Summary
Aquí se presenta un protocolo para la inducción y análisis de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) in vitro . La cuantificación del ADN, la catelicidina (LL37) y la actividad enzimática arrojó datos que muestran la variabilidad en la composición y morfología de los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos en condiciones controladas similares.
Abstract
Los neutrófilos funcionan como la primera línea de defensa celular en una respuesta inmune innata mediante el empleo de diversos mecanismos, como la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE). Este estudio analiza los cambios morfológicos y de composición en los NET inducidos por estímulos microbianos y químicos utilizando metodologías estandarizadas in vitro para la inducción y caracterización de NET con células humanas. Los procedimientos descritos aquí permiten el análisis de la morfología NET (lítica o no lítica) y la composición (estructuras ADN-proteína y actividad enzimática), y el efecto de los factores solubles o el contacto celular sobre dichas características. Además, las técnicas descritas aquí podrían modificarse para evaluar el efecto de los factores solubles exógenos o el contacto celular en la composición de NET.
Las técnicas aplicadas incluyen la purificación de células polimorfonucleares de sangre periférica humana utilizando un gradiente de doble densidad (1.079-1.098 g/mL), garantizando una pureza y viabilidad óptimas (≥ 95%) como lo demuestra la tinción de Wright, la exclusión de azul de tripano y la citometría de flujo, incluido el análisis FSC versus SSC y la tinción 7AAD. La formación de NET se induce con estímulos microbianos (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Candida albicans) y químicos (acetato de forbol miristato, HOCl), y los NET se caracterizan por tinción de ADN-DAPI, inmunotinción para el péptido antimicrobiano catelicidina (LL37) y cuantificación de la actividad enzimática (elastasa de neutrófilos, catepsina G y mieloperoxidasa). Las imágenes se adquieren a través de microscopía de fluorescencia y se analizan con ImageJ.
Introduction
Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en el torrente sanguíneo, desempeñando un papel esencial durante la eliminación de agentes patógenos por varios mecanismos, incluyendo la liberación de grandes estructuras de cromatina compuestas de ADN y varias proteínas antibacterianas nucleares, citoplasmáticas y granulares 1,2. El antecedente directo que describe este papel antimicrobiano de los neutrófilos fue elaborado por Takei et al.3 en 1996. Estos autores relataron una nueva forma de muerte diferente de la apoptosis y necroptosis en neutrófilos, mostraron cambios morfológicos que exhibieron ruptura nuclear, seguido de derrame del nucleoplasma hacia el citoplasma, y un aumento en la permeabilidad de la membrana a partir de 3 h de incubación con acetato de forbol miristato (PMA)2,3. Sin embargo, no fue hasta 2004 que se utilizó el término "trampas extracelulares de neutrófilos (TNE)"4.
Se ha observado la formación de NET en diversas afecciones, como infecciones bacterianas, fúngicas5,virales 6 y parasitarias, para neutralizar, matar y prevenir la diseminación microbiana7. Otros estudios muestran que también puede ocurrir en condiciones no patógenas por estímulos estériles, como citoquinas, ácido úrico monosódico o cristales de colesterol, autoanticuerpos, complejos inmunes y plaquetas activadas7. El lipopolisacárido (LPS), la interleucina-8 (IL-8) y el PMA estuvieron entre los primeros estímulos in vitro descritos como inductores de NET, y la participación in vivo de NET en procesos patogénicos se demostró en dos modelos de inflamación aguda: disentería experimental y apendicitis humana espontánea4. El ADN es un componente NET esencial. Su estructura y composición apropiadas son necesarias para el secuestro y la muerte de microorganismos mediante la entrega de una alta concentración local de moléculas antimicrobianas hacia los microbios capturados, como lo demuestra un breve tratamiento con desoxirribonucleasa (DNasa) que desintegra los NET y sus propiedades microbicidas4. Además del ADN, los NET comprenden proteínas unidas como histonas, elastasa de neutrófilos (NE), catepsina G (CG), proteinasa 3, lactoferrina, gelatinasa, mieloperoxidasa (MPO) y péptidos antimicrobianos (AMP) como el péptido proinflamatorio catiónico catelicidina LL-37 entre otros 8,9. Tales agregados pueden formar hilos más grandes con diámetros de hasta 50 nm. Estos factores pueden alterar los factores de virulencia microbiana o la integridad de la membrana celular patógena; además, los AMPs pueden estabilizar el ADN derivado de NET contra la degradación por nucleasas bacterianas10.
Los mecanismos específicos que regulan la formación de NET aún no se han aclarado completamente. La vía mejor caracterizada que conduce a la liberación de NET es a través de la señalización ERK, que conduce a la activación de la NADPH oxidasa y a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como al aumento del calcio intracelular que desencadena la activación de la vía MPO. Esto a su vez transforma el peróxido de hidrógeno en ácido hipocloroso, activando NE por oxidación11,12. NE es responsable de degradar los filamentos de actina del citoesqueleto para bloquear la fagocitosis y translocarlos al núcleo para su procesamiento por escisión proteolítica y desaminación por PAD4 que impulsan la desensibilización de las fibras de cromatina, que se asocian con proteínas granulares y citoplasmáticas, y luego se liberan extracelularmente7. Estas proteasas incluyen las liberadas por el complejo azurosómico de los gránulos azurófilos y otras proteasas como la catepsina G13.
