Summary
Bu protokol, farklı primerler kullanılarak hücrelerdeki dairesel RNA (circRNA) seviyelerinin hassas bir şekilde ölçülmesi için ayrıntılı dijital damlacık PCR (dd-PCR) yöntemini açıklamaktadır.
Abstract
Dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (dd-PCR) en hassas niceleme yöntemlerinden biridir; reaksiyonu yaklaşık 20.000 yağda su damlacığına ayırır ve PCR bireysel damlacıklarda meydana gelir. dd-PCR, geleneksel gerçek zamanlı qPCR'ye göre, düşük bolluk hedeflerinin tespitinde artan doğruluk, niceleme için referans genleri atlama, numuneler için teknik replikaları ortadan kaldırma ve numunelerdeki inhibitörlere karşı yüksek esneklik gösterme gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Son zamanlarda, dd-PCR, gen ekspresyon analizi ve teşhisi için hedef DNA veya RNA'yı doğru bir şekilde ölçmek için en popüler yöntemlerden biri haline gelmiştir. Dairesel RNA'lar (sirkRNA'lar), 5' ve 3' uçları olmayan, yakın zamanda keşfedilen kovalent olarak kapalı RNA moleküllerinin büyük bir ailesidir. RNA bağlayıcı proteinler ve mikroRNA'lar için sünger görevi görerek gen ekspresyonunu düzenledikleri gösterilmiştir. Ayrıca, sirkRNA'lar vücut sıvılarına salgılanır ve ekzonükleazlara karşı dirençleri, hastalık teşhisi için biyobelirteçler olarak hizmet etmelerini sağlar. Bu makale, hücrelerdeki spesifik dairesel RNA (circRNA) seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için farklı primer tasarımı, RNA ekstraksiyonu, cDNA sentezi ve dd-PCR analizinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermeyi amaçlamaktadır. Sonuç olarak, dd-PCR kullanarak circRNA'ların kesin niceliğini gösteriyoruz.
Introduction
RNA dizileme teknolojilerindeki son gelişmeler ve yeni hesaplama algoritmaları, dairesel RNA (circRNA)1 olarak adlandırılan, büyüyen kodlamayan RNA ailesinin yeni bir üyesini keşfetti. Adından da anlaşılacağı gibi, sirkRNA'lar, serbest uçları olmayan tek sarmallı RNA moleküllerinin bir ailesidir. Bunlar, yukarı akış ekleme alıcı bölgesinin, kararlı bir RNA çemberi1,2 oluşturmak için aşağı akış ekleme donör bölgesi ile kovalent olarak birleştiği, geri ekleme adı verilen kanonik olmayan baştan kuyruğa ekleme ile oluşturulurlar. Bu süreç, dairesel ekzonların yukarı ve aşağı akımında bulunan ters Alu tekrarlayan elementler de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından aracılık edilebilir veya bazı ekleme faktörleri veya RNA bağlayıcı proteinler (RPP'ler) tarafından aracılık edilebilir2,3. Sadece ekzonik veya intronik diziden üretilen dairesel RNA'lar ekzonik sirkRNA ve dairesel intronik RNA'lar veya ci-RNA'lar olarak sınıflandırılırken, bazı ekzonik sirkRNA'lar introniği korur ve ekzon-intron sirkRNA'lar (EIcircRNA'lar)3,4 olarak adlandırılır. SirkRNA'ların işlevleri, miRNA ve / veya RBP'yi süngerlemek, transkripsiyonu düzenlemek ve peptidlereçevirerek hücresel fonksiyonu düzenlemek de dahil olmak üzere çok yönlüdür 3,5,6,7. Çeşitli raporlar, sirkRNA'ların çeşitli hastalıklarda ve fizyolojik süreçlerdeki önemini vurgulamıştır8. Ayrıca, dokuya özgü ekspresyon paternleri ve ekzonükleaz sindirimine direnç, onu hastalık tanısı için fonksiyonel bir biyobelirteç haline getirir ve uygun bir terapötik hedef olarak da kullanılabilir8. Sağlık ve hastalıkların düzenlenmesindeki önemi göz önüne alındığında, sirkRNA ekspresyonunun doğru bir şekilde ölçülmesi saatin ihtiyacıdır.
