Summary
Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.
Abstract
Bağırsak epiteli her 5-7 günde bir yenilenir ve kript bölgesinin dibinde bulunan bağırsak epitel kök hücre (IESC) popülasyonu tarafından kontrol edilir. IESC'ler, kendini yenileyen ve çeşitli epitel hücre tiplerine farklılaşan aktif kök hücreleri ve yaralanma durumunda yedek kök hücre görevi gören sessiz kök hücreleri içerir. Bağırsak epitelinin yenilenmesi, bu aktif IESC'lerin kendini yenileyen ve farklılaştıran yetenekleri ile kontrol edilir. Ek olarak, kript kök hücre popülasyonunun dengesi ve kök hücre nişinin korunması, bağırsak yenilenmesi için gereklidir. Organoid kültür, kök hücre sağkalımını ve işlevlerini düzenleyen proteinleri, sinyal moleküllerini ve çevresel ipuçlarını incelemek için önemli ve çekici bir yaklaşımdır. Bu model, hayvan modellerinden daha ucuz, daha az zaman alıcı ve daha manipüle edilebilir. Organoidler ayrıca doku mikro ortamını taklit ederek in vivo alaka düzeyi sağlar. Mevcut protokol, kolonik kriptlerin izolasyonunu, bu izole edilmiş kript hücrelerini üç boyutlu bir jel matris sistemine gömmeyi ve kendi kendini organize etme, çoğalma, kendini yenileme ve farklılaşma yeteneğine sahip kolonik organoidler oluşturmak için kript hücrelerini kültürlemeyi açıklamaktadır. Bu model, bu etkilerin kolonik kök hücrelerin işleyişini nasıl etkilediğini incelemek için claudin-7 gibi spesifik proteinleri nakavt eden, sinyal yollarını aktive eden / devre dışı bırakan vb. Spesifik olarak, sıkı birleşim proteini claudin-7'nin kolonik kök hücre fonksiyonundaki rolü incelenmiştir. Claudin-7, bağırsak homeostazı ve bariyer fonksiyonunu ve bütünlüğünü korumak için hayati öneme sahiptir. Farelerde klodin-7'nin nakavtı, bağırsak iltihabı, epitel hiperplazisi, kilo kaybı, mukozal ülserasyonlar, epitel hücre dökülmesi ve adenomlar sergileyen inflamatuar bağırsak hastalığı benzeri bir fenotipe neden olur. Daha önce, ince bağırsakta bağırsak epitel kök hücre fonksiyonları için claudin-7'nin gerekli olduğu bildirilmiştir. Bu protokolde, claudin-7'nin kalın bağırsaktaki rolünü incelemek için kolonik bir organoid kültür sistemi kurulmuştur.
Introduction
Bağırsak organoid kültürü, kök hücrelerin birincil dokunun bağırsak kriptlerinden izole edildiği ve bir jel matrisi 1,2'ye kaplandığı üç boyutlu (3D) bir ex vivo sistemdir. Bu kök hücreler kendini yenileme, kendi kendini organize etme ve organ işlevselliği yeteneğine sahiptir2. Organoidler doku mikro ortamını taklit eder ve in vivo modellere iki boyutlu (2D) in vitro hücre kültürü modellerinden daha benzerdir, ancak hücrelerden daha az manipüle edilebilir 3,4. Bu model, uygun hücre-hücre yapışmaları, hücre-matris etkileşimleri ve homojen popülasyonların eksikliği gibi 2B modellerde karşılaşılan engelleri ortadan kaldırır ve ayrıca yüksek maliyetler ve uzun zaman dilimleri de dahil olmak üzere hayvan modellerinin sınırlamalarını azaltır5. Bağırsak organoidleri - kolonik kript kaynaklı kök hücrelerden yetiştirilenler için kolonoidler olarak da adlandırılır - esasen in vivo olarak mevcut olabilecek tüm hücre tiplerini ve bir lümeni içeren bir epitel içeren mini organlardır. Bu model, kök hücre nişi, bağırsak fizyolojisi, patofizyolojisi ve bağırsak morfogenezi 3,5,6 gibi bağırsağın birçok yönünü incelemek için sistemin manipülasyonuna izin verir. Ayrıca, enflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) ve