Dependiendo de los cambios morfológicos en los neutrófilos, los TNE se clasifican en dos tipos: formación de NET suicida o lítica que conduce a la muerte celular4, y formación de NET vital o no lítica producida por células viables mediadas por una liberación vesicular de ADN nuclear o mitocondrial, con un remanente de un citoplasto anucleado con capacidad fagocítica14,15. Generalmente, los NET compuestos de ADN mitocondrial presentan una morfología de fibra alargada14, mientras que los estructurados de ADN nuclear tienen una apariencia de nube3. Sin embargo, no se sabe cómo el neutrófilo elige su origen de ADN. Contrariamente a estudios previos que describieron las vías canónicas de los NET como que requieren varias horas, la vía vital se activa rápidamente en solo 5-60 min15.
A pesar de estos avances, la composición NET varía dependiendo del estímulo; por ejemplo, diferentes cepas mucoides y no mucoides de P. aeruginosa inducen la formación de NET que contienen 33 proteínas comunes y hasta 50 proteínas variables7. Así, es necesario homogeneizar técnicas que permitan la generación de conclusiones objetivas en los grupos de investigación. Este artículo describe un protocolo con diversas técnicas que permiten comparar y evaluar la composición, estructura y morfología de los TNE inducidos con diferentes microorganismos: Staphylococcus aureus (bacteria grampositiva), Pseudomonas aeruginosa (bacteria gramnegativa) y Candida albicans (hongo), así como estímulos químicos (PMA, HOCl) en neutrófilos humanos de individuos sanos. Los resultados representativos demuestran la heterogeneidad de los TNE dependiendo de su estímulo inductor en condiciones in vitro comparables, caracterizadas por tinción de ADN-DAPI, inmunotinción para LL37 y cuantificación de la actividad enzimática (NE, CG y MPO).
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Protocol
Las muestras de sangre se obtuvieron como donaciones de participantes clínicamente sanos después del consentimiento informado. Todos los experimentos se realizaron con el permiso del Comité de Ética en Investigación Humana de la Facultad de Ciencias Bioquímicas de la Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca.
NOTA: Los criterios de inclusión en el estudio fueron sexo y edad indistintos, y clínicamente sanos de acuerdo con las respuestas de los participantes a un cuestionario antes de tomar una muestra de sangre. Se realizó un análisis hematológico para determinar el recuento celular y descartar infecciones o anemia, así como la prueba de proteína C reactiva para descartar inflamación en el donante.
1. Extracción de sangre periférica y obtención del paquete de eritrocitos y leucocitos
- Recolectar 10 mL de sangre periférica por venopunción en tubos con 1.8 mg/mL de K2· EDTA como anticoagulante (ver Tabla de materiales) de individuos clínicamente sanos después de obtener el consentimiento informado. Luego, realice una biometría sanguínea estándar y una prueba de proteína C reactiva para descartar infección o inflamación, asegurando la calidad de la muestra.
- Centrifugar la muestra de sangre periférica a 82 x g durante 15 min para eliminar el plasma rico en plaquetas, seguido de una segunda centrifugación a 630 x g durante 5 min. Deseche el plasma restante para obtener el paquete de eritrocitos y leucocitos.
- Diluirlo en una proporción de 1:1 (v/v) con 1x solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
2. Purificación polimorfonuclear de neutrófilos (PMN) utilizando un gradiente de doble densidad
NOTA: Realice la purificación de neutrófilos inmediatamente después de que se recolecte la sangre, ya que tienen una vida útil in vitro limitada de aproximadamente 8 h.
- Deposite lo siguiente en un tubo de vidrio estéril de 10 ml (consulte la Tabla de materiales) en orden: 1 ml de solución de densidad de 1.098 g/ml, 1 ml de solución de densidad de 1.079 g/ml (consulte la tabla de materiales) y luego 4 ml del paquete diluido de eritrocitos y leucocitos. Verter sobre las paredes sin romper la tensión superficial entre las capas para evitar que se mezclen.
- Centrifugar a 320 x g durante 20 min a 4 °C, evitando la aceleración/desaceleración para que las altas fuerzas de la centrífuga no perturben el gradiente.
- Aspirar la fase que corresponde a los granulocitos (Figura 1A) mediante pipeteo, y transferir a otro tubo de vidrio estéril de 10 mL. Lavar con 4 mL de 1x DPBS a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y trate las células con shock osmótico para eliminar los eritrocitos restantes. Añadir 4 ml de solución salina al 0,2% durante 2 min a 4 °C, y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. A continuación, añadir 4 ml de solución isotónica (solución salina al 0,65%) durante 5 min a 4 °C para restaurar la integridad de la membrana, y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
NOTA: La solución salina al 0,2% es un medio hipotónico, con una concentración de soluto más baja en relación con la del medio intracelular RBC. El contacto con el medio hipotónico permite que el agua se difunda en el RBC, lo que lleva a su hinchazón y hemólisis. Esta eliminación de glóbulos rojos del sobrenadante fue confirmada por observación microscópica. - Retire el sobrenadante. Resuspender las células en 4 ml de 1x DPBS para eliminar los restos celulares, y luego centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Finalmente, resuspenda el pellet celular en 2 ml de tampón de solución salina balanceada de Hank (HBSS) frío.
