Summary
Questo protocollo descrive il metodo dettagliato della PCR digitale a goccia (dd-PCR) per una quantificazione precisa dei livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule utilizzando primer divergenti.
Abstract
La reazione a catena della polimerasi a goccia digitale (dd-PCR) è uno dei metodi di quantificazione più sensibili; fraziona la reazione in quasi 20.000 goccioline d'acqua in olio e la PCR si verifica nelle singole goccioline. La dd-PCR presenta diversi vantaggi rispetto alla qPCR convenzionale in tempo reale, tra cui una maggiore precisione nel rilevare bersagli a bassa abbondanza, omettendo geni di riferimento per la quantificazione, eliminando le repliche tecniche per i campioni e mostrando un'elevata resilienza agli inibitori nei campioni. Recentemente, la dd-PCR è diventata uno dei metodi più popolari per quantificare accuratamente il DNA o l'RNA bersaglio per l'analisi e la diagnostica dell'espressione genica. Gli RNA circolari (circRNA) sono una grande famiglia di molecole di RNA recentemente scoperte covalentemente chiuse prive di estremità 5' e 3'. È stato dimostrato che regolano l'espressione genica agendo come spugne per le proteine leganti l'RNA e i microRNA. Inoltre, i circRNA sono secreti nei fluidi corporei e la loro resistenza alle esonucleasi li rende utili come biomarcatori per la diagnosi della malattia. Questo articolo ha lo scopo di mostrare come eseguire la progettazione di primer divergenti, l'estrazione dell'RNA, la sintesi del cDNA e l'analisi dd-PCR per quantificare accuratamente specifici livelli di RNA circolare (circRNA) nelle cellule. In conclusione, dimostriamo la quantificazione precisa dei circRNA utilizzando dd-PCR.
Introduction
I recenti progressi nelle tecnologie di sequenziamento dell'RNA e nuovi algoritmi computazionali hanno scoperto un nuovo membro della crescente famiglia di RNA non codificanti, chiamato RNA circolare (circRNA)1. Come suggerisce il nome, i circRNA sono una famiglia di molecole di RNA a singolo filamento senza estremità libere. Sono formati da splicing testa-coda non canonico chiamato back-splicing, in cui il sito accettore di giunzione a monte si unisce covalentemente con il sito donatore di giunzione a valle per formare un cerchio stabile di RNA 1,2. Questo processo potrebbe essere mediato da diversi fattori, tra cui elementi ripetitivi invertiti di Alu presenti a monte e a valle degli esoni circolarizzati o può essere mediato da alcuni fattori di splicing o proteine leganti l'RNA (RBP)2,3. Gli RNA circolari generati esclusivamente dalla sequenza esonica o intronica sono classificati come circRNA esonico e RNA intronici circolari o ci-RNA, mentre alcuni circRNA esonici trattengono l'introne e sono chiamati circRNA esone-introne (EIcircRNAs)3,4. Le funzioni dei circRNA sono molteplici, tra cui la spugnatura di miRNA e/o RBP, la regolazione della trascrizione e la regolazione della funzione cellulare traducendo in peptidi 3,5,6,7. Diversi rapporti hanno evidenziato il significato dei circRNA in varie malattie e processi fisiologici8. Inoltre, i modelli di espressione tessuto-specifici e la resistenza alla digestione esonucleasica lo rendono un biomarcatore funzionale per la diagnosi della malattia e può anche essere utilizzato come bersaglio terapeutico adatto8. Considerando la sua importanza nella regolazione della salute e delle malattie, la quantificazione accurata dell'espressione del circRNA è la necessità del momento.