kolorektal kanser gibi insan bağırsak bozukluklarını inceleyen, hastaya özgü kişiselleştirilmiş tedavi gelişimini ve doku rejenerasyonunu inceleyen ilaç keşfi için harika bir model sağlar 4,7,8,9. Ek olarak, organoid sistem hücresel iletişimi, ilaç metabolizmasını, canlılığı, çoğalmayı ve uyaranlara verilen cevabı incelemek için de kullanılabilir 7,8. Hayvan modelleri, bağırsak patolojik koşulları için potansiyel terapötikleri test etmek için kullanılabilse de, aynı anda birden fazla ilacı incelemek bir zorluk oluşturduğundan oldukça sınırlıdır. İn vivo olarak daha kafa karıştırıcı değişkenler vardır ve ilişkili maliyet ve zaman sırasıyla yüksek ve uzundur. Öte yandan, organoid kültür sistemi, birçok terapötikin aynı anda daha kısa sürede taranmasına izin verir ve ayrıca hasta kaynaklı organoid kültürün kullanımı yoluyla kişiselleştirilmiş tedaviye olanak tanır 4,8. Kolonik organoidlerin doku organizasyonunu, mikro çevreyi ve işlevselliği taklit etme yeteneği, onları rejenerasyon ve doku onarımını incelemek için mükemmel bir model haline getirir9. Laboratuvarımız claudin-7'nin ince bağırsak kök hücre fonksiyonları üzerindeki etkisini incelemek için ince bağırsak organoid kültür sistemi kurmuştur10. Bu çalışmada, kök hücrelerin koşullu klodin-7 nakavt (cKO) modelinde kendini yenileme, farklılaştırma ve çoğalma yeteneğini veya yetenek eksikliğini incelemek için kalın bağırsak organoid kültür sistemi kurulmuştur.
Claudin-7, bağırsakta yüksek oranda eksprese edilen ve TJ fonksiyonunu ve bütünlüğünü korumak için gerekli olan çok önemli bir sıkı bağlantı (TJ) proteinidir11. cKO fareleri, şiddetli inflamasyon, ülserasyonlar, epitel hücre kayması, adenomlar ve artmış sitokin seviyeleri11,12 sergileyen IBD benzeri bir fenotipten muzdariptir. Claudins'in epitel bariyer fonksiyonu için hayati önem taşıdığı yaygın olarak kabul edilirken, claudins için yeni roller ortaya çıkmaktadır; proliferasyon, göç, kanser progresyonu ve kök hücre fonksiyonu 10,12,13,14,15,16,17 ile ilgilidirler. Claudin-7'nin kök hücre nişini ve kolonik kök hücrelerin işlevini nasıl etkilediği şu anda bilinmemektedir. Bağırsak yaklaşık her 5-7 günde bir hızla kendini yenilediğinden, kök hücre nişinin korunması ve aktif kök hücrelerin düzgün çalışması hayati önem taşır18. Burada, claudin-7'nin kolonik kök hücre nişi üzerindeki potansiyel düzenleyici etkilerini incelemek için bir sistem kurulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri ve prosedürleri, Doğu Carolina Üniversitesi (ECU) Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri ve ECU'nun laboratuvar hayvan bakımı ve kullanımı ile ilgili yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. İndüklenebilir, bağırsaklara özgü claudin-7 nakavt fareleri, C57BL6 claudin-7-flox transgenik fareleri Villin-CreERT2 fareleri19 ile geçerek üretildi. Bu çalışmada 3 aylık erkek ve dişi fareler kullanılmıştır.
1. Reaktif/ekipman hazırlama
- İlgili deneylere başlamadan önce aşağıdaki reaktifleri/ekipmanları soğutun: kript izolasyonu sırasında kolon dokusunu yıkamak için fosfat tamponlu salin (PBS); epitel ayrışma ortamı ile inkübasyon için bir rocker / rotator (4 °C buzdolabına yerleştirilmiş).
- Jel matrisini ( Malzeme Tablosuna bakınız) -20 °C'den çıkarın ve kaplamadan önce buz üzerinde çözün.
- Kaplama için kriptleri döndürmeden önce santrifüjü 4 ° C'ye kadar önceden soğutun.
