCSC عن طريق الانضمام إلى تسلسل exon / intron الموجود بين إحداثيات تقاطع اللصق الخلفي18,19.
- قم بإعداد تسلسل قالب تفاعل البوليميراز المتسلسل المكون من 200 نيوكليوتيد بطول 200 نيوكليوتيد من إجمالي طول تسلسل circRNA إلى أول 100 نيوكليوتيد من تسلسل circRNA10.
ملاحظة: إذا كان طول circRNA أقل من 200 نيوكليوتيد ، فقم بتقسيمه إلى نصفين متساويين وانضم إلى النيوكليوتيدات من النصف الأخير إلى بداية النصف الأول. - استخدم تسلسل القالب أعلاه لتصميم التمهيدي باستخدام أداة الويب Primer3 وتحديد طول منتج PCR يتراوح من 120-180 نيوكليوتيد بطول20.
- استخدم الإعدادات الافتراضية ل Primer3 للمعلمات الأخرى مثل Tm وطول التمهيدي. يتم سرد تسلسل التمهيدي ل circBnc2 في الجدول 1.
- اطلب تسلسلات التمهيدي المتباينة للتوليف من أي شركة توليف أوليجو.
2. عزل الحمض النووي الريبي
ملاحظة: عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا الماوس C2C12 باستخدام أي مجموعات متاحة تجاريا أو طريقة عزل الحمض النووي الريبي في المنزل. تم وصف طريقة عزل الحمض النووي الريبي الداخلية المستخدمة هنا سابقا21. يتم تحضير حبات السيليكا المغناطيسية في المختبر باستخدام البروتوكول22 المنشور مسبقا. يمكن أيضا شراء هذه الخرزات المغناطيسية من بائعين مختلفين.
- خذ طبقا واحدا بحجم 10 سم يحتوي على حوالي 5 × 106 خلايا أرومة عضلية C2C12 متكاثرة وأنبوب عضلي C2C12 متمايز لمدة 4 أيام لعزل الحمض النووي الريبي.
- اغسل الخلايا ب 10 مل من 1x PBS ثلاث مرات وتخلص من PBS باستخدام ماصة.
- كشط الخلايا في 1 مل من 1x PBS باستخدام مكشطة الخلية ، والطرد المركزي لهم عند 4 °C لمدة 5 دقائق عند 750 x g ، وتجاهل PBS باستخدام ماصة.
- أضف 1 مل من كاشف عزل الحمض النووي الريبي (RIR) وقم بتحليل الخلايا عن طريق ماصة قوية21.
- أضف 200 ميكرولتر (1/5 من حجم RIR) من الكلوروفورم والدوامة لمدة 15 ثانية. جهاز طرد مركزي للأنبوب عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق عند 12000 × جم.
- خذ 400 ميكرولتر من الطبقة المائية العليا ، وقم بتحميلها على عمود السيليكا ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 12000 × جم في درجة حرارة الغرفة. خذ التدفق إلى أنبوب جديد وأضف 600 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪.
- أضف 20 ميكرولتر من حبات السيليكا المغناطيسية وضع الأنبوب على خلاط حراري مضبوط على 25 درجة مئوية و 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يمكن زيادة حجم الخرزة أو تقليله اعتمادا على أرقام الخلايا الأولية المأخوذة للتحلل. يمكن شراء حبات السيليكا المغناطيسية من البائعين التجاريين. - ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة 30 ثانية أو حتى يصبح المحلول واضحا. تخلص من المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة.
- أعد تعليق حبات السيليكا المغناطيسية في 500 ميكرولتر من محلول الغسيل الذي يحتوي على 90٪ من الإيثانول. ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية. قم بتدوير الأنبوب مرتين على الحامل المغناطيسي لغسل الخرز. دع الخرزات تستقر باتجاه المغناطيس وتخلص من المخزن المؤقت باستخدام ماصة.