Sono stati sviluppati diversi metodi biochimici per quantificare i circRNA in campioni biologici9. Uno dei metodi più convenienti e ampiamente accettati per la quantificazione del circRNA è la trascrizione inversa seguita dalla reazione a catena della polimerasi quantitativa (RT-qPCR) utilizzando coppie di primer divergenti10. Tuttavia, la maggior parte dei circRNA sono in bassa abbondanza rispetto agli mRNA lineari, il che rende difficile quantificarli11. Per superare questo problema, abbiamo cercato di utilizzare la PCR digitale a goccia (dd-PCR) per quantificare accuratamente il numero di circRNA in un determinato campione. La dd-PCR è una tecnologia PCR avanzata che segue il principio della microfluidica; genera più goccioline acquose nell'olio e la PCR si verifica in ogni goccia come reazione individuale12. La reazione avviene nelle singole goccioline e viene analizzata utilizzando un lettore di goccioline, che fornisce il numero di goccioline positive o negative per il gene di interesse12. È la tecnica più sensibile per quantificare con precisione un gene di interesse, anche se c'è solo una singola copia in un dato campione. La diminuzione della sensibilità verso gli inibitori, la migliore precisione e l'omissione del gene di riferimento per la quantificazione lo rendono più vantaggioso rispetto alla qPCR convenzionale13,14,15. È stato ampiamente utilizzato come strumento di ricerca e diagnostica per la quantificazione assoluta di un gene di interesse16,17. Qui, descriviamo il protocollo dd-PCR dettagliato per la quantificazione del circRNA nella differenziazione dei miotubi C2C12 di topo e dei mioblasti C2C12 di topo proliferanti utilizzando primer divergenti.
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Protocol
L'RNA è sensibile alle RNasi; pertanto, tutti i reagenti, gli strumenti e gli spazi di lavoro devono essere privi di RNasi e maneggiati con cura.
1. Disegno di primer divergente per circRNA (vedi Figura 1)
- Recuperare la sequenza matura dai dati di annotazione del circRNA utilizzando BEDTools o dal browser del genoma UCSC unendo la sequenza esone/introne presente tra le coordinate di giunzione retrosplicare18,19.
- Preparare una sequenza modello PCR di 200 nucleotidi di lunghezza unendo gli ultimi 100 nucleotidi della lunghezza totale della sequenza circRNA ai primi 100 nucleotidi della sequenza circRNA10.
NOTA: Se la lunghezza del circRNA è inferiore a 200 nucleotidi, dividerla in due metà uguali e unire i nucleotidi dall'ultima metà all'inizio della prima metà. - Utilizzare la sequenza di modelli sopra per la progettazione del primer utilizzando lo strumento web Primer3 e impostando una lunghezza del prodotto PCR compresa tra 120-180 nucleotidi in lunghezza20.
- Utilizzare le impostazioni predefinite di Primer3 per altri parametri come Tm e lunghezza del primer. Le sequenze di primer per circBnc2 sono elencate nella Tabella 1.
- Ordina le sequenze di primer divergenti per la sintesi da qualsiasi azienda di oligosintesi.
2. Isolamento dell'RNA
NOTA: Isolare l'RNA totale dalle cellule C2C12 del topo utilizzando qualsiasi kit disponibile in commercio o metodo di isolamento dell'RNA interno. Il metodo interno di isolamento dell'RNA utilizzato qui è stato descritto in precedenza21. Le sfere di silice magnetica sono preparate in laboratorio utilizzando il protocollo22 precedentemente pubblicato. Queste sfere magnetiche possono anche essere acquistate da vari fornitori.
- Prendi un piatto da 10 cm contenente circa 5 x 106 cellule di mioblasti C2C12 proliferanti e un miotubo C2C12 differenziato di 4 giorni per l'isolamento dell'RNA.
- Lavare le celle con 10 ml di 1x PBS tre volte ed eliminare il PBS utilizzando una pipetta.
- Raschiare le cellule in 1 mL di 1x PBS usando un raschietto cellulare, centrifugarle a 4 °C per 5 minuti a 750 x g ed eliminare il PBS usando una pipetta.
- Aggiungere 1 mL di reagente di isolamento dell'RNA (RIR) e lisare le cellule mediante pipettaggio vigoroso21.
- Aggiungere 200 μL (1/5 del volume di RIR) di cloroformio e vortice per 15 s. Centrifugare il tubo a 4 °C per 10 minuti a 12.000 x g.
- Prelevare 400 μL dello strato acquoso superiore, caricarlo su una colonna di silice e centrifugare per 1 minuto a 12.000 x g a temperatura ambiente. Portare il flusso in un nuovo tubo e aggiungere 600 μL di etanolo al 100%.
- Aggiungere 20 μL di sfere di silice magnetica e posizionare il tubo su un termomixer impostato a 25 °C e 1.200 giri/min per 5 minuti.
NOTA: Il volume delle perle può essere aumentato o diminuito a seconda del numero iniziale di cellule prelevate per la lisi. Le sfere di silice magnetica possono essere acquistate da venditori commerciali. - Posizionare il tubo su un supporto magnetico per 30 secondi o fino a quando la soluzione diventa limpida. Scartare il surnatante con cautela usando una pipetta.