Biyolojik örneklerdeki sirkRNA'ları ölçmek için çeşitli biyokimyasal yöntemler geliştirilmiştir9. SirkRNA nicelleştirmesi için en uygun ve yaygın olarak kabul edilen yöntemlerden biri, ters transkripsiyon ve ardından farklı primer çiftleri10 kullanılarak kantitatif polimeraz zincir reaksiyonudur (RT-qPCR). Bununla birlikte, sirkRNA'ların çoğunluğu lineer mRNA'lara kıyasla düşük bolluk içindedir, bu da onları ölçmeyi zorlaştırır11. Bu sorunun üstesinden gelmek için, belirli bir numunedeki sirkRNA sayısını doğru bir şekilde ölçmek için dijital damlacık PCR'yi (dd-PCR) kullanmaya çalıştık. dd-PCR, mikroakışkanlar ilkesini takip eden gelişmiş bir PCR teknolojisidir; yağda birden fazla sulu damlacık üretir ve PCR her damlacıkta ayrı bir reaksiyon12 olarak oluşur. Reaksiyon bireysel damlacıklarda meydana gelir ve ilgilenilen gen için pozitif veya negatif damlacıkların sayısını veren bir damlacık okuyucu kullanılarak analiz edilir12. Belirli bir örnekte yalnızca tek bir kopya olsa bile, ilgilenilen bir geni doğru bir şekilde ölçmek için en hassas tekniktir. İnhibitörlere karşı duyarlılığın azalması, daha iyi hassasiyet ve niceleme için referans genin ihmal edilmesi, onu geleneksel qPCR 13,14,15'ten daha avantajlı hale getirir. İlgilenilen bir genin mutlak nicelleştirilmesi için bir araştırma ve teşhis aracı olarak yaygın olarak kullanılmıştır16,17. Burada, fare C2C12 miyotüplerini ayırt etmede ve farklı primerler kullanarak fare C2C12 miyoblastlarını çoğaltmada sirkRNA nicelemesi için ayrıntılı dd-PCR protokolünü açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
RNA RNazlara duyarlıdır; bu nedenle, tüm reaktifler, cihazlar ve çalışma alanları RNase içermeyen olmalı ve dikkatle kullanılmalıdır.
1. SirkRNA için farklı primer tasarım (bkz. Şekil 1)
- BEDTools kullanarak circRNA ek açıklama verilerinden veya UCSC genom tarayıcısından, backsplice bağlantı koordinatları18,19 arasında mevcut ekzon / intron dizisini birleştirerek olgun dizisini alın.
- Toplam sirkRNA dizi uzunluğunun son 100 nükleotidini sirkRNA dizisi 10'un ilk 100 nükleotidine birleştirerek 200 nükleotid uzunluğunda bir PCR şablon dizisihazırlayın.
NOT: Eğer sirkRNA uzunluğu 200 nükleotitten azsa, onu iki eşit yarıya bölün ve nükleotidleri son yarıdan ilk yarının başına kadar birleştirin. - Primer3 web aracını kullanarak ve uzunluğu 20 olan 120-180 nükleotid arasında değişen bir PCRürün uzunluğu ayarlayarak astar tasarımı için yukarıdaki şablon dizisini kullanın.
- Tm ve astar uzunluğu gibi diğer parametreler için Primer3'ün varsayılan ayarlarını kullanın. CircBnc2 için primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.
- Herhangi bir oligo sentezleme şirketinden sentez için farklı astar dizilerini sipariş edin.
2. RNA izolasyonu
NOT: Toplam RNA'yı fare C2C12 hücrelerinden ticari olarak temin edilebilen kitleri veya şirket içi RNA izolasyon yöntemini kullanarak izole edin. Burada kullanılan kurum içi RNA izolasyon yöntemi daha önce21 olarak tanımlanmıştır. Manyetik silika boncuklar, daha önce yayınlanan protokol22 kullanılarak laboratuvarda hazırlanır. Bu manyetik boncuklar çeşitli satıcılardan da temin edilebilir.
- RNA izolasyonu için yaklaşık 5 x 106 çoğalan C2C12 miyoblast hücresi ve bir adet 4 günlük diferansiye C2C12 miyotüp içeren 10 cm'lik bir çanak alın.
