Summary
Ett protokoll för känslig och kvantitativ detektion av topoisomeras 1-aktivitet med användning av rolling circle-testet för förbättrad enzymaktivitetsdetektering beskrivs. Metoden möjliggör detektion av topoisomeras 1-aktivitet från renade komponenter eller cell-/vävnadsextrakt. Detta protokoll har omfattande tillämpningar inom alla områden som involverar detektion av enzymatisk aktivitet.
Abstract
Isotermiska förstärkningsbaserade tekniker såsom rullande cirkelförstärkning har framgångsrikt använts för detektion av nukleinsyror, proteinmängder eller andra relevanta molekyler. Dessa metoder har visat sig vara betydande alternativ till PCR eller ELISA för kliniska och forskningstillämpningar. Dessutom är detektionen av proteinmängd (med Western blot eller immunohistokemi) ofta otillräcklig för att ge information för cancerdiagnos, medan mätningen av enzymaktivitet utgör en värdefull biomarkör. Mätning av enzymaktivitet möjliggör också diagnos och potentiell behandling av patogenburna sjukdomar. I alla eukaryoter är topoisomeraser de viktigaste DNA-bindande enzymerna som är involverade i kontrollen av DNA-topologiskt tillstånd under viktiga cellulära processer och är bland de viktiga biomarkörerna för cancerprognos och behandling.
Under årens lopp har topoisomeraser undersökts väsentligt som ett potentiellt mål för antiparasitiska och cancerläkemedel med bibliotek av naturliga och syntetiska småmolekylära föreningar som undersöks varje år. Här presenteras rullande cirkelförstärkningsmetod, kallad rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) analys som möjliggör kvantitativ mätning av topoisomeras 1 (TOP1) aktivitet på ett enkelt, snabbt och gelfritt sätt. Genom att klyva och ligera ett specialdesignat DNA-substrat omvandlar TOP1 en DNA-oligonukleotid till en sluten cirkel, som blir mallen för rullande cirkelförstärkning, vilket ger ~ 103 tandem upprepade rullande cirkelprodukter. Beroende på nukleotidinkorporeringen under förstärkningen finns det möjlighet till olika avläsningsmetoder, från fluorescens till kemiluminescens till kolorimetrisk. Eftersom varje TOP1-medierad klyvningsligering genererar en sluten DNA-cirkel är analysen mycket känslig och direkt kvantitativ.
Introduction
Topoisomeraser tillhör klassen DNA-modifierande enzymer och många av dessa har visat sig användbara som biomarkörer för mänskliga sjukdomar 1,2,3,4,5,6. TOP1 är involverad i att lösa den topologiska stressen i samband med cellulära processer såsom DNA-replikation, gentranskription, rekombination och kromosomal segregering7. TOP1 kan lösa både negativa och positiva superspolar genom en mekanism som involverar bildandet av ett övergående enkelsträngat brott i DNA 8,9. Efter bindning till DNA positionerar TOP1 det aktiva tyrosinet (Tyr723) för att utföra en nukleofil attack på fosfodiester-ryggraden. Ett TOP1-DNA-klyvningskomplex genereras sedan med enzymet kovalent fäst vid 3'-änden av den trasiga DNA-strängen. Detta frigör vridspänningar genom att låta 5'-änden av den klyvda strängen rotera runt den intakta strängen. Slutligen utför hydroxylgruppen i 5'-änden en nukleofil attack på 3'-fosfotyrosylbindningen. Som ett resultat frigörs TOP1 och DNA-ryggraden återställs8.
Flera analyser har utvecklats för att undersöka stegen i TOP1-katalytiska cykeln, inklusive avslappningsanalysen10, den elektrophoretiska mobilitetsskiftanalysen (EMSA) 11,12, DNA-självmordsklyvnings-ligeringsanalyserna 13,14 och in vivo-komplexet av enzymer (ICE) -analys 15 . Dessa analyser har dock flera begränsningar eftersom de är beroende av gelelektrofores, vilket kräver DNA-interkaleringsmedel, eller de kräver högspecialiserad utbildning och utrustning. Dessutom kräver analyserna stora mängder renat TOP1-enzym (från 1 till 5 ng för avslappningsanalysen och 50 till 200 ng för EMSA och klyvnings-ligeringsanalysen) eller extrakt från minst 106 celler för att fungera optimalt. Därför har en mycket känslig metod som möjliggör specifik detektion av TOP1-aktivitet i råa biologiska prover och på den enda katalytiska händelsenivån, kallad REEAD-analysen, utvecklats16.
