Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Isolering av hvilende stamcellepopulasjoner fra individuelle skjelettmuskler

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64557
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedicine, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver isolering av muskelstamceller og fibro-adipogene forfedre fra individuelle skjelettmuskler hos mus. Protokollen involverer enkel muskeldisseksjon, stamcelleisolering ved fluorescensaktivert cellesortering, renhetsvurdering ved immunfluorescensfarging og kvantitativ måling av S-faseinngang ved 5-etynyl-2'-deoksyuridininkorporeringsanalyse.

Abstract

Skjelettmuskulatur har forskjellige populasjoner av voksne stamceller som bidrar til homeostase og reparasjon av vevet. Skjelettmuskelstamceller (MuSC) har evnen til å lage nye muskler, mens fibro-adipogene progenitorer (FAP) bidrar til stromale støttevev og har evnen til å lage fibroblaster og adipocytter. Både MuSC og FAP befinner seg i en tilstand av langvarig reversibel cellesyklusutgang, kalt quiescence. Hviletilstanden er nøkkelen til deres funksjon. Hvilende stamceller blir ofte renset fra flere muskelvev samlet sammen i en enkelt prøve. Nylige studier har imidlertid avslørt tydelige forskjeller i molekylære profiler og hviledybde av MuSCs isolert fra forskjellige muskler. Denne protokollen beskriver isolering og studier av MuSCs og FAPs fra individuelle skjelettmuskler og presenterer strategier for å utføre molekylær analyse av stamcelleaktivering. Den beskriver hvordan man isolerer og fordøyer muskler av forskjellig utviklingsopprinnelse, tykkelser og funksjoner, som membran, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL) og massetermusklene. MuSC og FAP renses ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og analyseres ved immunfluorescensfarging og 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) inkorporeringsanalyse.

Introduction

Skjelettmuskulatur har høy kapasitet for regenerering på grunn av tilstedeværelsen av muskelstamceller (MuSC). MuSCs er lokalisert på myofibrene, under basal lamina, og ligger i en hviletilstand av langvarig, reversibel cellesyklusutgang 1,2,3,4. Ved skade aktiveres MuSC og går inn i cellesyklusen for å gi opphav til forsterkende progenitorer som kan differensiere og smelte sammen for å danne nye myofibre 2,5. Tidligere arbeid har vist at MuSCs er helt avgjørende for muskelregenerering 6,7,8. Videre kan en enkelt MuSC engraft og generere både nye stamceller og nye myofibre9. Skjelettmuskulaturen har også en populasjon av mesenkymale stromale celler kalt fibro-adipogene progenitorer (FAP), som spiller en avgjørende rolle i å støtte MuSC-funksjonen under muskelregenerering 6,10,11,12.

På grunn av deres potensial til å koordinere muskelregenerering, har det vært enorm interesse for å forstå hvordan MuSCs og FAPs fungerer. Hvilende MuSC er preget av ekspresjon av transkripsjonsfaktorene Pax7 og Sprouty1, og celleoverflateproteinkalsitoninreseptoren, mens hvilende FAP er preget av celleoverflateproteinblodplatederivert vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRa)10,12,13,14,15. Tidligere studier har vist at MuSCs og FAPs kunne renses fra skjelettmuskler ved hjelp av celleoverflatemarkører og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) 9,15,16,17,18,19,20,21. Selv om disse protokollene i stor grad har forbedret evnen til å studere MuSCs og FAPs, er en ulempe at de fleste av disse protokollene krever isolering av MuSCs fra et basseng av forskjellige muskelvev. Nylig arbeid fra oss og andre har avslørt forskjeller i cellefenotype og genuttrykksnivåer mellom MuSCs isolert fra forskjellige vev22,23. MuSC fra diafragma, triceps og gracilis viser raskere aktivering enn MuSC fra nedre baklemsmuskulatur22, mens MuSC fra ekstraokulær muskulatur viser raskere differensiering enn MuSC fra mellomgulvet og nedre bakkroppsmuskulatur23.

Denne protokollen beskriver isolering av MuSCs og FAPs fra individuelle skjelettmuskler (figur 1). Dette inkluderer disseksjon av membranen, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA) og masseter muskler. Dissekerte muskler dissosieres deretter ved enzymatisk fordøyelse ved bruk av kollagenase II (en protease som spesifikt retter seg mot Pro-X-Gly-Pro-aminosekvensen i kollagen, noe som muliggjør nedbrytning av bindevev og vevsdissosiasjon24) og dispase (en protease som spalter fibronektin og kollagen IV, noe som muliggjør ytterligere celledissosiasjon25). MuSCs og FAPs er isolert fra enkeltcelle suspensjoner av FACS. Som eksempler på nedstrømsanalyser for celleanalyse bestemmes stamcelleaktivering ved å analysere 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) inkorporering, mens cellerenhet bestemmes ved immunfluorescensfarging for celletypespesifikke markører Pax7 og PDGFRa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen ble utført i samsvar med retningslinjer for dyrepleie ved Aarhus Universitet og lokale etiske forskrifter.

MERK: Sørg for å overholde forskriftene fra den lokale etiske komiteen for dyreforsøk og håndtering av prøver av gnagere etter døden. Mus er en potensiell kilde til allergener; Hvis tilgjengelig, slå på eksosventilasjon og plasser den over arbeidsområdet for å unngå overdreven eksponering for allergener. Alternativt kan du bruke munnbind hvis forsøket gjennomføres regelmessig. Denne protokollen innebærer å jobbe med skarpe gjenstander, og forskere anbefales å gjøre seg kjent med prosedyrene og logistikken for å bruke førstehjelp i tilfelle et kutt.

1. Forberedelse (1-2 timer; dagen før disseksjon)

MERK: Løsningene, platene og mediene tilberedes under sterile forhold og filtreres (0,45 μm) før bruk, med mindre annet er angitt. Stamoppløsninger av dispase (11 E/ml i PBS) og kollagenase II (1,000 U/ml i PBS) og oppbevar dem ved -20 °C (tabell 1). Stammidlene tines og brukes til sekundær fordøyelse i trinn 4.2.6.