- Hücreleri 10 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve PBS'yi pipet kullanarak atın.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri 1 mL'lik 1x PBS'de kazıyın, 750 x g'de 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın ve PBS'yi bir pipet kullanarak atın.
- 1 mL RNA izolasyon reaktifi (RIR) ekleyin ve hücreleri kuvvetli pipetleme21 ile lize edin.
- 15 s için 200 μL (RIR hacminin 1 / 5'i) kloroform ve vorteks ekleyin. Tüpü 4 ° C'de 12.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Üst sulu tabakanın 400 μL'sini alın, bir silika kolona yükleyin ve oda sıcaklığında 12.000 x g'da 1 dakika boyunca santrifüj yapın. Akışı yeni bir tüpe alın ve 600 μL% 100 etanol ekleyin.
- 20 μL manyetik silika boncuk ekleyin ve tüpü 5 dakika boyunca 25 ° C ve 1.200 rpm'de ayarlanmış bir termomikser üzerine yerleştirin.
NOT: Boncuk hacmi, lizis için alınan ilk hücre sayılarına bağlı olarak arttırılabilir veya azaltılabilir. Manyetik silika boncuklar ticari satıcılardan temin edilebilir. - Tüpü 30 s boyunca veya çözelti netleşene kadar manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Süpernatantı bir pipet kullanarak dikkatlice atın.
- Manyetik silika boncukları% 90 etanol içeren 500 μL'lik bir yıkama tamponunda yeniden askıya alın. Tüpü manyetik standın üzerine 30 s boyunca yerleştirin. Boncukları yıkamak için tüpü manyetik stand üzerinde iki kez döndürün. Boncukların mıknatısa doğru yerleşmesine izin verin ve tamponu bir pipet kullanarak atın.
- Adım 2.9'u iki kez yineleyin. Yıkamadan sonra, tüpü kısaca döndürün ve 30 s boyunca manyetik standın üzerine geri yerleştirin. Kalan yıkama tamponunu atın. Tüpü 50 °C'de bir termomikserde 3 dakika boyunca hava ile kurutun ve kapağı açık tutun.
- 20 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve boncukları yeniden askıya alın.
NOT: RNA elüsyon hacmi, RNA konsantrasyonunu artırmak için 10 μL'ye düşürülebilir. - Tüpleri oda sıcaklığında 2-3 dakika bekletin. Tüpü manyetik standın üzerine geri yerleştirin ve 30 saniye bekletin. Bir spektrofotometre kullanarak miktar ve kalite değerlendirmesi için çözünmüş RNA'yı yeni bir tüpte toplayın.
NOT: RNA, uzun süreli depolama için -20 °C veya -80 °C'de saklanabilir. Optimum sonuç elde etmek için, ertesi gün cDNA sentez adımına devam etmeniz önerilir.
3. cDNA sentezi
- RNA konsantrasyonunu bir spektrofotometre kullanarak ölçün ve cDNA sentezi için 1 μg RNA alın.
- 1 μL toplam RNA'yı 1 μL dNTP karışımı (dATP, dTTP, dGTP ve dCTP'nin her biri 10 mM), 4 μL 5x ters transkriptaz (RT) tamponu, 2 μL 10x RT rastgele primer, 0.25 μL ters transkriptaz enzimi (200 U / μL) ve 0.5 μL RNaz inhibitörü (40 U / μL) ile karıştırın ve nükleaz içermeyen su kullanarak hacmi 20 μL'ye kadar yapın.
NOT: Ters transkriptaz enzim hacmi, cDNA sentezi için alınan ilk RNA konsantrasyonuna bağlı olarak değiştirilebilir. - Reaksiyonu karıştırmak ve kısaca döndürmek için tüpe dokunun. Tüpü 10 dakika boyunca 25 ° C'ye, ardından 1 saat boyunca 50 ° C'ye yerleştirin.
- Enzimi inaktive etmek için, tüpü 5 dakika boyunca 85 ° C'ye yerleştirin.
- Tüpü 2 dakika boyunca buzla soğutun ve cDNA konsantrasyonunu 2 ng / μL'ye çıkarmak için tüpe 480 μL nükleaz içermeyen su ekleyin.