- Risospendere le sfere di silice magnetica in un tampone di lavaggio da 500 μL contenente il 90% di etanolo. Posizionare il tubo sul supporto magnetico per 30 s. Ruotare il tubo due volte sul supporto magnetico per lavare le perline. Lasciare che le perline si depositino verso il magnete e gettare il tampone usando una pipetta.
- Ripetere il passaggio 2.9 due volte. Dopo il lavaggio, ruotare brevemente il tubo e riposizionarlo sul supporto magnetico per 30 secondi. Eliminare il tampone di lavaggio rimanente. Asciugare all'aria il tubo a 50 °C per 3 minuti su un termomiscelatore, mantenendo il coperchio aperto.
- Aggiungere 20 μL di acqua priva di nucleasi e risospendere le perle.
NOTA: Il volume di eluizione dell'RNA può essere ridotto fino a 10 μL per aumentare la concentrazione di RNA. - Posizionare i tubi per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico e lasciarlo riposare per 30 secondi. Raccogliere l'RNA disciolto in una nuova provetta per la valutazione della quantità e della qualità utilizzando uno spettrofotometro.
NOTA: L'RNA può essere conservato a -20 °C o -80 °C per la conservazione a lungo termine. Per ottenere un risultato ottimale, si consiglia di procedere con la fase di sintesi del cDNA il giorno successivo.
3. Sintesi del cDNA
- Misurare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro e prendere 1 μg di RNA per la sintesi del cDNA.
- Mescolare 1 μg di RNA totale con 1 μL di miscela dNTP (10 mM ciascuno di dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 4 μL di tampone 5x di trascrittasi inversa (RT), 2 μL di 10x RT random primer, 0,25 μL di enzima trascrittasi inversa (200 U/μL) e 0,5 μL di inibitore della RNasi (40 U/μL) e portare il volume fino a 20 μL utilizzando acqua priva di nucleasi.
NOTA: Il volume dell'enzima trascrittasi inversa può essere alterato a seconda della concentrazione iniziale di RNA prelevata per la sintesi del cDNA. - Tocca il tubo per mescolare la reazione e ruotare brevemente. Posizionare il tubo a 25 °C per 10 minuti e poi a 50 °C per 1 ora.
- Per inattivare l'enzima, posizionare il tubo a 85 °C per 5 minuti.
- Raffreddare il tubo per 2 minuti e aggiungere 480 μL di acqua priva di nucleasi al tubo per ottenere la concentrazione di cDNA a 2 ng/μL.
NOTA: il cDNA può essere conservato a -20 °C o utilizzato immediatamente per l'analisi dd-PCR.
4. Flusso di lavoro Digital droplet PCR (dd-PCR)
NOTA: Il flusso di lavoro della dd-PCR prevede più fasi, a partire dalla preparazione del campione, seguita dalla generazione di goccioline, dall'amplificazione PCR, dal conteggio delle gocce e dall'analisi dei dati. Ogni fase è cruciale per la generazione accurata dei dati in quanto la dd-PCR comporta la quantificazione assoluta dei prodotti e non richiede alcuna curva standard. Quindi, ciascuna delle diverse fasi della dd-PCR è stata descritta di seguito.
- Preparazione della reazione dd-PCR.
- Impostare la reazione PCR di 22 μL in provette o strisce PCR da 0,2 mL insieme a un tubo di controllo negativo e tubi NTC (non-template control).
NOTA: Ogni diversa coppia di primer divergenti per la rilevazione di diversi circRNA deve avere una reazione NTC insieme a campioni di prova. - Aggiungere 11 μL di miscela master dd-PCR (ad es. EvaGreen Supermix) e 11 μL di acqua priva di nucleasi per impostare il tubo di reazione di controllo negativo.
NOTA: Scongelare la miscela master dd-PCR a temperatura ambiente seguita da un breve vortice per ottenere una miscela omogenea. Utilizzare la stessa acqua priva di nucleasi per impostare il tubo di reazione di controllo negativo e i tubi NTC utilizzati per diluire il cDNA. - Aggiungere 11 μL di med-master mix dd-PCR, 5,5 μL di primer forward e reverse primer specifici per circRNA con concentrazione di 1 μM e 5,5 μL di acqua priva di nucleasi per impostare i tubi di reazione NTC.