  1. Kollagenbelegg av en 96-brønns halvområdeplate
    1. Forbered surt vann. Tilsett 5,15 ml iseddik til 895 ml autoklavert vann i et 2 l beger.
    2. Filtrer oppløsningen med en filterenhet på 0,45 μm og 500 ml. Overfør 800 ml av det filtrerte sure vannet til en 1 l flaske.
    3. Tilsett 40 ml steril kollagenoppløsning i flasken. Bland oppløsningen forsiktig ved å rotere og oppbevar ved 4 °C, beskyttet mot lys, inntil bruk.
    4. Belegg en eller flere 96-brønns halvarealplater med kollagen. Tilsett 50 μL kollagenbeleggløsning til hver brønn og belegg platen over natten (ON) ved 4 °C.
    5. Aspirer kollagenoppløsningen neste dag med en vakuumbasert aspirator og vask platen 2x ved å tilsette 100 μL autoklavert vann og aspirere.
    6. Vipp lokket på platen og la platen tørke i hetten i 20-30 min.
    7. Når tallerkenen er helt tørr, pakk den inn i aluminiumsfolie og oppbevar ved 4 °C til bruk. Belagte plater kan lagres i opptil 4 uker.
      MERK: Kollagenbelegg muliggjør celleadhesjon. Det er viktig å vaske bort fritt kollagen, da det kan forstyrre cellefunksjon og signalering (f.eks. binding av kollagen V til kalsitoninreseptorene på MuSCs)26.

2. Forberedelse (0,5 timer, dagen for disseksjon):

  1. Utarbeidelse av tilleggsløsninger og arbeidsområde
    1. Tilbered sterilt vaskemedium ved å tilsette 50 ml hesteserum og 5 ml penn/streptokokker til 445 ml HAMs F10-medium. Arbeid i en avtrekkshette med laminær luftstrøm for å forhindre kontaminering.
    2. Beregn og vei riktig mengde kollagenase II som trengs for å forberede dissosiasjonsbufferen. (For hver mus brukes 26 000 enheter kollagenase II til å lage 40 ml dissosiasjonsbuffer ved 650 U / ml kollagenase II). Tilsett det veide pulveret til et 50 ml konisk rør og oppbevar det på is.
    3. Forbered to 10 cm retter for muskelisolasjon. Hell 3 ml vaskemiddel (tabell 1) i hver petriskål. Ta de 10 cm tallerkenene utenfor den laminære avtrekkshetten for senere bruk.
    4. Forbered materialene for muskelfordøyelse. Basert på antall prøver, merk riktig antall 50 ml koniske rør (åtte per mus, en for hver muskel) og la dem ligge på benken. Spray ned nålene, 10 ml sprøyter og 40 μm cellesiler med 70% etanol (åtte av hver per mus, en for hver muskel) og bring dem inn i den laminære strømningshetten. Fest kanyler til sprøytene.
    5. Forbered materialene for sortering. Merk 5 ml runde bunnrør med cellesilhetter basert på antall prøver. Dekk rørene med aluminiumsfolie og la dem ligge i den laminære strømningshetten.
    6. Tilsvarende antall prøver og populasjoner som sorteres, klargjør 1,5 ml mikrosentrifugerør med 500 μL vaskemedium for celleoppsamling (16 per mus, ett rør for hver cellepopulasjon per muskelvev). Oppbevar disse rørene på is.

3. Muskeldisseksjon (20-30 min)

MERK: Denne delen av protokollen utføres i et ikke-sterilt miljø. Prosedyren kan utføres ved hjelp av en eller flere mus. En mus er imidlertid tilstrekkelig til å klargjøre både prøver for sortering og kontroller for å sette opp kompensasjon og FACS-porter.