NOT: cDNA -20 °C'de saklanabilir veya dd-PCR analizi için hemen kullanılabilir.
4. Dijital damlacık PCR (dd-PCR) iş akışı
NOT: dd-PCR'nin iş akışı, numune hazırlamadan başlayarak, damlacık üretimi, PCR amplifikasyonu, damlacık sayımı ve veri analizi ile devam eden birden fazla adımı içerir. dd-PCR, ürünlerin mutlak niceliğini içerdiğinden ve herhangi bir standart eğriye ihtiyaç duymadığından, her adım doğru veri üretimi için çok önemlidir. Bu nedenle, dd-PCR'nin farklı adımlarının her biri aşağıda açıklanmıştır.
- dd-PCR reaksiyonunun hazırlanması.
- 22 μL'lik PCR reaksiyonunu 0,2 mL PCR tüplerinde veya şeritlerinde, negatif bir kontrol tüpü ve NTC (şablon olmayan kontrol) tüpleri ile birlikte ayarlayın.
NOT: Farklı sirkRNA'ların tespiti için her farklı farklı primer çifti, test numuneleriyle birlikte bir NTC reaksiyonuna sahip olmalıdır. - Negatif kontrol reaksiyon tüpünü kurmak için 11 μL dd-PCR master-mix (örneğin, EvaGreen Supermix) ve 11 μL nükleaz içermeyen su ekleyin.
NOT: dd-PCR ana karışımını oda sıcaklığında çözün ve ardından homojen bir karışım yapmak için kısa bir vorteks yapın. cDNA'yı seyreltmek için kullanılan negatif kontrol reaksiyon tüpünü ve NTC tüplerini kurmak için aynı nükleaz içermeyen suyu kullanın. - NTC reaksiyon tüplerini kurmak için 11 μL dd-PCR master-mix, 5.5 μL circRNA spesifik ileri ve ters primer karışımı 1 μM konsantrasyonda ve 5.5 μL nükleaz içermeyen su ekleyin.
NOT: 100 μM stoğun ileri ve geri dairesel RNA'ya özgü farklı primerlerini seyreltin ve ileri ve geri sirkRNA primer karışımının 1 μM çalışma konsantrasyonunu hazırlamak için karıştırın; Böylece, son astar konsantrasyonu 22 μL reaksiyonunda 250 nM'dir. - Test reaksiyon tüplerini kurmak için 11 μL dd-PCR master-mix, 5.5 μL circRNA spesifik ileri ve ters primer karışımı 1 μM konsantrasyonda ve 5.5 μL cDNA (2 ng / μL) ekleyin.
- Vorteks, tüplerin dibinde homojen bir reaksiyon karışımı elde etmek için tüm reaksiyon tüplerini kısaca santrifüj ederek iyice takip eder.
- 22 μL'lik PCR reaksiyonunu 0,2 mL PCR tüplerinde veya şeritlerinde, negatif bir kontrol tüpü ve NTC (şablon olmayan kontrol) tüpleri ile birlikte ayarlayın.
- Damlacık üretimi.
- 20 μL PCR karışımını 0,2 mL PCR tüplerinden damlacık jeneratörü kartuşunun numune kuyucuklarına aktarın.
- Çok kanallı pipet kullanarak damlacık jeneratörü kartuşunun yağ kuyularına 70 μL damlacık üretim yağı ekleyin.
NOT: Damlacık üretim yağını kullanmadan önce oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. - Damlacık jeneratörü kartuşunu lastik conta ile örtün ve kartuşun damlacık kuyucuklarında oluşan numune-yağ damlacığı karışımını elde etmek için damlacık jeneratörü makinesine yerleştirin.
- PCR amplifikasyonu.
- Numune-yağ damlacık karışımının 40 μL'sini, damlacık jeneratörü kartuşunun damlacık kuyucuklarından çok kanallı pipet kullanarak 96 delikli bir PCR plakasına aktarın.