3. Morfología y viabilidad de neutrófilos (Figura 1B)
- Prueba de exclusión de azul de tripano
- Diluir 5 μL de la suspensión celular en 20 μL de azul de tripano al 0,4% (relación 1:5). Contar las células en una cámara Neubauer y determinar la viabilidad celular mediante una prueba de exclusión. Considere viables las células que mantienen la integridad de su membrana sin permeabilizar el tinte.
- Monte 5 μL de la suspensión celular en un portaobjetos; seco y manchado con la tinción de Wright durante 15 s. Fijar inmediatamente la muestra con tampón fosfato pH 6,4 durante 30 s. Lavar con suficiente agua destilada y observar la morfología bajo un microscopio óptico (100x).
- 7Tinción AAD y análisis de citometría de flujo
- Añadir 1 x 105 células a los tubos de citometría de flujo y teñir con 1 μL de 7AAD en 100 μL de tampón FACS (1x DPBS, 0,1% de azida sódica y 10% de plasma autólogo descomplementado) durante 15 min a 4 °C en la oscuridad.
- Lavar con 500 μL de tampón FACS a 300 x g durante 10 min. Fijar las células con 500 μL de paraformaldehído al 2%, y almacenar a 4 °C hasta su análisis en el citómetro de flujo.
- Para un control de células muertas, fijar 1 x 105 células con 200 μL de paraformaldehído al 4% durante 30 min, y lavar con 500 μL de 1x PBS a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y deséchelo. A continuación, añadir 200 μL de Triton X-100 al 0,1% durante 1 h a 4 °C. Lavar con 500 μL de 1x PBS y teñir con 7AAD como en el paso 3.2.1.
- Usando un citómetro de flujo (ver Tabla de materiales), realice análisis FSC versus SSC para analizar la pureza celular y SSC versus tinción 7AAD para analizar la viabilidad celular. Leer 3 x 104 eventos en 100 μL de volumen de captación a flujo medio (1.000 células/s) en los entornos polimorfonucleares (FSC, 400-490 y SSC, 300-320).
- Analice los datos capturados en el software del citómetro de flujo (ver Tabla de materiales) y determine el porcentaje de pureza y células positivas para 7AAD en la población polimorfonuclear, presentado a través de diagramas de puntos e histogramas.
4. Tinción CFSE de microorganismos
- Añadir 1 x 108 bacterias o 1 x 106 pseudohifas fúngicas en microtubos de 1,5 ml, y teñir con 200 μL de 5 μM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) disuelto en 1x PBS. Mezclar durante unos segundos e incubar a 37 °C durante 10 minutos en la oscuridad.
- Detenga la reacción añadiendo 500 μL de plasma descomplementado y centrifugar a 620 x g durante 10 min para pseudohifas o a 1.800 x g durante 10 min para bacterias.
- Desechar los sobrenadantes y lavar los gránulos con 1 ml de 1x PBS con centrifugación como en el paso 4.2. Finalmente, resuspender los microorganismos en 250 μL de 1x PBS.
- Preparar alícuotas de 50 μL en microtubos de 1,5 mL con 2 x 107 bacterias (MOI: 100) o 2 x 105 pseudohifas (MOI:1) para la inducción NET.
5. Inducción NET
- Coloque los cubreobjetos de vidrio estéril de 10 mm x 10 mm en una placa de 24 pocillos y cubra con 10 μL de poli-L-lisina al 0,001% durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar dos veces con 100 μL de 1x PBS, secar al aire e irradiar con luz UV durante 15 min.
- Reemplace la solución HBSS de la suspensión de neutrófilos en el paso 2.5 con RPMI 1640 medio suplementado con plasma autólogo al 10%. A la placa de 24 pocillos (paso 5.1), añadir 350 μL de esta suspensión celular, para obtener una concentración final de 2 x 105 neutrófilos/pocillo.
- Permitir que las células se adhieran al fondo de los pocillos incubando durante 20 min a 37 °C con 5% deCO2.
- Añadir los estímulos para inducir la formación de NET en 50 μL: estímulos microbianos-grampositivos de la bacteria S. aureus (ATCC 25923), la bacteria gramnegativa P. aeruginosa (ATCC 10145) en MOI 100, y pseudohifas de C. albicans (ATCC 10231) en MOI:1; estímulos bioquímicos-PMA (200 nM) y HOCl (4,5 mM), y control con estímulo ausente (50 μL de HBSS).
- Obtener un volumen final de 400 μL por pocillo. Mezclar en una agitadora de placas a 140 rpm durante 30 s, e incubar durante 4 h a 37 °C y 5% deCO2.