  1. Starter muskelisolasjon
    1. Forbered det ikke-sterile arbeidsområdet for disseksjon og muskelisolasjon. Desinfiser arbeidsstasjonen med 70% etanol. Plasser en steril, beskyttende engangsunderpute på arbeidsstasjonen.
    2. Bruk en permanent markør, tegne en boks for hver muskel på toppen av et petriskållokk for senere å plassere den isolerte muskelen.
    3. Spray de kirurgiske instrumentene med 70% etanol.
    4. Avlive musen ved CO2 innånding og / eller cervical dislokasjon.
    5. Isoler de enkelte musklene (fra en mus om gangen hvis du bruker flere mus). Spray musen med 70% etanol for å fukte pelsen og desinfisere huden. Plasser musen på underputen med magen vendt opp. En oversikt over alle de åtte musklene og deres respektive anatomiske plassering er vist i figur 2A.
  2. Isolere gracilis-musklene
    1. Bruk en saks til å lage et 0,5 cm horisontalt snitt i bukhuden.
    2. Fjern huden: Bruk begge hender, bruk tommelen og pekefingeren til å ta tak i den øvre og nedre delen av snittet. Trekk på hver side av snittet for å rive og dele huden på torso og nedre ekstremiteter. Trekk ned huden på underekstremiteten for å eksponere begge bakbenene (nedover fra hofte til tær). På samme måte trekker du oppover for å eksponere overkroppen.
    3. Finn gracilis-muskelen (indre lår). Bruk buede tang, ta tak i gracilisen og løft muskelen litt (figur 2B). Gjør et snitt på 0,5 cm med saks (figur 2C), hvorfra gracilis er kuttet ut og helt isolert (figur 2D). Gjenta dette for det andre benet for å isolere den andre gracilismuskelen.
  3. Isolering av TA- og EDL-musklene (nedre bakekstremitet, ventral side)
    1. Bruk en skalpell, kutt fascia ved å lage et 0,5 cm snitt langs sidesiden av tibia (det tykkeste nedre bakbenet). Bruk buede tang for å ta tak i fascia og trekk for å fjerne den.
      MERK: Når fascia er helt fjernet, er senene i den distale enden av bakbenet synlige og kan skilles.
    2. Bruk rett tang med superfine spisser for å gå inn mellom den distale senen til TA (lateral side av tibia) og EDL (under TA) (figur 2E-G).
      MERK: Med erfaring kan den stumpe enden av et skalpellblad brukes i stedet for de rette tangene.
    3. Skyv tangen mot den proksimale enden av muskelen for å skille musklene.
    4. Før den rette tangen tilbake til den distale enden. Klipp den distale senen.
    5. Ta forsiktig tak i muskelens distale sene med buede tang. Løft muskelen opp og over dens proksimale feste og kutt forsiktig den proksimale senen så nær festepunktet som mulig. Skjær den andre enden og overfør TA til en petriskål.
    6. Bruk rett tang med superfine spisser for å gå under den distale senen på EDL.
    7. Skyv tangen mot den proksimale enden av muskelen for å skille musklene.
    8. Før den rette tangen tilbake til den distale enden. Klipp den distale senen uten å skade muskelen.
    9. Ta forsiktig tak i EDLs distale sene med buede tang. Løft muskelen opp og over dens proksimale feste og kutt forsiktig den proksimale senen så nær festepunktet som mulig. Skjær den andre enden og overfør EDL til en petriskål. Gjenta for den andre bakbenet for å isolere de andre TA- og EDL-musklene.
  4. Isolering av GA og soleus muskler (nedre bakekstremitet, dorsalside)
    1. Bruk rett tang med superfine spisser for å gå inn mellom akillessenen og nedre bakben.
    2. Skyv tangen mot den proksimale enden av muskelen for å skille muskelen.
    3. Før den rette tangen tilbake til den distale enden. Klipp den distale senen.
      MERK: For å unngå å skade soleusmuskelen, som ligger under GA, kutt så nær dens distale akillessenefeste som mulig, og etterlater en del av senen festet til GA (figur 2H).
    4. For å avsløre og isolere soleusmuskelen, trekk GA opp og over fibula (det tynneste beinet av de to beinene i nedre baklem).
      MERK: Soleusmuskelen utmerker seg ved sin karakteristiske mørkerøde farge i forhold til GA (figur 2I).
    5. Finn den proksimale soleussenen. Med rett tang, gå inn mellom soleus og GA.
    6. Flytt tangen mot den distale enden av muskelen for å skille soleus fra GA.
    7. Isoler soleus først. Klipp den proksimale senen, ta tak i senen med buede tang, og løft soleus forsiktig for å få tilgang til den distale senen. Klipp den distale senen for å isolere soleus fra GA. Legg soleus i petriskålen med vaskemiddel (figur 2J)
    8. Skjær GA og legg den i petriskålen. Gjenta dette for det andre benet for å isolere den andre soleus og GA musklene.
  5. Isolering av tricepsmusklene (øvre forben, dorsalside)
    1. Bruk rett tang med superfine spisser for å gå inn mellom tricepsmuskelen og humerusbenet (hovedbeinet i øvre forben) (figur 2K-M).
    2. Skyv tangen mot den proksimale enden av muskelen for å skille muskelen. Klipp den proksimale enden av muskelen.
    3. Ta tak i den proksimale enden av triceps med buet tang og trekk den opp og over albuen for å få tilgang til den distale senen. Klipp den distale senen til triceps, overfør muskelen til en petriskål, og gjenta prosedyren for den andre forbenet.
  6. Isolere masseter muskler
    1. Fjern pelsen og huden fra kjeften. Lag et horisontalt snitt på 0,5 cm med saks. Bruk begge hender, klem på hver side av snittet ved hjelp av tommelen og pekefingrene. Fjern huden ved å trekke oppover og nedover.
    2. Finn massørens store sene (caudal, under øyet). Sett det flate skalpellbladet inn mellom benet og muskelen (figur 2N). Kutt senen.
    3. Ta tak i den store massetersenen med buet tang. Klipp den med et skalpellblad eller saks i rostralretningen for å skille massetermuskelen fra kjevebenet (figur 2O, P). Legg den isolerte massetermuskelen i petriskålen. Gjenta prosedyren for den andre massetermuskelen.
  7. Isolering av membranmuskelen
    MERK: Når du isolerer membranmuskelen, må du sørge for å kutte forsiktig for å unngå å kutte i indre organer og tarm, da dette er en kilde til forurensning.
    1. Bruk en saks til å lage en torakotomi (et kutt mellom ribbeina) midt i brystbenet (et langt flatt bein, plassert midt på brystet, som forbinder ribbeina) og skjær gjennom brystbenet (figur 2Q).
    2. Blottlegg membranen ved å skjære 360° gjennom brystkassen.
    3. Skill overkroppen fra nedre del/buk. Bruk en saks, klipp luftrøret, spiserøret, vena cava og abdominal aorta.
    4. Separat membranen fra underkroppen. Bruk en saks til å lage en laparotomi (et kirurgisk snitt i bukhulen) 1 cm under brystbenet og lage et 360° kutt (figur 2R).
    5. Plasser den lukkede saksen mellom brystkassen og bukorganene og trykk ned. Trekk forsiktig i brystkassen for å skille den fra bukorganene (figur 2S).
    6. Skill membranen fra ribbeholderen. Hold membranen løst mellom to fingre og skjær gjennom brystkassen med saks. Bruk saks til å klippe membranen så nær ribbeina som mulig i et 360° kutt. Legg den isolerte membranen i en petriskål.
      MERK: Under cervical dislokasjon, kan membranen briste og kollapse mot brystkassen, noe som gjør det vanskelig å finne. Muskelen kan fortsatt isoleres. Identifiser den kollapsede muskelen, hold den mellom to fingre, og kutt 360 ° etter brystkassen.

4. Muskelfordøyelse til en encellesuspensjon (~1 t 35 min)

MERK: Følgende trinn inkluderer ikke-sterile (trinn 4.1-4.2) og sterile arbeidsmiljøer (trinn 4.3).