- % 0.1 sodyum sitrat tamponunu soğutun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve in situ hücre ölümü tespitinden önce buz üzerinde tutun.
- İlgili deneylere başlamadan önce aşağıdaki reaktifleri ısıtın: kaplamadan önce 24 saat boyunca 96 kuyucuklu bir kültür plakası; L-WRN ortamı (bkz. Malzeme Tablosu) kaplanmış kriptlere eklemeden önce ve her ortam değişikliğinden önce.
- Lekelenmeden önce su banyosunu 94 ° C'ye ısıtın.
2. Murine kolonik kript izolasyonu
- Aşağıdaki adımları izleyerek gerekli medyayı hazırlayın.
NOT: Medya hacimleri burada iki farenin kolonik dokusu için hesaplanmıştır.- Epitel ayrışma ortamını hazırlayın: 30 mL 1x PBS + 400 μL 0,5 M EDTA + 50 μL 10 mM Y-27632 dihidroklorür (bkz. Kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Kript ayrışma ortamını hazırlayın: 10 mL 1x PBS + 10 μL 10 mM Y-27632 dihidroklorür. Kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Ek L-WRN ortamı: 50 mL L-WRN ortamı + L-Glutamin + 500 μL L-glutamin + 500 μL pennikilin / streptomisin + 1.000 μL B-27 takviyesi (50x) + 500 μL N2 takviyesi (100x) + 50 μL HEPES (1 M) tampon çözeltisi ile 47.5 mL DMEM yüksek glikoz (bkz.
- Tam (takviyeli) L-WRN ortamını ve aliquot'u -20 °C'de 3 aya kadar saklamak üzere filtreleyin.
NOT: Çözülmüş ortam 4 °C'de 2 haftaya kadar stabildir.
- Crypt yalıtımını gerçekleştirin.
- Genel anestezi için, pamuğa 1 mL izofluran ekleyin ve 0.09 metreküplük bir anestezi odasında plastik bir kasetin içine yerleştirin (bkz. Fareyi solunum durana kadar (yaklaşık 3-5 dakika) anestezi odasına yerleştirin ve ardından servikal çıkık20 gerçekleştirin.
- Farenin orta çizgisinden aşağı doğru yaklaşık 2 kesi yapın ve karnı açığa çıkarmak için arka cildi sabitleyin. Proksimal taraftan çekumun hemen altında ve distal taraftan rektumun üstünde keserek kolonu izole edin21.
- Forseps kullanarak, kolona bağlı yağ dokusunu çıkarın. Forsepsin düz ucunu kullanarak dışkıyı yavaşça dışarı itin ve dokuyu uzunlamasına açın.
- Yıkamalar arasında PBS'deki dokuyu "döndürmek" için forseps kullanarak dokuyu 10-15 kez soğuk 1x PBS ile yıkayın.
- Temiz, keskin makas kullanarak, dokuyu yaklaşık 3-5 mm büyüklüğünde küçük parçalara ayırın.
- İşlemi ikinci fare için tekrarlayın ve doku parçalarını soğuk epitel ayrışma ortamı içeren 50 mL'lik bir tüpte birleştirin (adım 2.1.1).
- Kolon dokusu parçalarını epitel ayrışma ortamında, 4 ° C'de 90 dakika boyunca hafif sallantılarla inkübe edin.
- Doku parçalarının tüpün dibine batmasına izin verin, ardından dokuyu bozmadan epitel ayrışma ortamını dikkatlice atın. Dokuyu soğuk 1x PBS ile 10-15 kez yıkarken bu işlemi tekrarlayın. Son yıkama sırasında mümkün olduğunca fazla PBS atın.
- Kolon dokusu parçalarını içeren 50 mL'lik tüpe kript ayrışma ortamı (adım 2.1.2) ekleyin ve elle 5-10 dakika boyunca sürekli sallayın.
NOT: Medya, ayrışmış kriptolardan bulanıklaşmalıdır. - Hücre kültürü başlığının altında, dokuyu ve ortamı 70 μm naylon hücre süzgeci ile ( Malzeme Tablosuna bakınız) taze bir 50 mL tüpe filtreleyin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj yapın ve kript içeren peleti rahatsız etmeden süpernatantı atın.