- كرر الخطوة 2.9 مرتين. بعد الغسيل ، قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة وضعه مرة أخرى على الحامل المغناطيسي لمدة 30 ثانية. تخلص من المخزن المؤقت المتبقي للغسيل. جفف الأنبوب بالهواء عند 50 درجة مئوية لمدة 3 دقائق على خلاط حراري ، مع إبقاء الغطاء مفتوحا.
- أضف 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز وأعد تعليق الخرز.
ملاحظة: يمكن تقليل حجم شطف الحمض النووي الريبي إلى 10 ميكرولتر لزيادة تركيز الحمض النووي الريبي. - ضع الأنابيب لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي واتركه لمدة 30 ثانية. اجمع الحمض النووي الريبي المذاب في أنبوب جديد لتقييم الكمية والجودة باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
ملاحظة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. للحصول على النتيجة المثلى ، يوصى بالمضي قدما في خطوة تخليق cDNA في اليوم التالي.
3. تخليق الحمض النووي المكمل
- قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي وأخذ 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتخليق cDNA.
- امزج 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي مع 1 ميكرولتر من مزيج dNTP (10 مللي متر لكل من dATP و dTTP و dGTP و dCTP) ، و 4 ميكرولتر من محلول النسخ العكسي 5x (RT) ، و 2 ميكرولتر من 10x RT التمهيدي العشوائي ، و 0.25 ميكرولتر من إنزيم النسخ العكسي (200 وحدة / ميكرولتر) ، و 0.5 ميكرولتر من مثبط RNase (40 وحدة / ميكرولتر) ، وقم بتكوين حجم يصل إلى 20 ميكرولتر باستخدام ماء خال من النيوكلياز.
ملاحظة: يمكن تغيير حجم إنزيم النسخ العكسي اعتمادا على تركيز الحمض النووي الريبي الأولي المأخوذ لتخليق cDNA. - اضغط على الأنبوب لخلط التفاعل والدوران لفترة وجيزة. ضع الأنبوب عند 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق متبوعا ب 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- لتعطيل الإنزيم ، ضع الأنبوب عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- قم بتبريد الأنبوب بالثلج لمدة دقيقتين وأضف 480 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز إلى الأنبوب لجعل تركيز cDNA إلى 2 نانوغرام / ميكرولتر.
ملاحظة: يمكن تخزين cDNA عند -20 درجة مئوية أو استخدامه على الفور لتحليل dd-PCR.
4. سير عمل PCR بالقطرات الرقمية (dd-PCR)
ملاحظة: يتضمن سير عمل dd-PCR خطوات متعددة ، بدءا من تحضير العينة ، متبوعا بتوليد القطيرات ، وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وعد القطيرات ، وتحليل البيانات. كل خطوة ضرورية لتوليد بيانات دقيقة لأن dd-PCR يتضمن القياس الكمي المطلق للمنتجات ولا يحتاج إلى أي منحنى قياسي. ومن ثم ، تم وصف كل خطوة من الخطوات المختلفة ل dd-PCR أدناه.
- تحضير تفاعل dd-PCR.
- قم بإعداد تفاعل PCR البالغ 22 ميكرولتر في أنابيب أو شرائط PCR سعة 0.2 مل جنبا إلى جنب مع أنبوب تحكم سلبي وأنابيب NTC (تحكم غير قالب).
ملاحظة: يجب أن يكون لكل زوج تمهيدي مختلف للكشف عن circRNAs المختلفة تفاعل NTC جنبا إلى جنب مع عينات الاختبار. - أضف 11 ميكرولتر من المزيج الرئيسي dd-PCR (على سبيل المثال ، EvaGreen Supermix) و 11 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لإعداد أنبوب تفاعل التحكم السالب.