NOT: dd-PCR 96 delikli plakaya aktarırken damlacıkları kırmayı önlemek için çok kanallı pipetin uçlarından kuyucuklara açı yaparken numune-yağ damlacık karışımını dikkatlice aktarın. - 96 delikli PCR plakasını alüminyum folyo sızdırmazlık maddesi ile kapatın, 80 ° C'de önceden ısıtılmış plaka sızdırmazlık makinesi bloğuna yerleştirin ve PCR plakasını kapatmak için contaya tıklayın.
- Şimdi, plakayı dd-PCR termal bisikletçiye yerleştirin ve programı, kapak sıcaklığı 105 ° C'ye ve 2 ° C / s'lik bir rampa hızına ayarlanmış olarak Tablo 2'de belirtildiği gibi ayarlayın.
- Numune-yağ damlacık karışımının 40 μL'sini, damlacık jeneratörü kartuşunun damlacık kuyucuklarından çok kanallı pipet kullanarak 96 delikli bir PCR plakasına aktarın.
- Damlacık sayımı.
- PCR bittikten sonra, plakayı dd-PCR damlacık sayacı makinesine, damlacıkları saymak için plaka tutucu ile doğru konuma getirin.
- Damlacık analiz yazılımını açın ve numune bilgileri için girdi vererek çalıştırmayı ayarlayın.
- Kurulum seçeneğine tıklayın. Ardından, yeni bir şablon açmak için şablon seçeneğine tıklayın.
- Deney adı (kullanılan cDNA veya negatif kontrol veya NTC), hedef adı (circRNA primer adı) ve tipi (bilinmeyen) ve deney türü ABS (mutlak niceleme) ve Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) gibi deneyin ayrıntılarını koyarak her bir kuyucuğu tanımlayın.
- Son olarak, şablonu kaydedin ve çalıştır seçeneğine tıklayarak çalıştırmayı başlatın ve satıra göre veya sütuna göre saymayı seçin. Makinenin damlacık sayımını tamamlamasına izin verin, bu da yaklaşık 1 dakika / kuyu alır.
- Damlacık okumasının tamamlanmasından sonra verileri analiz etmek için Analiz Et düğmesine tıklayın.
- Pozitif ve negatif damlacıkları görmek için 1D Genlik düğmesini tıklayın
- Pozitif damlacıkları negatif damlacıklardan ayırmak için, aynı hedefe sahip tüm numuneler için ortak bir eşik çizgisi koyun.
NOT: Her numunedeki toplam damlacıklar, mutlak niceleme için dikkate alınmak üzere 10.000'in üzerinde olmalıdır. NTC pozitif damlacık sayıları göstermemelidir. NTC'de pozitif damlacıkların varlığı, reaktiflerin kontaminasyonunu veya primer dimerlerin amplifikasyonunu gösterir. Pozitif damlacıkların NTC'de astar dimerlere mi yoksa spesifik olmayan ürünlere mi sahip olduğunu bulmak zordur. Primerlerin kontrol edilmesi ve dd-PCR dahil olmak üzere herhangi bir PCR için genel bir uygulama olarak reaktiflerin kontaminasyonundan kaçınılması önerilir. - circRNA sayım verilerini .csv dosyası olarak dışa aktarmak için Dışa Aktar düğmesine tıklayın. Dışa aktarılan veriler, her numunede bulunan circRNA'ların sayısını gösterir.
- Her reaksiyonda kullanılan toplam cDNA miktarını göz önünde bulundurarak, RNA'nın nanogramı başına her numunedeki sirkRNA sayısını manuel olarak hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her numunedeki sirkRNA'ların mutlak sayısı, dışa aktarılan dd-PCR verilerinden türetilebilir. Gerçek zamanlı kantitatif PCR analizi, diferansiye C2C12 miyotüplerinde circBnc2'nin diferansiyel ekspresyonunu önerdi (veriler gösterilmedi). Burada, çoğalan C2C12 miyoblastlarında ve miyotüplerinde circBnc2'nin mutlak kopya sayısını kontrol etmek istedik. CircBnc2'nin ekspresyonu iki koşulda karşılaştırıldığından, aynı reaktifleri ve prosedürü kullanarak RNA izolasyonu, cDNA sentezi ve PCR için tüm numunelerin aynı anda işlenmesi gerçekten önemlidir. dd-PCR reaksiyonunu kullanarak sirkRNA'ların mutlak niceliğini gerçekleştirmek için, toplam RNA'nın nanogramı başına hedef RNA moleküllerinin tam sayısını hesaplamak için cDNA sentezi için eşit miktarda başlangıç toplam RNA kullanılmalıdır. Örneğin, cDNA sentezi için 1 μg toplam RNA kullanıldı ve dd-PCR testi yapılmadan önce 2 ng / μL'lik son konsantrasyonu elde etmek için nükleaz içermeyen su kullanılarak 500 μL'ye seyreltildi (Şekil 1).