NOT: Ekipmana bağlı olarak, gerilen ortam santrifüj için 15 mL'lik bir tüpe aktarılabilir. - Peleti ~ 3-4 mL soğuk 1x PBS içinde yeniden askıya alın.
- Pipet, mikroskop üzerindeki bir çizgide izole edilmiş kriptlerin 10 μL'sini kaydırır. Mikroskop altında, 10 μL başına kript konsantrasyonunu tahmin etmek için tam, uzun kriptoların sayısını sayın.
- 96 delikli bir plakada 10 kript/μL plakalamak için aşağı dönecek uygun kript hacmini hesaplayın.
3. Kript kaplama
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'de 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde uygun miktarda izole edilmiş kriptleri santrifüj edin.
- Peletlenmiş kriptleri bozmadan 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı dikkatlice çıkarın.
- Hava kabarcıklarının ortaya çıkmasını önlemek için peletlenmiş kriptlere ve pipete 100 μL jel matrisi (dokuz kuyucuk için yeterli) dikkatlice ekleyin.
NOT: Jel matrisi ve kriptlerin nasıl karıştırılacağına ilişkin ayrıntılı bir açıklama için Tartışma bölümüne bakın. Tipik olarak, dokuz kuyu için 100 μL yeterlidir. - Jel matrisinin kısmen katılaşmasına izin verin (~ 1-2 dakika).
- Jel matrisinin 10 μL'lik plakası, kubbe şekli oluşturmak için önceden ısıtılmış 96 kuyucuklu bir kültür plakasının her bir kuyucuğundaki kriptlerle karıştırılır.
NOT: Kubbeyi kuyunun ortasına yerleştirin. Jel matrisinin kuyunun kenarlarına yayılmasına izin vermemeye dikkat edin. Katılaştırma ve kaplama hakkında ayrıntılı bir açıklama için Tartışma bölümüne bakın. - Jel matrisinin% 5 CO 2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde10-20 dakika boyunca tamamen ayarlanmasına izin verin.
- L-WRN ortamının nihai çalışma çözümünü hazırlayın.
- 10 mL'lik bir L-WRN ortamına 100 μL pennikilin/streptomisin ekleyin (bkz. adım 2.1.3) (4 °C'de 2 hafta boyunca stabil).
- Pennikilin / streptomisin ile 900 μL L-WRN ortamına takviyeler ekleyin: 0.9 μL 1 mg / mL EGF + 0.9 μL 10 mM Y-27632 dihidroklorür.
NOT: Hacimler dokuz kuyuya dayanmaktadır. Y-27632 dihidroklorür sadece 0. günde (kaplama sırasında) eklenir.
- Her bir kuyucuğa 100 μL ortam ekleyin. Kubbeyi bozmamaya dikkat edin.
- 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
4. Kültürde claudin-7 nakavt yaratmak
- Kriptoların kaplamadan sonra 24 saat boyunca kültürde normal şekilde büyümesine izin verin.
- 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 900 μL L-WRN ortamına (3 μmol / L'lik son konsantrasyon) + 1 mg / mL EGF'nin 0.9 μL'sine 2.7 μL 1 mmol / L 4-hidroksitamoksifen (4OH-Tamoksifen) ekleyin.
NOT: 4OH-Tamoksifen'in stok çözeltisi, toz haline getirilmiş 4OH-Tamoksifen'in ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1x PBS ile 1 mmol / L konsantrasyonuna karıştırılmasıyla hazırlanır. - Eski ortamları vakum emiş yoluyla kuyucuklardan çıkarın.
- Her bir oyuğa 100 μL 4OH-Tamoksifen içeren ortam ekleyin ve bunları claudin-7 cKO / 4OH-TAM olarak etiketleyin.
NOT: DMSO'nun kontrol kuyularına eklenmesi gerekir. Her 2 günde bir taze 4OH-Tamoksifen içeren ortam eklenmelidir. - Bir sonraki ortam değişikliğine kadar 37 ° C'de inkübe edin (~ 2-3 gün).
5. Kolonik organoid bakımı
NOT: Medya her 2-3 günde bir değiştirilmelidir. 12 güne kadar kültür.