ملاحظة: قم بإذابة المزيج الرئيسي dd-PCR في درجة حرارة الغرفة متبوعا بدوامة قصيرة لعمل خليط متجانس. استخدم نفس الماء الخالي من النيوكلياز لإعداد أنبوب تفاعل التحكم السلبي وأنابيب NTC التي تم استخدامها لتخفيف cDNA. - أضف 11 ميكرولتر من مزيج dd-PCR الرئيسي ، و 5.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي الأمامي والخلفي الخاص بالسيرنا بتركيز 1 ميكرومتر ، و 5.5 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز لإعداد أنابيب تفاعل NTC.
ملاحظة: قم بتخفيف البادئات المتباينة الدائرية الأمامية والعكسية الخاصة بالحمض النووي الريبي من مخزون 100 ميكرومتر واخلطها لتحضير تركيز عمل 1 ميكرومتر من مزيج التمهيدي circRNA الأمامي والعكسي ؛ وبالتالي ، فإن تركيز التمهيدي النهائي هو 250 نانومتر في تفاعل 22 ميكرولتر. - أضف 11 ميكرولتر من مزيج dd-PCR الرئيسي ، و 5.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي الأمامي والخلفي الخاص ب circRNA بتركيز 1 ميكرومتر ، و 5.5 ميكرولتر من cDNA (2 نانوغرام / ميكرولتر) لإعداد أنابيب تفاعل الاختبار.
- دوامة تليها تماما عن طريق الطرد المركزي لفترة وجيزة جميع أنابيب التفاعل للحصول على خليط تفاعل متجانس في الجزء السفلي من الأنابيب.
- قم بإعداد تفاعل PCR البالغ 22 ميكرولتر في أنابيب أو شرائط PCR سعة 0.2 مل جنبا إلى جنب مع أنبوب تحكم سلبي وأنابيب NTC (تحكم غير قالب).
- توليد القطرات.
- انقل 20 ميكرولتر من خليط PCR من أنابيب PCR سعة 0.2 مل إلى آبار عينة خرطوشة مولد القطيرات.
- أضف 70 ميكرولتر من زيت توليد القطيرات إلى آبار النفط لخرطوشة مولد القطيرات بعناية باستخدام ماصة متعددة القنوات.
ملاحظة: احتضان زيت توليد القطيرات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. - قم بتغطية خرطوشة مولد القطيرات بالحشية المطاطية وضعها في آلة مولد القطيرات للحصول على مزيج قطرات الزيت ، المتولد في آبار القطيرات في الخرطوشة.
- تضخيم PCR.
- انقل 40 ميكرولتر من مزيج قطرات زيت العينة من آبار القطيرات لخرطوشة مولد القطيرات إلى لوحة PCR ذات 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات.
ملاحظة: انقل مزيج عينة قطرات الزيت بعناية أثناء عمل زاوية إلى الآبار من خلال أطراف الماصة متعددة القنوات لتجنب كسر القطرات أثناء نقلها إلى لوحة البئر dd-PCR 96. - أغلق لوحة PCR التي تحتوي على 96 بئرا باستخدام مانع تسرب رقائق الألومنيوم ، وضعها في كتلة آلة ختم الألواح المسخنة مسبقا عند 80 درجة مئوية ، وانقر فوق الختم لإغلاق لوحة PCR.
- الآن ، ضع اللوحة في دورة الدورة الحرارية dd-PCR واضبط البرنامج كما هو مذكور في الجدول 2 مع ضبط درجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية ومعدل منحدر 2 درجة مئوية / ثانية.
- انقل 40 ميكرولتر من مزيج قطرات زيت العينة من آبار القطيرات لخرطوشة مولد القطيرات إلى لوحة PCR ذات 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات.
- عد القطرات.
- بمجرد انتهاء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ضع اللوحة على آلة عداد قطرات dd-PCR مع حامل اللوحة في الموضع الصحيح لحساب القطرات.
- افتح برنامج تحليل القطرات وقم بإعداد التشغيل عن طريق إعطاء مدخلات لمعلومات العينة.
