Summary
Viene descritto un protocollo per la rilevazione sensibile e quantitativa dell'attività della topoisomerasi 1 utilizzando il saggio di rilevamento dell'attività enzimatica potenziata del rolling circle. Il metodo consente di rilevare l'attività della topoisomerasi 1 da componenti purificati o estratti di cellule/tessuti. Questo protocollo ha applicazioni ad ampio raggio in qualsiasi campo che coinvolga il rilevamento dell'attività enzimatica.
Abstract
Tecniche basate sull'amplificazione isotermica come l'amplificazione del cerchio rotolante sono state impiegate con successo per la rilevazione di acidi nucleici, quantità proteiche o altre molecole rilevanti. Questi metodi hanno dimostrato di essere alternative sostanziali alla PCR o all'ELISA per applicazioni cliniche e di ricerca. Inoltre, la rilevazione della quantità proteica (mediante Western blot o immunoistochimica) è spesso insufficiente a fornire informazioni per la diagnosi del cancro, mentre la misurazione dell'attività enzimatica rappresenta un prezioso biomarcatore. La misurazione dell'attività enzimatica consente inoltre la diagnosi e il potenziale trattamento delle malattie trasmesse da agenti patogeni. In tutti gli eucarioti, le topoisomerasi sono gli enzimi chiave che legano il DNA coinvolti nel controllo dello stato topologico del DNA durante importanti processi cellulari e sono tra i biomarcatori importanti per la prognosi e il trattamento del cancro.
Nel corso degli anni, le topoisomerasi sono state sostanzialmente studiate come potenziale bersaglio di farmaci antiparassitari e antitumorali con librerie di composti naturali e sintetici a piccole molecole che vengono studiati ogni anno. Qui viene presentato il metodo di amplificazione del rolling circle, chiamato rolling circle enhanced enzyme activity detection (REEAD) assay che consente la misurazione quantitativa dell'attività della topoisomerasi 1 (TOP1) in modo semplice, veloce e senza gel. Tagliando e legando un substrato di DNA appositamente progettato, TOP1 converte un oligonucleotide del DNA in un cerchio chiuso, che diventa il modello per l'amplificazione del cerchio rotolante, producendo ~ 103 prodotti a cerchio di rotolamento ripetuti in tandem. A seconda dell'incorporazione nucleotidica durante l'amplificazione, esiste la possibilità di diversi metodi di lettura, dalla fluorescenza alla chemiluminescenza alla colorimetria. Poiché ogni legatura di scissione mediata da TOP1 genera un cerchio chiuso del DNA, il test è altamente sensibile e direttamente quantitativo.
Introduction
Le topoisomerasi appartengono alla classe degli enzimi modificanti il DNA e molti di questi si sono dimostrati utili come biomarcatori per le malattie umane 1,2,3,4,5,6. TOP1 è coinvolto nella risoluzione dello stress topologico associato a processi cellulari come la replicazione del DNA, la trascrizione genica, la ricombinazione e la segregazione cromosomica7. TOP1 può risolvere sia le bobine negative che quelle positive mediante un meccanismo che comporta la formazione di una rottura transitoria a singolo filamento nel DNA 8,9. Dopo il legame al DNA, TOP1 posiziona il sito attivo tirosina (Tyr723) per eseguire un attacco nucleofilo sulla spina dorsale del fosfodiestere. Viene quindi generato un complesso di scissione TOP1-DNA con l'enzima collegato covalentemente all'estremità 3' del filamento di DNA rotto. Ciò rilascia lo stress torsionale consentendo all'estremità 5' del filo scisso di ruotare attorno al trefolo intatto. Infine, il gruppo ossidrile dell'estremità 5' esegue un attacco nucleofilo sul legame 3'-fosfotirosil. Di conseguenza, TOP1 viene rilasciato e la spina dorsale del DNA viene ripristinata8.
Sono stati sviluppati diversi saggi per studiare le fasi del ciclo catalitico TOP1, tra cui il saggio di rilassamento10, il saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)11,12, i saggi di clivaggio del DNA13,14 e il saggio del complesso di enzimi in vivo (ICE) 15 . Tuttavia, questi test hanno diverse limitazioni in quanto dipendono dall'elettroforesi su gel, che richiede agenti intercalanti del DNA, o richiedono una formazione e attrezzature altamente specializzate. Inoltre, i saggi richiedono grandi quantità di enzima TOP1 purificato (che vanno da 1 a 5 ng per il test di rilassamento e da 50 a 200 ng per l'EMSA e il test di clivaggio-legatura) o estratti da almeno 106 cellule per funzionare in modo ottimale. Pertanto, è stato sviluppato un metodo altamente sensibile che consente la rilevazione specifica dell'attività TOP1 in campioni biologici grezzi e a livello di singolo evento catalitico, chiamato saggio REEAD,16.