  1. Mekanisk fordøyelse
    1. Plasser de isolerte musklene i lokket på en 10 cm petriskål.
    2. Bruk buede tang, ta tak i de isolerte musklene en etter en. For soleus og GA, fjern de resterende delene av akillessenen.
    3. Bruk en saks til å hakke de isolerte musklene en etter en ved å kutte dem i omtrent 1 mm3 stykker.
  2. Enzymatisk fordøyelse
    1. Forbered muskeldissosiasjonsbufferen ved å tilsette 40 ml kaldvaskmiddel til det veide kollagenase II-pulveret (kollagenase II: 650 E/ml i vaskemedier).
      MERK: Bruk nylaget muskeldissosiasjonsbuffer for å sikre optimal enzymatisk aktivitet.
    2. Overfør hakkede muskler til et 15 ml konisk rør inneholdende 5 ml dissosiasjonsbuffer.
    3. Inkuber røret i 35 minutter i et 37 °C ristende vannbad ved 60 o / min.
    4. Etter inkubering, tilsett vaskemedium til et totalt volum på 15 ml. Spinn røret ved 1 600 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    5. Aspirer supernatanten ned til et 4 ml volum ved hjelp av en vakuumbasert aspirator. For å unngå å forstyrre pelleten, aspirer sakte fra toppen, og fjern flytende fett.
    6. Tine lageralikoter av dispase og kollagenase II. Tilsett 500 mikrol kollagenase II-oppløsningen (1000 E/ml stam, -20 °C) til den resterende 4 ml prøven. Deretter tilsettes 500 μL av dispaseoppløsningen (11 E/ml stam, -20 °C).
      MERK: Dispase kan generere et bunnfall. Hvis dette skjer, spinn oppløsningen ved 10 000 x g, 1 min før bruk. Overfør den nå klare supernatanten til cellesuspensjonen uten å forstyrre pelleten.
    7. Vortex prøvene kort for å oppløse pelleten.
    8. Inkuber prøvene i 20 minutter i et 37 °C ristende vannbad ved 60 o / min.
      MERK: Å fordøye et stort antall muskelprøver er tidkrevende. For trinn 4.3.1-4.3.6, estimat tar 2-5 min per prøve. Dette trinnet går raskere når det utføres parallelt av to eller flere forskere.
  3. Homogenisering av prøver
    1. Homogeniser cellesuspensjonen. Overfør suspensjonen fra 15 ml røret til et 50 ml rør. Bruk en 10 ml sprøyte med en 20G kanyle til å blande prøven ved å trekke prøven opp og ned gjennom kanylen 5x.
      MERK: Hvis biter av ufordøyd muskel tetter nålen, tørk dem av på et papirlommetørkle.
    2. Plasser en 40 μm cellesil på et nytt 50 ml konisk rør.
    3. Ta opp hele cellesuspensjonen i sprøyten og sil prøven over i en ny 50 ml konisk slange med en cellesil på toppen. Sil prøven ved å dispensere totalvolumet direkte på filteret.
    4. For å hente alle mononukleerte celler, tilsett 20 ml av vaskemediet til det tomme koniske røret og hell dette gjennom cellesilen inn i det 50 ml koniske røret som inneholder den anstrengte prøven. Hent det gjenværende volumet under cellesilen med en p1000-pipette.
    5. Kast cellesilen og spinn prøven ved 1 600 x g i 5 minutter ved 4 °C.
    6. Ved å pipettere med en p1000-pipette, aspirer supernatanten uten å forstyrre pelleten.
    7. Ved å pipettere med en p1000-pipette, resuspenderes membranpelleten i 500 μL av vaskemediet og resuspendere de andre muskelprøvene i 300 μL av vaskemediet hver.
      MERK: Mellomgulvet er den største av musklene med høyest stamcelleinnhold og kan derfor brukes til kontrollfargene.

5. Farging og sortering (~40 min + 30 min sortering/prøve)

MERK: Arbeid i et sterilt miljø på is for følgende trinn.

  1. Overfør en 50 μL alikot av membrancellesuspensjonen til fire nye 2 ml mikrosentrifugerør for kontrollflekkene (50 μL hver). Tilsett 250 μL av vaskemediet til hvert kontrollrør til et endelig volum på 300 μL.
  2. Tilsett 3 μL (1:100) av fluorescensen minus en antistoffer (FMO-kontroll) til de tre kontrollfargerørene og la ett rør være uten antistoffer (ufarget kontroll) (se tabell 2).
  3. Legg til 3 μL (1:100) av antistoffene (VCAM1-PECy7, CD45-FITC, CD31-FITC og SCA1-PacificBlue) til de gjenværende muskel-enkeltcellesuspensjonene, inkludert den gjenværende membranprøven.
  4. Inkuber cellesuspensjonene i 15 minutter ved 4 °C i en hode-over-hode-rister.
    MERK: Kontrollfargene er nødvendige for å bestemme bakgrunnsfluorescensnivåer og sette portene for flowcytometri. Ulike antistoffer kan brukes, men hver vil ha en spesifikk arbeidskonsentrasjon og inkubasjonstid som må testes. Hvis antistoffer fra forskjellige leverandører brukes, kan konsentrasjonen, og dermed fortynningen, variere. En celle levedyktighet fargestoff kan legges til fargestoffet for å eliminere eventuelle døde eller døende celler i løpet av sorteringen.
  5. Spinn prøvene ved 1 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten uten å forstyrre pelleten ved hjelp av pipettering.
  6. Ved pipettering med en p1000-pipette resuspenderes hver prøve i 800 μL vaskemedium.
  7. Filtrer prøvene ved hjelp av et FACS-rør med en cellesilhette (40 μm) for å fjerne eventuelle gjenværende celleklumper (eller aggregater).
  8. Vask cellesilen ved å tilsette ytterligere 800 μl vaskemediet.
  9. Hold prøvene dekket med aluminiumsfolie på is til analyse.
    MERK: Hvis cellesuspensjonen på dette tidspunktet virker uklar/tett på grunn av den høye konsentrasjonen av celler, tilsett ytterligere 800 μl vaskemediet for å redusere celletettheten.
  10. Start opp FACS med en 70 μm dyse.
  11. Bruk de ufargede kontrollene og FMO-kontrollene til å angi gating-strategien: MuSC-er er negative for CD45-FITC, CD31-FITC og SCA1-PacBlue, og er positive for VCAM1-PECy7; FAP-ene er negative for CD45-FITC, CD31-FITC, VCAM1-PECy7 og positive for SCA1-PacBlue.
  12. Sorter de fargede encellede suspensjonene ved hjelp av toveis sortering og samle MuSCs og FAPs i separate oppsamlingsrør som inneholder 500 μL av vaskemediet.
    MERK: Ved bruk av FACS med fire lasere (konfigurasjon: 70 μm dyse, 405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm), krever den valgte kombinasjonen av fluoroforer ikke kompensasjon av fluorescenssignal. Ved bruk av et annet flowcytometer eller en annen kombinasjon av fluoroforer anbefales imidlertid ytterligere enkeltfargede kontrollprøver for kompensasjon. Fra de mindre musklene (EDL, soleus, TA) kan man forvente utbytte på 3000 MuSC og 5000 FAP. For de andre større musklene kan man forvente utbytter på 20 000 MuSC og FAP. Antall hendelser som er oppført av FACS-programvaren, kan avvike fra det faktiske antallet levedyktige celler i innsamlingsrøret. Celletall kan bekreftes ved celletelling ved hjelp av et hemocytometer.
  13. Spinn ned de sorterte cellene ved 1 600 x g i 5 minutter ved 4 °C. Ved pipettering, aspirer supernatanten uten å forstyrre cellepelleten.
  14. Tilsett 100 μL av vaskemediet i hver prøve, og resuspender cellene forsiktig uten å skape luftbobler. Overfør 100 μL av den resuspenderte prøven til en kollagenbelagt 96-brønnsplate med halvt område. Plate 1,000-3,000 celler per brønn.
    MERK: Hvis cellene ikke er ordentlig resuspendert, kan cellene holde sammen i klumper, forvirrende senere mikroskopianalyser.
  15. Inspiser cellene under mikroskopet og noter deres fordeling, form og størrelse.
  16. Inkuber platen ved 37 °C, 5% CO2. Cellene vil feste seg innen 2 timer.
    MERK: Det anbefales å bekrefte renheten til de innsamlede cellepopulasjonene, enten ved flowcytometrianalyse (ved å laste en alikot av den sorterte prøven på sortereren og registrere et lite antall hendelser) eller ved antistofffarging av de belagte cellene etterfulgt av mikroskopi (Pax7 er en definerende markør for mus MuSCs, PDGFRa er en definerende markør for muse-FAPer). Fra og med avsnitt 7 nedenfor er en protokoll for farging av celler for Pax7- og PDGFRa-proteinnivåer.