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, bu iki durumda circBnc2 ekspresyonundaki farkı kontrol etmek için çoğalan C2C12 miyoblast hücrelerinden (MB) 10 ng RNA'dan cDNA ve 4 günlük diferansiye miyotüp (MT) kullanılmıştır. Numuneler, damlacığı oluşturmak ve PCR gerçekleştirmek için işlendi, ardından üreticinin talimatlarına göre damlacık analiz yazılımı kullanılarak pozitif ve negatif damlacıklar sayıldı (Şekil 2B). Astarlar spesifik olmayan ürünleri yükseltebildiğinden ve astar dimerleri oluşturabildiğinden, NTC tüm astar setleri için kullanılmalıdır. İdeal olarak, NTC'nin pozitif damlacık sayısı olmamalıdır.
Şekil 3A'da gösterildiği gibi, MT1 dışındaki tüm örnekler 12.000'den fazla damlacık sayımı göstermiştir. MT1'de toplam damlacık sayısı düşük olduğundan, bu örnek nihai veri analizi için dikkate alınmamıştır. Düşük toplam damlacık sayısı, damlacık oluşumundaki bir hatadan, PCR plakasına aktarım sırasında damlacıkların yırtılmasından veya pipetleme sorunlarından kaynaklanabilir. İlginç bir şekilde, 4 günlük farklılaşmış miyotüp durumunda, miyoblast hücrelerine kıyasla circBnc2'nin ekspresyon paterninde açık bir fark vardı. CircBnc2 bolluğunun kopya sayısı açısından analizi, C2C12 miyoblastlarının üç replikasının 76.8, 67 ve 46 kopya / ng RNA'ya sahip olduğunu, iki miyotüp örneğinin ise 558 ve 610 kopya / ng RNA'ya sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 3B). Bir miyotüp örneği iyi çalışmadığından, iki koşuldaki ekspresyon kalıplarındaki istatistiksel farklılıkları incelemek için daha fazla sayıda biyolojik replikasyona sahip olmak daha iyidir.
Şekil 1: CircBnc2'nin PCR amplifikasyonu için farklı astar tasarımının şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: SirkRNA nicelemesi için dd-PCR iş akışı. dd-PCR iş akışının tamamı birçok adımı içerir: (A) C2C12 miyoblastından RNA izolasyonu ve cDNA preparasyonu, 4 günlük farklılaştırılmış miyotüp hücreleri, PCR karışımı hazırlama, (B) damlacık üretimi, PCR amplifikasyonu, damlacık sayımı ve veri analizi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: QuantaSoft yazılımı kullanılarak veri analizi. (A) Veri analizi, niceleme yazılımı kullanılarak pozitif ve negatif damlacıkların tanımlanmasını içerir. (B) C2C12 miyoblastlarında (MB) ve miyotüplerde (MT) RNA'nın sirkülasyon RNA/ng sayısının hesaplanması. Panel B çubuğu grafiğindeki veriler, iki ila üç biyolojik kopyanın STDEV'± ortalamasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Astar Adı | Sıra |
| circBnc2 İleri astar | AAAGAGATGCACGTCTGCAC |
| circBnc2 Ters astar | AACCGCAGAAACTGCTGAAG |
Tablo 1: CircBnc2'nin amplifikasyonu için kullanılan farklı primer dizileri.