Qui viene presentato un protocollo per il rilevamento dell'attività TOP1 utilizzando il saggio REEAD16 . Una rappresentazione schematica del saggio è illustrata nella Figura 1. Una griglia in silicone progettata su misura è collegata a una diapositiva funzionalizzata per creare una configurazione multipozzetto con vetrino, chiamata wellmaker di seguito (Figura 1A). Questo è seguito dall'accoppiamento di un primer modificato 5'-amminico ai gruppi funzionali NHS nei pozzetti del vetrino (Figura 1B). La scissione mediata da TOP1 e la reazione di legatura convertono uno specifico substrato di DNA in un cerchio chiuso. Il substrato specifico TOP1 (Figura 1C) si piega spontaneamente in una forma a manubrio contenente uno stelo a doppio filamento e due anelli a singolo filamento. Uno dei loop è complementare al primer ancorato alla superficie. La regione dello stelo contiene un sito di scissione TOP1 favorito tre basi a monte dell'estremità 3' e una sporgenza ossidrile 5'. La circolarizzazione del substrato può essere ottenuta utilizzando l'estratto cellulare/tissutale (Figura 1C) o la TOP1 purificata ricombinante (Figura 1D).
Quando il substrato viene scisso da TOP1, l'enzima si lega transitoriamente all'estremità 3' e il frammento a tre basi si diffonde, consentendo alla sporgenza di 5' di ricottura al substrato e facilitando la legatura mediata da TOP1. La legatura provoca la circolarizzazione del substrato e successivamente la dissociazione di TOP1. Il cerchio chiuso è ibridato al primer ancorato alla superficie (Figura 1E) e viene utilizzato come modello per l'amplificazione isotermica del cerchio di rotolamento (RCA) mediata dalla polimerasi phi29, che può eseguire RCA con spostamento del filamento, producendo 103 prodotti di ripetizione in tandem. Durante la fase RCA, possono essere incorporati nucleotidi marcati con fluorescenza (Figura 1F) o accoppiati a biotina (Figura 1G)17. L'incorporazione di nucleotidi marcati con fluorescenza consente il rilevamento degli RCP utilizzando un microscopio a fluorescenza o uno scanner a fluorescenza. In alternativa, un anticorpo anti-biotina accoppiato con perossidasi di rafano (HRP) (Figura 1H) può legare i nucleotidi biotinilati, consentendo così il rilevamento dei prodotti a cerchio laminato (RCP) utilizzando la chemiluminescenza potenziata (ECL) o mediante la conversione di 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) in un colore rilevabile. L'RCA segue una cinetica di reazione lineare, rendendo il saggio REEAD direttamente quantitativo, poiché un RCP rappresenta una singola reazione di clivaggio-legatura mediata da TOP1. Qui è dimostrato che questo test può essere utilizzato per rilevare l'attività TOP1 come enzima ricombinante purificato o estratto da campioni grezzi e come strumento di screening dei farmaci anti-TOP1.
Protocol
NOTA: trovare un elenco di composizioni tampone, attrezzature e altri materiali necessari nella tabella dei materiali.
1. Coltura cellulare
- Coltiva le cellule preferite in un mezzo adatto e coltivale secondo le istruzioni. Ad esempio, coltiva Caco2, cellule derivate dall'adenocarcinoma colorettale, in Minimal Essential Medium (MEM) integrate con il 20% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di aminoacidi non essenziali (NEAA), 100 unità / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. Mantenere le colture cellulari in un incubatore umidificato (5% CO2/95% aria atmosfera a 37 °C). Placcare le cellule in palloni di coltura tissutale e dividerle ogni 3 giorni per mantenere le cellule al 70% di confluenza.
- Prelevare le cellule da un matraccio confluente al 70% mediante trattamento con tripsina (soluzione di tripsina allo 0,25%, soluzione di EDTA allo 0,02%) e lavare con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Risospendere il pellet cellulare in PBS per regolare la concentrazione cellulare a 0,5 × 106 cellule / tubo. Girare a 200 × g per 5 minuti e aspirare con attenzione il surnatante.
NOTA: Le celle utilizzate per REEAD devono essere utilizzate fresche e conservate sul ghiaccio. I risultati ottenuti con le cellule Caco2 sono stati recentemente pubblicati17. Il test è stato testato con una varietà di linee cellulari, tra cui colon, seno, polmone e cellule derivate dal cancro cervicale 18,19,20,21,22,23, ma può essere utilizzato con tutti i campioni biologici grezzi contenenti TOP1, come tessuti, sangue e saliva.
2. Preparazione di vetrini funzionalizzati
- Collegare la griglia isolante in silicone progettata su misura alla guida funzionalizzata, rendendo così il wellmaker. Premere il silicone per evitare la formazione di bolle d'aria (vedere Figura 1A).
- Preparare una miscela di 5 μM 5'-amino primer in 1x tampone di stampa. Aggiungere 4 μL della miscela in ciascun pozzetto e mettere il pozzo in una camera di ibridazione con NaCl saturo a temperature comprese tra 15 °C e 25 °C, al riparo dalla luce.
NOTA: Una camera di ibridazione può essere facilmente realizzata utilizzando una scatola di punta per pipette riempita con NaCl saturo. L'ibridazione richiede un minimo di 16 h e un massimo di 72 h. Vedere la sequenza del primer 5'-amminico nella Figura 1B. I vetrini sono funzionalizzati con gruppi NHS per consentire il legame di oligonucleotidi amino-modificati.