6. EdU-inkorporeringsanalyse

MERK: Arbeid under sterile forhold og bruk den kjemiske avtrekkshetten ved håndtering av paraformaldehyd (PFA) for følgende trinn. EdU er en nukleotidanalog innlemmet i DNA når cellene går gjennom S-fasen av cellesyklusen. Det er mutagent ved høye konsentrasjoner. Bruk alltid hansker når du håndterer EdU. Sjekk de lokale retningslinjene for håndtering av EdU-avfall.

  1. EdU-puls (dag 1)
    1. Forbered en arbeidsløsning på 2x EdU i et nytt vaskemedium.
    2. Ta 96-brønnplaten med cellene ut av inkubatoren. Inspiser cellene under mikroskopet for å overvåke sammenløpet. Flytt inn i den laminære strømningshetten.
    3. Fjern 50 μl medium fra platen ved pipettering. Tilsett 50 μL 2x EdU-arbeidsløsning slik at det endelige volumet i brønnen er 100 μL.
    4. Kultur cellene i nærvær av EdU for den tiltenkte tidsperioden ved 37 ° C, 5% CO2.
      MERK: Tidspunktet og varigheten av EdU-pulsen kan variere. I gjennomsnitt tar hvilende MuSC 2 dager å fullstendig aktivere og fullføre sin første celledeling19. EdU kan legges til de sorterte cellene umiddelbart etter plating.
  2. Fiksering (dag 2)
    MERK: PFA er kreftfremkallende. Håndter alltid PFA med forsiktighet. Gjør deg kjent med de lokale forskriftene for håndtering av PFA og avhending av avfall.
    1. Ta 96-brønnplaten med cellene ut av inkubatoren. Inspiser cellene under mikroskopet og flytt platen inn i avtrekkshetten.
    2. Ved pipettering, fjern mediet og fikser cellene ved å tilsette 50 μL 4% PFA til hver brønn. Inkuber platen i 10 minutter ved romtemperatur (RT) i en kjemisk avtrekkshette.
    3. Fjern PFA med en pipette og kast den i en egnet avfallsbeholder.
    4. Vask cellene ved å tilsette 100 μL PBS til alle brønnene. Ved pipettering, aspirer PBS og gjenta vasken. Hold cellene i 100 μL PBS.
      NOTAT: For å unngå å vaske ut noen celler, dispenser PBS til siden av brønnen ved å pipettere sakte.
  3. EdU-merking
    1. Permeabiliser cellene før EdU-deteksjon ved å fjerne PBS og tilsette 100 μL 0,5% Triton X-100 i PBS. Inkuber platen i 5 minutter ved 4 °C.
      MERK: Triton X-100 er et overflateaktivt middel og kan forårsake hudirritasjon. Håndter med forsiktighet og bruk alltid hansker.
    2. Etter 5 minutter, aspirer Triton X-100 og tilsett 100 μL PBS.
    3. Forbered en EdU klikk-kjemi-reaksjonsblanding i henhold til produsentens protokoll.
    4. Aspirer PBS og tilsett 33 μL av EdU klikk-kjemi-reaksjonsblandingen. Inkuber platen i 30 min ved RT.
    5. Aspirer EdU klikk-kjemi-reaksjonsblandingen og vask cellene med 100 μL PBS.
    6. Aspirer PBS, tilsett 100 μL PBS med Hoechst (1:2,000), og inkuber beskyttet mot lys i 10 minutter ved RT.
    7. Aspirer Hoechst og vask to ganger ved å tilsette 100 μL PBS. Oppbevar cellene i 100 μL PBS ved 4 °C i mørket.
    8. Bilde cellene på et omvendt mikroskop. Cellene kan lagres i mørket i månedsvis så lenge brønnene ikke tørker ut.
      MERK: Det er mulig å co-flekke cellene med antistoffer. I dette tilfellet, fortsett med et blokkeringstrinn etterfulgt av inkubasjon med det primære antistoffet. Velg et sekundært antistoff med en konjugert fluorofor hvis utslippsspektrum ikke overlapper med fluoroforen som brukes til å oppdage EdU. Pass på at du ikke bruker sekundære antistoffer med fluoroforer som overlapper spektralområdet til Hoechst.

7. Farging av immunfluorescens

MERK: Denne delen av protokollen kan utføres uavhengig av avsnitt 6. Når du hopper over seksjon 6, må du utføre trinn 6.3.1 og 6.3.2 for å aktivere cellepermeabilisering før du fortsetter med trinn 7.2 nedenfor.

