Summary
Här presenteras ett protokoll för induktion och analys av in vitro neutrofila extracellulära fällor (NET). Kvantifiering av DNA, kathelicidin (LL37) och enzymaktivitet gav data som visar variationen i sammansättningen och morfologin hos NET inducerad av mikrobiella och kemiska stimuli under liknande kontrollerade förhållanden.
Abstract
Neutrofiler fungerar som den första linjen av cellulärt försvar i ett medfött immunsvar genom att använda olika mekanismer, såsom bildandet av neutrofila extracellulära fällor (NET). Denna studie analyserar de morfologiska och kompositionella förändringarna i NET inducerade av mikrobiella och kemiska stimuli med hjälp av standardiserade in vitro-metoder för NET-induktion och karakterisering med mänskliga celler. De förfaranden som beskrivs här möjliggör analys av NET-morfologi (lytisk eller icke-lytisk) och komposition (DNA-proteinstrukturer och enzymatisk aktivitet) och effekten av lösliga faktorer eller cellulär kontakt på sådana egenskaper. Dessutom kan de tekniker som beskrivs här modifieras för att utvärdera effekten av exogena lösliga faktorer eller cellulär kontakt på NET-kompositionen.
De tillämpade teknikerna inkluderar rening av polymorfonukleära celler från humant perifert blod med hjälp av en dubbeldensitetsgradient (1,079-1,098 g / ml), vilket garanterar optimal renhet och livskraft (≥ 95%) vilket demonstreras av Wrights färgning, trypanblå uteslutning och flödescytometri, inklusive FSC kontra SSC-analys och 7AAD-färgning. NET-bildning induceras med mikrobiella (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus och Candida albicans) och kemiska (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, och NETs kännetecknas av DNA-DAPI-färgning, immunfärgning för den antimikrobiella peptiden cathelicidin (LL37) och kvantifiering av enzymatisk aktivitet (neutrofilt elastas, cathepsin G och myeloperoxidas). Bilderna förvärvas genom fluorescensmikroskopi och analyseras med ImageJ.
Introduction
Neutrofiler är de vanligaste leukocyterna i blodomloppet och spelar en viktig roll under clearance av patogena medel genom flera mekanismer, inklusive frisättning av stora kromatinstrukturer som består av DNA och flera nukleära, cytoplasmatiska och granulära antibakteriella proteiner 1,2. Den direkta antecedenten som beskriver denna antimikrobiella roll av neutrofiler gjordes av Takei et al.3 1996. Dessa författare rapporterade en ny form av död som skiljer sig från apoptos och nekroptos hos neutrofiler, visade morfologiska förändringar som uppvisade kärnbrott, följt av spillning ur nukleoplasman i cytoplasman och en ökning av membranpermeabiliteten från 3 timmars inkubation med forbolmyristatacetat (PMA)2,3. Det var dock inte förrän 2004 som termen "neutrofila extracellulära fällor (NET)" användes4.
NET-bildning har observerats under olika förhållanden, såsom bakteriella, svamp5, virus6 och parasitinfektioner, för att neutralisera, döda och förhindra mikrobiell spridning7. Andra studier visar att det också kan förekomma vid icke-patogena tillstånd genom sterila stimuli, såsom cytokiner, mononatrium urinsyra eller kolesterolkristaller, autoantikroppar, immunkomplex och aktiverade blodplättar7. Lipopolysackarid (LPS), interleukin-8 (IL-8) och PMA var bland de första in vitro-stimuli som beskrivs som NET-inducerare, och in vivo NET-involvering i patogena processer demonstrerades i två modeller av akut inflammation: experimentell dysenteri och spontan human blindtarmsinflammation4. DNA är en viktig NET-komponent. Dess lämpliga struktur och sammansättning är nödvändiga för att binda och döda mikroorganismer genom att leverera en hög lokal koncentration av antimikrobiella molekyler mot de fångade mikroberna, vilket framgår av en kort deoxiribonukleasbehandling (DNase) som sönderdelar NET och deras mikrobicida egenskaper4. Förutom DNA består NET av bundna proteiner såsom histoner, neutrofilt elastas (NE), cathepsin G (CG), proteinas 3, laktoferrin, gelatinas, myeloperoxidas (MPO) och antimikrobiella peptider (AMP) såsom den katjoniska proinflammatoriska peptiden cathelicidin LL-37 bland andra 8,9. Sådana aggregat kan bilda större trådar med diametrar upp till 50 nm. Dessa faktorer kan störa de mikrobiella virulensfaktorerna eller patogencellmembranets integritet; Dessutom kan AMP: erna stabilisera det NET-härledda DNA: t mot nedbrytning av bakteriella nukleaser10.
De specifika mekanismer som reglerar NET-bildning har ännu inte klargjorts fullständigt. Den bäst karakteriserade vägen som leder till NET-frisättning är genom ERK-signalering, vilket leder till NADPH-oxidasaktivering och produktion av reaktiva syrearter (ROS), samt ökat intracellulärt kalcium som utlöser aktivering av MPO-vägen. Detta omvandlar i sin tur väteperoxid till hypoklorsyra och aktiverar NE genom oxidation11,12. NE är ansvarig för att bryta ner cytoskelettens aktinfilament för att blockera fagocytos och translokera dem till kärnan för bearbetning genom proteolytisk klyvning och deaminering av PAD4 som driver desensibiliseringen av kromatinfibrer, som associerar med granulat och cytoplasmatiska proteiner, och frigörs sedan extracellulärt7. Dessa proteaser innefattar de som frigörs från azurosomkomplexet av azurofilgranulerna och andra proteaser, såsom cathepsin G13.
