Summary
Immunolabeling van abnormaal prioneiwit met behulp van immunohistochemieprotocollen vereist specifieke monster- en anti-PrP-antilichaamvoorbereidingsmethoden. Het huidige protocol beschrijft de belangrijkste stappen in epitoopontmaskering om te zorgen voor een goede PrP-immunolabeling en om niet-specifieke achtergrondkleuring te minimaliseren. Ook houdt deze benadering rekening met bioveiligheidsmaatregelen bij het uitvoeren van immunohistochemische studies met de prion-geïnfecteerde weefsels.
Abstract
Abnormale prioneiwitten (PrPSc) zijn de ziekte-geassocieerde isovorm van cellulair prioneiwit en diagnostische markers van overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's). Deze neurodegeneratieve ziekten treffen mensen en verschillende diersoorten en omvatten scrapie, zoönotische boviene spongiforme encefalopathie (BSE), chronische verspillingsziekte van hertachtigen (CWD) en de nieuw geïdentificeerde kameel prionziekte (CPD). De diagnose van TSE's is gebaseerd op immunodetectie van PrPSc door toepassing van zowel immunohistochemie (IHC) als westerse immunoblotmethoden (WB) op encefalonweefsels, namelijk de hersenstam (obex-niveau). IHC is een veelgebruikte methode die primaire antilichamen (monoklonaal of polyklonaal) gebruikt tegen antigenen van belang in cellen van een weefselsectie. De antilichaam-antigeenbinding kan worden gevisualiseerd door een kleurreactie die gelokaliseerd blijft in het gebied van het weefsel of de cel waar het antilichaam op gericht was. Als zodanig worden bij prionziekten, net als in andere onderzoeksgebieden, de immunohistochemische technieken niet alleen gebruikt voor diagnostische doeleinden, maar ook in pathogenesestudies. Dergelijke studies omvatten het detecteren van de PrPSc-patronen en -typen van de eerder beschreven patronen om de nieuwe prionstammen te identificeren. Aangezien BSE mensen kan infecteren, wordt aanbevolen dat faciliteiten en/of praktijken van bioveiligheidslaboratoria niveau 3 (BSL-3) worden gebruikt voor het hanteren van monsters van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen die in de TSE-bewaking zijn opgenomen. Daarnaast worden containment en prion-dedicated apparatuur aanbevolen, waar mogelijk, om verontreiniging te beperken. De PrPSc IHC-procedure bestaat uit een mierenzuur epitoop-deasking stap die ook fungeert als een prion-inactivatiemaatregel, omdat formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde weefsels die in deze techniek worden gebruikt, besmettelijk blijven. Bij het interpreteren van de resultaten moet ervoor worden gezorgd dat niet-specifieke immunolabeling wordt onderscheiden van doeletikettering. Voor dit doel is het belangrijk om artefacten van immunolabeling te herkennen die zijn verkregen in bekende TSE-negatieve controledieren om die te onderscheiden van specifieke PrP Sc-immunolabelingtypen, die kunnen variëren tussen TSE-stammen, gastheersoorten en prnp-genotype, verder hierin beschreven.
Introduction
Volgens de prionhypothese is de abnormale isovorm (PrPSc) de primaire of enige component van het infectieuze agens in overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's). Bevestiging voor de diagnose van TSE is gebaseerd op immunodetectie van PrPSc door toepassing van immunohistochemie (IHC) protocollen en/of westerse immunoblotmethoden (WB) van encefalonweefsels1.
IHC is een methode waarbij monoklonale of, in sommige gevallen, polyklonale antilichamen (als primaire antilichamen) worden gebruikt als eerste stap in immunostaining van specifiek gerichte antigenen van belang in cellen van een weefselsectie. Elke effectieve primaire antilichaam-antigeenbinding wordt vervolgens gevisualiseerd met behulp van secundaire antilichamen die specifiek zijn voor de primaire antilichamen. Deze secundaire antilichamen worden geconjugeerd aan enzymen, zoals mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP). Visualisatie wordt vervolgens bereikt door een substraat aan deze enzymen toe te voegen, waardoor onoplosbare kleurproducten worden geproduceerd die zijn gelokaliseerd in gebieden waar de primaire antilichamen zijn gebonden aan de beoogde antigenen. Verbeterde visualisatie kan worden bereikt door counterstaining, waarbij een kleurstof wordt gebruikt om een contrast te creëren tussen immunogelabeld en niet-immunogelabeld weefsel2.
Met IHC met behulp van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefsels (FFPE), kan formalinefixatie de effectiviteit van primaire antilichamen tenietdoen als gevolg van cross-linking door formaldehyde en verwarming en uitdroging tijdens paraffine-inbedding. Deze veranderen de conformatie van eiwitten, vernietigen, denatureren of maskeren de epitopen, waardoor hun detectie wordt verminderd of ingetrokken3. Als zodanig vereist dit antigeen retrieval (AR). De AR-technieken verstoren formaldehyde-gerelateerde chemische groep cross-linking in de antigene moleculen, waardoor de oorspronkelijke antigeen-eiwitconformatie wordt hersteld of ontmaskerd. Dit resulteert in het herstellen van de antilichaam-antigeen (epitoop) affiniteit voor immunolabeling. De uiteindelijke werkzaamheid van AR hangt af van de kwaliteiten van het beoogde antigeen en/of het primaire antilichaam2.