Här presenteras ett protokoll för detektering av TOP1-aktivitet med REEAD-analys16 . En schematisk representation av analysen visas i figur 1. Ett specialdesignat silikongaller är fäst vid en funktionaliserad bild för att skapa en glasskiva multiwell-installation, kallad wellmaker i följande (figur 1A). Detta följs av koppling av en 5'-aminomodifierad primer till de funktionella NHS-grupperna i borrmassans brunnar (figur 1B). TOP1-medierad klyvning och ligeringsreaktion omvandlar ett specifikt DNA-substrat till en sluten cirkel. Det TOP1-specifika substratet (figur 1C) viks spontant till en hantelform som innehåller en dubbelsträngad stam och två enkelsträngade slingor. En av slingorna kompletterar den ytförankrade primern. Stamregionen innehåller en gynnad TOP1-klyvningsplats tre baser uppströms från 3'-änden och ett 5'-hydroxylöverhäng. Cirkularisering av substratet kan uppnås med antingen cell-/vävnadsextrakt (figur 1C) eller rekombinant, renad TOP1 (figur 1D).
När substratet klyvs av TOP1 blir enzymet övergående bundet till 3'-änden och trebasfragmentet diffunderar, vilket gör att 5'-överhänget kan glödgas till substratet och underlätta TOP1-medierad ligering. Ligeringen resulterar i cirkularisering av substratet och därefter dissociationen av TOP1. Den slutna cirkeln hybridiseras till den ytförankrade primern (figur 1E) och används som en mall för isotermisk rullande cirkelförstärkning (RCA) medierad av phi29-polymeraset, som kan utföra RCA med strängförskjutning, vilket ger 103 tandemupprepningsprodukter. Under RCA-steget kan fluorescerande märkta (figur 1F) eller biotinkopplade (figur 1G) nukleotider införlivas17. Införlivande av fluorescerande märkta nukleotider möjliggör detektion av RCP: erna antingen med hjälp av ett fluorescensmikroskop eller en fluorescensskanner. Alternativt kan en pepparrotsperoxidas (HRP)-kopplad antibiotinantikropp (figur 1H) binda de biotinylerade nukleotiderna, vilket möjliggör detektion av de rullade cirkelprodukterna (RCP) med användning av antingen förbättrad kemiluminescens (ECL) eller genom omvandling av 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) till en detekterbar färg. RCA följer en linjär reaktionskinetisk, vilket gör REEAD-analysen direkt kvantitativ, eftersom en RCP representerar en enda TOP1-medierad klyvningsligeringsreaktion. Här visas att denna analys kan användas för att detektera TOP1-aktivitet som ett renat rekombinant enzym eller extraheras från råprover och som ett anti-TOP1-läkemedelsscreeningsverktyg.
Protocol
OBS: Hitta en lista över buffertkompositioner, utrustning och andra material som krävs i materialförteckningen.
1. Cellodling
- Odla de föredragna cellerna i lämpligt medium och odla dem enligt instruktionerna. Som ett exempel, odla Caco2, kolorektal adenokarcinom-härledda celler, i minimalt essentiellt medium (MEM) kompletterat med 20% fetalt bovint serum (FBS), 1% icke-essentiella aminosyror (NEAA), 100 enheter / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin. Behåll cellkulturerna i en fuktad inkubator (5% CO2/95% luftatmosfär vid 37 °C). Platta cellerna i vävnadsodlingskolvar och dela var 3: e dag för att hålla cellerna vid 70% sammanflöde.
- Skörda cellerna från en 70% konfluent kolv genom trypsinbehandling (0,25% trypsin, 0,02% EDTA-lösning) och tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Återsuspendera cellpelleten i PBS för att justera cellkoncentrationen till 0,5 × 106 celler / rör. Snurra på 200 × g i 5 min och aspirera försiktigt supernatanten.
OBS: Celler som används för REEAD måste användas färska och förvaras på is. Resultaten som erhållits med Caco2-celler har nyligen publicerats17. Analysen har testats med en mängd olika cellinjer, inklusive celler från tjocktarms-, bröst-, lung- och livmoderhalscancer 18,19,20,21,22,23, men den kan användas med alla råa biologiska prover som innehåller TOP1, såsom vävnader, blod och saliv.
2. Förberedelse av funktionaliserade bilder
- Fäst det specialdesignade silikonisolatornätet på den funktionaliserade bilden och gör därmed brunnsmakaren. Tryck på silikonet för att undvika att det bildas luftbubblor (se figur 1A).
- Bered en blandning av 5 μM 5'-aminoprimer i 1x utskriftsbuffert. Tillsätt 4 μl av blandningen till varje brunn och placera wellamkern i en hybridiseringskammare med mättad NaCl vid temperaturer mellan 15 °C och 25 °C, skyddad från ljus.
OBS: En hybridiseringskammare kan enkelt tillverkas med hjälp av en pipettspetslåda fylld med mättad NaCl. Hybridiseringen tar minst 16 h och högst 72 h. Se sekvensen för 5'-aminoprimern i figur 1B. Bilderna funktionaliseras med NHS-grupper för att möjliggöra bindning av aminomodifierade oligonukleotider.
3. Generering av slutna cirkulära underlag
- Framställning av slutna cirkulära substrat med rekombinant TOP1 eller cellextrakt.