3. Generazione di substrati circolari chiusi
- Preparazione di substrati circolari chiusi con TOP1 ricombinante o estratto cellulare.
- Lisare un pellet cellulare di 0,5 × 106 cellule in 500 μL di tampone di lisi per raggiungere una densità cellulare di 1.000 cellule / μL. Incubare per 10 minuti su ghiaccio.
- Preparare una miscela circolare di 2 μL di substrato specifico per TOP1 da 5 μM (la sequenza del substrato è la seguente: 5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3') e 2 μL di enzima TOP1 ricombinante o 2 μL di estratto cellulare (vedere punto 3.1.1) in 16 μL di 1x tampone di reazione TOP1.
NOTA: La concentrazione di TOP1 ricombinante utilizzata dipende dal metodo di lettura scelto (vedere Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5). Vedere la sequenza del substrato specifico TOP1 nella Figura 1C. - Incubare per 30 minuti a 37 °C (vedi figura 1C,D).
- Interrompere la reazione aggiungendo 2 μL di SDS all'1%.
- Preparazione di substrati circolari chiusi in presenza di farmaci
- Preparare una miscela circolare di 2 μL di 5 μM di substrato TOP1-specifico e 1 μL di 100% DMSO o 1 μL di 1,6 mM di camptotecina (CPT) in 14 μL di 1x tampone di reazione TOP1. Aggiungere 2 μL di 5 ng/μL di enzima TOP1 ricombinante.
NOTA: Possono essere utilizzati altri composti o farmaci a piccole molecole. In tal caso, deve essere effettuata una titolazione del composto. Se il composto è disciolto in un solvente diverso dal DMSO, questo deve essere usato come controllo al posto del DMSO. - Incubare per 1 min a 37 °C.
- Interrompere la reazione aggiungendo 2 μL di SDS all'1%.
- Preparare una miscela circolare di 2 μL di 5 μM di substrato TOP1-specifico e 1 μL di 100% DMSO o 1 μL di 1,6 mM di camptotecina (CPT) in 14 μL di 1x tampone di reazione TOP1. Aggiungere 2 μL di 5 ng/μL di enzima TOP1 ricombinante.
NOTA: il passaggio 3 può essere avviato in parallelo al punto 2 e i cerchi possono essere memorizzati a 4 °C durante la notte. In alternativa, i cerchi di DNA possono essere preparati contemporaneamente al punto 4 e utilizzati immediatamente. Vedere la sequenza del substrato specifico TOP1 nella Figura 1C. Il substrato si piega in una forma a manubrio con una regione a doppio stelo contenente un sito di scissione TOP1 preferito e due anelli a filamento singolo. Il substrato con manubri aperti viene convertito in un substrato circolare chiuso mediante scissione e legatura mediate da TOP1 e viene di seguito denominato cerchio. Poiché c'è un eccesso del primer 5'-ammino, non ci sarà competizione tra substrati TOP1 aperti e chiusi.
4. Blocco del pozzo
- Immergere il pozzo in un vassoio di 5 cm x 5 cm riempito con Buffer 1 preriscaldato a 50 °C. Utilizzando una pipetta, spingere il liquido all'interno dei pozzetti per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria. Incubare per 30 minuti a 50 °C.
- Rimuovere Buffer 1 e lavare 2 x 1 min con dH2O. Agitare energicamente a mano.
- Aggiungere il buffer 2 preriscaldato a 50 °C. Assicurati che non ci siano bolle d'aria nei pozzi. Incubare per 30 minuti a 50 °C.
- Lavare 2 x 1 min con dH2O. Agitare energicamente a mano.
- Lavare con 70% EtOH per 1 min. Agitare vigorosamente a mano.
- Lasciare asciugare la configurazione del pozzo all'aria.
NOTA: Utilizzare aria compressa per asciugare i pozzi. In alternativa, è possibile soffiare aria utilizzando una pipetta Pasteur. Assicurarsi che i pozzetti siano asciutti prima di procedere.
5. Ibridazione dei cerchi al wellmaker
- Aggiungere 4 μL dei cerchi (fatti al punto 3) a ciascun pozzetto corrispondente.
- Posizionare il pozzo in una camera di umidità per 1 ora con dH2O a 37 °C.
NOTA: Una camera di umidità può essere realizzata utilizzando una scatola per punte di pipette riempita con dH2O. In alternativa, l'ibridazione può essere eseguita durante la notte a 25 °C nella camera di umidità.
6. Lavaggio
- Lavare il wellmaker con Buffer 3.
- Rimuovere il buffer 3 e sostituirlo con il buffer 4.
- Rimuovere Buffer 4 e lavare con 70% EtOH.
- Rimuovere l'EtOH e lasciare asciugare il wellmaker.
NOTA: Tutte le fasi di lavaggio vengono eseguite per 1 minuto in un vassoio da 5 cm x 5 cm immergendo completamente il vetrino. Assicurati sempre che non ci siano bolle d'aria all'interno dei pozzi.