Beroende på de morfologiska förändringarna i neutrofiler klassificeras NET i två typer: suicidal eller lytisk NET-bildning som leder till celldöd4 och vital eller icke-lytisk NET-bildning producerad av livskraftiga celler medierade av en vesikulär frisättning av kärn- eller mitokondriellt DNA, med en rest av en anucleated cytoplast med fagocytisk förmåga14,15. I allmänhet presenterar NETs som består av mitokondriellt DNA en långsträckt fiber14-morfologi, medan de som är strukturerade av kärn-DNA har ett molnliknande utseende3. Det är emellertid inte känt hur neutrofilen väljer sitt DNA-ursprung. I motsats till tidigare studier som beskrev de kanoniska vägarna för NETs som kräver flera timmar, aktiveras den vitala vägen snabbt på bara 5-60 min15.
Trots dessa framsteg varierar NET-sammansättningen beroende på stimulansen; till exempel inducerar olika mucoid- och icke-mucoidstammar av P. aeruginosa bildandet av NET innehållande 33 vanliga proteiner och upp till 50 variabla proteiner7. Således är det nödvändigt att homogenisera tekniker som möjliggör generering av objektiva slutsatser i forskargrupper. Detta papper beskriver ett protokoll med olika tekniker som möjliggör jämförelse och utvärdering av sammansättningen, strukturen och morfologin hos NETs inducerad med olika mikroorganismer: Staphylococcus aureus (grampositiv bakterie), Pseudomonas aeruginosa (gramnegativ bakterie) och Candida albicans (svamp), liksom kemiska stimuli (PMA, HOCl) i humana neutrofiler från friska individer. De representativa resultaten visar heterogeniteten hos NETs beroende på deras inducerande stimulans under jämförbara in vitro-förhållanden, kännetecknade av DNA-DAPI-färgning, immunfärgning för LL37 och kvantifiering av enzymatisk aktivitet (NE, CG och MPO).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Blodproverna erhölls som donationer från kliniskt friska deltagare efter informerat samtycke. Alla experiment utfördes med tillstånd från kommittén för mänsklig forskningsetik vid fakulteten för biokemiska vetenskaper, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' i Oaxaca.
OBS: Inklusionskriterierna i studien var otydligt kön och ålder och kliniskt friska enligt deltagarnas svar på ett frågeformulär innan ett blodprov togs. En hematologisk analys utfördes för att bestämma cellantalet och utesluta infektioner eller anemi, liksom det C-reaktiva proteintestet för att utesluta inflammation hos givaren.
1. Uppsamling av perifert blod och erhållande av erytrocyt- och leukocytpaketet
- Samla 10 ml perifert blod genom venipunktur i rör med 1,8 mg/ml K2· EDTA som antikoagulantia (se materialförteckning) från kliniskt friska individer efter att ha erhållit informerat samtycke. Utför sedan standard blodbiometri och C-reaktivt proteintest för att utesluta infektion eller inflammation, vilket säkerställer provets kvalitet.
- Centrifugera det perifera blodprovet vid 82 x g i 15 minuter för att avlägsna den trombocytrika plasman, följt av en andra centrifugering vid 630 x g i 5 minuter. Kassera återstående plasma för att erhålla erytrocyt- och leukocytpaketet.
- Späd den i förhållandet 1: 1 (v / v) med 1x Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS).
2. Polymorfonukleär neutrofil (PMN) rening med användning av en dubbeldensitetsgradient
OBS: Utför neutrofil rening omedelbart efter att blodet har samlats in, eftersom de har en begränsad in vitro-livslängd på cirka 8 timmar.
- Deponera följande i ett sterilt 10 ml glasrör (se materialtabell) i ordning: 1 ml 1,098 g / ml densitetslösning, 1 ml 1,079 g / ml densitetslösning (se materialtabell) och sedan 4 ml av det utspädda erytrocyt- och leukocytpaketet. Häll över väggarna utan att bryta ytspänningen mellan skikten för att förhindra att de blandas.
- Centrifugera vid 320 x g i 20 minuter vid 4 °C och undvik acceleration/retardation så att centrifugens höga krafter inte stör lutningen.
- Aspirera den fas som motsvarar granulocyter (figur 1A) genom pipettering och överför till ett annat sterilt 10 ml glasrör. Tvätta med 4 ml 1x DPBS vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och behandla cellerna med osmotisk chock för att avlägsna de återstående erytrocyterna. Tillsätt 4 ml 0,2 % saltlösning i 2 min vid 4 °C och centrifugera med 300 x g i 10 min vid 4 °C. Kassera supernatanten. Tillsätt sedan 4 ml av den isotoniska lösningen (0,65 % saltlösning) i 5 minuter vid 4 °C för att återställa membranets integritet och centrifugera vid 300 x g i 10 min vid 4 °C.
OBS: 0,2% saltlösning är ett hypotoniskt medium, med en lägre lösningskoncentration i förhållande till RBC: s intracellulära medium. Kontakt med hypotoniskmedium tillåter vatten att diffundera in i RBC, vilket leder till svullnad och hemolys. Detta avlägsnande av RBC från supernatanten bekräftades genom mikroskopisk observation. - Ta bort supernatanten. Återsuspendera cellerna i 4 ml 1x DPBS för att avlägsna cellulärt skräp och centrifugera sedan vid 300 x g i 10 minuter vid 4 °C. Återsuspendera slutligen cellpelleten i 2 ml kall Hanks balanserade saltlösning (HBSS) buffert.
3. Neutrofil morfologi och livskraft (figur 1B)
- Trypan blå uteslutningstest
- Späd 5 μl av cellsuspensionen i 20 μl med 0,4 % trypanblå (förhållandet 1:5). Räkna cellerna i en Neubauer-kammare och bestäm cellviabiliteten med hjälp av ett uteslutningstest. Tänk på cellerna som upprätthåller membranets integritet utan att permeabilisera färgämnet som livskraftigt.