- L-WRN ortamının yeni bir nihai çalışma çözeltisini hazırlayın: 900 μL L-WRN ortamı + 0,9 μL 1 mg / mL EGF.
- Eski ortamları vakum emiş yoluyla kuyucuklardan çıkarın. Kuyucuklara taze medya ekleyin.
NOT: Kubbeyi bozmamaya dikkat edin. - Bir sonraki ortam değişikliğine kadar 37 ° C'de inkübe edin.
NOT: Kültürler, deney için istenen süre boyunca korunabilir ve geçirilebilir. Bu çalışmanın kültürleri tipik olarak 9-12 gün arasında korunmuştur, ancak 15 veya 20 gün boyunca daha fazla devam etmek istenebilir.
6. Kolonik organoidlerin toplanması ve gömülmesi
- Eski ortamları vakum emiş yoluyla kuyucuklardan çıkarın.
- Organoidleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
NOT: PFA toksik bir malzemedir. Bu reaktifi kullanırken önlem alın. - Vakumlu emme ile kuyucuklardan %4 PFA'yı çıkarın ve 4 °C'de 24 saat boyunca %30 sakkaroz ekleyin.
- Plastik bir kalıbı etiketleyin ve optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile % 90'a kadar doldurun (bkz.
- Vakumlu emme ile kuyucuklardan% 30 sakkaroz alın. Her bir kuyucuğa 10 μL 1x PBS ekleyin.
- Bir pipet ucu ile, organoidler içeren kubbeyi ayırmak için kuyucuğun tabanını yavaşça çizin.
- Bir pipetle, ayrışmış organoidleri içeren PBS'yi çıkarın ve sıvıyı OCT içeren kalıba yükleyin.
NOT: OCT bileşiğine kabarcıklar sokmaktan kaçının. - Tüm organoidler tüm kuyucuklardan çıkarılana kadar bu işleme devam edin.
- Paslanmaz çelik bir Dewar şişesinde, kuru buz topakları ve 2-metilbütan (kuru buz topaklarını örtmek için yeterli) ekleyin (bkz.
- Donmayı durdurmak için organoid içeren OCT bloğunu 2-metilbütanın üzerinde sabit bir şekilde tutun.
- Organoid içeren OCT bloğunu bölüme hazır olana kadar -80 °C'de saklayın (1 yıla kadar saklanabilir).
7. İmmünofloresan
- Organoid içeren OCT bloğunu -20 °C'de bir kriyostat kullanarak 5 μm kalınlığında kesitleyin (bkz.
- Her bölüm için, bir organoidin yakalandığından emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. Kesitleme tamamlandığında, slaytları lekelenmeye hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın (6 aya kadar saklanabilir).
- Kızakları 10 mM sodyum sitrat tamponunda 94 °C'de 10 dakika ısıtın.
NOT: Tampon, sodyum sitratın deiyonize suda çözülmesiyle yapılır. PH'ı hidroklorik asit ile 6'ya ayarlayın. - Slaytların tezgahta 20 dakika soğumasını bekleyin. Damıtılmış su ile 5 dakika durulayın.
- Slaytları %0,2 Triton X-100 ile bir boyama rafında (bakınız Malzeme Tablosu) birleştirin ve 15 dakika boyunca 100 mM glisin ile inkübe edin.
- Her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın. Oda sıcaklığında 45 dakika boyunca% 5 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin.
- Claudin-7 anti-murin tavşan primer antikoru22 (% 1 BSA'da seyreltilmiş) ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca Cy3 anti-tavşan sekonder antikoru23 (% 1 BSA'da seyreltilmiş) ile inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın.
- Slaytları DAPI ile uygun bir montaj ortamıyla (bkz. Malzeme Tablosu) monte edin ve bir kapak parçası ekleyin.
8. Hücre ölümü tespiti
- Kuyucukların içindeki organoidleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin. 5 dakika boyunca 1x PBS ile durulayın.
- Kültür plakasını buz üzerinde% 0.1 Triton X-100 ile soğuk% 0.1 sodyum sitrat tamponunda 2 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile iki kez durulayın.
- Bir in situhücre ölümü tespit kiti olan TMR Red'i kullanarak TUNEL reaksiyonu 24,25'i hazırlayın (bkz. Her bir kuyucuğa 50 μL TUNEL reaksiyon reaktifi ekleyin.
- Nemlendirilmiş bir atmosferde karanlıkta 37 °C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
NOT: Kalan tüm adımlar karanlıkta tamamlanmalıdır. - Her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın. 1:2.500 Hoechst (1x PBS'de seyreltilmiş, bakınız Malzeme Tablosu) ile 3 dakika boyunca inkübe edin.
- Her biri 5 dakika boyunca 1x PBS ile üç kez durulayın. Floresan mikroskoptaki görüntüleri görselleştirmek için TRITC filtresini kullanın (bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Claudin-7'nin kolon kök hücreleri üzerindeki düzenleyici etkilerini incelemek için, kolonik kriptler yukarıda tarif edildiği ve Şekil 1A'da gösterildiği gibi murin kolon dokusundan izole edildi. Kriptler birincil dokudan izole edildikten sonra, 11 gün boyunca büyümek üzere 96 kuyucuklu bir plakada bir 3D matriste kaplandılar (Şekil 1). Normal sağlıklı kriptler lümeni kapatır ve 2. güne kadar sferoidler haline gelir ve sonunda yaklaşık 5. günde tomurcuklanmaya ve çeşitli epitel hücre tiplerini oluşturmaya başlar (Şekil 1B). Kolonoidlerin 11. güne kadar büyümelerine izin verildi, daha sonra daha fazla deney için hasat edildiler (Şekil 1B). Kültürde claudin-7'yi nakavt etmek için, kriptlerin 24 saat boyunca normal şekilde büyümesine izin verildi. 24 saat sonra, kriptler 3 μmol / L 4OH-Tamoksifen (TAM) ile muamele edildi ve 10 gün daha kültürlendi. Taze 4OH-TAM içeren kültür ortamı her 2 günde bir değiştirildi. DMSO, kontrol kuyularında araç olarak kullanıldı. Claudin-7 eksik kriptleri (claudin-7 KO) uygun sferoidler oluşturamadı ve 1 günlük 4OH-TAM tedavisinden sonra hızla ölmeye başladı (Şekil 1B).
Şekil 2A, kolonoidlerin klodin-7 (kontrol) içeren normal kriptlerden 9 günlük kültür boyunca ilerledikçe başarılı bir şekilde büyüdüğünü vurgulamaktadır. Bu kriptler 2. günde sferoidler oluşturmaya başladı, 5. günde tomurcuklanmaya başladı ve 9. günde hasat edilene kadar büyümeye ve tomurcuklanmaya devam etti (Şekil 2A). Buna karşılık, claudin-7 (claudin-7 KO) içermeyen kriptolar çok hızlı bir şekilde bozuldu (Şekil 2B). 4OH-TAM ile tedaviden yaklaşık 2-3 gün sonra, claudin-7 KO kriptleri sağlıklı görünümlü sferoidler oluşturmamış ve sadece dairesel hücre kümeleri olarak ortaya çıkmıştır (Şekil 2B). Vahşi tip farelerden izole edilen kriptolar, Tamoksifen tedavisine bağlı toksik bir etki olmadığını doğrulamak için 4OH-TAM ile muamele edildi; Bu kriptolar hayatta kalmayı ve normal şekilde büyümeyi başardı. Claudin-7 delesyonunu ve claudin-7 KO kolonoidlerinin sağkalım durumunu incelemek için bir immün boyama yöntemi ve bir in situ hücre ölümü tespit kiti kullanılmıştır (Şekil 3). Hasat edilen kontrolde klodin-7 için immünofloresan boyama ve cKO organoidleri, kültürde claudin-7'nin başarılı bir şekilde nakavt edildiğini doğruladı (Şekil 3A). 9. Gün kontrol kolonoidleri çok az apoptotik sinyal sergiledi (Şekil 3B); ancak klodin-7 KO kolonoidleri yüksek apoptoz gösterdi (Şekil 3B). Claudin-7 olmadan, kök hücreler hayatta kalamaz, kendini yenileyemez veya kolonoidleri oluşturmak için farklılaşamazdı.