  1. Ta ut platen som inneholder de EdU-merkede cellene.
  2. Forbered 20 ml blokkeringsbuffer ved å tilsette 2 ml eselserum til 18 ml PBS.
  3. For å forhindre uspesifikk antistoffbinding, fjern 100 μL av PBS fra hver brønn og tilsett 50 μL av blokkeringsbufferen med en p200-pipette. Inkuber platen i 30 minutter ved RT, beskyttet mot lys og dekket av aluminiumsfolie for å forhindre fotobleking av fluoroformerket EdU.
    MERK: Cellene er festet til bunnen av brønnen, men kan løsne hvis det brukes for mye kraft ved pipettering.
  4. Mens du blokkerer prøvene, klargjør den primære antistoffblandingen. Tilsett 8,0 μL (1:100) mus anti-Pax7 og kanin anti-PDGFRa til 800 μL blokkeringsbuffer for å flekke 16 brønner (åtte vev, to celletyper).
  5. Etter blokkering, fjern eselserumet og tilsett 50 μL av den primære antistoffblandingen til hver brønn. Inkuber platen over natten ved 4 °C, dekket av aluminiumsfolie.
  6. Etter inkubering, fjern det primære antistoffet og tilsett 50 μL Triton (0, 5% i PBS) til hver av brønnene. Inkuber platen i 5 minutter ved RT beskyttet mot lys, for å vaske bort det ubundne antistoffet. Gjenta vasken tre ganger.
  7. Forbered den sekundære antistoffmasterblandingen ved å tilsette 1,0 μL (1:1,000) esel-anti-mus-Alexa647 og esel-antikanin-Alexa555 til et mikrosentrifugerør inneholdende 1000 μL av blokkeringsbufferen.
  8. Tilsett 33 μL av den sekundære antistoffmasterblandingen til hver av brønnene. Inkuber platen i 60 min ved RT beskyttet mot lys.
  9. Fjern overflødig sekundært antistoff ved pipettering, tilsett 50 μL Triton (0,1% i PBS), og inkuber i 5 minutter ved RT beskyttet mot lys. Gjenta vasken tre ganger.
  10. Til slutt tilsettes 100 μL PBS. Bestem om du vil avbilde platen umiddelbart ved hjelp av et invertert fluorescensmikroskop med et avkjølt CCD-kamera, eller oppbevar platen ved 4 ° C til senere analyse ved å forsegle platekantene med parafilm og pakke den forseglede platen i aluminiumsfolie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter protokoll for individuell skjelettmuskelisolasjon (figur 2) ble gracilis-, TA-, EDL-, GA-, soleus-, triceps-, masseter- og diafragmamuskulaturen isolert fra tre sveitsiske hannmus som var seponert fra et lokalt avlsprogram (figur 2). Etter vevsdissosiasjon og antistofffarging ble MuSC og FAP fra de enkelte musklene renset med FACS (figur 3). Den første gatingen ble oppnådd med en ufarget prøve for å identifisere cellene og skille singlettene fra dubletter (figur 3A). De påfølgende portene ble satt ved hjelp av FMO-kontroller for å identifisere fargeterskler (figur 3B). Den fargede prøven ble deretter gated for CD31 / CD45-FITC og Sca1-PacBlue. SCA1+/CD31-/CD45- populasjonen (FAP) ble sortert i et eget oppsamlingsrør, mens den dobbeltnegative populasjonen ble inngjerdet og plottet for VCAM1-PECy7 og forward scatter (FSC). VCAM1+-populasjonen (MuSC) ble sortert i et eget innsamlingsrør. MuSC og FAP ble kvantifisert som prosentandel av singleter (tabell 3) og sortert i separate oppsamlingsrør inneholdende 500 μL av vaskemediet. Membran- og tricepsmuskel-encellesuspensjonene har en høyere relativ forekomst av MuSCs enn FAPs, mens de andre encellede suspensjonene har en høyere relativ forekomst av FAPs enn MuSCs (tabell 3).

Av de sorterte cellene ble 1000-3000 celler sådd og inkubert i 24 timer. Etter 24 timers inkubasjon ble mediet fjernet og erstattet med et friskt medium inneholdende EdU. Cellene ble fiksert ved 48 timer, farget for EdU, og deretter med antistoffer mot Pax7-protein eller PDGFRa-protein, og avbildet ved hjelp av et invertert epifluorescensmikroskop. Bilder ble kvantifisert ved hjelp av Fiji plugin i ImageJ. Robust EdU-farging ble observert, selv om fraksjonen av EdU-positive celler var forskjellig for de to stamcelletypene og de forskjellige musklene (figur 4A-C). MuSCs isolert fra enten EDL eller GA viste signifikant lavere EdU-inkorporering sammenlignet med MuSCs isolert fra enten TA, membran, gracilis, eller triceps, mens MuSCs isolert fra massør og soleus faller i mellom og er ikke signifikant forskjellig fra noen av gruppene (figur 4A,B). Dette stemmer overens med våre tidligere resultater22. Videre er vevene som MuSC-ene viser høye EdU-inkorporeringsnivåer fra de samme vevene som MuSC-ene tidligere ble vist å uttrykke høye nivåer av Pax3-protein22. FAPs isolert fra EDL viste en signifikant lavere EdU-inkorporering sammenlignet med FAPs isolert fra GA og soleus, mens FAPs isolert fra TA viste en signifikant lavere EdU-inkorporering sammenlignet med FAPs isolert fra soleus (figur 4A, C). Dette understreker viktigheten av å analysere stamceller fra individuelle vev i stedet for å samle muskler fra forskjellige vev for isolasjon. For alle vev var gjennomsnittlig fraksjon av EdU-positive MuSCs høyere sammenlignet med gjennomsnittlig fraksjon av EdU-positive FAPer, noe som tyder på at MuSCs aktiveres raskere under de gitte forholdene.

Til slutt ble cellerenhet bekreftet med immunfluorescensfarging (figur 4D). I gjennomsnitt farget 97,71 % (± 1,38 %) av MuSCs positivt for Pax7-protein, og 88,16 % (±6,35 %) av FAP-ene farget positivt for PDGFRa-protein, noe som bekrefter spesifisiteten til vår stamcelleisolasjonsprosedyre (figur 4D).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk sammendrag av protokollen. Skjematisk viser de to hovedsegmentene i protokollen, MuSC-isolasjon (øvre panel), hvileanalyse (nedre panel) og nøkkeltrinnene i metodikken som brukes i hver av dem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Muskellokalisering og isolasjon. (A) Et skjema som viser plasseringen av hver muskel. (VG Nett) Demonstrasjon av muskelisolasjon for (B-D) gracilis, (E-G) TA / EDL, (H-J) triceps, (KM) GA / SOLEUS, (N-P) masseter og (Q-S) membranmuskler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Gating strategi brukt til å identifisere og sortere MuSCs og FAPs i en membran muskelprøve. Celler identifiseres basert på cellestørrelse (Forward Scatter (FSC)) og granularitet (Side Scatter (SSC)). Singlets er valgt basert på FSC-A og FSC-W. Avstamningsceller er inngjerdet for senere identifisering av MuSCs (Lineage-/VCAM1+), og FAP (Lineage-/SCA1+) celler er inngjerdet for å identifisere FAPer. Den samme gatingstrategien ble brukt på (A) en ufarget kontroll, (B) FMO-kontroller (FMO-SCA1PacBlue, FMO-CD31/45-FITC og FMO-VCAM1-PECy7) og (C) en farget prøve. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kvantifisering av celleaktivering ved EdU-farging. (A) Representative bilder av EdU-farging av MuSCs (topppaneler) og FAPs (nederste paneler) fra en membranprøve. Vist er sammenslåtte bilder av EdU og Hoechst (venstre paneler), og enkeltkanalene i grønt (EdU, midtpaneler) og blått (Hoechst, høyre paneler). (B,C) Søylediagram som viser prosentandelen av EdU-positive (B) MuSCs eller (C) FAPs for indikerte muskler. Plottet er gjennomsnittet ± SEM. Hver prikk representerer en mus. Statistisk analyse ble utført i GraphPad med tosidige Student t-tester, med signifikans satt til *p < 0,05 og **p < 0,01. (D) Immunfluorescensfarging av MuSCs (topppaneler) og FAPs (nederste paneler) med antistoffer mot MuSC-markøren Pax7 (venstre side) og FAP-markøren PDGFRa (høyre side). Vist er sammenslåtte bilder av Pax7 med Hoechst, etterfulgt av enkeltkanalene, og sammenslåtte bilder av PDGFRa med Hoechst, etterfulgt av enkeltkanalene. N = 3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Løsninger Reagenser Beløp 
Vaskemiddel F-10 Næringsblanding (skinke) (1x), +L-glutamin 445 ml
Hesteserum 50 ml
Penn/streptokokker 5 ml
Dissosiasjonsbuffer (1. fordøyelse) Kollagenase type II 650 U/ml
Vaskemiddel 100 ml
Dispase lager (2. fordøyelse) Dispase i PBS 11 E/ml
Kollagenasebestand (2. fordøyelse) Kollagenase type II i PBS 1000 U/ml
PBS 1x PBS 10x pulverkonsentrat 9,89 g/l
Autoklavert/sterilt vann 1 l
Surt vann Iseddik (100%) Vannfri for analyse 5,15 ml
Autoklavert/sterilt vann 895 ml
Kollagenoppløsning (0,002%) Kollagen fra kalveskinn 20 ml
Surt vann 800 ml
Triton X-100 Triton X-100 0,5 % (v/v)
PBS 1x 99.5%
Blokkering av buffer PBS 1x 18 ml
Eselskerum 2 ml