NOTA: Diluire i primer divergenti circolari RNA-specifici diretti e inversi di 100 μM e miscelare per preparare una concentrazione di lavoro di 1 μM di miscela di primer circRNA diretta e inversa; quindi, la concentrazione finale del primer è 250 nM nella reazione da 22 μL. - Aggiungere 11 μL di med-master dd-PCR, 5,5 μL di primer forward e reverse primer specifici per circRNA con concentrazione di 1 μM e 5,5 μL di cDNA (2 ng/μL) per impostare le provette di reazione.
- Vortex accuratamente seguito centrifugando brevemente tutti i tubi di reazione per ottenere una miscela di reazione omogenea sul fondo dei tubi.
- Impostare la reazione PCR di 22 μL in provette o strisce PCR da 0,2 mL insieme a un tubo di controllo negativo e tubi NTC (non-template control).
- Generazione di goccioline.
- Trasferire i 20 μL di miscela PCR da provette PCR da 0,2 mL ai pozzetti del campione della cartuccia del generatore di gocce.
- Aggiungere 70 μL di olio per la generazione di goccioline ai pozzetti dell'olio della cartuccia del generatore di gocce con attenzione utilizzando una pipetta multicanale.
NOTA: Incubare l'olio di generazione di goccioline a temperatura ambiente per 15 minuti prima dell'uso. - Coprire la cartuccia del generatore di gocce con la guarnizione in gomma e posizionarla nella macchina del generatore di gocce per ottenere la miscela di gocce di olio campione, generata nei pozzetti delle gocce della cartuccia.
- Amplificazione PCR.
- Trasferire 40 μL della miscela di gocce di olio campione dai pozzetti delle gocce della cartuccia del generatore di gocce a una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.
NOTA: trasferire con attenzione la miscela di gocce di olio campione mentre si fa un angolo verso i pozzetti attraverso le punte della pipetta multicanale per evitare di rompere le goccioline durante il trasferimento sulla piastra dd-PCR a 96 pozzetti. - Sigillare la piastra PCR a 96 pozzetti con il sigillante a fogli di alluminio, posizionarla nel blocco macchina sigillante preriscaldato a 80 °C e fare clic sul sigillo per sigillare la piastra PCR.
- Ora, posizionare la piastra nel termociclatore dd-PCR e impostare il programma come indicato nella Tabella 2 con la temperatura del coperchio impostata a 105 °C e una velocità di rampa di 2 °C/s.
- Trasferire 40 μL della miscela di gocce di olio campione dai pozzetti delle gocce della cartuccia del generatore di gocce a una piastra PCR a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale.
- Conteggio delle goccioline.
- Una volta terminata la PCR, posizionare la piastra sulla macchina contagocce dd-PCR con il supporto della piastra nella posizione corretta per il conteggio delle goccioline.
- Aprire il software di analisi delle gocce e impostare l'esecuzione fornendo input per le informazioni di esempio.
- Fare clic sull'opzione di configurazione. Quindi, fai clic sull'opzione del modello per aprire un nuovo modello.
- Definisci ogni pozzetto inserendo i dettagli dell'esperimento, come il nome del campione (cDNA usato o controllo negativo o NTC), il nome del bersaglio (nome del primer circRNA) e il tipo (sconosciuto) e il tipo di esperimento come ABS (quantificazione assoluta) e Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) utilizzati, ecc.
- Infine, salva il modello e avvia la corsa facendo clic sull'opzione di esecuzione e seleziona il conteggio per riga o colonna. Consentire alla macchina di completare il conteggio delle gocce, che richiede circa 1 minuto / pozzetto.
- Fare clic sul pulsante Analizza per analizzare i dati dopo il completamento della lettura del droplet.
- Fare clic sul pulsante Ampiezza 1D per visualizzare le goccioline positive e negative
- Per separare le goccioline positive dalle goccioline negative, inserire una linea di soglia comune per tutti i campioni con lo stesso target.
NOTA: Le goccioline totali in ciascun campione devono essere superiori a 10.000 per essere considerate per la quantificazione assoluta. Il NTC non dovrebbe mostrare conteggi di goccioline positivi. La presenza di goccioline positive nel NTC indica la contaminazione dei reagenti o l'amplificazione dei dimeri di primer. È difficile scoprire se le goccioline positive hanno dimeri primer o prodotti non specifici in NTC. Si consiglia di controllare i primer ed evitare qualsiasi contaminazione dei reagenti come pratica generale per qualsiasi PCR incluso dd-PCR. - Fare clic sul pulsante Esporta per esportare i dati del conteggio circRNA come file .csv. I dati esportati mostrano il numero di circRNA presenti in ciascun campione.
- Calcolare manualmente il numero di circRNA in ciascun campione per nanogrammo di RNA considerando la quantità totale di cDNA utilizzata in ciascuna reazione.
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Representative Results
Il numero assoluto di circRNA in ciascun campione può essere derivato dai dati dd-PCR esportati. L'analisi PCR quantitativa in tempo reale ha suggerito l'espressione differenziale di circBnc2 nei miotubi C2C12 differenziati (dati non mostrati). Qui, abbiamo voluto verificare il numero assoluto di copie di circBnc2 nei mioblasti e nei miotubi C2C12 proliferanti. Poiché l'espressione di circBnc2 viene confrontata in due condizioni, è molto importante elaborare tutti i campioni per l'isolamento dell'RNA, la sintesi del cDNA e la PCR contemporaneamente utilizzando gli stessi reagenti e la stessa procedura. Per eseguire la quantificazione assoluta dei circRNA utilizzando la reazione dd-PCR, una quantità uguale di RNA totale iniziale dovrebbe essere utilizzata per la sintesi del cDNA per calcolare il numero esatto di molecole di RNA bersaglio per nanogrammo di RNA totale. Ad esempio, 1 μg di RNA totale è stato utilizzato per la sintesi del cDNA e diluito a 500 μL utilizzando acqua priva di nucleasi per ottenere una concentrazione finale di 2 ng / μL prima di eseguire il test dd-PCR (Figura 1).
Come mostrato nella Figura 2A, cDNA da 10 ng di RNA da cellule proliferanti di mioblasti C2C12 (MB) e un miotubo differenziato (MT) di 4 giorni è stato utilizzato per verificare la differenza di espressione di circBnc2 in queste due condizioni. I campioni sono stati elaborati per generare la goccia ed eseguire la PCR, seguita dal conteggio delle goccioline positive e negative utilizzando il software di analisi delle goccioline secondo le istruzioni del produttore (Figura 2B). Poiché i primer possono amplificare prodotti non specifici e formare dimeri di primer, NTC dovrebbe essere utilizzato per tutti i set di primer. Idealmente, NTC non dovrebbe avere conteggi di goccioline positivi.
Come mostrato nella Figura 3A, tutti i campioni tranne MT1 hanno mostrato più di 12.000 conteggi di goccioline. Poiché il conteggio totale delle goccioline era basso in MT1, questo campione non è stato considerato per l'analisi finale dei dati. Il basso numero totale di goccioline potrebbe essere dovuto a un errore nella generazione di goccioline, alla rottura delle goccioline durante il trasferimento alla piastra PCR o a problemi di pipettaggio. È interessante notare che c'era una chiara differenza nel modello di espressione di circBnc2 nella condizione differenziata del miotubo a 4 giorni rispetto alle cellule dei mioblasti. L'analisi dell'abbondanza di circBnc2 in termini di numero di copie ha indicato che le tre repliche dei mioblasti C2C12 avevano 76,8, 67 e 46 copie / ng di RNA, mentre i due campioni di miotubo avevano 558 e 610 copie / ng di RNA (Figura 3B). Poiché un campione di miotubo non ha funzionato bene, è meglio avere un numero maggiore di repliche biologiche per studiare le differenze statistiche nei loro modelli di espressione nelle due condizioni.
Figura 1: Rappresentazione schematica del progetto di primer divergente per l'amplificazione PCR di circBnc2. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Il flusso di lavoro dd-PCR per la quantificazione del circRNA. Il flusso di lavoro completo della dd-PCR comprende molti passaggi: (A) isolamento dell'RNA e preparazione del cDNA da mioblasti C2C12 e cellule miotubo differenziate a 4 giorni, preparazione della miscela PCR, (B) generazione di goccioline, amplificazione PCR, conteggio delle goccioline e analisi dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Analisi dei dati utilizzando il software QuantaSoft. (A) L'analisi dei dati include l'identificazione di goccioline positive e negative utilizzando il software di quantificazione. (B) Calcolo del numero di circRNA/ng di RNA nei mioblasti C2C12 (MB) e nei miotubi (MT). I dati nel grafico a barre del pannello B rappresentano la media ± STDEV di due o tre repliche biologiche. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Nome del primer | Sequenza |
| circBnc2 Primer Forward | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 Primer inverso | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
Tabella 1: Sequenze di primer divergenti utilizzate per l'amplificazione di circBnc2.
| Passo | Temperatura (°C) | Ore | Numero di cicli | Velocità di rampa |
| Attivazione enzimatica | 95 | 10 minuti | 1 | ~ 2 °C/s |
| Denaturazione | 94 | 30 secondi | 40 | ~ 2 °C/s |
| Ricottura/Estensione | 60 | 1 min | 40 | ~ 2 °C/s |
| Stabilizzazione del segnale | 4 | 5 minuti | 1 | ~ 2 °C/s |
| Stabilizzazione del segnale | 90 | 5 minuti | 1 | ~ 2 °C/s |
Tabella 2: Condizioni per l'amplificazione PCR di circBnc2 su un termociclatore.
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Discussion
La ricerca sul CircRNA è cresciuta nell'ultimo decennio con la scoperta di tecnologie di sequenziamento ad alto rendimento. Di conseguenza, è stata considerata una potenziale molecola per le future terapie a RNA. Inoltre, è noto per agire come biomarcatore in diverse malattie, tra cui il cancro e le malattie cardiovascolari 4,8. Tuttavia, l'identificazione del circRNA è difficile a causa della sua bassa abbondanza e ha solo una specifica sequenza di giunzione backsplice che lo differenzia dall'mRNA9 parentale. La RT-PCR che utilizza primer divergenti è stata la tecnica gold standard per convalidare il circRNA sin dalla sua scoperta 9,10. Sebbene siano stati sviluppati diversi metodi molecolari per la quantificazione del circRNA, è difficile misurare accuratamente le espressioni di circRNA a causa della loro bassa abbondanza. Poiché la dd-PCR può amplificare molecole di RNA/DNA a bassissima abbondanza da un dato campione14, è uno dei metodi migliori per la quantificazione accurata dei circRNA.
La dd-PCR è un test end-point che fornisce una quantificazione assoluta del gene bersaglio15. A differenza della qPCR convenzionale, è dispendiosa in termini di tempo, noiosa e costosa, rendendola meno accettata rispetto alla PCR in tempo reale anche un decennio dopo la sua scoperta15. Tuttavia, offre diversi vantaggi rispetto alla qPCR ampiamente utilizzata per studiare i cambiamenti di espressione genica13,23. In primo luogo, dd-PCR può fornire il numero esatto di copie di DNA presenti in un dato campione. In secondo luogo, un cambiamento nell'espressione genica housekeeping altera il calcolo della popolazione genica bersaglio in un dato campione. Questo può essere evitato nella dd-PCR, che non dipende dalle curve standard o dai geni di housekeeping per quantificare il DNA bersaglio15. In terzo luogo, poiché la reazione PCR avviene in piccoli compartimenti, fornisce una maggiore flessibilità verso la presenza di inibitori non specifici o DNA di fondo, rendendolo un metodo più accurato per quantificare i geni bersaglio23,24.
Abbiamo utilizzato la tecnologia dd-PCR per quantificare l'espressione di circBnc2 nei mioblasti C2C12 proliferanti e nei miotubi differenziati utilizzando primer divergenti. Tuttavia, l'amplificazione specifica del circRNA con coppie di primer divergenti senza primer-dimeri deve essere controllata nella PCR regolare prima di eseguire dd-PCR. Inoltre, il protocollo dd-PCR deve essere seguito attentamente per la misurazione accurata dell'espressione del circRNA. Il flusso di lavoro qui presentato può essere facilmente adattato per la quantificazione di qualsiasi circRNA di interesse. Recenti studi hanno evidenziato i valori diagnostici dei circRNA presenti nei tessuti e nei fluidi corporei per la rilevazione di malattie8. Insieme, questo metodo sarà uno strumento essenziale nel settore della ricerca e della diagnostica e accelererà la ricerca sul circRNA.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da finanziamenti intramurali dell'Institute of Life Sciences, dalla sovvenzione di ricerca DBT (BT / PR27622 / MED / 30/1961 / 2018) e dalla Wellcome Trust / DBT India Alliance Fellowship [IA / I / 18/2 / 504017] assegnata ad Amaresh C. Panda. Ringraziamo gli altri membri del laboratorio per aver riletto l'articolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L.
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C.
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