- Montera 5 μL av cellsuspensionen på ett objektglas; torka och fläcka med Wrights fläck i 15 s. Fixera omedelbart provet med fosfatbuffert pH 6,4 i 30 s. Tvätta med tillräckligt destillerat vatten och observera morfologin under ett optiskt mikroskop (100x).
- 7AAD-färgning och flödescytometrianalys
- Tillsätt 1 x 105 celler till flödescytometrirör och fläcka med 1 μL 7AAD i 100 μL FACS-buffert (1x DPBS, 0,1% natriumazid och 10% autolog desupplementerad plasma) i 15 min vid 4 ° C i mörkret.
- Tvätta med 500 μL FACS-buffert vid 300 x g i 10 min. Fixera cellerna med 500 μl 2 % paraformaldehyd och förvara vid 4 °C tills de analyseras i flödescytometern.
- För en dödcellskontroll, fixera 1 x 105 celler med 200 μl 4% paraformaldehyd i 30 minuter och tvätta med 500 μL 1x PBS vid 300 x g i 10 min vid 4 °C. Dra av supernatanten och kasta. Tillsätt sedan 200 μl 0,1 % Triton X-100 i 1 timme vid 4 °C. Tvätta med 500 μL 1x PBS och fläcka med 7AAD som i steg 3.2.1.
- Använd en flödescytometer (se materialförteckning), utför FSC kontra SSC-analys för att analysera cellrenhet och SSC kontra 7AAD-färgning för att analysera cellviabiliteten. Läs 3 x 104 händelser i 100 μl upptagningsvolym vid medelflöde (1 000 celler/s) i de polymorfonukleära inställningarna (FSC, 400-490 och SSC, 300-320).
- Analysera insamlade data i flödescytometerprogramvaran (se Materialförteckning) och bestäm procentandelen renhet och positiva celler för 7AAD i den polymorfonukleära populationen, presenterad genom punktdiagram och histogram.
4. CFSE-färgning av mikroorganismer
- Tillsätt 1 x 108 bakterier eller 1 x 106 svamp pseudohyfer i 1,5 ml mikrorör och fläcka med 200 μL 5 μM karboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) upplöst i 1x PBS. Blanda i några sekunder och inkubera vid 37 °C i 10 min i mörker.
- Stoppa reaktionen genom att tillsätta 500 μl desupplementerad plasma och centrifugera vid 620 x g i 10 minuter för pseudohyfer eller vid 1 800 x g i 10 minuter för bakterier.
- Kassera supernatanterna och tvätta pelletsen med 1 ml 1x PBS med centrifugering som i steg 4.2. Slutligen återsuspendera mikroorganismerna i 250 μL 1x PBS.
- Bered 50 μL alikvoter i mikrorör på 1,5 ml med 2 x 107 bakterier (MOI: 100) eller 2 x 105 pseudohyfer (MOI:1) för NET-induktion.
5. NET-induktion
- Placera 10 mm x 10 mm sterila glasöverdrag i en 24-brunnsplatta och täck med 10 μL 0,001% poly-L-lysin i 1 h vid rumstemperatur. Tvätta två gånger med 100 μL 1x PBS, lufttorka och bestråla med UV-ljus i 15 min.
- Byt ut HBSS-lösningen av neutrofilsuspensionen i steg 2.5 med RPMI 1640-medium kompletterat med 10% autolog plasma. Till 24-brunnsplattan (steg 5.1), tillsätt 350 μL av denna cellsuspension för en slutlig koncentration av 2 x 105 neutrofiler/brunn.
- Låt cellerna fästa vid botten av brunnarna genom att inkubera i 20 minuter vid 37 °C med 5 %CO2.
- Tillsätt stimuli för att inducera NET-bildning i 50 μL: mikrobiell stimuli-grampositiv bakterie S. aureus (ATCC 25923), gramnegativ bakterie P. aeruginosa (ATCC 10145) vid MOI 100 och pseudohyfer av C. albicans (ATCC 10231) vid MOI:1; biokemiska stimuli-PMA (200 nM) och HOCl (4,5 mM), och kontroll med stimulans frånvarande (50 μL HBSS).
- Få en slutlig volym på 400 μL per brunn. Blanda på en tallriksskakare vid 140 rpm i 30 s och inkubera i 4 timmar vid 37 °C och 5 %CO2.
6. Visualisering av NET genom fluorescensmikroskopi
- DNA- och LL37-immunfärgning
- Efter NET-induktion, ta bort supernatanterna från brunnarna genom att pipettera försiktigt och fixera cellerna med 300 μL 4% paraformaldehyd i 30 min.
- Tvätta cellerna med 200 μL 1x PBS utan centrifugering och tillsätt 200 μL blockerande buffert (10% dekomplementerad plasma i 1x PBS) i 30 min.
- För LL-37-fläck, permeabilisera cellerna med 200 μL 0,2% Triton X-100 i 1x PBS i 10 min för att låta antikroppen komma in i cellerna. Tvätta 2x försiktigt med 1x PBS för att ta bort överflödigt tvättmedel.
- Montera täckglasen på glasskivor (fyra täckglas på varje bild). DNA färgar cellerna med 2 μL DAPI (se materialförteckning), förseglar täckglasen och förvarar vid -20 °C tills de analyseras med konfokal fluorescensmikroskopi.
- Förvärv och analys av fluorescerande bilder
- Ta NET-bilder för att kvantifiera deras komponenter och använd motsvarande filter i det konfokala fluorescensmikroskopet (se materialförteckning) för att hämta bilderna med datorns programvara.