- انقر فوق خيار الإعداد. ثم ، انقر فوق خيار القالب لفتح قالب جديد.
- حدد كل بئر عن طريق وضع تفاصيل التجربة ، مثل اسم العينة (cDNA المستخدم أو التحكم السلبي أو NTC) ، واسم الهدف (اسم التمهيدي circRNA) والنوع (غير معروف) ، ونوع التجربة مثل ABS (القياس الكمي المطلق) و Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) المستخدمة ، إلخ.
- أخيرا ، احفظ القالب وابدأ التشغيل بالنقر فوق خيار التشغيل وحدد العد حسب الصف أو العمود. اسمح للآلة بإكمال عد القطيرات ، والذي يستغرق حوالي 1 دقيقة / بئر.
- انقر فوق الزر "تحليل " لتحليل البيانات بعد الانتهاء من قراءة القطير.
- انقر فوق الزر 1D Amplitude لرؤية القطرات الإيجابية والسالبة
- لفصل القطرات الإيجابية عن القطرات السالبة ، ضع خط عتبة مشترك لجميع العينات التي لها نفس الهدف.
ملاحظة: يجب أن يكون إجمالي القطرات في كل عينة أعلى من 10000 للنظر في القياس الكمي المطلق. يجب ألا يظهر المجلس الوطني الانتقالي عددا إيجابيا من القطرات. يشير وجود قطرات إيجابية في NTC إلى تلوث الكواشف أو تضخيم ثنائيات التمهيدي. من الصعب معرفة ما إذا كانت القطرات الإيجابية لها ثنائيات أولية أو منتجات غير محددة في NTC. ينصح بفحص البادئات وتجنب أي تلوث للكواشف كممارسة عامة لأي تفاعل البوليميراز المتسلسل بما في ذلك DD-PCR. - انقر فوق الزر تصدير لتصدير بيانات circRNA كملف .csv. تظهر البيانات المصدرة عدد circRNAs الموجودة في كل عينة.
- احسب يدويا عدد الحمض النووي الريبوزي الحمضي (circRNA) في كل عينة لكل نانوجرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA) من خلال النظر في إجمالي كمية الحمض النووي الريبوزي المستخدمة في كل تفاعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن اشتقاق العدد المطلق ل circRNAs في كل عينة من بيانات dd-PCR المصدرة. اقترح تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي التعبير التفاضلي ل circBnc2 في الأنابيب العضلية المتمايزة C2C12 (البيانات غير معروضة). هنا ، أردنا التحقق من عدد النسخ المطلق ل circBnc2 في تكاثر الأرومات العضلية C2C12 والأنابيب العضلية. نظرا لأن التعبير عن circBnc2 تتم مقارنته في حالتين ، فمن المهم حقا معالجة جميع العينات لعزل الحمض النووي الريبي ، وتوليف cDNA ، و PCR في وقت واحد باستخدام نفس الكواشف والإجراء. لإجراء القياس الكمي المطلق ل circRNAs باستخدام تفاعل dd-PCR ، يجب استخدام كمية متساوية من إجمالي الحمض النووي الريبي الأولي لتخليق cDNA لحساب العدد الدقيق لجزيئات الحمض النووي الريبي المستهدفة لكل نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال ، تم استخدام 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي لتخليق cDNA وتخفيفه إلى 500 ميكرولتر باستخدام الماء الخالي من النيوكلياز للحصول على تركيز نهائي قدره 2 نانوغرام / ميكرولتر قبل إجراء اختبار dd-PCR (الشكل 1).
