Summary
Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methode van digitale druppel PCR (dd-PCR) voor nauwkeurige kwantificering van circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen met behulp van divergente primers.
Abstract
Digitale druppelpolymerasekettingreactie (dd-PCR) is een van de meest gevoelige kwantificeringsmethoden; het fractioneert de reactie in bijna 20.000 water-in-oliedruppels en de PCR komt voor in de individuele druppels. De dd-PCR heeft verschillende voordelen ten opzichte van conventionele real-time qPCR, waaronder verhoogde nauwkeurigheid bij het detecteren van doelen met een lage abundantie, het weglaten van referentiegenen voor kwantificering, het elimineren van technische replicaties voor monsters en het tonen van een hoge veerkracht tegen remmers in de monsters. Onlangs is dd-PCR een van de meest populaire methoden geworden voor het nauwkeurig kwantificeren van doel-DNA of RNA voor genexpressieanalyse en diagnostiek. Circulaire RNA's (circRNA's) zijn een grote familie van recent ontdekte covalent gesloten RNA-moleculen zonder 5' en 3' uiteinden. Het is aangetoond dat ze genexpressie reguleren door te fungeren als sponzen voor RNA-bindende eiwitten en microRNA's. Bovendien worden circRNA's uitgescheiden in lichaamsvloeistoffen en hun weerstand tegen exonucleasen zorgt ervoor dat ze dienen als biomarkers voor ziektediagnose. Dit artikel is bedoeld om te laten zien hoe divergent primerontwerp, RNA-extractie, cDNA-synthese en dd-PCR-analyse kunnen worden uitgevoerd om specifieke circulaire RNA (circRNA) niveaus in cellen nauwkeurig te kwantificeren. Tot slot demonstreren we de precieze kwantificering van circRNA's met behulp van dd-PCR.
Introduction
Recente ontwikkelingen in RNA-sequencingtechnologieën en nieuwe computationele algoritmen hebben een nieuw lid ontdekt van de groeiende familie van niet-coderende RNA's, genaamd circulair RNA (circRNA)1. Zoals de naam al doet vermoeden, zijn circRNA's een familie van enkelstrengs RNA-moleculen zonder vrije uiteinden. Ze worden gevormd door niet-canonieke head-to-tail splicing genaamd back-splicing, waarbij de upstream splice acceptor site covalent aansluit op de downstream splice donor site om een stabiele RNA cirkel 1,2 te vormen. Dit proces kan worden gemedieerd door verschillende factoren, waaronder omgekeerde Alu-repetitieve elementen die aanwezig zijn in de upstream en downstream van gecirculeerde exonen, of kan worden gemedieerd door sommige splicingfactoren of RNA-bindende eiwitten (RBPs)2,3. Circulaire RNA's die uitsluitend uit de exonische of intronische sequentie worden gegenereerd, worden geclassificeerd als exonische circRNA en circulaire intronische RNA's of ci-RNA's, terwijl sommige exonische circRNA's het intron behouden en exon-intron circRNA's (EIcircRNA's) worden genoemd(EIcircRNA's)3,4. De functies van circRNA's zijn veelzijdig, waaronder het sponzen van miRNA en/of RBP, het reguleren van transcriptie en het reguleren van de cellulaire functie door te vertalen in peptiden 3,5,6,7. Verschillende rapporten hebben het belang van circRNA's in verschillende ziekten en fysiologische processen benadrukt8. Bovendien maken weefselspecifieke expressiepatronen en resistentie tegen exonucleasevertering het een functionele biomarker voor ziektediagnose en kan het ook worden gebruikt als een geschikt therapeutisch doelwit8. Gezien het belang ervan bij het reguleren van gezondheid en ziekten, is de nauwkeurige kwantificering van circRNA-expressie de behoefte van het uur.