OBS: Tänk på att DNA är färgat med DAPI (blå färg), vilket visar excitation vid 360 nm och emission vid 460 nm. Mikroorganismerna är färgade med CFSE (grön färg), som har en excitation på 492 nm och en emission av 521 nm. LL37-peptiden är märkt med anti-LL37 Alexa Fluor 594-antikropp (röd färg), som har en excitation på 594 nm och en emission på 614 nm. - Kalibrera mikroskopet. Placera bilden och fokusera med hjälp av differentiell interferenskontrast (DIC) med normalt ljus på. Välj Live för att projicera bilden på bildskärmen.
- Stäng av ljuset och välj fluorokrom motsvarande kanal. Välj till exempel filter 365 nm/blått för DAPI, 43 HE DsRed för Alexa 594 eller 38 HE GFP för CFSE.
- Justera inställningarna med isotypkontrollantikroppen för LL37 och ofärgade celler för DAPI och CFSE. Ställ in samma exponeringstid, spänning, kontrast och linsinställningar för att fånga alla bilder under samma förhållanden.
OBS: I denna studie ställdes exponeringstiden, spänningen och kontrasten in på 1,0 ms, 4,0 V respektive 0,0 med ett 40x mål. Dessa värden kan justeras för att underlätta den bästa bildtagningen för proverna. - Välj Fäst för att fånga bilden. Spara fem bilder (fyra ytterligheter och mitten) per brunn och av samlokaliseringen (sammanslagningen) av DNA/LL37/CFSE.
- Definiera de tre klasserna av pixlar som bakgrund med de oberoende bilderna av varje färg och analysera medelvärdet för grå signal per område med programvaran Image J.
- Ta NET-bilder för att kvantifiera deras komponenter och använd motsvarande filter i det konfokala fluorescensmikroskopet (se materialförteckning) för att hämta bilderna med datorns programvara.
7. Kvantifiering av enzymatisk aktivitet
- Tillsätt 90 μl cellsuspension i HBSS innehållande 1 x 10 5 neutrofiler för NET-induktion i en 96-brunnsplatta och inkubera i 20 minuter vid 37 °C och5 %CO2.
- Tillsätt omedelbart 10 μl av motsvarande stimuli (koncentration enligt steg 5.4) och inkubera i 4 timmar vid 37 °C med 5 %CO2.
- Kassera supernatanterna och tvätta cellerna med 100 μL HBSS. Behandla med 1 U/ml DNas i 10 min vid 37 °C för att främja frisättningen av DNA-proteinstrukturer och centrifugera vid 1 800 x g i 10 minuter.
- Återställ supernatanterna och utvärdera enzymaktiviteten i supernatanten med hjälp av kolorimetriska reaktioner som tidigare beskrivits av White et al.17.
- Bestäm den maximala enzymaktiviteten för NE, CG och MPO i neutrofiler under samma experimentella betingelser utan att tillsätta några stimuli för NET-induktion. Frys sedan cellprovet vid -70 ° C och tina vid 37 ° C i ett vattenbad, vilket genererar en temperaturchock för att gynna frisättningen av intracellproteiner genom celllys. Centrifugera vid 1 800 x g i 10 min och återvinn supernatanterna.
- Tillsätt 50 μl supernatanten till varje brunn i 96-brunnsplattor och tillsätt sedan 50 μl av varje substrat enligt anvisningarna i steg 7.7.
- Tillsätt 0,5 m N-metoxisuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitro anilin som substrat för NE och 1 mM N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid för CG. Inkubera i 3 timmar vid rumstemperatur. För MPO, tillsätt 1,6 mM 3,3', 5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Efter inkubation, tillsätt 50 μl av stopplösningen (0,5 MH2S04) för MPO och mät absorbansen vid 405 nm för NE och CG och 450 nm för MPO med hjälp av en spektrofotometer.
- Jämför de erhållna värdena med motsvarande kalibreringskurvor och visa resultaten av varje tillstånd i förhållande till den maximala enzymaktiviteten (100%).
8. Statistisk analys
- Analysera mätdata i tre exemplar för varje oberoende experiment (n = 10) och utför en ANOVA för statistisk analys genom att jämföra grupper med en 95% konfidensnivå.
Figur 1: PMN-rening och NET-induktionsprotokoll. (A) Plasma avlägsnades från det perifera blodet för att erhålla erytrocyt- och leukocytpaketet och späddes 1:1 (v/v) med 1x DPBS. Därefter tillsattes 4 ml av utspädningen längs väggen till gradientröret med dubbel densitet och centrifugerades vid 320 x g i 20 minuter vid 4 °C, vilket erhöll separationen av olika cellskikt och återvann det som motsvarar PMN. (B) De renade cellerna räknades och deras morfologi analyserades genom Wrights färgning. Viabiliteten bestämdes genom trypanblå uteslutning och 7AAD-färgning med hjälp av flödescytometri. När optimal neutrofil renhet och viabilitet verifierades inducerades NET-bildning genom tillsats av mikrober (S. aureus, P. aeruginosa och C. albicans) eller kemikalier (PMA, HOCl) i 24-brunnsplattor för analys genom fluorescensmikroskopi med DAPI-DNA, anti-LL37 Alexa Fluor 594 och mikroorganism-CFSE-färgning. För enzymkvantifiering inducerades NET i 96-brunnsplattor i 3 timmar och behandlades med DNas, följt av tillsats av substrat för varje enzym: NE, CG och MPO; färgförändringar kvantifierades med spektrofotometri. DPBS = Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning; PBMC = Mononukleära celler i perifert blod; PMN = Polymorfonukleära neutrofiler; NE = Neutrofil elastas; CG = Cathepsin G; MPO = Myeloperoxidas; PMA = Phorbol myristateacetat; HOCl = Hypoklorsyra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Renhet och livskraft hos neutrofiler
De dynamiska cellfaserna visualiseras i röret från dubbeldensitetsgradientreningen. Inom dessa skikt ligger skiktet som motsvarar granulocyter över densitetsskiktet på 1,079 g / ml, som skiljer sig från faserna av mononukleocyter i perifert blod (PBMC) och erytrocyter (figur 1A). De renade cellernas morfologi verifierades med Wrights färgning genom att observera celler med segmenterade kärnor kopplade till trådliknande filament som motsvarar mogna neutrofiler (figur 2A). På grund av den minskade halveringstiden för neutrofiler är viabilitet en avgörande punkt för följande NET-induktionsexperiment. Därför verifierades cellviabiliteten med trypanblå uteslutningsfärgning, som utvärderade plasmamembranets integritet när färgämnet inte tränger in (figur 2B). Dessutom interkalerar 7AAD i cytosin- och guaninbaser av DNA och avger fluorescens, vilket underlättar uteslutning av döda celler (figur 2C,D). Dessa procedurer resulterade i en cellrenhet på 98,9% ± 0,06% och en cellviabilitet på 95,5% ± 4,2% i 10 utförda experiment.