- Lysera en cellpellet på 0,5 × 106 celler i 500 μl lysbuffert för att nå en celltäthet på 1 000 celler/μl. Inkubera i 10 minuter på is.
- Bered en cirkelblandning av 2 μL 5 μM TOP1-specifikt substrat (substratets sekvens är följande: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') och 2 μL rekombinant TOP1-enzym eller 2 μL cellextrakt (se steg 3.1.1) i 16 μL av 1x TOP1 reaktionsbuffert.
OBS: Koncentrationen av rekombinant TOP1 som används beror på vilken avläsningsmetod som valts (se figur 2, figur 3, figur 4 och figur 5). Se sekvensen för det TOP1-specifika substratet i figur 1C. - Inkubera i 30 minuter vid 37 °C (se figur 1C,D).
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 2 μL 1% SDS.
- Framställning av slutna cirkulära substrat i närvaro av läkemedel
- Bered en cirkelblandning av 2 μL 5 μM TOP1-specifikt substrat och 1 μL 100% DMSO eller 1 μL 1,6 mM camptothecin (CPT) i 14 μL 1x TOP1 reaktionsbuffert. Tillsätt 2 μl 5 ng/μL rekombinant TOP1-enzym.
OBS: Andra småmolekylära föreningar eller läkemedel kan användas. I så fall bör en titrering av föreningen göras. Om föreningen löses i ett annat lösningsmedel än DMSO bör detta användas som en kontroll istället för DMSO. - Inkubera i 1 min vid 37 °C.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 2 μL 1% SDS.
- Bered en cirkelblandning av 2 μL 5 μM TOP1-specifikt substrat och 1 μL 100% DMSO eller 1 μL 1,6 mM camptothecin (CPT) i 14 μL 1x TOP1 reaktionsbuffert. Tillsätt 2 μl 5 ng/μL rekombinant TOP1-enzym.
OBS: Steg 3 kan startas parallellt med steg 2, och cirklarna kan förvaras vid 4 ° C över natten. Alternativt kan DNA-cirklarna framställas samtidigt som steg 4 och användas omedelbart. Se sekvensen för det TOP1-specifika substratet i figur 1C. Underlaget viks till en hantelform med en dubbel stamregion som innehåller en föredragen TOP1-klyvningsplats och två enkelsträngade öglor. Det öppna hantelsubstratet omvandlas till ett slutet cirkulärt substrat genom TOP1-medierad klyvning och ligering och kallas nedan en cirkel. Eftersom det finns ett överskott av 5'-aminoprimern kommer det inte att finnas någon konkurrens mellan öppna och slutna TOP1-specifika substrat.
4. Blockering av brunnsmakaren
- Sänk ner brunnstillverkaren i en 5 cm x 5 cm bricka fylld med buffert 1 som förvärmdes till 50 °C. Genom att använda en pipett, tryck vätskan inuti brunnarna för att se till att det inte finns några luftbubblor. Inkubera i 30 minuter vid 50 °C.
- Ta bort Buffer 1 och tvätta 2 x 1 min med dH2O. Skaka kraftigt för hand.
- Lägg till buffert 2 som har förvärmts till 50 °C. Se till att det inte finns några luftbubblor i brunnarna. Inkubera i 30 minuter vid 50 °C.
- Tvätta 2 x 1 min med dH2O. Skaka kraftigt för hand.
- Tvätta med 70% EtOH i 1 min. Skaka kraftigt för hand.
- Låt brunnsmakaren lufttorka.
OBS: Använd tryckluft för att torka brunnarna. Alternativt är det möjligt att blåsa luft med en Pasteur-pipett. Se till att brunnarna är torra innan du fortsätter.
5. Hybridisering av cirklarna till välmakaren
- Tillsätt 4 μL av cirklarna (gjorda i steg 3) till varje motsvarande brunn.
- Placera brunnstillverkaren i en fuktkammare i 1 timme meddH 2O vid 37 °C.
OBS: En fuktighetskammare kan tillverkas med hjälp av en låda för pipettspetsar fyllda med dH2O. Alternativt kan hybridiseringen göras över natten vid 25 ° C i fuktighetskammaren.
6. Tvätt
- Tvätta brunnsmakaren med buffert 3.
- Ta bort buffert 3 och ersätt med buffert 4.
- Ta bort Buffer 4 och tvätta med 70% EtOH.
- Ta bort EtOH och låt välgöraren torka.
OBS: Alla tvättsteg utförs i 1 min i en 5 cm x 5 cm bricka genom att sänka bilden helt. Se alltid till att det inte finns några luftbubblor inuti brunnarna.
7. Förstärkning av rullande cirkel
- Förbered en RCA-blandning av 1x Phi29 reaktionsbuffert kompletterad med 0,2 μg / μL BSA, 1 enhet Phi29-polymeras och antingen 0,25 mM dNTP och 0,0125 mM ATTO-488-dUTP för fluorescensavläsning, eller 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP och 0,01 mM Biotin-dCTP för kolorimetrisk / kemiluminescensavläsning. Tillsätt 4 μL till varje brunn. Se figur 1E.