7. Amplificazione del cerchio di rotolamento
- Preparare una miscela RCA di 1x tampone di reazione Phi29 integrato con 0,2 μg/μL BSA, 1 unità di Phi29 polimerasi e 0,25 mM dNTP e 0,0125 mM ATTO-488-dUTP per la lettura della fluorescenza, o 0,1 mM dATP, 0,1 mM DTTP, 0,1 mM dGTP, 0,09 mM dCTP e 0,01 mM Biotina-dCTP per la lettura colorimetrica/chemiluminescenza. Aggiungere 4 μL a ciascun pozzetto. Vedere la Figura 1E.
NOTA: La preparazione della miscela RCA deve essere effettuata su ghiaccio. Quando si incorporano nucleotidi fluorescenti nell'RCA, evitare la luce diretta da questo passaggio per proteggere i fluorofori. - Incubare per 2 ore a 37 °C nella camera di umidità. In caso di nucleotidi fluorescenti utilizzati, impostare la camera di umidità al buio. Vedi figura 1F,G.
8. Lavaggio
- Per i protocolli di lettura chemiluminescenziale o colorimetrica, lavare il wellmaker come nel passaggio 6, quindi procedere al passaggio 11.
- Per il protocollo di lettura della fluorescenza, rimuovere la griglia in silicone usando una pinzetta prima del lavaggio come nei seguenti passaggi.
- Lavare la diapositiva per 10 minuti nel buffer 3.
- Rimuovere il buffer 3 e sostituirlo con il buffer 4. Lavare per 5 min.
- Rimuovere Buffer 4 e lavare per 1 minuto in 70% EtOH.
- Rimuovere l'EtOH e lasciare asciugare il wellmaker.
9. Visualizzazione di prodotti fluorescenti a cerchio di laminazione mediante scanner a fluorescenza
- Scansionare il vetrino in uno scanner a fluorescenza utilizzando i filtri corrispondenti al fluoroforo utilizzato. Utilizzare il massimo fotomoltiplicatore possibile che non dia saturazione.
NOTA: Lo scanner fluorescente utilizzato per l'acquisizione delle immagini in questo protocollo è dotato di un laser a 473 nm e di un filtro FAM ad eccitazione 490 nm, emissione 520 nm. - Importare l'immagine in ImageJ e modificare il tipo di immagine a 8 bit (Image | Tipo | 8 bit). Per misurare le bande separatamente, limitare l'area misurata utilizzando lo strumento di disegno rettangolo dalla barra degli strumenti. Disegna l'area desiderata e misura l'intensità (Analizza | Misura). Quindi, spostate l'area originariamente disegnata sulla banda successiva e misurate.
- Tracciare i dati nel software desiderato. Le immagini rappresentative, inclusa la quantificazione estratta da ImageJ, sono rappresentate nella Figura 2.
10. Visualizzazione di prodotti fluorescenti a cerchio mobile mediante microscopio a fluorescenza
- Con una penna resistente all'EtOH, disegnare la posizione dei pozzetti prima di rimuovere la griglia in silicone e lavare il vetrino come al punto 8.2. Dopo le fasi di lavaggio, montare il vetrino con 1 μL di mezzo di montaggio senza 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e aggiungere un vetro di copertura. Per consentire la visualizzazione nella fotocamera, incollare il vetrino su un vetrino da microscopio da 76 mm x 26 mm.
- Analizza utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di un obiettivo ad immersione in olio 60x e di una fotocamera. Prendi 12-15 immagini di ogni campione / pozzo.
- Importare le immagini in ImageJ e impilarle (Image | Pile | Immagine da impilare). Modificare il tipo di immagine a 8 bit (Immagine | Tipo | 8 bit).
- Impostare la soglia (Immagine | Regola | Soglia).
- Imposta la soglia come segue: imposta la barra inferiore e regola la barra superiore in modo che solo i segnali giusti siano rossi e lo sfondo sia nero. Assicurati che la soglia sia il più bassa possibile prima che i segnali reali inizino a scomparire.
- Scorri le singole immagini e assicurati che corrispondano alle immagini prima di impostare la soglia. Si noti che la soglia può cambiare da esperimento a esperimento.
- Contare i segnali (Analizza | Analizzare le particelle). Assicurarsi che il campo riepilogato nelle impostazioni di ImageJ sia selezionato.
- Esporta i risultati in un foglio di calcolo o in un altro software per un'ulteriore elaborazione dei dati. Le immagini rappresentative, inclusa la quantificazione estratta da ImageJ, sono rappresentate nella Figura 3.
11. Accoppiamento dell'anticorpo anti-biotina coniugato HRP ai prodotti a cerchio rotolante marcati con biotina
- Aggiungere 4 μL di anticorpo anti-biotina coniugato HRP diluito 1:300 in Buffer 5 integrato con il 5% di latte scremato non grasso e il 5% di BSA a ciascun pozzetto.
- Incubare per 50 minuti a 15-25 °C nella camera di umidità (vedi figura 1H).
- Lavare 3 x 3 minuti con Buffer 5.
- Asciugare il pozzo.