Tabell 1: Tabell over oppskrifter.

Eksempel nr. Navn 
1 Ubeiset
2 Fluorescens minus VCAM1-PeCy7
3 Fluorescens minus SCA1-PacificBlue
4 Fluorescens minus CD31/45-FITC
5 Eksperimentell flekk (alle fire antistoffer)

Tabell 2: Oversikt over farging, kontroller og prøver utarbeidet for hvert vev før sortering.

Vev Antistoffblanding Celler Singleter Lin neg FAP-er MuSC-er
Mellomgulv ubeiset 100% 82% 55% 0.5% 0.0%
FMO Sca1-PacBlue 100% 83% 19% 0.3% 4.3%
FMO CD31/45-488 100% 84% 40% 9.4% 5.6%
FMO Vcam1-PeCy7 100% 78% 20% 5.6% 0.0%
Farget 100% 77% 19% 2.4% 3.8%
Gracilis Farget 100% 96% 11% 2.6% 1.4%
TAKK Farget 100% 88% 16% 2.8% 2.2%
EDL Farget 100% 86% 26% 19.2% 0.8%
Soleus Farget 100% 91% 41% 13.3% 1.1%
GA Farget 100% 94% 51% 6.1% 1.5%
Triceps Farget 100% 92% 30% 2.6% 4.5%
Masseter Farget 100% 85% 27% 19.3% 2.6%

Tabell 3: Oversikt over relativ celletypemengde i FACS-dataene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Flere trinn er nøkkelen i gjennomføringen av denne protokollen for å oppnå gode utbytter. De enkelte musklene har et lite volum sammenlignet med mengden muskel som brukes i bulkisolasjonsprotokoller. Dette medfører risiko for at muskelen tørker ut under disseksjonen, noe som reduserer utbyttet. For å forhindre dette er det viktig å legge medium til musklene umiddelbart etter disseksjon. I tillegg, hvis disseksjon tar lengre tid, kan huden fjernes fra ett lem om gangen for å redusere tiden for eksponering av musklene til luft. Det mindre volumet resulterer også i økt risiko for overfordøyelse. For å motvirke dette krever den nåværende metoden lavere mengder kollagenase II-enzym og reduserte fordøyelsestider sammenlignet med bulkmuskelprotokoller 9,16. Enzymatisk fordøyelse avhenger også av renheten til enzymene, og lavere renhet kan påvirke utbyttet negativt. I tillegg er mekanisk fordøyelse kritisk. Ved utilstrekkelig skjæring vil det reduserte overflatearealet hemme enzymatisk fordøyelse og senke stamcelleutbyttet. Ved kutting for mye, vil det økte overflatearealet føre til overfordøyelse og senke stamcelleutbyttet. Det ristende vannbadet forhindrer utfelling av den fordøyede muskelen, forbedrer fordelingen av enzymet og hjelper til med å skape en homogen temperatur, noe som helt muliggjør kortere inkubasjonstider. Derfor tillater den nåværende metoden en signifikant reduksjon av inkubasjonstiden sammenlignet med andre metoder.

Denne protokollen avhenger av celledissosiasjon og rensing. Disse prosedyrene etterligner vevsskade, som aktiverer stamcellene. Konsekvent har nyere studier avslørt at MuSCs endrer sine genuttrykksprogrammer under isolasjonsprosedyren27,28,29,30. Som et resultat er de rensede stamcellene forskjellige fra cellene in vivo når det gjelder genuttrykksmønstre. En annen begrensende faktor i protokollen er dens avhengighet av FACS, som krever tilgang til dyrt utstyr. FACS er gullstandarden for å isolere flere cellepopulasjoner samtidig med høy renhet20. Nylige fremskritt ved bruk av magnetiske perler og mikrobobler gir reduksjoner i kostnadene31,32, men om de tilbyr sammenlignbare utbytter for å jobbe med enkeltmuskler, må bestemmes. Endelig er utbyttet av protokollen begrenset på grunn av den lille størrelsen på musklene, og utgjør dermed begrensninger på potensielle nedstrømsanalyser.

Tidligere studier har stolt på å samle forskjellige muskler når man isolerer MuSCs og / eller FAPs for å maksimere celleutbyttet. Dette gjennomsnitter imidlertid ut eventuelle vevsspesifikke forskjeller i stamcelleadferd og funksjon mellom forskjellige muskler. Den nåværende protokollen muliggjør isolering av MuSCs og FAPs fra individuelle muskler for nedstrøms analyser av stamcellefunksjon. Som et eksempel på en nedstrømsanalyse ble stamcelleaktivering analysert ved EdU-inkorporering, noe som avslørte at stamceller fra forskjellige vev viser forskjellig aktiveringskinetikk. I tidligere arbeider har muligheten for å bruke andre nedstrømsanalyser blitt vist; disse analysene krever mindre celletall, for eksempel SmartSeq2 enkeltcelle RNA-sekvensering, celletransplantasjon, mikrofluidisk PCR og klonale ekspansjonsanalyser 22,33,34,35.