OBS: Beredning av RCA-blandningen måste göras på is. När du införlivar fluorescerande nukleotider i RCA, undvik direkt ljus från detta steg för att skydda fluoroforerna. - Inkubera i 2 timmar vid 37 °C i fuktkammaren. Vid fluorescerande nukleotider som används, ställ in fuktighetskammaren i mörkret. Se figur 1F,G.
8. Tvätt
- För kemiluminescens- eller kolorimetriska avläsningsprotokoll, tvätta brunnsmakaren som i steg 6 och fortsätt sedan till steg 11.
- För fluorescensavläsningsprotokollet, ta bort silikonnätet med pincett innan du tvättar enligt följande steg.
- Tvätta rutschkanan i 10 min i buffert 3.
- Ta bort buffert 3 och ersätt med buffert 4. Tvätta i 5 min.
- Ta bort Buffer 4 och tvätta i 1 min i 70% EtOH.
- Ta bort EtOH och låt välgöraren torka.
9. Visualisering av fluorescerande rullcirkelprodukter med hjälp av en fluorescensskanner
- Skanna bilden i en fluorescensskanner med de filter som motsvarar den fluorofor som används. Använd den maximala möjliga fotomultiplikatorn som inte ger mättnad.
OBS: Den fluorescerande skannern som används för bildförvärv i detta protokoll är utrustad med en 473 nm laser och en FAM-filter-excitation 490 nm, utsläpp 520 nm. - Importera bilden till ImageJ och ändra bildtypen till 8-bitars (Bild | Typ | 8-bitars). Om du vill mäta banden separat begränsar du det uppmätta området med hjälp av rektangelritverktyget från verktygsfältet. Rita önskat område och mät intensiteten (Analysera | Mäta). Flytta sedan det ursprungligen ritade området till nästa band och mät.
- Plotta data i önskad programvara. Representativa bilder inklusive kvantifiering extraherad från ImageJ visas i figur 2.
10. Visualisering av fluorescerande rullcirkelprodukter med hjälp av ett fluorescensmikroskop
- Med en EtOH-beständig penna ritar du brunnarnas position innan du tar bort silikongallret och tvättar bilden som i steg 8.2. Efter tvättstegen monterar du bilden med 1 μL monteringsmedium utan 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) och tillsätter ett täckglas. För att möjliggöra visualisering i kameran, limma bilden på en 76 mm x 26 mm mikroskopbild.
- Analysera med hjälp av ett fluorescensmikroskop utrustat med ett 60x oljedoppningsmål och en kamera. Ta 12-15 bilder av varje prov/brunn.
- Importera bilderna till ImageJ och stapla bilderna (Bild | Staplar | Bild att stapla). Ändra bildtypen till 8-bitars (Bild | Typ | 8-bitars).
- Ställ in tröskelvärdet (Bild | Justera | Tröskel).
- Ställ in tröskeln enligt följande: ställ in den nedre stapeln och justera den övre stapeln så att endast de rätta signalerna är röda och bakgrunden är svart. Se till att tröskeln är så låg som möjligt innan de verkliga signalerna börjar försvinna.
- Svep igenom de enskilda bilderna och se till att de motsvarar bilderna innan du ställer in tröskeln. Observera att tröskelvärdet kan ändras från experiment till experiment.
- Räkna signalerna (Analysera | Analysera partiklar). Kontrollera att det sammanfattade fältet i ImageJ-inställningarna är markerat.
- Exportera resultaten till ett kalkylblad eller annan programvara för vidare databehandling. Representativa bilder inklusive kvantifiering extraherad från ImageJ visas i figur 3.
11. Koppling av HRP-konjugerad antibiotinantikropp till de biotinmärkta rullcirkelprodukterna
- Tillsätt 4 μL HRP-konjugerad antibiotinantikropp utspädd 1:300 i buffert 5 kompletterad med 5% fettfri skummjölk och 5% BSA till varje brunn.
- Inkubera i 50 minuter vid 15–25 °C i fuktkammaren (se figur 1H).
- Tvätta 3 x 3 min med Buffer 5.
- Torka brunnsmakaren.
12. Visualisering av de biotinmärkta rullcirkelprodukterna
- Visualisering med ECL
- Blanda 40 μl ECL Luminol och 40 μLH2O2omedelbart före användning. Tillsätt 2 μL till varje brunn.
- Visualisera bilden med en CCD-kamera eller på röntgenfilmer.
- Visualisering med TMB
- Efter steg 11.4, ta bort silikonnätet. Tillsätt sedan 400 μL TMB ovanpå hela bilden och lägg bilden i en fuktighetskammare. Vänta i ~ 5-10 min för färgutveckling. Tvätta bilden med 70% EtOH efter färgutvecklingen.
- Visualisera färgutvecklingen med blotta ögat. Ta ett fotografi av bilden med en fotokamera eller mobiltelefon.