Heat-induced antigen (epitope) retrieval (HIER) is een procedure van AR3 en wordt routinematig gebruikt voor PrPSc IHC-detectie, zoals hierin beschreven. IHC is essentieel voor de diagnose en wordt gebruikt in onderzoekslaboratoria om de weefselverdeling van een pathologie-geassocieerd antigeen te bepalen. Het wordt veel gebruikt bij het diagnosticeren en onderzoeken van kanker, neurowetenschappen en infectieziekten4, onder anderen. Voor TSE's speelt IHC een belangrijke rol in diagnose en onderzoek voor het bevestigen en onderzoeken van PrPSc-distributie in natuurlijke gastheren en experimentele modellen. IHC draagt bij aan prionpathogenesestudies en de analyse van PrP Sc-depositietypen en -patronen, namelijk in neurale weefsels5, om afwijkingen van routinematig beschreven infecties te detecteren en vermeende nieuwe prionstammen te identificeren.
Omdat prionen van boviene spongiforme encefalopathie (BSE) de mens kunnen infecteren, kunnen bepaalde laboratoriumprotocollen die betrokken zijn bij het werk met BSE het gebruik van BSL-3-faciliteiten en -praktijken vereisen6. Deze omvatten het gebruik van een verzegelde secundaire container om potentiële met BSE geïnfecteerde weefselmonsters binnen het instituut en het laboratorium te vervoeren. Het omvat ook het aanwijzen van inperkingsgebieden en prionspecifieke apparatuur voor BSE-onderzoek en -analyse, waar mogelijk. Dit wordt gedaan om besmetting buiten het werkgebied te voorkomen en een besloten ruimte te bieden, omdat decontaminatieprocedures noodzakelijk worden.
Dienovereenkomstig volgt het Laboratorium voor Pathologie van INIAV de aanbevolen bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) faciliteiten en praktijken6 om potentiële prion-geïnfecteerde monsters van weefsels van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen in verband met de TSE-surveillance te beheren.
Formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde weefsels opgenomen in TSE diagnostische of onderzoeksprocedures, vooral in het centrale zenuwstelsel, kunnen potentieel besmettelijk zijn. Daarom moeten deze vaste weefsels worden behandeld met mierenzuur om de infectiviteit van prionen, indien aanwezig, voorafgaand aan weefselverwerking te verminderen. Dit wordt uitgevoerd door vaste, bijgesneden weefsels (ongeveer 2-4 mm dikte) in een verwerkingscassette te plaatsen. De cassette wordt vervolgens ondergedompeld in 98% mierenzuur (gedurende 1 uur). Na onderdompeling worden de cassettes met weefsels gedurende 30 minuten in stromend leidingwater gewassen en teruggebracht naar het fixatief voor verdere verwerking. Als weefselsecties niet vóór de verwerking worden behandeld, moeten postmicrotomische weefselsecties gedurende ten minste 5 minuten vóór histologische kleuring in onverdund mierenzuur worden ondergedompeld7. Het IHC-protocol voor PrPSc bevat een routinematige mierenzuur-epitoop-ontmaskeringsstap, die ook dient om prionen7 te inactiveren. Na deze prioninactiveringsstappen kunnen de resulterende vaste weefsels vervolgens worden verwerkt bij BSL-2 met behulp van standaard BSL-2-praktijken.
De minimale weefselbemonsteringsvereiste voor TSE-diagnose bij elk dier dat onder TSE-surveillance valt, is het verzamelen van de hersenstam (op obex-niveau). Bovendien wordt voor het opsporen van atypische BSE en scrapie geadviseerd om ook een deel van het cerebellum te verzamelen 1,8. Voor CWD-diagnose moeten zowel hersenstam (obex) als retrofaryngeale lymfeklieren worden getest, omdat PrP Sc kan worden gedetecteerd in lymfoïde weefsels zonder detecteerbare PrPSc in obex9, beoordeeld door Machado et al.10.
Het obex-gedeelte van de hersenstam omvat diagnostische TSE-doellocaties, namelijk de dorsale vagale kern (DVN), solitaire tractuskern (STN) en spinale tractuskern van de trigeminuszenuw (V). Deze gebieden vertonen consequent bilaterale PrP Sc-accumulatie, zelfs in de vroege stadia van BSE en klassieke scrapie. In klinische gevallen van gevorderde TSE vertonen alle grijze stofgebieden in de hersenstam een wijdverspreide PrPSc-distributie 11.