Figur 2: Morfologi och livskraft hos nyrenade neutrofiler. (A) Efter gradientrening bekräftades den typiska neutrofila morfologin av Wrights färgning (100x). Cellerna visade en multilobed kärna som är karakteristisk för mogna neutrofiler i blodomloppet och (B) optimal livskraft genom trypanblå uteslutning utan membranavbrott. (C) Analys av SSC kontra FSC genom flödescytometri bekräftar en population som motsvarar PMN, vilket ger cellrenhet på 98,9% ± 0,06% (n = 10). (D) PMN-punktdiagram presenteras (ofärgade celler, vänstra paneler kontra 7AAD-färgade cellhögra paneler) med sina respektive histogram (ofärgad-blå kontra färgad-röd), vilket indikerar en hög cellviabilitet på 95,5% ± 4,2% (n = 10) i de nyligen isolerade neutrofilerna jämförde kontrollcellerna permeabiliserade med 0,1% Triton (nedre paneler) för att validera resultaten. 7AAD-färgämnet binder till DNA och utesluts från livskraftiga celler, så tvättmedelsförbehandling orsakade förändringar i cellmembranet och tillät inträde av 7AAD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Morfologi och sammansättning av NET inducerad av kemiska och mikrobiologiska stimuli
Figur 3 visar representativa bilder som bevisar in vitro-NET-induktion genom verkan av kemiska (PMA, HOCl) eller mikrobiella (C. albicans, S. aureus och P. aeruginosa) medel efter 4 timmars inkubation (figur 3A). NET-sammansättningen bestämdes genom DNA/LL37-färgning, och bilderna togs för kvantifiering av genomsnittliga gråvärden i området med ImageJ (figur 3B,C). Suicidal (lytisk) eller vital (icke-lytisk) NET-bildning beskrevs baserat på deras morfologi. Som jämförelse visade ostimulerade kontrollneutrofiler odlade i HBSS i 4 timmar LL37 lokaliserade i cytoplasman med kondenserat multilobed-segmenterat kromatin (figur 3A 1-3), karakteristiskt för dessa viloceller.
PMA är en potent ROS-inducerare genom PKC-aktivering, vilket fungerar som en positiv kontroll för att inducera suicidal (lytisk) NET-bildning. Bilderna av PMA-inducerade NET visar nätverk med riklig kromatindekondensation som bildar molnliknande strukturer associerade med självmordsvägen (figur 3A 4-6), där neutrofilen dör på grund av att rikligt DNA släpps ut i det extracellulära utrymmet som täcker stora delar av det analyserade området. Inom dessa molniga områden som täckte DNA samlokaliserades LL37, både intra- och extracellulärt i höga koncentrationer (figur 3A 6, B-C). Däremot är HOCl en fysiologisk, biokemisk förening som genereras som en produkt av den oxidativa aktiviteten hos MPO. NETs bildade med HOCl visade mindre DNA-dispersion i det extracellulära utrymmet med trådformig morfologi som verkar härledas från cellmembranet (figur 3A 7-9). Sådana morfologiska egenskaper motsvarar den vitala NET-bildningen, och de visade inte samlokalisering av LL37 med DNA-filamenten; LL37 förblev lokaliserad på kärnkraftsnivå (figur 3A 7-9,C). Dessa resultat indikerar att dessa kemiska medel under liknande kontrollerade förhållanden visar skillnader i sammansättningen av de frigjorda NET: erna, både DNA och LL37.
Analys av NETs inducerade av mikroorganismer visade att pseudohyfer av C. albicans inducerade nätverk med låga koncentrationer av DNA som släpptes ut i det extracellulära utrymmet med trådformiga strukturer, vilket belyser närvaron av anucleated cytoplastliknande strukturer som är karakteristiska för den vitala NET-bildningen (Figur 3A 10-13), som inte observeras med HOCl och S. aureus som aktiverar samma väg. Under tiden samlokaliseras LL37 med DNA på cellulär nivå, och låga koncentrationer är associerade med pseudohyfer, vilket avgränsar deras förökning. Båda komponenterna visade inte statistiskt signifikanta skillnader från kontrollen med HBSS (figur 3B,C). S. aureus är en av de vanligaste patogena bakterierna i världen, med förmågan att inducera NET som visar en vitalliknande morfologi som tidigare rapporterats i flera studier15,19. Rikligt DNA frigjordes i statistiskt signifikanta koncentrationer som trådformiga strukturer som samlokaliserades med LL37 och bildade bakteriekluster, vilket indikerar att ställningen kan avgränsa och gynna eliminering av bakterierna (figur 3A 14-17). Å andra sidan inducerade den gramnegativa bakterien P. aeruginosa frisättningen av stora koncentrationer av DNA med en grumlig morfologi associerad med självmords-NET-bildningen, och LL37 samlokaliserades signifikant med DNA och bakterier (Figur 3A 18-21,B,C).
Visualisering av NET genom fluorescensmikroskopi visade att NETs inducerade av HOCl , S. aureus och C. albicans presenterar vitalliknande morfologi med trådformiga strukturer. Men endast S. aureus ledde till frisättning av statistiskt signifikanta mängder DNA. Morfologin hos de andra två stimuli (PMA och P. aeruginosa)-inducerade NETs motsvarar typen av självmords-NET-bildning, med statistiskt signifikanta mängder DNA och LL37 jämfört med ostimulerade neutrofiler. Det fanns rikliga molnliknande DNA-strukturer, mer signifikanta i NETs inducerade av P. aeruginosa än de som inducerades av PMA.
Figur 3: DNA- och LL37-sammansättning och morfologi hos NET inducerad av kemiska och mikrobiella stimuli. (A) Humana blod-härledda neutrofiler stimulerades med PMA (4-6), HOCl (7-9), pseudohyfer av C. albicans (10-13), S. aureus (14-17), P. aeruginosa (18-21) och en ostimulerad kontroll (1-3) i HBSS, för 4 h. NET visualiserades med hjälp av DNA-DAPI (blå), anti-LL37 Alexa Fluor 594 (röd), eller isotypkontroll, och mikroorganismer färgades med 5 μM CFSE (grön). Bilder visar representativa fluorescensmikroskopiresultat av 10 oberoende experiment utförda i tre exemplar. (B–C) Grafer visar medelvärden ± SD för signalens genomsnittliga gråvärde per område för de angivna färgerna på fem bilder (fyra ytterligheter och mitten) per brunn och analyseras med ImageJ-programvaran för (B) DAPI-DNA och (C) Alexa Fluor 594-LL37-färgning. ANOVA utfördes för att jämföra grupper av experimentella förhållanden med en konfidensnivå på 95%. * = p ≤ 0,05. HBSS = Hanks balanserade saltlösning; PMA = phorbol myristate acetat; HOCl = hypoklorsyra. Anpassad från Sosa-Luis et al.16 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Enzymatisk aktivitet av NE, CG och MPO i NET inducerad av kemiska och mikrobiologiska stimuli
Ett annat mål med denna studie var att kvantifiera aktiviteten hos enzymer som beskrivs som centrala komponenter i NET, såsom NE, CG och MPO, som är rikliga med antimikrobiell aktivitet härledd från azurofila granuler. Därför inducerades NET och cellnätverken behandlades med DNase, vilket gynnade frisättningen av strukturassocierade proteiner, och enzymaktiviteten bestämdes med hjälp av kolorimetriska analyser. Analysen visade restaktivitet för NE (2,3% ± 0,6%), CG (6,2% ± 2,7%) och MPO (21,4% ± 2,0%) associerade med DNA-strukturer härledda från alla NET, jämfört med den maximala aktiviteten erhållen från lyserade vilande neutrofiler tagna som 100% (Figur 4). NET inducerade av de flesta stimuli visade låga enzymaktivitetsvärden för NE och CG, förutom S. aureus för NE och PMA för CG, som visade statistisk signifikans. Å andra sidan ökade MPO-aktiviteten i alla stimuli utan någon statistiskt signifikant skillnad mellan dem, men var signifikant mellan grupperna av kemiska stimuli kontra mikroorganismer.
Dessa resultat visar genomförbarheten av det presenterade protokollet, vilket ger information om heterogeniteten i NET-sammansättning genom att kvantifiera DNA, LL37 och enzymaktivitet (NE, CG och MPO) med olika stimuli under samma in vitro-förhållanden . Resultaten avslöjar att neutrofilerna kan reagera differentiellt och specifikt på varje stimulans genom att bilda lämpliga DNA-strukturer med olika antimikrobiella proteiner under NET-bildning.
Figur 4: Återstående enzymatisk aktivitet i NET inducerad av kemiska och mikrobiella stimuli. Kolorimetriska analyser användes för att utvärdera den enzymatiska aktiviteten i NETs efter att DNA-proteinstrukturer har frigjorts av DNase för att analysera just NET-bundna proteiner. Diagrammet visar medelvärdet ± SD för procentandelen kvarvarande enzymatisk aktivitet i NET inducerad av varje kemisk eller mikrobiell stimuli jämfört med den maximala enzymatiska aktiviteten (i supernatanterna hos neutrofilerna lyserade genom frys-upptining vid -70 °C) erhållna för NE (3,54 ± 2,52 U / ml), CG (34,90 ± 25,85 U / ml) och MPO (0,29 ± 0,13 U / ml). Basal visar den enzymatiska aktiviteten i supernatanterna hos neutrofilerna som hålls i HBSS-buffert. Statistisk analys utfördes med data från 10 oberoende experiment av ANOVA för att jämföra grupper av experimentella förhållanden med en konfidensnivå på 95%. * och ** = p ≤ 0,05 jämfört med alla andra stimuli. = p ≤ 0,05 som jämför de signalerade grupperna av stimuli. NE = neutrofilt elastas; CG = cathepsin G; MPO = myeloperoxidas; PMA = phorbol myristate acetat; HOCl = hypoklorsyra. Anpassad från Sosa-Luis et al.16 med tillstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En mycket ren population av viabla neutrofiler måste erhållas för att inducera frisättning av NET eftersom dessa celler har en begränsad ex vivo-livslängd på i genomsnitt 8 timmar, en period inom vilken alla experiment måste utföras. För detta ändamål är den ideala metoden dubbeldensitetsgradienten för att optimera reningstiden genom att isolera icke-aktiverade celler som är mer mottagliga för exogen stimulering, i motsats till Ficoll-Histopaque-gradient eller Dextran sedimenteringstekniker17. En annan fördel med dubbeldensitetsgradientmetoden är dess relativt låga kostnad jämfört med cellanrikningstekniker med hög renhet såsom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och magnetiskt aktiverad cellsortering (MACS) som förlitar sig på cellytans antigener, såsom CD16hej i neutrofiler. Förutom en hög kostnad kan dessa sorteringsmetoder också orsaka oavsiktlig aktivering av målcellerna under antikropp-antigeninteraktionen och öka ex vivo-tiden för neutrofiler, eftersom dessa två tekniker vanligtvis används efter densitetsgradientrening. Cellmorfologi och viabilitet utesluter förändringar i de renade neutrofilerna och bekräftar att de observerade förändringarna är specifika som svar på de tillsatta stimuli kontra de vilande neutrofilerna under samma experimentella förhållanden utan stimulering (Figur 2). Detta bekräftar protokollets effektivitet som en aseptisk och reproducerbar metod för neutrofilisolering utan att förändra cellviabiliteten och morfologin. Detta bidrag av eosinofiler, som vanligtvis finns i blod med räkningar under 2%, uteslöts och förändrade inte den statistiska signifikansen av resultaten, eftersom eosinofiler inte observerades i provet på Wrights färgning vid analys av olika fält (Figur 2A). Detta kan bekräftas genom flödescytometri med hjälp av CD16-markören, som inte finns i eosinofiler men finns i höga koncentrationer i neutrofiler.