Şekil 1: Kript izolasyonunu ve kolonoid büyümesini gösteren şematik gösterim. (A) Kript izolasyon işleminin grafiksel tasviri, 3B matriste kaplama ve hasada kadar büyüme. (B) Deneylerin zaman çizelgesi ve kontrolde kolonoid büyümesi ve claudin-7 KO türevi kriptler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Claudin-7 eksikliği olan kolonoidler hayatta kalamaz ve büyüyemez . (A) 3. gün ve 9. günde kontrol/DMSO organoidlerinin temsili görüntüleri. (B) 4OH-TAM/cKO organoidlerinin 3. gün ve 9. gündeki temsili görüntüleri, n = 10. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Claudin-7 eksikliği olan kolonoidler hızla apoptoza uğrar. (A) 9. gün kontrolünde Claudin-7 boyaması/DMSO ve claudin-7 cKO/4OH-TAM organoidleri, n = 3. Ölçek çubukları = 250 μm. (B) 9. gün kontrolünde apoptotik boyama ve claudin-7 cKO / 4OH-TAM kolonoidleri, n = 3. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Organoid kültür, kök hücre fonksiyonunu, bağırsak fizyolojisini, ilaç keşfini, insan bağırsak hastalıklarını ve doku yenilenmesini incelemek ve onarmak için mükemmel bir modeldir 7,8,9,10,11,26. Birçok avantajı olsa da, kurulması zor olabilir. Protokol boyunca tüm adımlarda, ancak en önemlisi kaplama aşamasında dikkatli olunmalıdır. İzole edilmiş kriptleri bir jel matrisi ile karıştırırken, santrifüjlemeyi takiben oluşan kript peletini parçalamak ve kriptleri matris boyunca eşit olarak dağıtmak için yukarı ve aşağı iyice pipet yaptığınızdan emin olun. Aynı zamanda, pipetleme sırasında matrise hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Bunu yapmak için, pipetleme pipet ucu 1,5 mL'lik tüpün altına doğru olacak şekilde yavaşça yapılmalıdır.
Ek olarak, jel matrisi bu işlem boyunca tamamen katılaşmamalıdır. Erken katılaşmayı önlemek için, dikkatli pipetleme ile karıştırın, ardından tüpü buz üzerine yerleştirin ve bu işlemi tekrarlayın. İzole edilmiş kriptler ve jel matrisi yeterince karıştırıldıktan sonra, jel matrisinin kısmen katılaşmasına izin verin. Bu işlem, kullanılan jel matrisinin türüne / markasına bağlı olarak 1-5 dakika sürebilir. Tüp devrilirse hafifçe hareket edecek bir jele benzemelidir, ancak ters çevrilirse dökülecek kadar akıntılı olmamalıdır. Bu noktada, her bir kuyucuğun merkezine 10 μL kaplamaya başlanabilir. Jel matris bir 3D kubbe oluşturmalı ve kuyunun kenarlarına dokunmamalıdır. Jel matrisi yayılır ve kuyunun duvarına çarparsa, yeterince katılaşmamıştır; Bir kubbe oluşturmak için yeterince katılaşana kadar bekleyin, çünkü kubbe oluşmazsa kriptolar hayatta kalamaz ve büyüyemez. Kaplama düzgün bir şekilde tamamlandıktan ve kriptler yukarıda açıklandığı gibi yeterince desteklendikten sonra, organoidlerin sorunsuz bir şekilde büyümesi beklenir.