- Importera bilden till ImageJ och ändra bildtypen till 8-bitars (Bild | Typ | 8-bitars). Om du vill mäta banden separat begränsar du det uppmätta området med hjälp av rektangelritverktyget från verktygsfältet. Rita önskat område och mät intensiteten (Analysera | Mäta). Flytta sedan det ursprungligen ritade området till nästa band och mät.
- Plotta data i önskad programvara. Representativa bilder inklusive kvantifiering extraherad från ImageJ visas i figur 4, figur 5 och figur 6.
Representative Results
Här presenteras ett protokoll för detektering av TOP1-aktivitet med REEAD-analysen16. Protokollet användes för att detektera rekombinant TOP1-aktivitet med hjälp av fyra olika avläsningsmetoder: fluorescensskanner, fluorescensmikroskop, kemiluminescens och kolorimetrisk. Protokollet användes också för att detektera aktiviteten hos TOP1 extraherad från Caco2-celler, som ett exempel på råextrakt, med kemiluminescens eller TMB-avläsning. Dessutom användes protokollet som ett läkemedelsscreeningsverktyg för att detektera hämningen av rekombinant TOP1-aktivitet av CPT, som ett exempel på en TOP1-specifik hämmare, med användning av kemiluminescensavläsningsmetoden.
Resultaten som erhållits vid analys av TOP1-aktiviteten med hjälp av fluorescensavläsningen visas i figur 2 och figur 3. En representativ skanning av den fluorescerande objektsglaset och den resulterande kvantifieringen visas i figur 2. Som framgår av kvantifieringen har denna avläsning en detektionsgräns på 12,5 ng TOP1. Representativa bilder och den resulterande kvantifieringen som erhålls vid användning av den fluorescerande mikroskopavläsningen visas i figur 3. Med den här avläsningsmetoden är detektionsgränsen så lite som 0,1 ng TOP1. Resultaten som erhållits vid analys av TOP1-aktiviteten med hjälp av kemiluminescensavläsningen visas i figur 4, och resultaten från den kolorimetriska avläsningen visas i figur 5. Detektionsgränsen för dessa avläsningsmetoder är vid 6 ng TOP1 eller som TOP1 extraherad från 312 Caco2-celler. Figur 6 visar mätningarna av TOP1-aktiviteten i närvaro av 80 μM CPT eller DMSO som ett exempel på läkemedelsscreeningsapplikation. Den representativa bilden och den resulterande kvantifieringen av tre oberoende experiment visar att CPT hämmar TOP1-medierad cirkularisering av substratet som förväntat24,25.
Figur 1: Schematisk representation av REEAD-protokollet. (A,B) Förberedelse av de funktionaliserade diabilderna. Silikonnätet är fäst vid den funktionaliserade bilden. Därefter kopplas 5'-aminoprimern till bilden, vilket möjliggör förstärkning av det TOP1-specifika substratet. (C,D) Generering av slutna cirkulära substrat. Det TOP1-specifika substratet viks till en hantelform med en föredragen TOP1-klyvningsplats i den dubbelsträngade stammen och en primerbindande sekvens i en av de två enkelsträngade öglorna. (C) TOP1 frigörs vid lys av cellerna. Vid TOP1-medierad klyvning och ligering omvandlas substratet till en sluten cirkel; (D) Renad, rekombinant TOP1 används. E) Förstärkning av rullande cirkel. De slutna cirkulära substraten hybridiseras till den ytförankrade primern och förstärks av RCA med användning av Phi29-polymeras. RCA kan uppnås antingen genom införlivande av fluorescerande nukleotider som i F eller biotinylerade nukleotider som i G. De fluorescerande rullcirkelprodukterna visualiseras med hjälp av antingen ett fluorescensmikroskop eller en fluorescensskanner. (H) Koppling av den HRP-konjugerade antibiotinantikroppen. De biotinylerade rullande cirkelprodukterna inkuberas med den HRP-konjugerade antibiotinantikroppen. Signalutvecklingen förmedlas av HRP-enzymet, och signalerna visualiseras antingen av ECL och detekteras med hjälp av en CCD-kamera eller genom att använda TMB som genererar en kolorimetrisk visualisering. Förkortningar: REEAD = rullande cirkelförbättrad enzymaktivitetsdetektering; RCA = rullande cirkelförstärkning; TOP1 = topoisomeras 1; HRP = pepparrotsperoxidas; ECL = förbättrad kemiluminescens; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Mätningar av TOP1-aktivitet med fluorescensskannern. Vänster panel visar en representativ bild av bilden när du analyserar aktiviteten för 3-50 ng TOP1 med hjälp av fluorescensskannerns avläsningsprotokoll. Höger panel visar den resulterande kvantifieringen. t-test med Welchs korrigering, p = 0,0064, n = 4. Förkortning: TOP1 = topoisomeras 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Mätningar av TOP1-aktivitet med fluorescensmikroskopet. Vänster