I studien av NETs finns det konsensus och avvikelser18; Olika studier har rapporterat motsägelsefulla resultat som svar på samma stimuli, vilket kan bero på skillnader i neutrofilisoleringsprotokollen, den långvariga experimenttiden som aktiverar neutrofilerna spontant, buffertarna och olika koncentrationer av samma stimulans som används. Därför är det viktigt att homogenisera protokollen med uttryckliga detaljer så att protokollen kan replikeras konsekvent för att möjliggöra jämförelser. De vanligaste metoderna som används är immunocytokemi och immunhistokemi, som möjliggör identifiering av strukturer som innehåller extracellulärt DNA-samlokalisering med granul-härledda proteiner18 som vanligtvis innehåller komponenter med bakteriedödande aktivitet som kan förstöra virulensfaktorer8, såsom NE, MPO, CG och LL37. Dessutom rekommenderar nyligen genomförda studier för övervakning av NET-bildning att analysera denna process med hjälp av realtidsmetoder för levande celler, såsom intravital mikroskopi 1,18. Få studier som denna studie förenar de experimentella förhållandena för att jämföra sammansättningen av NET under olika stimuli (bakterier, svampar och kemikalier)1,9, med hjälp av tekniken för fluorescensmikroskopi för att visualisera spridningen av DNA-DAPI, LL37-Alexa 594, och dess samlokalisering med mikroorganismer-CFSE. På samma sätt frigör behandlingen med DNase endast de proteiner som är associerade med DNA-strukturen hos NET, så den spektrofotometriska tekniken säkerställer kvantifiering av den enzymatiska aktiviteten hos MPO, NE och CG, vilket utesluter att de kommer från degranulering.
NET-morfologi kan definieras som självmordsbenägen eller vital, med möjlighet att differentiera dem enligt den dispersion som antagits av DNA i det extracellulära utrymmet. Den självmordsbenägna vägen kännetecknas av en molnliknande struktur, medan den vitala vägen är en trådformig form15,19,20. Baserat på detta indikerar figur 3 att PMA och P. aeruginosa representerar en självmordsbenägen NET-typ. Dessa resultat validerar denna teknik genom att under våra förhållanden replikera vad som beskrevs av Brinckman et al. med PMA, den vanligaste föreningen för att inducera NETs genom att utlösa aktiveringen av c-Raf, MEK, Akt, ERK och proteinkinas C (PKC), som i sin tur aktiverar NADPH-oxidas11 och orsakar en kraftig ökning av intracellulär ROS. Dessutom utesluter resultaten möjligheten att externa artefakter, inkubationstider eller den korta mekaniska omrörningen som används i denna studie orsakade spontan in vitro-frisättning av NET med ett molnliknande utseende som vissa författare har nämnt17, eftersom vilande neutrofiler utan stimulering efter 4 h visade en multilobed kärna med intakt kromatin (Figur 3A 1-3).
På samma sätt induceras NETs med HOCl, C. albicans, och S. aureus presenterade trådformig morfologi, motsvarande den vitala NET-morfologin (figur 3A 7-17). Denna väg kännetecknas av neutrofiler som svarar på ett unikt och oxidantoberoende sätt utan celllys eller till och med bristning av plasmamembranet, endast spirande vesiklar med kärn-DNA15. Detta resultat validerar återigen potentialen hos denna teknik att urskilja båda morfologiska utseenden av NET-produktion som självmordsbenägna eller vitala. När det gäller NET-sammansättningen visade de resultat som erhölls med hjälp av denna metod statistisk signifikans i differentialkraven för LL37 för PMA- och P. aeruginosa-stimulering (figur 3C). NE (endast för S. aureus) och MPO-aktiviteten var högre i mikroorganismerna jämfört med den kemiska gruppen (figur 4). Denna information bevisar återigen neutrofil selektivitet när det gäller att svara på varje stimulans, som rapporterats av Kenny et al.5 när man jämför olika stimuli i NET-produktion in vitro. Det beskrevs att produktionen av NET i vissa fall behöver ROS eller har olika krav på specifika enzymer såsom PAD4, medan i andra är närvaron av dessa molekyler irrelevant för deras produktion5.