12. Visualizzazione dei prodotti a cerchio di rotolamento marcati con biotina
- Visualizzazione con ECL
- Mescolare 40 μL di ECL Luminol e 40 μL di H 2 O2immediatamente prima dell'uso. Aggiungere 2 μL a ciascun pozzetto.
- Visualizza il vetrino utilizzando una telecamera CCD o su pellicole a raggi X.
- Visualizzazione con TMB
- Dopo il passaggio 11.4, rimuovere la griglia in silicone. Quindi, aggiungere 400 μL di TMB sopra l'intero vetrino e mettere il vetrino in una camera di umidità. Attendere ~ 5-10 minuti per lo sviluppo del colore. Dopo lo sviluppo del colore, lavare il vetrino con il 70% di EtOH.
- Visualizza lo sviluppo del colore ad occhio nudo. Scatta una fotografia della diapositiva con una macchina fotografica o un telefono cellulare.
- Importare l'immagine in ImageJ e modificare il tipo di immagine a 8 bit (Image | Tipo | 8 bit). Per misurare le bande separatamente, limitare l'area misurata utilizzando lo strumento di disegno rettangolo dalla barra degli strumenti. Disegna l'area desiderata e misura l'intensità (Analizza | Misura). Quindi, spostate l'area originariamente disegnata sulla banda successiva e misurate.
- Tracciare i dati nel software desiderato. Le immagini rappresentative, inclusa la quantificazione estratta da ImageJ, sono rappresentate nelle Figure 4, 5 e 6.
Representative Results
Qui, viene presentato un protocollo per il rilevamento dell'attività TOP1 utilizzando il test REEAD16. Il protocollo è stato utilizzato per rilevare l'attività TOP1 ricombinante utilizzando quattro diversi metodi di lettura: scanner a fluorescenza, microscopio a fluorescenza, chemiluminescenza e colorimetrico. Il protocollo è stato utilizzato anche per rilevare l'attività di TOP1 estratto da cellule Caco2, come esempio di estratto grezzo, con chemiluminescenza o lettura TMB. Inoltre, il protocollo è stato utilizzato come strumento di screening farmacologico, per rilevare l'inibizione dell'attività TOP1 ricombinante da parte di CPT, come esempio di un inibitore TOP1-specifico, utilizzando il metodo di lettura della chemiluminescenza.
I risultati ottenuti analizzando l'attività TOP1 utilizzando la lettura della fluorescenza sono illustrati in Figura 2 e Figura 3. Una scansione rappresentativa del vetrino fluorescente e la quantificazione risultante sono mostrate nella Figura 2. Come evidente dalla quantificazione, questa lettura ha un limite di rilevamento di 12,5 ng di TOP1. Le immagini rappresentative e la quantificazione risultante ottenuta utilizzando la lettura del microscopio fluorescente sono mostrate nella figura 3. Utilizzando questo metodo di lettura, il limite di rilevamento è di appena 0,1 ng di TOP1. I risultati ottenuti analizzando l'attività TOP1 utilizzando la lettura della chemiluminescenza sono illustrati nella Figura 4 e i risultati della lettura colorimetrica sono rappresentati nella Figura 5. Il limite di rilevazione di questi metodi di lettura è a 6 ng di TOP1 o come TOP1 estratto da 312 celle Caco2. La Figura 6 mostra le misurazioni dell'attività TOP1 in presenza di 80 μM CPT o DMSO come esempio di applicazione dello screening farmacologico. L'immagine rappresentativa e la conseguente quantificazione di tre esperimenti indipendenti mostrano che il CPT inibisce la circolarizzazione mediata da TOP1 del substrato come previsto24,25.
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo REEAD. (A,B) Preparazione delle diapositive funzionalizzate. La griglia in silicone è attaccata alla diapositiva funzionalizzata. Quindi, il primer 5'-amminico viene accoppiato al vetrino, consentendo così l'amplificazione del substrato specifico TOP1. (C,D) Generazione di substrati circolari chiusi. Il substrato specifico TOP1 si piega in una forma a manubrio con un sito di scissione TOP1 preferito nello stelo a doppio filamento e una sequenza di legame del primer in uno dei due anelli a filamento singolo. (C) TOP1 viene rilasciato dopo lisi delle cellule. Dopo la scissione e la legatura mediate da TOP1, il substrato viene convertito in un cerchio chiuso; (D) viene utilizzata TOP1 purificata e ricombinante. (E) Amplificazione del cerchio rotante. I substrati circolari chiusi sono ibridati al primer ancorato alla superficie e amplificati da RCA utilizzando la polimerasi Phi29. L'RCA può essere ottenuta incorporando nucleotidi fluorescenti come in F o nucleotidi biotinilati come in G. I prodotti fluorescenti a cerchio di laminazione vengono visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza o uno scanner a fluorescenza. (H) Accoppiamento dell'anticorpo anti-biotina coniugato HRP. I prodotti a cerchio di rotolamento biotinilato sono incubati con l'anticorpo anti-biotina coniugato HRP. Lo sviluppo del segnale è mediato dall'enzima HRP e i segnali vengono visualizzati da ECL e rilevati utilizzando una telecamera CCD o utilizzando TMB generando una visualizzazione colorimetrica. Abbreviazioni: REEAD = rolling circle enhanced enzyme activity