panel visar representativa bilder av bilden när man analyserar aktiviteten för 0,1-12,5 ng TOP1 med hjälp av fluorescensmikroskopavläsningsprotokollet. Observera att bilderna är beskurna versioner för att korrekt visa punkterna. Av denna anledning liknar de inte antalet signaler i kvantifieringen som visas i den högra panelen. t-test med Welchs korrigering, p = 0,0136, n = 3. Förkortning: TOP1 = topoisomeras 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mätningar av TOP1-aktivitet med hjälp av kemiluminescensavläsningen. (A) Vänster panel visar en representativ bild av bilden när man analyserar aktiviteten för 3-50 ng TOP1 med hjälp av kemiluminescensavläsningsprotokollet. Höger panel visar den resulterande kvantifieringen. t-test med Welchs korrigering, p < 0,0001, n = 4. (B) Vänster panel visar en representativ bild av bilden när man analyserar aktiviteten hos TOP1 extraherad från 156-40 000 Caco2-celler med hjälp av kemiluminescensavläsningsprotokollet. Höger panel visar den resulterande kvantifieringen. t-test med Welchs korrigering, p = 0,0224, n = 3. Förkortningar: TOP1 = topoisomeras 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Mätningar av TOP1-aktivitet med kolorimetrisk avläsning. (A) Vänster panel visar en representativ bild av bilden när du analyserar 3-50 ng TOP1 med hjälp av kolorimetriska avläsningsprotokollet. Höger panel visar den resulterande kvantifieringen. t-test med Welchs korrigering, p = 0,0012, n = 4. (B) Vänster panel visar en representativ bild av bilden när man analyserar aktiviteten hos TOP1 extraherad från 156-40 000 Caco2-celler med hjälp av kolorimetriska avläsningsprotokollet. Höger panel visar den resulterande kvantifieringen. t-test med Welchs korrigering, p = 0,0117, n = 3. Förkortningar: TOP1 = topoisomeras 1; TMB = 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Mätningar av TOP1-aktivitet efter läkemedelsbehandling med hjälp av chemiluminescensavläsningsprotokollen. Vänster panel visar en representativ bild av bilden när du analyserar 10 ng TOP1 i närvaro av 5% DMSO eller 80 μM CPT i 1 min. Höger panel visar den resulterande kvantifieringen. t-test med Welchs korrigering, p = 0,0017, n = 3. Förkortningar: TOP1 = topoisomeras 1; CPT = camptothecin; DMSO = dimetylsulfoxid; Neg = negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Topoisomeraser representerar en klass av DNA-modifierande enzymer som lockar hög forskning och kliniskt intresse, vilket är målet för småmolekylära föreningar med potentiell effekt vid behandling mot cancer eller i kampen mot infektionssjukdomar. Dessutom har aktiviteten hos human TOP1 visat sig vara en effektiv biomarkör för cancerprognos och behandling18,19,23. Även om det är TOP1-aktiviteten som påverkar effekten av en kemoterapeutisk hämmare26, är det ofta mängden DNA-RNA eller mängden TOP1 som bedöms i kliniska miljöer. Detta beror på bristen på snabba, enkla och gelbaserade fria verktyg som kan ge exakt och exakt kvantifiering av topoisomerasaktivitet i alla laboratorieinställningar.
Här beskrivs ett protokoll för REEAD-analysen som möjliggör mätning av TOP1-aktivitet på ett gelfritt sätt. I detta protokoll inkuberas renat TOP1- eller råextrakt från celler med ett specialdesignat DNA-hantelformat substrat som vid klyvning/ligering medierat av TOP1 omvandlas till en sluten, cirkulär molekyl. Cirklarna hybridiseras sedan på en glasyta och förstärks av RCA. För att möjliggöra enkel användning vid utförandet av reaktioner som händer på bilden är ett silikonnät fäst vid glaset, vilket gör enskilda brunnar där reaktionerna äger rum. På detta sätt utnyttjar protokollet ett multiwell-system - ett silikonnät som kallas wellmaker.
Protokollet användes för att detektera aktiviteten hos rekombinanta TOP1 och TOP1 extraherade från kolorektal adenokarcinomceller Caco2, som används som ett exempel. Dessutom, som ett exempel på REEAD som ska användas som ett läkemedelsscreeningsverktyg, användes protokollet för att detektera TOP1-aktivitetshämning av den välkända TOP1-hämmaren CPT24,25. Analysen var kopplad till olika avläsningsmetoder-fluorescensmikroskopi, vilket ger en hög känslighet, och en fluorescensskanner, kemiluminescens eller kolorimetrisk, som kräver mindre specialiserad utrustning och utbildning. Den mycket känsliga fluorescensmikroskopavläsningen har begränsningarna av behovet av en fluorescensmikroskopinställning av god kvalitet, skicklig personal och tidskrävande bildförvärv och analys.
Av dessa skäl avläses fluorescensskannern som möjliggör snabbare förvärv och analys även om det är på bekostnad av känsligheten presenteras. Vid brist på en fluorescensskanner kan två utmärkta alternativ, kemiluminescens och kolorimetriska avläsningsmetoder, övervägas. Båda metoderna är snabba och enkla och kräver ingen dyr utrustning eller specialutbildning. I alla avläsningsformat har REEAD många fördelar jämfört med de senaste analyserna, som är mer tidskrävande, gelbaserade (med kraven på interkaleringsmedel) och mindre direkt kvantitativa. Det finns dock några kritiska steg i det presenterade protokollet. Vid hantering av läkemedelsscreeningen bör tidpunkterna, läkemedelskoncentrationen och förhållandet mellan TOP1-mängden / DNA-substratet optimeras jämfört med de beskrivna inställningarna optimerade för CPT. Läkemedlet kan undersökas genom att utföra en preinkubation med DNA-substratet eller en preinkubation med TOP1-enzymet. Detta kan ge värdefull information om molekylens förmåga att hämma TOP1 och ge insikt i läkemedlets verkningsmekanism.
Dessutom, om man upplever låga eller frånvarande signaler, beror detta troligen på en ineffektiv lys av råprovet eller en nedbrytning av TOP1 i extraktet på grund av felaktig användning av proteashämmare. Dessutom kan detta också bero på otillräcklig lagring av de viktiga analyskomponenterna, såsom rekombinant TOP1, phi29-polymeras, nukleotider, substrat och primer. Slutligen bör upprepade frys-tina cykler av oligonukleotiderna undvikas, eftersom detta dramatiskt påverkar analysprestandan. När råextrakt används måste extraktionseffektiviteten för det specifika biologiska provet optimeras och mängden och aktiviteten för TOP1 kan variera från det exempel som rapporteras här. Av denna anledning kommer varje råextrakt som ska testas att kräva en titrering för identifiering av analysdetekteringsgränsen och känslighetsintervallet vid användning av det specifika provet. Protokollet har optimerats för detektering av human TOP1. Aktiviteten hos andra eukaryota TOP1 kan mätas, men NaCl-koncentrationen och inkubationstiden kan behöva optimeras enligt enzymreningsmetoden och optimal enzymaktivitet. Mer cirkulära substrat kommer att bli resultatet av långvarig inkubation, medan färre cirkulära substrat kommer att bli resultatet av förkortad inkubation.
Förutom de presenterade applikationerna möjliggör REEAD mätning av TOP1-aktiviteten i råa extrakt från små biopsier från cancerpatienter18, förutsägelsen av den cytotoxiska anticancereffekten av CPT i cancercellinjer 20,21,22 och till och med detektering av enzymaktiviteten i enstaka celler20,21 . Dessutom möjliggör den presenterade REEAD-inställningen med hjälp av wellmaker multiwell-baserad drogscreening av bibliotek av syntetiska eller naturliga föreningar. Utöver detta har en modifierad version av REEAD-analysen, kallad REEAD C / L, utvecklats. Denna inställning möjliggör separata undersökningar av klyvnings- och ligeringsstegen i TOP1-reaktionen27. Med REEAD C / L är det möjligt att bestämma verkningsmekanismen för småmolekylära hämmare och karakterisera dem som TOP1-katalytiska hämmare med potentiella antiparasitiska effekter28 eller som TOP1-gifter som ska användas för cancerbehandling24,25. Slutligen, med specifik redesign av DNA-substraten för att matcha de olika kraven (för DNA-bindning eller klyvningsligering) av andra TOP1-enzymer, har REEAD också använts för detektion av infektionssjukdomar (som i fallet med Plasmodium falciparum, som orsakar malaria29) eller Leishmania donovani och Monkeypox-virus (data visas inte). Eller det kan användas för att identifiera småmolekylära föreningar med antipatogena effekter. Det presenterade protokollet ger forskare inom TOP1-området en enkel metod för att upptäcka enzymaktivitet med liten eller ingen optimering och med möjlighet att anpassas till ännu bredare applikationer i framtiden.
Disclosures
Författarna C.T. och K.M. är anställda av VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. och M.S. är aktieägare och/eller optionsinnehavare. C.T., B.R.K. och M.S. förklarar att de är uppfinnare av patentet EP2022/057172 som lämnats in i VPCIR biosciences ApS namn. De andra författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka laboratorietekniker Noriko Y. Hansen, Institutionen för molekylärbiologi och genetik, Aarhus universitet, för tekniskt stöd i samband med Phi29- och TOP1-enzymrening.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
References
- Baldwin, E. L., Osheroff, N. Etoposide, topoisomerase II and cancer. Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents. 5 (4), 363-372 (2005).
- Gilbert, D. C., Chalmers, A. J., El-Khamisy, S. F. Topoisomerase I inhibition in colorectal cancer: Biomarkers and therapeutic targets. British Journal of Cancer. 106 (1), 18-24 (2012).
- Ikeguchi, M., et al. TopoisomeraseI expression in tumors as a biological marker for CPT-11 chemosensitivity in patients with colorectal cancer. Surgery Today. 41 (9), 1196-1199 (2011).
- Meisenberg, C., et al. Clinical and cellular roles for TDP1 and TOP1 in modulating colorectal cancer response to irinotecan. Molecular Cancer Therapeutics. 14 (2), 575-585 (2015).
- Palshof, J. A., et al. Topoisomerase I copy number alterations as biomarker for irinotecan efficacy in metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 17 (1), 1-10 (2017).
- Proszek, J., et al. Topoisomerase I as a biomarker: Detection of activity at the single molecule level. Sensors. 14 (1), 1195-1207 (2014).
- Leppard, J. B., Champoux, J. J. Human DNA topoisomerase I: Relaxation, roles, and damage control. Chromosoma. 114 (2), 75-85 (2005).
- Champoux, J. J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 369-413 (2001).
- Redinbo, M. R., et al. Crystal structures of human topoisomerase I in covalent and noncovalent complexes with DNA. Science. 279 (5356), 1504-1513 (1998).
- Nitiss, J. L., Soans, E., Rogojina, A., Seth, A., Mishina, M.
- Tesauro, C., et al. Erybraedin C, a natural compound from the plant Bituminaria bituminosa, inhibits both the cleavage and religation activities of human topoisomerase I. Biochemical Journal. 425 (3), 531-539 (2010).
- Keller, J. G., et al. Topoisomerase 1 inhibits MYC promoter activity by inducing G-quadruplex formation. Nucleic Acids Research. 50 (11), 6332-6342 (2022).
- Christiansen, K., Westergaard, O. Characterization of intra- and intermolecular DNA ligation mediated by eukaryotic topoisomerase I. Role of bipartite DNA interaction in the ligation process. Journal of Biological Chemistry. 269 (1), 721-729 (1994).
- Svejstrup, J. Q., Christiansen, K., Andersen, A. H., Lund, K., Westergaard, O. Minimal DNA duplex requirements for topoisomerase I-mediated cleavage in vitro. Journal of Biological Chemistry. 265 (1), 12529-12535 (1990).
- Anand, J., Sun, Y., Zhao, Y., Nitiss, K. C., Nitiss, J. L. Detection of topoisomerase covalent complexes in eukaryotic cells. Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 283-299 (2018).
- Stougaard, M., et al. Single-molecule detection of human topoisomerase I cleavage-ligation activity. ACS Nano. 3 (1), 223-233 (2009).
- Keller, J. G., Petersen, K. V., Knudsen, B. R., Tesauro, C. Simple and fast DNA-based tool to investigate topoisomerase 1 activity, a biomarker for drug susceptibility in colorectal cancer. Recent Underst. Colorectal Cancer Treatment. , (2022).
- Jakobsen, A. K., et al. Correlation between topoisomerase I and tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 activities in non-small cell lung cancer tissue. Experimental and Molecular Pathology. 99 (1), 56-64 (2015).
- Jakobsen, A. K., et al. TDP1 and TOP1 as targets in anticancer treatment of NSCLC: Activity and protein level in normal and tumor tissue from 150 NSCLC patients correlated to clinical data. Lung Cancer. 164, 23-32 (2022).
- Keller, J. G., et al. On-slide detection of enzymatic activities in selected single cells. Nanoscale. 9 (36), 13546-13553 (2017).
- Keller, J. G., Stougaard, M., Knudsen, B. R.
- Tesauro, C., et al. Different camptothecin sensitivities in subpopulations of colon cancer cells correlate with expression of different phospho-isoforms of topoisomerase i with different activities. Cancers. 12 (5), 1240 (2020).
- Tesauro, C., et al. Topoisomerase i activity and sensitivity to camptothecin in breast cancer-derived cells: A comparative study. BMC Cancer. 19 (1), 1-15 (2019).
- Pommier, Y. DNA topoisomerase I Inhibitors: Chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chemical Reviews. 109 (7), 2894-2902 (2009).
- Pommier, Y. Drugging topoisomerases: lessons and challenges. ACS Chemical Biology. 8 (1), 82-95 (2013).
- Bailly, C. Irinotecan: 25 years of cancer treatment. Pharmacological Research. 148, 104398 (2019).
- Petersen, K. V., et al. Simple and fast dna based sensor system for screening of small-molecule compounds targeting eukaryotic topoisomerase 1. Pharmaceutics. 13 (8), 1255 (2021).
- García-Estrada, C., Prada, C. F., Fernández-Rubio, C., Rojo-Vázquez, F., Balaña-Fouce, R. DNA topoisomerases in apicomplexan parasites: promising targets for drug discovery. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 277 (1689), 1777-1787 (2010).
- Hede, M. S., et al. Detection of the malaria causing Plasmodium parasite in saliva from infected patients using topoisomerase I activity as a biomarker. Scientific Reports. 8 (1), 1-12 (2018).