6. Visualización de NET por microscopía de fluorescencia
- Inmunotinción de ADN y LL37
- Después de la inducción NET, retire los sobrenadantes de los pocillos pipeteando cuidadosamente y fije las células con 300 μL de paraformaldehído al 4% durante 30 min.
- Lavar las células con 200 μL de 1x PBS sin centrifugar, y añadir 200 μL de tampón de bloqueo (10% de plasma descomplementado en 1x PBS) durante 30 min.
- Para la tinción LL-37, permeabilizar las células con 200 μL de Triton X-100 al 0,2% en 1x PBS durante 10 min para permitir que el anticuerpo entre en las células. Lave 2x cuidadosamente con 1x PBS para eliminar el exceso de detergente.
- Monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio (cuatro cubreobjetos en cada portaobjetos). El ADN tiñe las células con 2 μL de DAPI (ver Tabla de materiales), sella los cubreobjetos y almacena a -20 °C hasta su análisis por microscopía de fluorescencia confocal.
- Adquisición y análisis de imágenes fluorescentes
- Tome imágenes NET para cuantificar sus componentes y use los filtros correspondientes en el microscopio de fluorescencia confocal (consulte la Tabla de materiales) para adquirir las imágenes con el software de la computadora.
NOTA: Considere que el ADN está teñido con DAPI (color azul), mostrando excitación a 360 nm y emisión a 460 nm. Los microorganismos se tiñen con CFSE (color verde), que tiene una excitación de 492 nm y una emisión de 521 nm. El péptido LL37 está marcado con anticuerpo anti-LL37 Alexa Fluor 594 (color rojo), que tiene una excitación de 594 nm y una emisión de 614 nm. - Calibre el microscopio. Coloque la diapositiva y enfoque utilizando el contraste de interferencia diferencial (DIC) con la luz normal encendida. Elija Live (En directo ) para proyectar la imagen en el monitor.
- Apague la luz y seleccione el canal de fluorocromo correspondiente. Por ejemplo, seleccione el filtro 365 nm/azul para DAPI, 43 HE DsRed para Alexa 594 o 38 HE GFP para CFSE.
- Ajuste la configuración con el anticuerpo de control de isotipo para LL37 y células no teñidas para DAPI y CFSE. Establezca el mismo tiempo de exposición, voltaje, contraste y configuración de lente para capturar todas las imágenes en las mismas condiciones.
NOTA: En este estudio, el tiempo de exposición, el voltaje y el contraste se establecieron en 1.0 ms, 4.0 V y 0.0, respectivamente, con un objetivo de 40x. Estos valores se pueden ajustar para facilitar la mejor captura de imágenes para las muestras. - Seleccione Ajustar para capturar la imagen. Guardar cinco imágenes (cuatro extremos y el centro) por pocillo, y de la colocalización (fusión) de DNA/LL37/CFSE.
- Defina las tres clases de píxeles como fondo con las imágenes independientes de cada color y analice el valor de la señal de gris medio por área con el software Image J.
- Tome imágenes NET para cuantificar sus componentes y use los filtros correspondientes en el microscopio de fluorescencia confocal (consulte la Tabla de materiales) para adquirir las imágenes con el software de la computadora.
7. Cuantificación de la actividad enzimática
- En una placa de 96 pocillos, añadir 90 μL de suspensión celular en HBSS que contenga 1 x 10 5 neutrófilos para la inducción NET e incubar durante 20 min a 37 °C y5 % deCO2.
- Añadir inmediatamente 10 μL de los estímulos correspondientes (concentración como en el paso 5.4) e incubar durante 4 h a 37 °C con 5% deCO2.
- Deseche los sobrenadantes y lave las células con 100 μL de HBSS. Tratar con 1 U/mL de DNasa durante 10 min a 37 °C para favorecer la liberación de estructuras ADN-proteína, y centrifugar a 1.800 x g durante 10 min.
- Recuperar los sobrenadantes y evaluar la actividad enzimática en el sobrenadante mediante reacciones colorimétricas descritas previamente por White et al.17.
- Determinar la actividad enzimática máxima de NE, CG y MPO en neutrófilos bajo las mismas condiciones experimentales sin agregar ningún estímulo para la inducción de NET. A continuación, congelar la muestra celular a -70 °C y descongelar a 37 °C en un baño maría, generando un choque de temperatura para favorecer la liberación de proteínas intracelulares por lisis celular. Centrifugar a 1.800 x g durante 10 min y recuperar los sobrenadantes.
- Añadir 50 μL del sobrenadante a cada pocillo en placas de 96 pocillos y, a continuación, añadir 50 μL de cada sustrato como se indica en el paso 7.7.
- Añadir 0,5 M de N-metoxisuccinil-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitro anilina como sustrato para NE, y 1 mM de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida para CG. Incubar durante 3 h a temperatura ambiente. Para MPO, añadir 1,6 mM de 3,3', 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
- Después de la incubación, añadir 50 μL de la solución de parada (0,5 M H2SO4) para MPO y medir la absorbancia a 405 nm para NE y CG y 450 nm para MPO, utilizando un espectrofotómetro.