detection; RCA = amplificazione del cerchio rotante; TOP1 = topoisomerasi 1; HRP = rafano perossidasi; ECL = chemiluminescenza potenziata; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Misurazioni dell'attività TOP1 utilizzando lo scanner a fluorescenza. Il pannello di sinistra mostra un'immagine rappresentativa della diapositiva quando si analizza l'attività di 3-50 ng di TOP1 utilizzando il protocollo di lettura dello scanner a fluorescenza. Il pannello di destra mostra la quantificazione risultante. t-test con correzione di Welch, p = 0.0064, n = 4. Abbreviazione: TOP1 = topoisomerasi 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Misurazioni dell'attività TOP1 utilizzando il microscopio a fluorescenza. Il pannello di sinistra mostra immagini rappresentative del vetrino quando si analizza l'attività di 0,1-12,5 ng di TOP1 utilizzando il protocollo di lettura del microscopio a fluorescenza. Si noti che le immagini sono versioni ritagliate per mostrare correttamente i punti. Per questo motivo, non assomigliano al numero dei segnali nella quantificazione mostrati nel pannello di destra. t-test con correzione di Welch, p = 0.0136, n = 3. Abbreviazione: TOP1 = topoisomerasi 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Misurazioni dell'attività TOP1 utilizzando la lettura della chemiluminescenza. (A) Il pannello di sinistra mostra un'immagine rappresentativa della diapositiva quando si analizza l'attività di 3-50 ng di TOP1 utilizzando il protocollo di lettura della chemiluminescenza. Il pannello di destra mostra la quantificazione risultante. t-test con correzione di Welch, p < 0,0001, n = 4. (B) Il pannello di sinistra mostra un'immagine rappresentativa della diapositiva quando si analizza l'attività di TOP1 estratta da 156-40.000 celle Caco2 utilizzando il protocollo di lettura della chemiluminescenza. Il pannello di destra mostra la quantificazione risultante. t-test con correzione di Welch, p = 0,0224, n = 3. Abbreviazioni: TOP1 = topoisomerasi 1. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Misurazioni dell'attività TOP1 utilizzando la lettura colorimetrica. (A) Il pannello di sinistra mostra un'immagine rappresentativa della diapositiva quando si analizzano 3-50 ng di TOP1 utilizzando il protocollo di lettura colorimetrica. Il pannello di destra mostra la quantificazione risultante. t-test con correzione di Welch, p = 0.0012, n = 4. (B) Il pannello di sinistra mostra un'immagine rappresentativa della diapositiva quando si analizza l'attività di TOP1 estratta da 156-40.000 celle Caco2 utilizzando il protocollo di lettura colorimetrica. Il pannello di destra mostra la quantificazione risultante. t-test con correzione di Welch, p = 0.0117, n = 3. Abbreviazioni: TOP1 = topoisomerasi 1; TMB = 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Misurazioni dell'attività TOP1 dopo il trattamento farmacologico utilizzando i protocolli di lettura della chemiluminescenza. Il pannello di sinistra mostra un'immagine rappresentativa del vetrino quando si analizzano 10 ng di TOP1 in presenza di DMSO al 5% o CPT a 80 μM per 1 minuto. Il pannello di destra mostra la quantificazione risultante. t-test con correzione di Welch, p = 0.0017, n = 3. Abbreviazioni: TOP1 = topoisomerasi 1; CPT = camptotecina; DMSO = dimetilsolfossido; Neg = controllo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Discussion
Le topoisomerasi rappresentano una classe di enzimi modificanti il DNA che attirano un elevato interesse per la ricerca e la clinica, essendo il bersaglio di composti a piccole molecole con potenziale effetto nel trattamento antitumorale o nella lotta contro le malattie infettive. Inoltre, l'attività della TOP1 umana ha dimostrato di essere un efficace biomarcatore della prognosi e del trattamento del cancro18,19,23. Sebbene sia l'attività TOP1 che influenza l'efficacia di un inibitore chemioterapico26, è spesso la quantità di DNA-RNA o la quantità di TOP1 che viene valutata in ambito clinico. Ciò è dovuto alla mancanza di strumenti gratuiti, veloci, facili e basati su gel in grado di fornire una quantificazione accurata e precisa dell'attività della topoisomerasi in ogni ambiente di laboratorio.
Qui viene descritto un protocollo per il test REEAD che consente la misurazione dell'attività TOP1 in modo gel-free. In questo protocollo, TOP1 purificato o estratto grezzo dalle cellule viene incubato con un substrato a forma di manubrio di DNA appositamente progettato che, dopo scissione / legatura mediata da TOP1 viene convertito in una molecola circolare chiusa. I cerchi vengono quindi ibridati su una superficie di vetro e amplificati da RCA. Per consentire facilità d'uso nell'esecuzione delle reazioni che si verificano sul vetrino, una griglia di silicone è attaccata al vetro, creando singoli pozzetti dove avvengono le reazioni. In questo modo, il protocollo sfrutta un sistema multipozzetto - una griglia in silicone - chiamato wellmaker.