En begränsning av tekniken för att kvantifiera DNA i det extracellulära rummet som beskrivs i denna studie är att DNA också kan komma från andra former av celldöd med en nekrotisk morfotyp, och det är omöjligt för denna teknik att skilja mellan dem. Det har emellertid rapporterats att NET kan differentieras från denna process genom att bekräfta närvaron av granulära proteiner18. På samma sätt är DNA: s ursprung okänt, vilket kan bekräftas genom att förstärka organellspecifika, mitokondriella eller kärngener med PCR19. En annan svaghet är att skilja NET från andra fibrösa strukturer som fibrin; En sådan urskiljning skulle kräva sofistikerade tekniker som högupplöst svepelektronmikroskopi20. Sammanfattningsvis tillåter de presenterade teknikerna in vitro-karakterisering (under liknande förhållanden) av kompositionen och morfologin hos NETs inducerad med olika stimuli, vilket visar neutrofilernas selektivitet vid frisättningen av några av deras komponenter (DNA, LL37, NE, CG, MPO) till en specifik stimulans. Dessa tekniker kan anpassas för att utvärdera effekten av exogena lösliga faktorer eller cellulär kontakt på sådana NET-egenskaper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett grundvetenskapligt bidrag (#285480) från CONACyT och av institutionen för klinisk immunologiforskning vid fakulteten för biokemiska vetenskaper, Universidad Autónoma 'Benito Juárez' de Oaxaca. A.A.A, S.A.S.L och W.J.R.R. har doktorandstipendier med CONACyT-nummer #799779, #660793 respektive #827788.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well plate for cell culture | Corning | 3526 | |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Pharmingen | 51-668981E | |
| 96 Well plate for cell culture | Costar | 3596 | Flat bottom |
| Agitator | CRM Globe | CRM-OS1 | |
| Antibody LL37 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166770 | |
| Blood collection tubes | BD VACUTAINER | 368171 | K2 EDTA 7.2 mg |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) | Sigma-Aldrich | 21878 | |
| Centrifuge | Hettich | 1406-01 | |
| Coverslip | Madesa | M03-CUB-22X22 | 22 mm x 22 mm |
| Dulbecco´s phosphate-buffered saline (DPBS) | Caisson | 1201022 | |
| Falcon tubes 50 mL | CORNING | 430829 | |
| Flow Cytometry Tubes | Miltenyi Biotec | 5 mL - Without caps | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Analyze flow cytometry data | |
| Fluorescence microscope | DM 2000 | LEICA | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Incubator | NUAIRE | UN-4750 | |
| MACSQuant Analyzer | Miltenyi Biotec | Flow cytometer | |
| Microplate reader photometer | Clarkson Laboratory - CL | ||
| Microtubes 1.5 mL | Zhejiang Runlab Tech | 35200N | wire snap |
| Minitab Software | Minitab | Statistical analysis | |
| Needles | BD VACUTAINER | 301746 | Diameter 1.34 mm |
| Optical microscope | VELAB | VE-B50 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | Solution for density gradient |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Caisson | PBL07-500ML | |
| Pyrex culture tubes | CORNING | CLS982025 | N°9820 |
| RPMI 1640 1x | Corning | 10-104-CV | contains Glutagro |
| Slides | Madesa | PDI257550 | 22 mm x 75 mm |
| Trypan Blue solution 0.4% | SIGMA | T8154-100ML |
References
- De Buhr, N., Maren, K. B. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Takei, H., Araki, A., Watanabe, H., Ichinose, A., Sendo, F. Rapid killing of human neutrophils by the potent activator phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) accompanied by changes different from typical apoptosis or necrosis. Journal of Leukocyte Biology. 59 (2), 229-240 (1996).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. eLife. 6, 24437 (2017).
- Schultz, B. M., Acevedo, O. A., Kalergis, A. M., Bueno, S. M. Role of extracellular trap release during bacterial and viral infection. Frontiers in Microbiology. 13, 798853 (2022).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 134-147 (2018).
- Delgado-Rizo, V., et al. Neutrophil extracellular traps and its implications in inflammation: An overview. Frontiers in Immunology. 8, 81 (2017).
- Petretto, A., et al. Neutrophil extracellular traps (NET) induced by different stimuli: A comparative proteomic analysis. PLoS One. 14 (7), 0218946 (2019).
- Neumann, A., et al. Novel role of the antimicrobial peptide LL-37 in the protection of neutrophil extracellular traps against degradation by bacterial nucleases. Journal of Innate Immunity. 6 (6), 860-868 (2014).
- Hakkim, A., et al. Activation of the Raf-MEK-ERK pathway is required for neutrophil extracellular trap formation. Nature Chemical Biology. 7 (2), 75-77 (2011).
- Sabbatini, M., Magnelli, V., Renò, F. NETosis in wound healing: When enough Is enough. Cells. 10 (3), 494 (2021).
- Metzler, K. D., Goosmann, C., Lubojemska, A., Zychlinsky, A., Papayannopoulos, V. A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dynamics during NETosis. Cell Reports. 8 (3), 883-896 (2014).
- Clark, S. R., et al. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood. Nature Medicine. 13 (4), 463-469 (2007).
- Pilsczek, F. H., et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus. Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).
- Sosa, S. A., et al. Structural differences of neutrophil extracellular traps induced by biochemical and microbiologic stimuli under healthy and autoimmune milieus. Immunologic Research. 69 (3), 264-274 (2021).
- White, P. C., et al. Characterization, quantification, and visualization of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1537, 481-497 (2017).
- Boeltz, S., et al. To NET or not to NET: current opinions and state of the science regarding the formation of neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 26 (3), 395-408 (2019).
- Yousefi, S., Mihalache, C., Kozlowski, E., Schmid, I., Simon, H. U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA to form neutrophil extracellular traps. Cell Death and Differentiation. 16 (11), 1438-1444 (2009).
- Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. The Journal of Cell Biology. 198 (5), 773-783 (2012).