- Comparar los valores obtenidos con las curvas de calibración correspondientes y mostrar los resultados de cada condición en relación con la actividad enzimática máxima (100%).
8. Análisis estadístico
- Analizar los datos de medición por triplicado para cada experimento independiente (n = 10) y realizar un ANOVA para el análisis estadístico comparando grupos con un nivel de confianza del 95%.
Figura 1: Purificación de PMN y protocolo de inducción NET. (A) El plasma se extrajo de la sangre periférica para obtener el paquete de eritrocitos y leucocitos y se diluyó 1:1 (v/v) con 1x DPBS. A continuación, se añadieron 4 mL de dilución a lo largo de la pared hasta el tubo de gradiente de doble densidad, y se centrifugaron a 320 x g durante 20 min a 4 °C, obteniendo la separación de diferentes capas celulares y recuperando la correspondiente a PMN. (B) Se contaron las células purificadas y se analizó su morfología mediante tinción de Wright. La viabilidad se determinó mediante exclusión de azul de tripano y tinción de 7AAD mediante citometría de flujo. Una vez que se verificó la pureza y viabilidad óptimas de los neutrófilos, se indujo la formación de NET mediante la adición de microbios (S. aureus, P. aeruginosa y C. albicans) o productos químicos (PMA, HOCl) en placas de 24 pocillos para su análisis por microscopía de fluorescencia con DAPI-DNA, anti-LL37 Alexa Fluor 594 y tinción de microorganismos-CFSE. Para la cuantificación enzimática, los TNE se indujeron en placas de 96 pocillos durante 3 h y se trataron con DNasa, seguido de la adición de sustratos para cada enzima: NE, CG y MPO; Los cambios de color se cuantificaron mediante espectrofotometría. DPBS = solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco; PBMC = células mononucleares de sangre periférica; PMN = neutrófilos polimorfonucleares; NE = elastasa de neutrófilos; CG = catepsina G; MPO = mieloperoxidasa; PMA = acetato de miristato de forbol; HOCl = ácido hipocloroso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Representative Results
Pureza y viabilidad de los neutrófilos
Las fases celulares dinámicas se visualizan en el tubo a partir de la purificación de gradiente de doble densidad. Dentro de estas capas, la capa correspondiente a los granulocitos está por encima de la capa de densidad de 1,079 g/ml, que se distingue de las fases de los mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) y eritrocitos (Figura 1A). La morfología de las células purificadas se verificó con la tinción de Wright mediante la observación de células con núcleos segmentados conectados con filamentos en forma de hilo correspondientes a neutrófilos maduros (Figura 2A). Debido a la vida media reducida de los neutrófilos, la viabilidad es un punto crucial para los siguientes experimentos de inducción NET. Así, se verificó la viabilidad celular con tinción de exclusión de azul de tripano, evaluando la integridad de la membrana plasmática cuando el colorante no penetra (Figura 2B). Además, 7AAD intercala en las bases de citosina y guanina del ADN y emite fluorescencia, lo que facilita la exclusión de células muertas (Figura 2C, D). Estos procedimientos dieron como resultado una pureza celular del 98,9% ± 0,06% y una viabilidad celular del 95,5% ± del 4,2% en 10 experimentos realizados.
Figura 2: Morfología y viabilidad de neutrófilos recién purificados. (A) Después de la purificación del gradiente, la morfología típica de los neutrófilos fue confirmada por la tinción de Wright (100x). Las células mostraron un núcleo multilobulado característico de neutrófilos maduros en el torrente sanguíneo y (B) viabilidad óptima por exclusión de azul de tripano sin interrupción de la membrana. (C) El análisis de SSC versus FSC por citometría de flujo confirma una población correspondiente a PMN, obteniendo una pureza celular de 98,9% ± 0,06% (n = 10). (D) Se presentan diagramas de puntos PMN (células no teñidas, paneles izquierdos vs. paneles derechos de células teñidas con 7AAD) con sus respectivos histogramas (azul no teñido vs. teñido de rojo), lo que indica una alta viabilidad celular de 95,5% ± 4,2% (n = 10) en los neutrófilos recién aislados en comparación con las células control permeabilizadas con Tritón al 0,1% (paneles inferiores) para validar los resultados. El colorante 7AAD se une al ADN y se excluye de las células viables, por lo que el pretratamiento con detergente causó alteraciones en la membrana celular y permitió la entrada de 7AAD. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Morfología y composición de los TNE inducidos por estímulos químicos y microbiológicos
La Figura 3 muestra imágenes representativas que prueban la inducción NET in vitro por la acción de agentes químicos (PMA, HOCl) o microbianos (C. albicans, S. aureus y P. aeruginosa) después de 4 h de incubación (Figura 3A). La composición NET se determinó mediante tinción DNA/LL37, y las imágenes fueron capturadas para la cuantificación de los valores grises medios en el área con ImageJ (Figura 3B,C). La formación de NET suicida (lítica) o vital (no lítica) se describió en función de su morfología. En comparación, los neutrófilos control no estimulados cultivados en HBSS durante 4 h mostraron LL37 localizada en el citoplasma con cromatina condensada de segmentos múltiples lobulados (Figura 3A 1-3), característica de estas células en reposo.
PMA es un potente inductor de ROS a través de la activación de PKC, por lo que funciona como un control positivo para inducir la formación de NET suicidas (líticas). Las imágenes de NET inducidos por PMA muestran redes con abundante descondensación de cromatina formando estructuras similares a nubes asociadas con la vía suicida (Figura 3A 4-6), en las que el neutrófilo muere debido a la abundante liberación de ADN en el espacio extracelular que cubre grandes proporciones del área analizada. Dentro de estas áreas nubladas que cubren el ADN, LL37 fue colocalizada, tanto intra como extracelularmente en altas concentraciones (Figura 3A 6, B-C). En contraste, HOCl es un compuesto bioquímico fisiológico generado como producto de la actividad oxidativa de MPO. Los NET formados con HOCl mostraron una dispersión menor del ADN en el espacio extracelular con morfología filamentosa que parece derivarse de la membrana celular (Figura 3A 7-9). Tales características morfológicas corresponden a la formación vital de NET y no mostraron colocalización de LL37 con los filamentos de ADN; LL37 permaneció localizado a nivel nuclear (Figura 3A 7-9,C). Estos resultados indican que bajo condiciones controladas similares, estos agentes químicos muestran divergencias en la composición de los NET liberados, tanto ADN como LL37.
El análisis de TNE inducidos por microorganismos mostró que pseudohifas de C. albicans indujeron redes con bajas concentraciones de ADN liberadas en el espacio extracelular con estructuras filamentosas, destacando la presencia de estructuras similares a citoplastos anucleados características de la formación vital de NET (Figura 3A 10-13), que no se observan con HOCl y S. aureus que activan esta misma vía. Mientras tanto, LL37 se colocaliza con el ADN a nivel celular, y las bajas concentraciones se asocian con pseudohifas, delimitando su propagación. Ambos componentes no mostraron diferencias estadísticamente significativas con respecto al control con HBSS (Figura 3B, C). S. aureus es una de las bacterias patógenas más comunes en todo el mundo, con la capacidad de inducir TNE que muestran una morfología similar a la vital, como se informó previamente en varios estudios15,19. Se liberó abundante ADN en concentraciones estadísticamente significativas como estructuras filamentosas que se colocalizaron con LL37 y formaron grupos bacterianos, lo que indica que el andamio podría delimitar y favorecer la eliminación de las bacterias (Figura 3A 14-17). Por otro lado, la bacteria gramnegativa P. aeruginosa indujo la liberación de grandes concentraciones de ADN con una morfología turbia asociada a la formación de NET suicidas, y LL37 colocalizó significativamente con ADN y bacterias (Figura 3A 18-21,B,C).
La visualización de NET por microscopía de fluorescencia mostró que los NET inducidos por HOCl, S. aureus y C. albicans presentan morfología vital con estructuras filamentosas. Sin embargo, solo S. aureus condujo a la liberación de cantidades estadísticamente significativas de ADN. La morfología de los otros dos tumores NET inducidos por estímulos (PMA y P. aeruginosa) corresponde al tipo de formación de NET suicidas, con cantidades estadísticamente significativas de ADN y LL37 en comparación con neutrófilos no estimulados. Hubo abundantes estructuras de ADN en forma de nube, más significativas en los NET inducidos por P. aeruginosa que en los inducidos por PMA.
Figura 3: Composición de ADN y LL37 y morfología de los TNE inducidos por estímulos químicos y microbianos. (A) Los neutrófilos derivados de la sangre humana fueron estimulados con PMA (4-6), HOCl (7-9), pseudohifas de C. albicans (10-13), S. aureus (14-17), P. aeruginosa (18-21), y un control no estimulado (1-3) en HBSS, durante 4 h. Los NET se visualizaron utilizando DNA-DAPI (azul), anti-LL37 Alexa Fluor 594 (rojo), o control de isotipo, y los microorganismos fueron pre-teñidos con 5 μM CFSE (verde). Las imágenes muestran resultados representativos de microscopía de fluorescencia de 10 experimentos independientes realizados por triplicado. (B-C) Los gráficos muestran promedios ± SD del valor gris medio de la señal por área para los colores indicados de cinco imágenes (cuatro extremos y el centro) por pocillo y analizadas con el software ImageJ para (B) DAPI-DNA y (C) tinción Alexa Fluor 594-LL37. Se realizó ANOVA para comparar grupos de condiciones experimentales con un nivel de confianza del 95%. * = p ≤ 0,05. HBSS = solución salina balanceada de Hank; PMA = acetato de miristato de forbol; HOCl = ácido hipocloroso. Adaptado de Sosa-Luis et al.16 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Actividad enzimática de NE, CG y MPO en NET inducida por estímulos químicos y microbiológicos
Otro objetivo de este estudio fue cuantificar la actividad de las enzimas descritas como componentes centrales en los TNE, como NE, CG y MPO, que son abundantes con actividad antimicrobiana derivada de gránulos azurófilos. Por lo tanto, se indujeron TNE y las redes celulares se trataron con DNasa, favoreciendo la liberación de proteínas asociadas a la estructura, y se determinó la actividad enzimática mediante ensayos colorimétricos. El análisis mostró actividad residual para NE (2,3% ± 0,6%), GC (6,2% ± 2,7%) y MPO (21,4% ± 2,0%) asociada con estructuras de ADN derivadas de todos los TNE, en comparación con la actividad máxima obtenida de neutrófilos lisados en reposo tomados como 100% (Figura 4). Los TNE inducidos por la mayoría de los estímulos mostraron valores bajos de actividad enzimática para NE y CG, excepto S. aureus para NE y PMA para CG, que mostraron significación estadística. Por otro lado, la actividad MPO aumentó en todos los estímulos sin ninguna diferencia estadísticamente significativa entre ellos, pero fue significativa entre los grupos de estímulos químicos versus microorganismos.
Estos resultados demuestran la viabilidad del protocolo presentado, proporcionando información sobre la heterogeneidad en la composición NET mediante la cuantificación de ADN, LL37 y actividad enzimática (NE, CG y MPO) con diferentes estímulos en las mismas condiciones in vitro . Los resultados revelan que los neutrófilos pueden responder diferencial y específicamente a cada estímulo formando estructuras de ADN adecuadas con varias proteínas antimicrobianas durante la formación de NET.
Figura 4: Actividad enzimática residual en TNE inducida por estímulos químicos y microbianos. Se utilizaron ensayos colorimétricos para evaluar la actividad enzimática en NET después de desacoplar las estructuras ADN-proteína por DNasa para analizar solo proteínas unidas a NET. El gráfico muestra el promedio ± DE del porcentaje de actividad enzimática residual en NET inducida por cada estímulo químico o microbiano en comparación con la actividad enzimática máxima (en los sobrenadantes de los neutrófilos lisados por congelación-descongelación a -70 °C) obtenida para NE (3,54 ± 2,52 U/mL), CG (34,90 ± 25,85 U/mL) y MPO (0,29 ± 0,13 U/mL). Basal muestra la actividad enzimática en los sobrenadantes de los neutrófilos mantenidos en tampón HBSS. El análisis estadístico se realizó con datos de 10 experimentos independientes por ANOVA para comparar grupos de condiciones experimentales con un nivel de confianza del 95%. * y ** = p ≤ 0,05 en comparación con todos los demás estímulos. = p ≤ 0,05 comparando los grupos señalados de estímulos. NE = elastasa de neutrófilos; CG = catepsina G; MPO = mieloperoxidasa; PMA = acetato de miristato de forbol; HOCl = ácido hipocloroso. Adaptado de Sosa-Luis et al.16 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se debe obtener una población altamente pura de neutrófilos viables para inducir la liberación de TNE, ya que estas células tienen una vida útil ex vivo limitada de 8 h en promedio, un período dentro del cual se deben realizar todos los experimentos. Para ello, la metodología ideal es el gradiente de doble densidad para optimizar el tiempo de purificación mediante el aislamiento de células no activadas más sensibles a la estimulación exógena, en contraste con el gradiente de Ficoll-Histopaque o las técnicas de sedimentación dextrano17. Otra ventaja del método de gradiente de doble densidad es su costo relativamente bajo en comparación con las técnicas de enriquecimiento celular de alta pureza, como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y la clasificación celular activada magnéticamente (MACS) que dependen de los antígenos de la superficie celular, como CD16hi en neutrófilos. Además de un alto costo, estos métodos de clasificación también pueden causar la activación involuntaria de las células diana durante la interacción anticuerpo-antígeno, y aumentar el tiempo ex vivo de los neutrófilos, ya que estas dos técnicas se utilizan generalmente después de la purificación del gradiente de densidad. La morfología y viabilidad celular descartan alteraciones en los neutrófilos purificados y confirman que los cambios observados son específicos en respuesta a los estímulos añadidos frente a los neutrófilos en reposo en las mismas condiciones experimentales sin estimulación (Figura 2). Esto corrobora la eficiencia del protocolo como método aséptico y reproducible para el aislamiento de neutrófilos sin alterar la viabilidad y morfología celular. Esta contribución de los eosinófilos, que se encuentran comúnmente en sangre con recuentos inferiores al 2%, fue descartada y no alteró la significación estadística de los resultados, ya que no se observaron eosinófilos en la muestra sobre la tinción de Wright al analizar varios campos (Figura 2A). Esto podría confirmarse mediante citometría de flujo utilizando el marcador CD16, que no está presente en los eosinófilos, pero está presente en altas concentraciones en los neutrófilos.
En el estudio de los NET existen consensos y discrepancias18; Varios estudios han reportado resultados contradictorios en respuesta a los mismos estímulos, lo que podría deberse a diferencias en los protocolos de aislamiento de neutrófilos, el tiempo de experimentación prolongado que activa los neutrófilos espontáneamente, los amortiguadores y diferentes concentraciones del mismo estímulo utilizado. Por lo tanto, es esencial homogeneizar los protocolos con detalles explícitos para que los protocolos puedan replicarse consistentemente para permitir comparaciones. Los métodos más utilizados son la inmunocitoquímica y la inmunohistoquímica, que permiten la identificación de estructuras que contienen ADN extracelular colocalizado con proteínas derivadas de gránulos18 que generalmente incluyen componentes con actividad bactericida capaces de destruir los factores de virulencia8, como NE, MPO, CG y LL37. Además, estudios recientes para monitorear la formación de NET recomiendan analizar este proceso utilizando métodos de células vivas en tiempo real, como la microscopía intravital 1,18. Pocos estudios como este unifican las condiciones experimentales para comparar la composición de los TNE bajo diferentes estímulos (bacterias, hongos y productos químicos)1,9, utilizando la técnica de microscopía de fluorescencia para visualizar la dispersión de DNA-DAPI, LL37-Alexa 594, y su colocalización con microorganismos-CFSE. Asimismo, el tratamiento con DNasa libera únicamente aquellas proteínas asociadas a la estructura ADN de los NETs, por lo que la técnica espectrofotométrica asegura cuantificar la actividad enzimática de MPO, NE y CG, descartando que provengan de la desgranulación.
La morfología NET puede definirse como suicida o vital, con la posibilidad de diferenciarlos según la dispersión adoptada por el ADN en el espacio extracelular. La vía suicida se caracteriza por una estructura similar a una nube, mientras que la vía vital es una forma filamentosa15,19,20. Con base en esto, la Figura 3 indica que PMA y P. aeruginosa representan un tipo NET suicida. Estos resultados validan esta técnica replicando bajo nuestras condiciones lo descrito por Brinckman et al. con PMA, el compuesto más utilizado para inducir TNE al desencadenar la activación de c-Raf, MEK, Akt, ERK y proteína quinasa C (PKC), que a su vez activan la NADPH oxidasa11 y causan un fuerte aumento de ROS intracelular. Además, los resultados descartan la posibilidad de que artefactos externos, tiempos de incubación o la breve agitación mecánica utilizada en este estudio provocaran la liberación espontánea in vitro de NET con apariencia de nube, como algunos autores han mencionado17, ya que los neutrófilos en reposo sin estimulación después de 4 h mostraron un núcleo multilobulado con cromatina intacta (Figura 3A 1-3).
Del mismo modo, los NET inducidos con HOCl, C. albicans, y S. aureus presentó morfología filamentosa, correspondiente a la morfología NET vital (Figura 3A 7-17). Esta vía se caracteriza por la respuesta de neutrófilos de una manera única e independiente del oxidante sin lisis celular o incluso ruptura de la membrana plasmática, solo gemación de vesículas con ADN nuclear15. Este resultado valida de nuevo el potencial de esta técnica para discernir tanto los aspectos morfológicos de la producción NET como suicidas o vitales. En cuanto a la composición de NET, los resultados obtenidos utilizando esta metodología mostraron significación estadística en los requerimientos diferenciales de LL37 para la estimulación de PMA y P. aeruginosa (Figura 3C). La actividad de NE (solo para S. aureus) y MPO fue mayor en los microorganismos frente al grupo químico (Figura 4). Esta información demuestra nuevamente la selectividad de neutrófilos en la respuesta a cada estímulo, como lo reportan Kenny et al.5 al comparar diferentes estímulos en la producción NET in vitro. Se describió que en algunos casos la producción de NET necesita ROS o tiene requerimientos diferenciales de enzimas específicas como PAD4, mientras que en otros la presencia de estas moléculas es irrelevante para su producción5.
Una limitación de la técnica de cuantificación del ADN en el espacio extracelular descrita en este estudio es que el ADN también puede provenir de otras formas de muerte celular con un morfotipo necrótico, y es imposible que esta técnica discierna entre ellas. Sin embargo, se ha relatado que los NET pueden diferenciarse de este proceso al confirmar la presencia de proteínas granulares18. Asimismo, se desconoce el origen del ADN, que puede confirmarse mediante la amplificación de genes específicos de orgánulos, mitocondriales o nucleares mediante PCR19. Otra debilidad es distinguir los TNE de otras estructuras fibrosas como la fibrina; Tal discernimiento requeriría técnicas sofisticadas como la microscopía electrónica de barrido de alta resolución20. En conclusión, las técnicas presentadas permiten la caracterización in vitro (en condiciones similares) de la composición y morfología de los NET inducidos con diferentes estímulos, mostrando la selectividad de los neutrófilos en la liberación de algunos de sus componentes (ADN, LL37, NE, CG, MPO) a un estímulo específico. Estas técnicas pueden adaptarse para evaluar el efecto de los factores solubles exógenos o el contacto celular sobre dichas características NET.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de ciencias básicas (#285480) del CONACyT y por el Departamento de Investigación en Inmunología Clínica de la Facultad de Ciencias Bioquímicas de la Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L, y W.J.R.R. tienen becas doctorales de CONACyT números #799779, #660793 y #827788, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL - Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory - CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
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