Il protocollo è stato utilizzato per rilevare l'attività di TOP1 e TOP1 ricombinanti estratti dalle cellule di adenocarcinoma colorettale Caco2, utilizzate come esempio. Inoltre, come esempio di REEAD da utilizzare come strumento di screening dei farmaci, il protocollo è stato utilizzato per rilevare l'inibizione dell'attività TOP1 da parte del noto inibitore TOP1 CPT24,25. Il test è stato accoppiato con diversi metodi di lettura: microscopia a fluorescenza, che fornisce un'alta sensibilità, e uno scanner a fluorescenza, chemiluminescenza o colorimetrico, che richiedono attrezzature e formazione meno specializzate. La lettura del microscopio a fluorescenza altamente sensibile ha i limiti della necessità di un'impostazione del microscopio a fluorescenza di buona qualità, personale qualificato e acquisizione e analisi delle immagini che richiedono molto tempo.
Per questi motivi, viene presentata la lettura dello scanner a fluorescenza che consente un'acquisizione e un'analisi più rapide anche se a scapito della sensibilità. In caso di mancanza di uno scanner a fluorescenza, si possono prendere in considerazione due ottime alternative, chemiluminescenza e metodi di lettura colorimetrica. Entrambi i metodi sono veloci e semplici, non richiedono attrezzature costose o formazione specializzata. In tutti i formati di lettura, REEAD presenta molti vantaggi rispetto ai saggi all'avanguardia, che richiedono più tempo, a base di gel (con i requisiti di agenti intercalanti) e meno direttamente quantitativi. Tuttavia, ci sono alcuni passaggi critici nel protocollo presentato. Durante la gestione dello screening del farmaco, i punti temporali, la concentrazione del farmaco e il rapporto tra quantità TOP1 / substrato di DNA devono essere ottimizzati rispetto alle impostazioni descritte ottimizzate per CPT. Il farmaco può essere studiato eseguendo una preincubazione con il substrato del DNA o una preincubazione con l'enzima TOP1. Questo può fornire informazioni preziose sulla capacità della molecola di inibire TOP1 e offrire informazioni sul meccanismo d'azione del farmaco.
Inoltre, se si verificano segnali bassi o assenti, ciò è molto probabilmente dovuto a una lisi inefficiente del campione grezzo o a una degradazione di TOP1 nell'estratto a causa di un uso improprio di inibitori della proteasi. Inoltre, ciò può anche essere dovuto allo stoccaggio inadeguato degli importanti componenti del test, come TOP1 ricombinante, polimerasi phi29, nucleotidi, substrato e primer. Infine, devono essere evitati ripetuti cicli di congelamento-disgelo degli oligonucleotidi, poiché ciò influisce notevolmente sulle prestazioni del test. Quando viene utilizzato l'estratto grezzo, l'efficienza di estrazione del campione biologico specifico deve essere ottimizzata e la quantità e l'attività di TOP1 possono variare dall'esempio riportato qui. Per questo motivo, ogni estratto grezzo da testare richiederà una titolazione per l'identificazione del limite di rilevazione del saggio e dell'intervallo di sensibilità quando si utilizza quel particolare campione. Il protocollo è stato ottimizzato per il rilevamento di TOP1 umano. L'attività di altre TOP1 eucariotiche può essere misurata, ma la concentrazione di NaCl e il tempo di incubazione potrebbero dover essere ottimizzati in base al metodo di purificazione enzimatica e all'attività enzimatica ottimale. Più substrati circolarizzati risulteranno da un'incubazione prolungata, mentre meno substrati circolarizzati risulteranno da un'incubazione accorciata.
Oltre alle applicazioni presentate, REEAD consente la misurazione dell'attività TOP1 in estratti grezzi da piccole biopsie di pazienti oncologici18, la previsione dell'effetto antitumorale citotossico della CPT nelle linee cellulari tumorali 20,21,22 e persino la rilevazione dell'attività enzimatica in singole cellule20,21 . Inoltre, l'impostazione REEAD presentata utilizzando il wellmaker consente lo screening multi-based di librerie di composti sintetici o naturali. Oltre a questo, è stata sviluppata una versione modificata del test REEAD, chiamata REEAD C / L. Questa configurazione consente indagini separate delle fasi di scissione e legatura della reazione TOP127. Con il REEAD C/L è possibile determinare il meccanismo d'azione degli inibitori di piccole molecole e caratterizzarli come inibitori catalitici TOP1 con potenziali effetti antiparassitari28 o come veleni TOP1 da utilizzare per il trattamento antitumorale24,25. Infine, con una specifica riprogettazione dei substrati del DNA per soddisfare i diversi requisiti (per il legame del DNA o la legatura del clivaggio) di altri enzimi TOP1, REEAD è stato utilizzato anche per la rilevazione di malattie infettive (come nel caso del Plasmodium falciparum, che causa la malaria29), o Leishmania donovani e Monkeypox virus (dati non mostrati). Oppure, può essere utilizzato per identificare composti di piccole molecole con effetti antipatogeni. Il protocollo presentato fornisce agli scienziati nel campo TOP1 un metodo semplice per rilevare l'attività enzimatica con poca o nessuna ottimizzazione e con la possibilità di essere adattato ad applicazioni ancora più ampie in futuro.