Bu protokol, kolonik kök hücre sağkalımı üzerindeki etkilerini gözlemlemek için claudin-7'li veya klodinsiz bir kolon organoid sistemi kurar. Kolon organoid kültürü yenilikçi ve avantajlı bir sistem olsa da, modelin hala sınırlamaları vardır. Çalışmanın türüne bağlı olarak, bağırsak organoidlerinde bağışıklık hücrelerinin ve mikrobiyota eksikliği bir avantaj veya dezavantaj olabilir26. Bu çalışma için, claudin-7'nin bağışıklık bileşeni olmadan kök hücre fonksiyonları üzerindeki düzenleyici rolünü araştırmak avantajlıdır. Belirli bir etkinin, in vivo hayvan modellerinde mevcut olacak bağışıklık tepkisi gibi diğer potansiyel değişkenlerden ziyade, özellikle claudin-7'ye bağlı olduğu sonucuna varılmıştır. Tersine, bu faktör diğer çalışma türleri için bir sınırlama olabilir. Kolon organoid kültürünün oluşturulması, geleneksel 2D hücre hatlarından daha maliyetli ve zaman alıcı olabilir. Bununla birlikte, in vivo alaka düzeyi sağlayan dokuların hücresel mikro ortamını taklit edebilirler, 2D hücre kültüründen çok daha fazla doku temsilcisidir ve hayvan modellerinden daha az maliyetlidirler 4,7. Bağırsak organoid kültürünün geniş uygulaması ve muazzam potansiyeli göz önüne alındığında, bu sistemin dünya çapında laboratuvar araştırmalarında ideal bir model haline gelmesi muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH DK103166 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.09 cubic feet space-saver vacuum desiccator | United States Plastic Corp | 78564 | anesthesia chamber |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | AM9261 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 1x Dulbecco’s Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| 2-methylbutane | Sigma | 277258 | |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | J61899.AK | |
| 4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM) | Sigma | 579002 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Corning | 352350 | |
| 96 well culture plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| B-27 Supplement (50x) | Gibco | 12587-010 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Claudin-7 anti-murine rabbit antibody | Immuno-Biological Laboratories | 18875 | |
| Cover glass (24 x 50-1.5) | Fisher Scientific | 12544E | |
| Cryomolds | vwr | 25608-916 | |
| Cultrex RCF BME, Type 2 | R&D Systems | 3533-005-02 | gel matrix |
| Cy3 anti-rabbit antibody | Jackson Immunoresearch | 111-165-003 | |
| Dewar Flask | Thomas Scientific | 1173F61 | |
| DMEM High Glucose with L-Glutamine | ATCC | 30-2002 | |
| EVOS FLoid Imaging System | ThermoFisher | 4477136 | |
| Fluoro-Gel II with DAPI | Electron Microscopy Sciences | 17985-50 | |
| GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Glycine | JT Baker | 4059-02 | |
| HEPES (1 M) Buffer Solution | Gibco | 15630-080 | |
| Hoechst | ThermoFisher | 62249 | |
| In situ cell death detection kit, TMR Red | Roche | 12156792910 | |
| Isoflurane | Pivetal | 07-893-8440 | |
| L-WRN Media | Harvard Medical School Gastrointestinal Organoid Derivation and Culture Core | N/A | |
| Mouse surgical kit | Kent Scientific Corporation | INSMOUSEKIT | |
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-500UG | |
| N2 Supplement (100x) | Gibco | 17502-048 | |
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Agar Scientific | AGR1180 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Sequenza Rack | vwr | 10129-584 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S-279 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Vacuum filter (0.22 µm; cellulose acetate) | Corning | 430769 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris Bioscience | 1254 |
References
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wallach, T. E., Bayrer, J. R. Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).
- Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. Advances in development and application of human organoids. 3 Biotech. 11 (6), 257 (2021).
- Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research. Frontiers in Medicine. 6, 334 (2020).
- Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications. Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).
- Gupta, N., et al. Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research. Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).
- Yoo, J., Donowitz, M. Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases. World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Xing, T., et al. Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).
- Ding, L., et al. Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice. Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).
- Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases. Tissue Barriers. 1 (3), 24978 (2013).
- Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective. Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).
- Bhat, A. A., et al. Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis. Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).
- Lu, Z., et al. A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement. Molecular Cancer. 14, 120 (2015).
- Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review. Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).
- Wang, K., et al. Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition. Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).
- Wang, F., et al. Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay. Gastroenterology. 145 (2), 383 (2013).
- Li, W., et al. Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7. Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).
- Donovan, J., Brown, P.
- Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue. Journal of Visual Experiments. (80), e50611 (2013).
- Sugimoto, K., et al. Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).
- Mansour, H., et al. Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina. PLoS One. 8 (3), 57038 (2013).
- Miranda, M., et al. Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism. Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).
- Wang, L., et al. Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling. Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188 (2017).
- Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).