Avslutningsvis beskriver denne protokollen en metode for disseksjon av individuelle muskler for å isolere og studere MuSCs og FAPs. Denne strategien vil gjøre det mulig for eksperimenter å få en bedre forståelse av stamcellefunksjon på tvers av forskjellige muskler i helse og sykdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser og ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Cellesortering ble utført ved FACS Core Facility, Aarhus Universitet, Danmark. Figurer ble opprettet ved hjelp av Biorender.com. Vi takker Dr. J. Farup for å dele kaninen anti-PDGFRa antistoff. Dette arbeidet ble støttet av et AUFF Starting Grant til E.P. og Start Package tilskudd fra NovoNordiskFonden til E.P. (0071113) og til A.D.M. (0071116).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube( PCR performance tested, PP, 30,000 xg, DNA/DNase-/RNase-free, Low DNA binding, Sterile ) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 72.706.700 1.5 mL tube
15 mL tube (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, Non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.554.502 15 mL tube
5 mL polystyrene round-bottom tube Falcon, Fisher Scientific  352054 FACS tube without strainer cap
5 mL polystyrene Round-bottom tube with cell-strainer cap Falcon, Fisher Scientific   352235 FACS tube with strainer cap
5 mL tube (PP, non sterile autoclavable) VWR collection 525.0946 5 mL tube
50 mL tube( PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non-cytotoxic, pyrogen free, Sterile) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 62.547.254 50 mL tube
Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387458 (Cat # A31572)
Alexa Fluor 647 donkey-anti mouse IgG (H+L) Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2420713 (Cat#A31571)
ARIA 3 BD FACS, Core facility Aarhus University
Centrifuge 5810 eppendorf EP022628188 Centrifuge
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 dye Invitrogen, Thermo Fisher Lot: 2387287 (Cat# C10337) Cell Proliferation Kit
Collagen from calf-skin  Bioreagent, Sigma Aldrich  Source: SLCK6209 (Cat# C8919)
Collagenase type II Worthington, Fisher Scientific  Lot: 40H20248 (cat# L5004177 ) Collagenase
Dispase Gibco, Fisher Scientific  Lot: 2309415 (cat# 17105-041 ) Dispase
Donkey serum (non-sterile) Sigma Aldrich, Merck Lot: 2826455 (Cat# S30-100mL)
Dumont nr. 5, 110 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.327 Straight forceps with fine tips
Dumont nr. 7, 115 mm Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1606.335 Curved forceps
F-10 Nutrient mixture (Ham) (1x), +L-glutamine Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2453614 (cat# 31550-023)
FITC anti-mouse CD31 BioLegend, NordicBioSite MEC13.3 (Cat # 102506)
FITC Anti-mouse CD45 BioLegend, NordicBioSite 30-F11 (Cat# 103108)
Glacial acetic acid (100%) EMSURE, Merck   K44104563 9Cat # 1000631000)
Head over head mini-tube rotator  Fisher Scientific  15534080 (Model no. 88861052) Head over head mini-tube rotator
Horse serum Gibco, Fisher Scientific  Lot. 2482639 (cat# 10368902 )
Isotemp SWB 15 FisherBrand, Fisher Scientific 15325887 Shaking water bath
MS2 mini-shaker  IKA  Vortex unit
Needle 20 G (0.9 mm x 25 mm) BD microlance, Fisher Scientific  304827 20G needle 
Neutral formalin buffer 10% CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)
Non-pyrogenic cell strainer (40 µM) Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3945.040 Cell strainer 
Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) BioLegend, NordicBioSite D7 (Cat# 108120)
Pax7 primary antibody DSHB Lot: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)
PBS 10x powder concentrate Fisher BioReagents, Fisher Scientific BP665-1
PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) BioLegend, NordicBioSite 429 (MVCAM.A) (Cat # 105720)
Pen/strep Gibco, Fisher Scientific  Lot. 163589 (cat# 11548876 )
Pipette tips p10 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2140-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p1000 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2279-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p20 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2149P-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Pipette tips p200 Art tips, self sealing barrier, Thermo Scientific 2069-05 Low retention, pre-sterilized, filter tips
Protective underpad Abena  ACTC-7712  60 x 40cm, 8 layers
Rainin, pipet-lite XLS Mettler Toledo, Thermo Scientific  2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 Pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Recombinant anti-PDGFR-alpha RabMAb, abcam AB134123
Scalpel (shaft no. 3) Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.502 Scalpel
Scalpel blade no. 11 Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 1902.0911 Scalpel
Scanlaf mars Labogene class 2 cabinet: Mars Flow bench
ScanR Olympus Microscope, Core facility Aarhus University
Scissors FST 14568-09
Series 8000 DH Thermo Scientific 3540-MAR Incubator
Serological pipette 10 mL VWR 612-3700 Sterile, non-pyrogenic
Serological pipette 5 mL VWR, Avantor delivered by VWR 612-3702 Sterile, non-pyrogenic
Syringe 5 mL, Luer tip (6%), sterile  BD Emerald, Fisher Scientific 307731 Syringe
TC Dish 100, standard Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S 83.3902 Petri dish 
Tissue Culture (TC)-treated surface, black polystyrene, flat bottom, sterile, lid, pack of 20 Corning, Sigma Aldrich 3764 96-well Half bottom plate
Triton X-100 Sigma Aldrich, Merck Source: SLCJ6163 (Cat # T8787)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  2. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
  3. Cheung, T. H., Rando, T. A. Molecular regulation of stem cell quiescence. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).
  4. Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche. Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).
  5. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
  7. Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
  8. Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
  9. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
  10. Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
  11. Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
  12. Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
  13. Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  14. Shea, K. L., et al. Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration. Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).
  15. Fukada, S. -I., et al. Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle. Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).
  16. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  17. Joe, A., Wang, J., Rossi, F. Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle. Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124 (2007).
  18. Yi, L., Rossi, F. Purification of progenitors from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments. (49), e2476 (2011).
  19. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119 (4), 543-554 (2004).
  20. Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  21. Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).
  22. de Morree, A., et al. Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function. Science. 366 (6466), 734-738 (2019).
  23. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).
  24. Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities. Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).
  25. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  26. Baghdadi, M. B., et al. Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche. Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).
  27. van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo. Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).
  28. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  29. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  30. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  31. Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits. PloS One. 14 (3), 0213832 (2019).
  32. Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles. PloS One. 10 (5), 0125036 (2015).
  33. Brett, J. O., et al. Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1. Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).
  34. Tabula Muris Consortium. A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  35. de Morrée, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).

Tags

Tilbaketrekking utgave 190
Isolering av hvilende stamcellepopulasjoner fra individuelle skjelettmuskler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frimand, Z., Das Barman, S.,… More

Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., de Morrée, A. Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles. J. Vis. Exp. (190), e64557, doi:10.3791/64557 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter