Summary
右心室衰竭和功能性三尖瓣反流与左侧心脏病和肺动脉高压有关，这可显著降低患者的发病率和死亡率。建立慢性绵羊模型来研究右心室衰竭和功能性三尖瓣反流将有助于了解其机制、进展和可能的治疗方法。
Abstract
与右心室功能障碍相关的严重功能性三尖瓣反流 （FTR） 的病理生理学知之甚少，导致临床结果欠佳。我们着手建立FTR和右心衰竭的慢性绵羊模型，以研究FTR的机制。20只成年雄性绵羊（6-12月龄，62±7公斤）接受了左胸切开术和基线超声心动图。在主肺动脉 （PA） 周围放置并收紧肺动脉束带 （PAB），使收缩期肺动脉压 （SPAP） 至少翻倍，诱发右心室 （RV） 压力超负荷和右心室扩张体征。PAB将SPAP从21±2毫米汞柱急剧增加到62±2毫米汞柱。对动物进行8周随访，用利尿剂治疗心力衰竭症状，并使用监测超声心动图评估胸腔和腹部积液。三只动物在随访期间因中风、出血和急性心力衰竭而死亡。2个月后，进行正中胸骨切开术和心外膜超声心动图。在存活的17只动物中，3只发生轻度三尖瓣反流，3只发生中度三尖瓣反流，11只发生严重三尖瓣反流。八周的肺动脉束带治疗导致右心室功能障碍和显著FTR的稳定慢性绵羊模型。该大型动物平台可用于进一步研究右心室衰竭和功能性三尖瓣反流的结构和分子基础。
Introduction
右心室衰竭（RVF）被认为是导致心脏病患者发病率和死亡率的重要因素。裂谷热最常见的病因是左侧心脏病和肺动脉高压1。在裂谷热进展期间，右心室功能障碍、瓣环扩张和瓣膜下重塑可能引起功能性三尖瓣反流（FTR）。中度至重度 FTR 是死亡率的独立预测指标2，3，据估计，80%-90% 的三尖瓣反流病例本质上是功能性的4。FTR 本身可能通过影响后负荷或预负荷来促进不良心室重塑5.三尖瓣历来被认为是被遗忘的瓣膜6，人们认为治疗左侧心脏病将解决相关的右心室病理和FTR7。最近的数据显示，这是一种错误的策略，目前的临床指南提倡对FTR4采取更积极的方法。然而，与右心室功能障碍相关的严重FTR的病理生理学仍然知之甚少，导致临床结果欠佳8。目前可用的裂谷热大型动物模型基于压力、体积或混合过载。我们之前曾描述过裂谷热和TR的大型动物模型，但仅在急性情况下9。
目前的研究重点是肺动脉束带（PAB）的慢性绵羊模型，以增加右心室后负荷（压力超负荷）并诱导右心室功能障碍和FTR。与肺动脉高压模型相比，后负荷模型可靠且可重复，肺动脉高压模型的微脉管系统变化更难预测，更可能10。该研究的目的是开发一种裂谷热和FTR的慢性大型动物模型，该模型将最准确地模拟左侧心脏病和肺动脉高压患者的右心室压力超负荷。建立这样的模型将允许深入研究与右心室功能障碍和三尖瓣功能不全相关的心室和瓣膜重塑的病理生理学。选择绵羊模型是基于我们之前对二尖瓣的工作以及支持人类和绵羊心脏之间解剖学和生理学相似性的已发表文献11，12，13。
在这项研究中，20只成年绵羊（62±7公斤）接受了左胸切开术和主肺动脉束带（PAB），使收缩期肺动脉压（SPAP）至少翻倍，从而诱发右心室压力超负荷。对动物进行8周随访，当临床上明显时，用利尿剂治疗心力衰竭的症状。定期进行超声心动图监测，以评估右心室功能和瓣膜能力。在完成模型开发实验方案（8周）后，将动物带回手术室进行正中胸骨切开术，并在心外膜和心内结构上植入超声显微镜晶体。该手术使用心跳的体外循环和双腔控制进行。在稳定的稳态血流动力学环境中使动物脱离体外循环或获取超声测微数据没有问题，而无需正性肌力药物进行右心支持。我们预计在不久的将来，在终末期和生存实验中使用右胸切开术方法进行三尖瓣环成形术和其他右心手术。目前的经验使我们相信，有可能毫无困难地使动物脱离体外循环，并且长期存活是可行的。因此，我们相信该模型将允许进行临床相关的心脏手术。以下是为执行绵羊实验方案而执行的步骤（围手术期和手术期）的描述。
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Protocol
该协议已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准（协议 2020-035，于 2020 年 7 月 27 日批准）。在这项研究中，使用了20只体重62±7公斤的成年公羊。
1.术前步骤
- 手术前12小时（过夜）禁食动物。
- 将动物放在羊椅上（图1），并使用长11 Fr引入鞘（鞘长度= 10 cm）准备右颈静脉插管。
- 用剪刀沿静脉放置部位剃须 - 颈部的右前侧，距离右颈静脉中线外侧约 10-15 厘米。
- 将动物的头部向左转动，使颈部的右侧前侧和外侧暴露出来。定位颈静脉病程。为了促进这一点，压缩颈部底部以扩张静脉。
- 用氯己定和含酒精的磨砂膏清洁，并用1%利多卡因局部麻醉。
- 如前所述，颈静脉位于颈部中至上三分之一处。
- 用垂直于静脉的数字 11 刀片切割静脉上方的皮肤。
- 插管与14G血管导管;就位后（血液从针头中流出或发现血液），取出针头，离开导管，通过导丝，取出导管，放置 11 Fr 鞘并固定它。
- 通过抽取暗红色血液并进行盐水冲洗来确认插入部位的流动和无肿胀，确保套管的通畅和正确放置。
- 以1.0-1.5mg / kg静脉注射（IV）开始诱导丙泊酚。
- 使用 5 号刀片的喉镜用 9 号气管内 （ET） 插管插管。为此，一个人应该固定下颌和舌头，而另一个人识别气管，插入 ET 管，并给密封袖带充气。通过双侧呼吸音和 ET 管上的冷凝确认正确放置。
- 静脉给予镇痛药丁丙诺啡 0.01 mg/kg，并使用 240 mg 庆大霉素和 1 g 头孢唑啉进行抗生素预防。
- 将动物从羊椅上转移到手术台上，并将其放在右侧。
2. 手术步骤
- 以 15 mL/kg（12-18 次呼吸/分钟）通风，氧气流量为 4 L/min，异氟醚为 2.5%-4.0%。通过检查下颌音调和眼睛旋转来确认适当的麻醉，以确保受试者处于手术水平（第 3 阶段）。
- 通过涂抹眼科药膏润滑双眼，并插入胃管以确保气体和食物排出。连接心电图 （EKG）、脉搏血氧仪 （SpO 2）、二氧化碳仪 （ETCO2） 和体温监测器。通过鳄鱼夹将心电图肢体导联线（I、II、III）连接到皮肤，将 SpO 2 传感器连接到动物的脸颊，将 ETCO2 管连接到气管插管，并将温度探头通过鼻孔进入鼻咽。
- 准备操作字段。剃除左前胸，用洗必泰和含酒精的磨砂膏清洁，并用无菌窗帘覆盖。
- 在第四肋间隙的水平上做一个10厘米长的皮肤和皮下切口。
- 通过识别胸廓入口并向下计数肋间隙来确认正确的肋间隙。随后，继续在中心和第四肋间隙切口。
- 分开肋间肌，打开胸腔，并用迷你开胸术Finochietto式牵开器展开肋骨。在进行开胸术时，注意不要损伤切口胸骨边界的左侧乳内动脉 （LIMA） 和上缘的肺。
- 进行基线心外膜超声心动图检查，以评估双心室功能和瓣膜能力。非标准视图的发生可能是由于以三尖瓣 （TV）、左右心室功能以及肺动脉血流为重点的小型开胸术所致。
- 识别切口胸骨边缘的LIMA细胞，切除其周围的相邻组织，并准备建立动脉管线进行压力监测。
- 在动脉周围放置两条 4-0 丝线，一条在插管部位的近端，一根在插管部位远端（用于固定动脉导管）。
- 使用带有夹具的钛夹将 LIMA 远端夹在计划的插管部位，以防止插管期间回流出血。
- 用 11 号刀片在 LIMA 中做一个垂直切口，该切口是导管周长的一半。
- 插入 18 G 血管导管，并将其连接到动脉管路模块。当压力达到约120/80mmHg时，使用之前放置的两条4-0丝线将导管固定到位。
- 从肺动脉窦水平开始，沿着主肺动脉（MPA）横向进行4-5厘米的心包切开术，注意不要损伤左膈神经。
- 在打开的心包上缝合四到五条回缩针，以形成心包孔，因为这有利于肺干和主动脉之间的暴露和夹层。
- 使用钝的直角镊子从距其原点约 2-3 cm 的升主动脉 （AA） 中解剖 MPA，从左心耳水平开始，向 AA 方向工作。要将MPA与AA完全分离，请使用电烙或剪刀去除两个结构之间的结缔组织。
- 用钝的直角夹将脐带绕在 MPA 周围。通过在距离 MPA 窦远端 1 cm 处放置 5-0 单丝钱包绳缝合线来建立 MPA 压力线。
- 插入 20 G 血管导管，并将其连接到监测管线。确保在扣住脐带之前获得正确的 MPA 和动脉线读数;动脉和肺压可能有所不同，但应与人类患者值相当。
- 握住脐带的两端，并将它们夹在一起以减少 MPA 的管腔。
- 通过连续使用夹子施加器逐渐收紧束带，将每个夹子放置在前一个夹子下方，直到全身血压开始稳步下降（图2）。此时，取下最后一个放置的夹子以稳定全身血压。
- 当达到最大紧缩和稳定的血流动力学条件时，使用 5-0 单丝缝合线将脐带固定在 MPA 的外膜上，以避免远端迁移。
- 进行束带后超声心动图检查以评估双心室功能和瓣膜能力，如步骤 2.7 所示。移除 MPA 压力管和动脉管，并通过检查放置束带和动脉管的区域是否有出血来确保良好的止血。
- 将胸管插入左胸，入口部位在初始切口下方一个肋间隙。用两条Vicryl 2号缝合线闭合肋骨，并用三层连续缝合线闭合伤口：Vicryl 2-0用于肌肉和皮下组织，Prolene 3-0用于皮肤。
- 当没有看到出血迹象时，在将动物从呼吸机上断奶之前取出胸管。
- 将动物从呼吸机中断奶，拔管，将其移至单个笼子中，并密切跟踪至少1小时。将中央静脉输液管留在原位，并使用松散的绷带固定在颈部。
注意：术后用丁丙诺啡（0.05mg / kg）和氟尼辛（1.2mg / kg）维持术后静脉镇痛3天。
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Representative Results
在完成模型开发的实验方案（近8周）后，将动物带回手术室进行正中胸骨切开术，并在心外膜和心内结构上植入超声显微镜晶体。该手术是使用心跳和双腔控制的体外循环进行的，如我们小组之前详细描述的那样9。在稳定的稳态血流动力学环境中，从体外循环断奶或获取超声微缩测量数据没有问题。
肺动脉束带使SPAP从21±2mmHg增加到62±9mmHg（p = 0.001）。三只动物在随访期间因中风、出血和急性心力衰竭而死亡。在存活的17只动物中，3只发生轻度TR，3只发生中度TR，11只发生重度TR。随访期后的平均TR等级（0-4;0 =无或痕量，1=轻度，2=中度，3=中度重度，4=重度）从0.8±0.4增加到3.2±1.2（p = 0.0001）。 表1 中提供的数据显示了肺束带8周后右心室衰竭进展的迹象和显着TR的发展，与 图3所示代表性动物的超声心动图检查一致。
图1：羊椅。 羊椅极大地促进了动物成像和麻醉的诱导，以及静脉内插管的放置。它通常用于羊毛剪毛，动物通常熟悉这个位置，并且在必要的程序中保持相当温顺。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：肺动脉束带的术中视图。 这张照片显示了由脐带穿过主肺动脉形成的肺动脉束带，手术夹用于收紧和固定束带。黄色箭头指向应用于脐带的夹子。缩写：MPA =主肺动脉;PAB = 肺动脉束带。 请点击此处查看此图的大图。
图 3： PAB 后 8 周的术中超声心动图图像（A = 四腔视图，B = 四腔视图，彩色多普勒显示 FTR）。 请点击此处查看此图的大图。
| 基线 | 8 周 | |
| 心率（b/分钟） | 107±15 | 88±11 |
| 左心室放电率 （%） | 62±3 | 58±4* |
| 斯帕普毫米汞柱 | 62±2 | 40±7* |
| 裂谷和灾区 （%） | 50±14 | 38±7* |
| 叮叮当当 | 1.2±0.1 | 0.8±0.1* |
| TR 级 （0-4） | 0.4±0.5 | 3.2±1.2* |
| 电视环（厘米） | 2.4±0.2 | 3.1±0.2* |
表1：超声心动图和血流动力学数据。 缩写：HR = 心率;左心室射血分数 = 左心室射血分数;SPAP = 收缩期肺动脉压;RVFAC = 右心室分数面积改变;TAPSE = 三尖瓣环平面收缩偏移;TR = 三尖瓣反流（0-4 级）;TV = 三尖瓣。数据显示SD±平均值; *P < 0.05 与基线相比，通过配对 t 检验。
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Discussion
在该模型中，8 周的肺动脉束带导致右心室功能障碍的稳定慢性绵羊模型，并且在大多数情况下，显着的 FTR。所提出的慢性PAB模型的优点包括在手术过程中精确的后负荷调整，尽管其对RV反应的影响可能不同。该模型适用于评估不同程度的右心室衰竭或FTR，其严重程度由肺动脉收缩程度调节。此外，与肺动脉高压模型不同，在主PA水平上应用固定和稳定的阻力，排除了肺血管床变化对后负荷的影响11。肺动脉栓塞的绵羊肺动脉高压模型尚未被证明可预测地诱发裂谷热14。然而，充分收紧束带以达到右心衰竭所需的程度（表型）15可能具有挑战性，更不用说确切的TR分级了。这反映在研究中，因为所有动物（62±9mmHg）都达到了相似的PA峰值压力，但它与TR或RHF没有任何相关性。这可能表明应变的右心房对后负荷增加的重塑反应存在生物学变异性。然而，在大多数情况下，由于后负荷增加以及与RV重塑和故障相关的后续变化，产生了显着的TR。
该绵羊模型专门设计用于诱导功能性三尖瓣反流，与其他主要针对右心功能障碍的模型不同。TR的可用模型主要基于TV和瓣膜下装置的结构损伤16，17，因此这意味着这些大多是RHF的容量过载模型，不能代表FTR的真实性质。我们之前已经开发了一个心动过速诱发的心肌病模型18，该模型导致双心室衰竭和功能性二尖瓣和三尖瓣反流。目前的模型允许在孤立性右心室功能障碍的情况下研究和治疗FTR。最近，引入了一种带有充气带和皮下端口的渐进肺动脉束带模型19，这可能提供该技术的扩展。基于导管的肺动脉狭窄尚未被描述，但这种实验技术肯定即将出现。
执行此协议时有几个关键步骤。打开第四肋间隙时必须小心，以免损伤用于建立动脉线的左侧乳内动脉。下一个关键步骤是将MPA从左心耳旁边的升主动脉中释放出来，并将脐带穿过MPA。最重要的是，在肺动脉紧绷过程中，正确调整束带的松紧度，因为过度收紧会导致动物早期死亡，而束带太松则不会诱发足够程度的右心衰竭和FTR。随着夹子应用的连续应用，束带逐渐收紧，直到全身血压开始稳步下降。善于迅速移除最后一个夹子以避免血流动力学衰竭和心室颤动至关重要。紧急心脏药物应随时可用且易于获得。
该模型受到需要开胸术和肺动脉直接手术操作的限制，这代表了手术风险并导致粘连的形成，使后续手术更加困难。此外，使用上述方案，一些动物经历心力衰竭和功能性TR的快速进化，这与8周生存率不相容。因此，预计流失率为15%-20%。该技术可以根据手头的科学问题进行修改。在目前的研究中，实验的目标是诱导显着的功能性三尖瓣反流，因此使用积极的肺束带。然而，可以修改该模型以研究不同程度的心室后负荷（肺动脉高压的替代物）对右心室功能和重塑的影响。在这种情况下，可以调整肺束带以达到几种不同水平的肺动脉压，以允许研究不同后负荷水平的影响。此外，相同的模型可以转换为啮齿动物20 或使用可充气肺带和皮下注射口21以分级方式用于绵羊。
该技术将来可用于研究功能性三尖瓣反流及其相关的右心室、环状和瓣膜下重塑以及组织变化的机制。该模型适用于反向重塑的研究，因为肺带通过重复开胸术是可逆的。此外，该模型已被用于研究右心室机械辅助装置21，并且随着右侧机械支持领域的不断发展，预计它将更频繁地被利用。
综上所述，所提出的右心衰竭和功能性三尖瓣反流的大型动物模型对产生相对较低的失访率的FTR具有可重复性和有效性。该大型动物平台可用于进一步研究右心室衰竭和功能性三尖瓣反流的结构和分子基础。该模型还可以促进评估针对故障房车和电视设备的干预措施。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
该研究由Spectrum Health的Meijer心脏和血管研究所的内部资助资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia Machine Drager Narkomed MRI-2 | Drager | 4116091-001 | |
| angiocatheter | BD | BD382268 | 14GAx8.25cm |
| BD ChloraPrep Scrub Teal 26 ml applicator with a sterile solution | |||
| Blade #11 | Bard-Parker | 371111 | |
| Buprenorphine | HIKMA | ||
| cefazolin 1.0g | Hikma | 0143-9924-90 | |
| Diprivan 200mg/20ml | 63323-0269-29 | FRESENIUS KABI | |
| Electrosurgical generator Valleylab Force FX | Valleylab | CF5L44233A | |
| Gentamicin Sulfate 40 mg / mL | Fresenius | 406365 | |
| i-Stat Blood analyzer MN 300 | Abbott | ||
| Lidocaine HCl 1% | Pfizer | 243243 | |
| Open ligating clip appliers Horizon Medium | Teleflex | 237061 | |
| PERMAHAND Silk Suture | PERMA HAND | SA 63H | |
| Pinnacle Introducer sheath | Terrumo | RSS102 | sheath length 10cm |
| Prolene 3-0 | ETHICON | 8684H | |
| Titanium Clips Medium | Teleflex | 2200 | |
| Umbilical tape | Ethicon | EFA 1165 | |
| VICRYL 2 coated undyed 1X54" TP-1 | ETHICON | J 880T | |
| Vicryl 2-0 | ETHICON | J269H |
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