Disclosures
Gli autori C.T. e K.M. sono dipendenti di VPCIR biosciences ApS. C.T., B.R.K. e M.S. sono azionisti e/o titolari di opzioni su azioni. C.T., B.R.K. e M.S. dichiarano di essere nominati inventori del brevetto EP2022/057172 depositato a nome di VPCIR biosciences ApS. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il tecnico di laboratorio Noriko Y. Hansen, Dipartimento di Biologia Molecolare e Genetica, Università di Aarhus, per l'assistenza tecnica in relazione alle purificazioni enzimatiche Phi29 e TOP1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Camera for fluorescence image analysis | |||
| CCD camera | For chemiluninescence image analysis | ||
| Fluorescence microscope | Olympus | Equipped with 60x oil immersion objective and a GFP filter ( https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/) | |
| Fluorescence scanner | Typhoon | FLA 9500 | Equipped with 473 laser and FAM filter |
| Humidity chamber with dH2O | |||
| Hybridization chamber with saturated NaCl | |||
| ImageJ software | Fiji | Download at: https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Materials | |||
| Cell culture | |||
| Cell growth medium appropiate for the chosen cell line | |||
| Trypsin | Sigma | #T4174 | |
| Pen strep | Sigma | #P4300 | |
| Tissue culture flasks | ThermoFisher | #178983 | |
| FBS | Gibco | #10270106 | |
| NEEA | Sigma | #M7145 | |
| PBS | ThermoFisher | #10010023 | |
| Functionalized slides | |||
| 5'-amine anti-TOP1 primer | Sigma | 5’-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3’ | |
| Activated Codelink HD slides | SurModics | #DHD1-0023 | |
| Silicon grid | Grace-biolabs | Custom made | |
| Pertex glue | Histolabs | #00801 | |
| Microscope slide 76 x 26 mm | Hounisen | #2510 1201BL | Other microscope slide of same dimension can be used |
| DNA circles and rolling circle amplification | |||
| TOP1 specific substrate | Sigma | 5’-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3’ | |
| ATTO-488-dUTP | Jena Biosciences | #95387 | |
| Biotin-dCTP | Jena Biosciences | #NU-809-BIO16L | |
| dNTP | ThermoFisher | #R0181 | |
| Phi29 polymerase | VPCIR Biosciences | #10010041 | |
| Recombinant TOP1 | VPCIR Biosciences | #10010001 | |
| Detection of rolling circle products | |||
| BioFX TMB | SurModics | #ESPM-0100-01 | |
| Cover glass | |||
| ECL mixture | Cytiva | #RPN2236 | |
| HRP conjugated anti-biotin antibody | Merck | #A4541 | |
| Mounting medium (vectachield) | Vector laboratories | #H-1000 | |
| Buffer list | |||
| 1x PE Buffer | 1 mM EDTA, 8.12 mM Na2HPO4·2H2O, 1.88 mM NaH2PO4·H2O | ||
| 6x Print Buffer | 300 mM Na3PO4, pH 8.5 | ||
| Blocking solution | Buffer 5 supplemented with 5% non-fat milk and 5% BSA pH 9 | ||
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA + protease inhibitors | ||
| 10x TOP1 Reaction Buffer | 50 mM CaCl2, 50 mM MgCl2, 100 mM Tris-HCl pH 7.5 | ||
| 10x Phi29 Reaction Buffer | 330 mM Tris-acetate pH 7.5, 100 mM Mg-acetate, 660 mM K-acetate, 1% Tween20, 200 mM DTT | ||
| Buffer 1 | 50 mM Tris, 50 mM Tris-HCl, 32 mM ethanolamine. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 2 | 4x SSC, 0.1% SDS. NB: stored at 50 °C. | ||
| Buffer 3 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.3% SDS | ||
| Buffer 4 | 100 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Buffer 5 | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20 | ||
| Chemicals for buffers | |||
| Tris | Sigma | #T1506 | |
| HCl | Sigma | #1.00317.2011 | |
| EDTA | Sigma | #1.08418.1000 | |
| PMSF | Sigma | #05056489001 | |
| SDS | Applichem | #436143 | |
| Na2HPO4 | Sigma | #1.06580.1000 | |
| NaH2PO4 | Sigma | #1.06346.1000 | |
| Ethanolamine | Sigma | #411000 | |
| SSC | Invitrogen | #15557-036 | |
| Tris-acetate | Sigma | #T1258 | |
| Mg-acetate | Sigma | #M0631 | |
| K-acetate | Sigma | #1.04820.1000 | |
| Tween20 | Sigma | #8.22184.0500 | |
| DTT | Sigma | #D0632 | |
| CaCl2 | Sigma | #1.02382.1000 | |
| MgCl2 | Sigma | #M2670 | |
| NaCl | Sigma | #1.06404.5000 | |
| Skimmed milk powder | Sigma | #70166 | |
| BSA | Sigma | #A4503 |
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