Er zijn verschillende biochemische methoden ontwikkeld om cirkelRNA's in biologische monsters te kwantificeren9. Een van de handigste en meest geaccepteerde methoden voor circRNA-kwantificering is reverse transcriptie gevolgd door kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met behulp van divergente primerparen10. De meerderheid van de circRNA's is echter in lage abundantie in vergelijking met lineaire mRNA's, waardoor het een uitdaging is om ze te kwantificeren11. Om dit probleem op te lossen, hebben we geprobeerd om digitale druppel-PCR (dd-PCR) te gebruiken om het aantal cirkel-RNA's in een bepaald monster nauwkeurig te kwantificeren. De dd-PCR is een geavanceerde PCR-technologie die het microfluïdica-principe volgt; het genereert meerdere waterige druppels in olie en de PCR komt in elke druppel voor als een individuele reactie12. De reactie treedt op in individuele druppels en wordt geanalyseerd met behulp van een druppellezer, die het aantal positieve of negatieve druppels voor het gen van belang geeft12. Het is de meest gevoelige techniek om een gen van belang nauwkeurig te kwantificeren, zelfs als er slechts één kopie in een bepaald monster is. Verminderde gevoeligheid voor remmers, betere precisie en het weglaten van het referentiegen voor kwantificering maken het voordeliger dan conventionele qPCR 13,14,15. Het is op grote schaal gebruikt als een onderzoeks- en diagnostisch hulpmiddel voor de absolute kwantificering van een gen van belang16,17. Hier beschrijven we het gedetailleerde dd-PCR-protocol voor circRNA-kwantificering bij het differentiëren van muis C2C12-myotubes en prolifererende muis C2C12-myoblasten met behulp van divergente primers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RNA is gevoelig voor RN's; daarom moeten alle reagentia, instrumenten en werkruimten RNase-vrij zijn en met zorg worden behandeld.
1. Divergent primerontwerp voor circRNA (zie figuur 1)
- Haal de volwassen sequentie op uit circRNA-annotatiegegevens met BEDTools of uit de UCSC-genoombrowser door de exon/intron-sequentie samen te voegen die aanwezig is tussen de backsplice-junctiecoördinaten18,19.
- Bereid een PCR-sjabloonsequentie voor van 200 nucleotiden in lengte door de laatste 100 nucleotiden van de totale circRNA-sequentielengte samen te voegen met de eerste 100 nucleotiden van de circRNA-sequentie10.
OPMERKING: Als de circRNA-lengte minder dan 200 nucleotiden is, verdeel het dan in twee gelijke helften en voeg de nucleotiden van de laatste helft tot het begin van de eerste helft samen. - Gebruik de bovenstaande sjabloonreeks voor primerontwerp met behulp van de Primer3-webtool en stel een PCR-productlengte in, variërend van 120-180 nucleotiden in lengte20.
- Gebruik de standaardinstellingen van Primer3 voor andere parameters zoals Tm en primerlengte. De primersequenties voor circBnc2 zijn opgenomen in tabel 1.
- Bestel de divergente primersequenties voor synthese bij elk oligosynthesebedrijf.
2. RNA-isolatie
OPMERKING: Isoleer totaal RNA uit de C2C12-cellen van de muis met behulp van in de handel verkrijgbare kits of interne RNA-isolatiemethode. De interne RNA-isolatiemethode die hier wordt gebruikt, is eerder beschreven21. De magnetische silicakorrels worden in het lab bereid met behulp van het eerder gepubliceerde protocol22. Deze magnetische kralen kunnen ook worden verkregen bij verschillende leveranciers.
- Neem een schaal van 10 cm met ongeveer 5 x 106 prolifererende C2C12 myoblastcellen en één 4-daagse gedifferentieerde C2C12 myotube voor RNA-isolatie.
- Was de cellen drie keer met 10 ml 1x PBS en gooi de PBS weg met een pipet.
- Schraap de cellen in 1 ml 1x PBS met behulp van een celschraper, centrifugeer ze bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 750 x g en gooi de PBS weg met een pipet.
- Voeg 1 ml RNA-isolatiereagens (RIR) toe en laat de cellen lyseren door krachtig te pipetteren21.
- Voeg 200 μL (1/5 van het volume RIR) chloroform en vortex toe gedurende 15 s. Centrifugeer de buis bij 4 °C gedurende 10 minuten bij 12.000 x g.
- Neem 400 μL van de bovenste waterige laag, laad deze op een silicakolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 12.000 x g bij kamertemperatuur. Neem de doorstroom naar een nieuwe buis en voeg 600 μL 100% ethanol toe.
- Voeg 20 μL magnetische silicaparels toe en plaats de buis op een thermomixer die gedurende 5 minuten is ingesteld op 25 °C en 1.200 tpm.
OPMERKING: Het kraalvolume kan worden verhoogd of verlaagd, afhankelijk van de initiële celnummers die voor lysis worden genomen. Magnetische silica kralen kunnen worden verkregen van commerciële leveranciers. - Plaats de buis op een magnetische standaard gedurende 30 s of totdat de oplossing helder wordt. Gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet.
- Resuspendeer de magnetische silicakorrels in een wasbuffer van 500 μL met 90% ethanol. Plaats de buis gedurende 30 s op de magnetische standaard. Draai de buis twee keer op de magnetische standaard om de kralen te wassen. Laat de kralen naar de magneet zakken en gooi de buffer weg met een pipet.
- Herhaal stap 2.9 tweemaal. Draai na het wassen de buis kort rond en plaats deze gedurende 30 s terug op de magnetische standaard. Gooi de resterende wasbuffer weg. Droog de buis aan de lucht bij 50 °C gedurende 3 minuten op een thermomixer en houd het deksel open.
- Voeg 20 μL nucleasevrij water toe en resuspendeer de kralen.
OPMERKING: Het RNA-elutievolume kan worden verlaagd tot 10 μL om de RNA-concentratie op te schalen. - Plaats de buizen gedurende 2-3 minuten op kamertemperatuur. Plaats de buis terug op de magnetische standaard en laat hem 30 s zitten. Verzamel het opgeloste RNA in een nieuwe buis voor kwantiteits- en kwaliteitsbeoordeling met behulp van een spectrofotometer.
OPMERKING: RNA kan worden bewaard bij −20 °C of −80 °C voor langdurige opslag. Om een optimaal resultaat te krijgen, wordt aanbevolen om de volgende dag door te gaan met de cDNA-synthesestap.
3. cDNA-synthese
- Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer en neem 1 μg RNA voor cDNA-synthese.
- Meng 1 μg totaal RNA met 1 μL dNTP-mix (10 mM elk van dATP, dTTP, dGTP en dCTP), 4 μL 5x reverse transcriptase (RT) buffer, 2 μL 10x RT willekeurige primer, 0,25 μL reverse transcriptase-enzym (200 U/μL) en 0,5 μL RNase-remmer (40 U/μL) en vul het volume aan tot 20 μL met nucleasevrij water.
OPMERKING: Het reverse transcriptase-enzymvolume kan worden gewijzigd afhankelijk van de initiële RNA-concentratie die wordt genomen voor cDNA-synthese. - Tik op de buis om de reactie te mengen en draai kort. Plaats de buis gedurende 10 minuten op 25 °C, gevolgd door 1 uur op 50 °C.
- Om het enzym te inactiveren, plaatst u de buis gedurende 5 minuten op 85 °C.
- Koel de buis gedurende 2 minuten af en voeg 480 μL nucleasevrij water toe aan de buis om de cDNA-concentratie op 2 ng / μL te brengen.
OPMERKING: cDNA kan worden bewaard bij -20 °C of onmiddellijk worden gebruikt voor dd-PCR-analyse.
4. Digitale druppel PCR (dd-PCR) workflow
OPMERKING: De workflow van dd-PCR omvat meerdere stappen, te beginnen met de monstervoorbereiding, gevolgd door druppelgeneratie, PCR-versterking, druppeltellingen en gegevensanalyse. Elke stap is cruciaal voor nauwkeurige gegevensgeneratie, omdat dd-PCR de absolute kwantificering van producten omvat en geen standaardcurve nodig heeft. Daarom is elk van de verschillende stappen van dd-PCR hieronder beschreven.
- Voorbereiding van de dd-PCR-reactie.
- Stel de PCR-reactie van 22 μL in 0,2 ml PCR-buizen of -strips in, samen met een negatieve controlebuis en NTC-buizen (niet-sjabloonbesturing).
OPMERKING: Elk verschillend divergent primerpaar voor de detectie van verschillende cirkel-RNA's moet een NTC-reactie hebben samen met testmonsters. - Voeg 11 μL dd-PCR master-mix (bijv. EvaGreen Supermix) en 11 μL nucleasevrij water toe om de negatieve controlebuis in te stellen.
OPMERKING: Ontdooi de dd-PCR master-mix bij kamertemperatuur gevolgd door een korte vortex om een homogeen mengsel te maken. Gebruik hetzelfde nucleasevrije water om de negatieve controlereactiebuis en NTC-buizen in te stellen die werden gebruikt voor het verdunnen van het cDNA. - Voeg 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-specifieke voor- en achterwaartse primermix van 1 μM-concentratie en 5,5 μL nucleasevrij water toe om de NTC-reactiebuizen op te zetten.
OPMERKING: Verdun de voorwaartse en omgekeerde cirkelvormige RNA-specifieke divergente primers van 100 μM-voorraad en meng om een werkconcentratie van 1 μM van voorwaartse en omgekeerde circRNA-primermix te bereiden; de uiteindelijke primerconcentratie is dus 250 nM in de reactie van 22 μL. - Voeg 11 μL dd-PCR master-mix, 5,5 μL circRNA-specifieke voorwaartse en omgekeerde primermix van 1 μM-concentratie en 5,5 μL cDNA (2 ng/μL) toe om de reageerbuizen in te stellen.
- Vortex grondig gevolgd door het kort centrifugeren van alle reactiebuizen om een homogeen reactiemengsel aan de onderkant van de buizen te krijgen.
- Stel de PCR-reactie van 22 μL in 0,2 ml PCR-buizen of -strips in, samen met een negatieve controlebuis en NTC-buizen (niet-sjabloonbesturing).
- Druppelgeneratie.
- Breng de 20 μL PCR-mengsel van 0,2 ml PCR-buizen over naar de monsterputten van de druppelgeneratorcartridge.
- Voeg voorzichtig 70 μL druppelgeneratieolie toe aan de oliebronnen van de druppelgeneratorcartridge met behulp van een meerkanaals pipet.
OPMERKING: Incubeer de druppelgeneratieolie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor gebruik. - Bedek de druppelgeneratorcartridge met de rubberen pakking en plaats deze in de druppelgeneratormachine om het monster-oliedruppelmengsel te krijgen, gegenereerd in de druppelputten van de cartridge.
- PCR-versterking.
- Breng 40 μL van het monster-olieduppletmengsel over van de druppelputten van de druppelgeneratorcartridge naar een 96-well PCR-plaat met behulp van een meerkanaals pipet.
OPMERKING: Breng het monster-oliedruppelmengsel voorzichtig over terwijl u een hoek maakt met de putten door de uiteinden van de meerkanaals pipet om te voorkomen dat de druppels breken terwijl u ze overbrengt naar de dd-PCR 96-putplaat. - Sluit de 96-well PCR-plaat af met de aluminiumfoliesealer, plaats deze in het machineblok voorverwarmd op 80 °C en klik op seal voor het afdichten van de PCR-plaat.
- Plaats nu de plaat in de dd-PCR thermische cycler en stel het programma in zoals vermeld in tabel 2 met de dekseltemperatuur ingesteld op 105 °C en een hellingsnelheid van 2 °C/s.
- Breng 40 μL van het monster-olieduppletmengsel over van de druppelputten van de druppelgeneratorcartridge naar een 96-well PCR-plaat met behulp van een meerkanaals pipet.
- Druppels tellen.
- Zodra PCR voorbij is, plaatst u de plaat op de dd-PCR druppeltellermachine met de plaathouder in de juiste positie voor het tellen van de druppels.
- Open de druppelanalysesoftware en stel de run in door invoer te geven voor de voorbeeldinformatie.
- Klik op de installatieoptie. Klik vervolgens op de sjabloonoptie om een nieuwe sjabloon te openen.
- Definieer elke put door de details van het experiment, zoals monsternaam (cDNA gebruikt of negatieve controle of NTC), doelnaam (circRNA-primernaam) en type (onbekend) en experimenttype als ABS (absolute kwantificering) en Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) te gebruiken, enz.
- Sla ten slotte de sjabloon op en start de run door op de run-optie te klikken en telling per rij of kolom te selecteren. Laat de machine de druppeltelling voltooien, wat ongeveer 1 minuut / put duurt.
- Klik op de knop Analyseren om de gegevens te analyseren na het voltooien van de druppellezing.
- Klik op de knop 1D Amplitude om de positieve en negatieve druppels te zien
- Om de positieve druppels van de negatieve druppels te scheiden, plaatst u een gemeenschappelijke drempellijn voor alle monsters met hetzelfde doel.
OPMERKING: De totale druppels in elk monster moeten hoger zijn dan 10.000 om in aanmerking te komen voor absolute kwantificering. De NTC mag geen positieve druppeltellingen vertonen. De aanwezigheid van positieve druppels in de NTC duidt op besmetting van de reagentia of versterking van de primerdimeer. Het is moeilijk om erachter te komen of de positieve druppels primer dimeren of niet-specifieke producten in NTC hebben. Het wordt aanbevolen om de primers te controleren en verontreiniging van de reagentia te vermijden als algemene praktijk voor elke PCR, inclusief dd-PCR. - Klik op de knop Exporteren om de gegevens van het circRNA-telt te exporteren als een .csv bestand. De geëxporteerde gegevens tonen het aantal cirkel-RNA's dat in elk monster aanwezig is.
- Bereken handmatig het aantal circRNA's in elk monster per nanogram RNA door rekening te houden met de totale hoeveelheid cDNA die in elke reactie wordt gebruikt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het absolute aantal cirkel-RNA's in elk monster kan worden afgeleid uit de geëxporteerde dd-PCR-gegevens. Real-time kwantitatieve PCR-analyse suggereerde differentiële expressie van circBnc2 in de gedifferentieerde C2C12-myotubes (gegevens niet getoond). Hier wilden we het absolute kopienummer van circBnc2 controleren in prolifererende C2C12-myoblasten en myotubes. Omdat de expressie van circBnc2 in twee omstandigheden wordt vergeleken, is het erg belangrijk om alle monsters voor RNA-isolatie, cDNA-synthese en PCR tegelijkertijd te verwerken met dezelfde reagentia en procedure. Om de absolute kwantificering van circRNA's uit te voeren met behulp van de dd-PCR-reactie, moet een gelijke hoeveelheid initieel totaal RNA worden gebruikt voor cDNA-synthese om het exacte aantal doel-RNA-moleculen per nanogram totaal RNA te berekenen. Bijvoorbeeld, 1 μg totaal RNA werd gebruikt voor cDNA-synthese en verdund tot 500 μL met behulp van nucleasevrij water om een uiteindelijke concentratie van 2 ng / μL te krijgen voordat de dd-PCR-test werd uitgevoerd (figuur 1).
Zoals te zien is in figuur 2A, werd cDNA van 10 ng RNA uit prolifererende C2C12 myoblastencellen (MB) en een 4-daagse gedifferentieerde myotube (MT) gebruikt om het verschil in expressie van circBnc2 in deze twee omstandigheden te controleren. De monsters werden verwerkt om de druppel te genereren en PCR uit te voeren, gevolgd door het tellen van de positieve en negatieve druppels met behulp van de druppelanalysesoftware volgens de instructies van de fabrikant (figuur 2B). Omdat primers niet-specifieke producten kunnen versterken en primerfileren kunnen vormen, moet NTC voor alle primersets worden gebruikt. Idealiter zou NTC geen positieve druppeltellingen moeten hebben.
Zoals te zien is in figuur 3A, vertoonden alle monsters behalve MT1 meer dan 12.000 druppeltellingen. Aangezien het totale aantal druppels laag was in MT1, werd dit monster niet in aanmerking genomen voor de uiteindelijke gegevensanalyse. Het lage totale aantal druppels kan te wijten zijn aan een fout in het genereren van druppels, het scheuren van de druppels tijdens de overdracht naar de PCR-plaat of pipetteerproblemen. Interessant is dat er een duidelijk verschil was in het expressiepatroon van circBnc2 in de 4-daagse gedifferentieerde myotube-conditie in vergelijking met de myoblastcellen. De analyse van circBnc2-abundantie in termen van kopienummer gaf aan dat de drie replicaties van C2C12-myoblasten 76,8, 67 en 46 kopieën / ng RNA hadden, terwijl de twee myotube-monsters 558 en 610 kopieën / ng RNA hadden (figuur 3B). Omdat één myotubemonster niet goed werkte, is het beter om een groter aantal biologische replicaties te hebben om de statistische verschillen in hun expressiepatronen in de twee omstandigheden te bestuderen.
Figuur 1: Schematische weergave van het divergente primerontwerp voor de PCR-versterking van circBnc2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De dd-PCR-workflow voor circRNA-kwantificering. De volledige dd-PCR-workflow omvat vele stappen: (A) RNA-isolatie en cDNA-voorbereiding van C2C12-myoblast en 4-daagse gedifferentieerde myotubecellen, PCR-mengselvoorbereiding, (B) druppelgeneratie, PCR-amplificatie, druppeltellingen en gegevensanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Data-analyse met quantasoft-software. (A) Data-analyse omvat de identificatie van positieve en negatieve druppels met behulp van de kwantificeringssoftware. (B) Berekening van het aantal cirkelRNA's/ng RNA in C2C12 myoblasten (MB) en myotubes (MT). De gegevens in het staafdiagram van paneel B vertegenwoordigen de gemiddelde ± STDEV van twee tot drie biologische replicaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Primer Naam | Volgorde |
| circBnc2 Voorwaartse primer | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 Omgekeerde primer | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
Tabel 1: Divergente primersequenties die worden gebruikt voor de versterking van circBnc2.
| Stap | Temperatuur (°C) | Tijd | Aantal cycli | Hellingsnelheid |
| Enzymactivering | 95 | 10 min. | 1 | ~ 2 °C/s |
| Denaturatie | 94 | 30 s | 40 | ~ 2 °C/s |
| Gloeien/Verlengen | 60 | 1 min | 40 | ~ 2 °C/s |
| Signaalstabilisatie | 4 | 5 min. | 1 | ~ 2 °C/s |
| Signaalstabilisatie | 90 | 5 min. | 1 | ~ 2 °C/s |
Tabel 2: Voorwaarden voor PCR-versterking van circBnc2 op een thermische cycler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CircRNA-onderzoek is het afgelopen decennium gegroeid met de ontdekking van high-throughput sequencing-technologieën. Als gevolg hiervan is het beschouwd als een potentieel molecuul voor toekomstige RNA-therapeutica. Bovendien is bekend dat het fungeert als een biomarker bij verschillende ziekten, waaronder kanker en hart- en vaatziekten 4,8. De identificatie van circRNA is echter lastig vanwege de lage abundantie en het heeft slechts één specifieke backsplice junction-sequentie die het onderscheidt van het ouderlijke mRNA9. RT-PCR met behulp van divergente primers is de gouden standaardtechniek om circRNA te valideren sinds de ontdekking 9,10. Hoewel er verschillende moleculaire methoden zijn ontwikkeld voor circRNA-kwantificering, is het een uitdaging om circRNA-expressies nauwkeurig te meten vanwege hun lage abundantie. Aangezien dd-PCR zeer laag-overvloedige RNA/DNA-moleculen uit een bepaald monster kan versterken14, is het een van de beste methoden voor de nauwkeurige kwantificering van circRNA's.
De dd-PCR is een eindpunttest die absolute kwantificering van het doelgen15 geeft. In tegenstelling tot conventionele qPCR is het tijdrovend, vervelend en duur, waardoor het minder geaccepteerd is in vergelijking met real-time PCR, zelfs een decennium na de ontdekking15. Het biedt echter verschillende voordelen ten opzichte van de veelgebruikte qPCR om genexpressieveranderingen te bestuderen13,23. Ten eerste kan dd-PCR het exacte aantal kopieën van DNA in een bepaald monster leveren. Ten tweede verandert een verandering in huishoudelijke genexpressie de berekening van de doelgenpopulatie in een bepaald monster. Dit kan worden vermeden in dd-PCR, dat niet afhankelijk is van standaardcurves of huishoudgenen voor het kwantificeren van doel-DNA15. Ten derde, omdat de PCR-reactie optreedt in kleine compartimenten, biedt het een grotere flexibiliteit in de richting van de aanwezigheid van niet-specifieke remmers of achtergrond-DNA, waardoor het een nauwkeurigere methode is voor het kwantificeren van doelgenen23,24.
We gebruikten de dd-PCR-technologie om circBnc2-expressie te kwantificeren in prolifererende C2C12-myoblasten en gedifferentieerde myotubes met behulp van divergente primers. Specifieke circRNA-amplificatie met divergente primerparen zonder primer-dimeren moet echter worden gecontroleerd in reguliere PCR voordat dd-PCR wordt uitgevoerd. Ook moet het dd-PCR-protocol zorgvuldig worden gevolgd voor de nauwkeurige meting van circRNA-expressie. De hier gepresenteerde workflow kan eenvoudig worden aangepast voor de kwantificering van elk circRNA van belang. Recente studies hebben de diagnostische waarden van circRNA's in weefsel en lichaamsvloeistoffen voor de detectie van ziekten8 benadrukt. Samen zal deze methode een essentieel hulpmiddel zijn in de onderzoeks- en diagnose-industrie en het circRNA-onderzoek versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door intramurale financiering van het Institute of Life Sciences, de DBT-onderzoeksbeurs (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) en de Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2/ 504017] toegekend aan Amaresh C. Panda. We bedanken andere lableden voor het proeflezen van het artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L.
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C.
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