كما هو موضح في الشكل 2 أ ، تم استخدام cDNA من 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي من خلايا الأرومات العضلية المتكاثرة C2C12 (MB) والأنبوب العضلي المتمايز لمدة 4 أيام (MT) للتحقق من الاختلاف في التعبير عن circBnc2 في هاتين الحالتين. تمت معالجة العينات لتوليد القطرة وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل ، متبوعا بحساب القطرات الإيجابية والسالبة باستخدام برنامج تحليل القطيرات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (الشكل 2 ب). نظرا لأن البادئات يمكنها تضخيم المنتجات غير المحددة وتشكيل دايمرات أولية ، يجب استخدام NTC لجميع مجموعات التمهيدي. من الناحية المثالية ، يجب ألا يكون لدى NTC عدد قطرات إيجابي.
كما هو موضح في الشكل 3 أ ، أظهرت جميع العينات باستثناء MT1 أكثر من 12000 قطرة. نظرا لأن إجمالي عدد القطيرات كان منخفضا في MT1 ، لم يتم النظر في هذه العينة لتحليل البيانات النهائي. قد يكون انخفاض إجمالي عدد القطيرات ناتجا عن خطأ في توليد القطيرات أو تمزق القطرات أثناء النقل إلى لوحة تفاعل البوليميراز المتسلسل أو مشاكل في سحب العينات. ومن المثير للاهتمام ، كان هناك اختلاف واضح في نمط التعبير عن circBnc2 في حالة الأنبوب العضلي المتمايز لمدة 4 أيام مقارنة بخلايا الأرومة العضلية. أشار تحليل وفرة circBnc2 من حيث عدد النسخ إلى أن النسخ المتماثلة الثلاثة للخلايا العضلية C2C12 تحتوي على 76.8 و 67 و 46 نسخة / نانوغرام من الحمض النووي الريبي ، بينما تحتوي عينتا الأنبوب العضلي على 558 و 610 نسخة / نانوغرام من الحمض النووي الريبي (الشكل 3 ب). نظرا لأن عينة الأنبوب العضلي الواحدة لم تعمل بشكل جيد ، فمن الأفضل أن يكون لديك عدد أكبر من التكرارات البيولوجية لدراسة الاختلافات الإحصائية في أنماط تعبيرها في الحالتين.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لتصميم التمهيدي المتباعد لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ل circBnc2. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: سير عمل dd-PCR لتحديد كمية circRNA. يتضمن سير عمل dd-PCR الكامل العديد من الخطوات: (أ) عزل الحمض النووي الريبي وإعداد cDNA من الخلايا العضلية C2C12 وخلايا الأنبوب العضلي المتمايزة لمدة 4 أيام ، وإعداد خليط PCR ، (B) توليد القطيرات ، وتضخيم PCR ، وعد القطيرات ، وتحليل البيانات. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحليل البيانات باستخدام برنامج QuantaSoft. (أ) يتضمن تحليل البيانات تحديد القطرات الإيجابية والسالبة باستخدام برنامج القياس الكمي. ب: حساب عدد الحمض النووي الريبوزي (circRNAs/نانوغرام) للحمض النووي الريبوزي (RNA) في الأرومات العضلية C2C12 (MB) والأنابيب العضلية (MT). تمثل البيانات الموجودة في الرسم البياني الشريطي للوحة B متوسط STDEV ± اثنين إلى ثلاثة مكررات بيولوجية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| اسم التمهيدي | تسلسل |
| circBnc2 التمهيدي إلى الأمام | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 التمهيدي العكسي | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
الجدول 1: تسلسلات التمهيدي المتباينة المستخدمة لتضخيم circBnc2.
| درج | درجة الحرارة (°C) | الوقت | عدد الدورات | معدل المنحدر |
| تنشيط الإنزيم | 95 | 10 دقائق | 1 | ~ 2 °C / ثانية |
| تمسخ | 94 | 30 ثانية | 40 | ~ 2 °C / ثانية |
| التلدين / التمديد | 60 | 1 دقيقة | 40 | ~ 2 °C / ثانية |
| استقرار الإشارة | 4 | 5 دقائق | 1 | ~ 2 °C / ثانية |
| استقرار الإشارة | 90 | 5 دقائق | 1 | ~ 2 °C / ثانية |
الجدول 2: شروط تضخيم PCR ل circBnc2 على دورة حرارية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نمت أبحاث CircRNA في العقد الماضي مع اكتشاف تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية. نتيجة لذلك ، تم اعتباره جزيئا محتملا لعلاجات الحمض النووي الريبي المستقبلية. بالإضافة إلى ذلك ، من المعروف أنه يعمل كمؤشر حيوي في العديد من الأمراض ، بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية 4,8. ومع ذلك ، فإن تحديد circRNA أمر صعب بسبب وفرته المنخفضة وله تسلسل تقاطع ارتدادي محدد واحد فقط يميزه عن mRNAالأبوي 9. كان RT-PCR باستخدام البادئات المتباينة هو التقنية القياسية الذهبية للتحقق من صحة circRNA منذ اكتشافه 9,10. على الرغم من تطوير العديد من الطرق الجزيئية لقياس كمية circRNA ، إلا أنه من الصعب قياس تعبيرات circRNA بدقة بسبب وفرتها المنخفضة. نظرا لأن dd-PCR يمكنه تضخيم جزيئات RNA / DNA منخفضة الوفرة جدا من عينة معينة14 ، فهي واحدة من أفضل الطرق للقياس الكمي الدقيق ل circRNAs.
DD-PCR هو اختبار نقطة النهاية الذي يعطي القياس الكمي المطلق للجينالمستهدف 15. على عكس qPCR التقليدي ، فهو يستغرق وقتا طويلا ومملا ومكلفا ، مما يجعله أقل قبولا مقارنة ب PCR في الوقت الفعلي حتى بعد عقد من اكتشافه15. ومع ذلك ، فإنه يوفر العديد من المزايا على qPCR المستخدم على نطاق واسع لدراسة تغيرات التعبير الجيني13,23. أولا ، يمكن أن يوفر dd-PCR العدد الدقيق لنسخ الحمض النووي الموجودة في عينة معينة. ثانيا ، يؤدي التغيير في التعبير الجيني المنزلي إلى تغيير حساب عدد الجينات المستهدفة في عينة معينة. يمكن تجنب ذلك في dd-PCR ، والذي لا يعتمد على المنحنيات القياسية أو جينات التدبير المنزلي لتحديد الحمض النوويالمستهدف 15. ثالثا ، نظرا لأن تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل يحدث في مقصورات صغيرة ، فإنه يوفر مرونة أعلى تجاه وجود مثبطات غير محددة أو الحمض النووي الخلفي ، مما يجعله طريقة أكثر دقة لتحديد الجينات المستهدفة23,24.
استخدمنا تقنية dd-PCR لتحديد تعبير circBnc2 في تكاثر الخلايا العضلية C2C12 والأنابيب العضلية المتباينة باستخدام البادئات المتباينة. ومع ذلك ، يجب فحص تضخيم circRNA المحدد مع أزواج أولية متباينة بدون دايمرات أولية في تفاعل البوليميراز المتسلسل العادي قبل إجراء dd-PCR. أيضا ، يجب اتباع بروتوكول dd-PCR بعناية من أجل القياس الدقيق لتعبير circRNA. يمكن تكييف سير العمل المقدم هنا بسهولة لتحديد كمية أي circRNA ذات أهمية. أبرزت الدراسات الحديثة القيم التشخيصية ل circRNAs الموجودة في الأنسجة وسوائل الجسم للكشف عن الأمراض8. معا ، ستكون هذه الطريقة أداة أساسية في صناعة البحث والتشخيص وستسرع أبحاث circRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل بتمويل داخلي من معهد علوم الحياة ، ومنحة أبحاث DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) ، وزمالة Wellcome Trust / DBT India Alliance [IA / I / 18/2/504017] الممنوحة لأماريش سي باندا. نشكر أعضاء المختبر الآخرين على تدقيق المقال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L.
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C.
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