| Adım | Sıcaklık (°C) | Saat | Döngü sayısı | Rampa oranı |
| Enzim aktivasyonu | 95 | 10 dk | 1 | ~ 2 °C/s |
| Denatürasyon | 94 | 30 Saniye | 40 | ~ 2 °C/s |
| Tavlama/Uzatma | 60 | 1 dk | 40 | ~ 2 °C/s |
| Sinyal stabilizasyonu | 4 | 5 dk | 1 | ~ 2 °C/s |
| Sinyal stabilizasyonu | 90 | 5 dk | 1 | ~ 2 °C/s |
Tablo 2: Bir termal döngü üzerinde circBnc2'nin PCR amplifikasyonu için koşullar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CircRNA araştırması, son on yılda yüksek verimli dizileme teknolojilerinin keşfi ile büyümüştür. Sonuç olarak, gelecekteki RNA terapötikleri için potansiyel bir molekül olarak kabul edilmiştir. Ek olarak, kanser ve kardiyovasküler hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda biyobelirteç olarak hareket ettiği bilinmektedir 4,8. Bununla birlikte, sirkRNA'nın tanımlanması, düşük bolluğu ve onu ebeveyn mRNA9'dan ayıran yalnızca bir spesifik backsplice bağlantı dizisine sahip olması nedeniyle zordur. Farklı primerler kullanan RT-PCR, keşfinden bu yana sirkRNA'yı doğrulamak için altın standart teknik olmuştur 9,10. SirkRNA nicelemesi için çeşitli moleküler yöntemler geliştirilmiş olmasına rağmen, sirkRNA ekspresyonlarını düşük bollukları nedeniyle doğru bir şekilde ölçmek zordur. dd-PCR, belirli bir numune14'ten çok düşük miktarda RNA / DNA moleküllerini yükseltebildiğinden, sirkRNA'ların doğru bir şekilde ölçülmesi için en iyi yöntemlerden biridir.
dd-PCR, hedef gen15'in mutlak niceliğini veren bir son nokta testidir. Geleneksel qPCR'den farklı olarak, zaman alıcı, sıkıcı ve pahalıdır, bu da keşfinden on yıl sonra bile gerçek zamanlı PCR'ye kıyasla daha az kabul görmesini sağlar15. Bununla birlikte, gen ekspresyon değişikliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılan qPCR'ye göre çeşitli avantajlar sunar13,23. İlk olarak, dd-PCR, belirli bir örnekte bulunan DNA'nın tam kopya sayısını sağlayabilir. İkincisi, temizlik gen ekspresyonundaki bir değişiklik, belirli bir örneklemdeki hedef gen popülasyonunun hesaplanmasını değiştirir. Bu, hedef DNA15'i ölçmek için standart eğrilere veya temizlik genlerine bağlı olmayan dd-PCR'de önlenebilir. Üçüncüsü, PCR reaksiyonu küçük bölmelerde meydana geldiğinden, spesifik olmayan inhibitörlerin veya arka plan DNA'sının varlığına karşı daha yüksek esneklik sağlar ve bu da onu hedef genleri ölçmek için daha doğru bir yöntem haline getirir23,24.
dd-PCR teknolojisini, proliferasyon yapan C2C12 miyoblastlarında ve farklı primerler kullanarak farklılaşmış miyotüplerde sirküBnc2 ekspresyonunu ölçmek için kullandık. Bununla birlikte, primer-dimerleri olmayan farklı primer çiftleri ile spesifik sirkRNA amplifikasyonu, dd-PCR yapılmadan önce düzenli PCR'de kontrol edilmelidir. Ayrıca, sirkRNA ekspresyonunun doğru ölçümü için dd-PCR protokolü dikkatle izlenmelidir. Burada sunulan iş akışı, ilgilenilen herhangi bir circRNA'nın nicelleştirilmesi için kolayca uyarlanabilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, hastalıkların tespiti için doku ve vücut sıvılarında bulunan sirkRNA'ların tanısal değerlerini vurgulamıştır8. Birlikte, bu yöntem araştırma ve teşhis endüstrisinde önemli bir araç olacak ve circRNA araştırmalarını hızlandıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Yaşam Bilimleri Enstitüsü'nden intramural fonlar, DBT araştırma hibesi (BT / PR27622 / MED / 30/1961/2018) ve Amaresh C. Panda'ya verilen Wellcome Trust / DBT Hindistan İttifakı Bursu [IA / I / 18 / 2 / 504017] ile desteklenmiştir. Makaleyi düzelttikleri için diğer laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml microcentifuge tube | Tarson | 500010 | |
| 0.2 ml tube strips with cap | Tarson | 610020, 510073 | |
| Filter Tips | Tarson | 528104 | |
| DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | |
| Cell scrapper | HiMedia | TCP223 | |
| Chloroform | SRL | 96764 | |
| DNA diluent | HiMedia | MB228 | |
| Random primers | Thermo Fisher Scientific | 48190011 | |
| dNTP set | Thermo Fisher Scientific | R0181 | |
| Murine RNase inhibitor | NEB | M0314S | |
| Maxima reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | EP0743 | |
| QX200 dd-PCR Evagreen Supermix | Bio-Rad | 1864033 | |
| Droplet generation oil for Evagreen | Bio-Rad | 1864006 | |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio-Rad | 1814040 | |
| DG8 Cartridges and Gaskets | Bio-Rad | 1864007 | |
| DG8 Cartridge holder | Bio-Rad | 1863051 | |
| QX200 Droplet Generator | Bio-Rad | 1864002 | |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio-Rad | 12001925 | |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio-Rad | 1814000 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module | Bio-Rad | 1851197 | |
| QX200 Droplet Reader | Bio-Rad | 1864003 | |
| Quantasoft Software | Bio-Rad | 1864011 | |
| Silica column | Umbrella Life Science | 38220090 | |
| UCSC Genome Browser | https://genome.ucsc.edu/ | ||
| Primer 3 | https://primer3.ut.ee/ |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PLoS One. 7 (2), 30733 (2012).
- Chen, L. L., Yang, L.
- Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
- Chen, X., Zhou, M., Yant, L., Huang, C. Circular RNA in disease: Basic properties and biomedical relevance. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. , (2022).
- Sinha, T., Panigrahi, C., Das, D., Chandra Panda, A. Circular RNA translation, a path to hidden proteome. Wiley Interdisciplinary Reviews. RNA. 13 (1), 1685 (2022).
- Panda, A. C. Circular RNAs Act as miRNA Sponges. Circular RNAs: Biogenesis and Functions. Xiao, J. , Springer. Singapore. 67-79 (2018).
- Das, A., Sinha, T., Shyamal, S., Panda, A. C.
- Verduci, L., Tarcitano, E., Strano, S., Yarden, Y., Blandino, G. CircRNAs: Role in human diseases and potential use as biomarkers. Cell Death & Disease. 12 (5), 468 (2021).
- Pandey, P. R., et al. Methods for analysis of circular RNAs. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 11 (1), 1566 (2020).
- Das, A., Das, D., Panda, A. C. Validation of circular RNAs by PCR. PCR Primer Design. Methods in Molecular Biology. 2392, Humana. New York, NY. 103-114 (2022).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Hayden, R. T., et al. Comparison of droplet digital PCR to real-time PCR for quantitative detection of cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 51 (2), 540-546 (2013).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: From variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409 (2017).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Ishak, A., AlRawashdeh, M. M., Esagian, S. M., Nikas, I. P. Diagnostic, prognostic, and therapeutic value of droplet digital PCR (ddPCR) in COVID-19 patients: A systematic review. Journal of Clinical Medicine. 10 (23), 5712 (2021).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Lee, B. T., et al. The UCSC genome browser database: 2022 update. Nucleic Acids Research. 50, 1115-1122 (2022).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: A flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
- Untergasser, A., et al.
- Das, A., Das, D., Das, A., Panda, A. C. A quick and cost-effective method for DNA-free total RNA isolation using magnetic silica beads. bioRxiv. , (2020).
- Oberacker, P., et al. Simple Synthesis of Functionalized Paramagnetic Beads for Nucleic Acid Purification and Manipulation. Bio-protocol. 9 (20), 3394 (2019).
- Rački, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A., Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods. 10 (1), 42 (2014).
- Taylor, S. C., Carbonneau, J., Shelton, D. N., Boivin, G. Optimization of droplet digital PCR from RNA and DNA extracts with direct comparison to RT-qPCR: Clinical implications for quantification of Oseltamivir-resistant subpopulations. Journal of Virological Methods. 224, 58-66 (2015).