Voordat de hersenmonsters worden gesegmenteerd en verwerkt, worden ze geëvalueerd (figuur 1) om het niveau van autolyse en de aanwezigheid van weefselschade vast te stellen die mogelijk de geschiktheid van het monster voor IHC-gebaseerde bevestigende diagnose8 in gevaar brengt. Om de integriteit van de voorbereidende protocollen en de analyseresultaten te valideren, worden de positieve en negatieve weefselmonsters van TSE opgenomen als controles in combinatie met de bereiding van weefsels uit testgevallen in elke test.
Figuur 1: De PrPSc IHC procedure. Representatie van de stapsgewijze volgorde van de PrPSc IHC-procedure van deparaffinisatie van weefselsecties tot uiteindelijke immunostaining en detectie (FFPE - Formaline-fixed paraffine-embedded; Mab - monoklonaal antilichaam; DAB - 3,3' diaminobenzidine). Deze figuur is gemaakt in BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De hierin beschreven IHC-procedure is een onderdeel van het onderzoeksproject FAIRJ-CT98-7021, "De oprichting van een Europees netwerk voor de surveillance van TSE's van herkauwers en de standaardisatie en harmonisatie van het proces en de criteria voor de identificatie van verdachte gevallen". Het volgt de diagnostische criteria die zijn gedefinieerd door de Wereldorganisatie voor diergezondheid, WOAH (voorheen het Office International des Épizooties, OIE)1 en het Europees referentielaboratorium voor dierlijke TSE's 8,11. De beschreven IHC-procedure is sinds 2008 ook geaccrediteerd volgens NPISOIEC17025 (algemene vereisten voor de competentie van test- en kalibratielaboratoria). Een dergelijke accreditatie impliceert een kwalitatief hoogstaand managementsysteem met standaard operationele procedures, gekwalificeerd personeel, nauwkeurig gekalibreerde apparatuur, strenge controle van gegevens en reagentia, deelname aan interlaboratoriumvaardigheidstests, niet-conform werk en risicobeoordeling om de effectiviteit van het managementsysteem te vergroten, betere resultaten te behalen en laboratoriumrisico's te voorkomen. Prion-geïnfecteerde weefselcontroles met BSE, klassieke scrapie, atypische scrapie en CWD werden verzameld (formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed, FFPE) uit verschillende bronnen. De runder- en schapensecties zijn afkomstig van de gevallen die zijn gediagnosticeerd in het kader van een TSE-bewakingsprogramma voor dieren. De CWD-secties zijn afkomstig van de controlemonsters die in 2003 door professor Stefanie Czub (Canadian Food Inspection Agency, National Center for Animal Diseases) zijn verstrekt en van de CWD Proficiency testing 2008 georganiseerd door het European Reference Laboratory for TSEs (APHA, Weybridge).
1. Weefseldoorsnede en diavoorbereiding
- Snijd secties van formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels met een dikte van 3-5 μm met behulp van een microtoom.
- Laat delen drijven op gezuiverd water met een temperatuur van ongeveer 10 °C onder het smeltpunt van de gebruikte paraffine. Til de secties uit het water op speciaal behandelde microscoopglaasjes (zie materiaaltabel). Laat het water goed weglopen van de glijbanen.
- Incubeer de dia's een nacht bij 50 °C om de schuifhechting van weefsels te verbeteren.
OPMERKING: Het verdient de voorkeur om vers gesneden weefsels voor IHC-protocollen voor te bereiden, hoewel TSE-positieve en negatieve controlesecties van tevoren kunnen worden voorbereid en opgeslagen. Stap 2 tot en met 4 moeten worden uitgevoerd in een chemische zuurkast.
2. Deparaffinisatie en rehydratatie
- Plaats de dia's met de weefselsecties in een roestvrijstalen beitsmand (zie materiaaltabel). Dompel de mand gedurende 3 minuten onder in een xyleen bad (roestvrijstalen vlekcontainer), verwijder en dompel opnieuw onder.
- Verwijder xyleen en rehydrateer secties door ze gedurende 3 minuten onder te dompelen in een absoluut ethanolbad. Verwijder en dompel opnieuw onder.
- Droog de secties aan de lucht en plaats ze gedurende 1 minuut in een 90% ethanolbad. Breng nog een minuut over naar een 70% ethanolbad, gevolgd door een laatste overbrenging naar een 50% ethanolbad gedurende 1 minuut. Voor elke behandeling met ethanolbad roert u de schuifkorf twee keer voorzichtig en laat u de mand leeglopen voordat u de volgende keer overbrengt.
3. Epitoop ophalen
- Dompel de weefselsecties voorzichtig onder in 98% mierenzuur bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Spoel de secties gedurende 5 minuten in leidingwater, gevolgd door twee keer spoelen in gedestilleerd water.
LET OP: Mierenzuur is zeer corrosief. Het dragen van een veiligheidsbril en handschoenen is verplicht. - Voer heat-induced antigen retrieval (HIER) uit volgens de onderstaande stappen.
OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd door gehydrateerd autoclaveren bij 121 °C gedurende 30 minuten in een specifieke drukkamer (zie materiaaltabel).- Verwarm de citraatbuffer (10 mM, pH 6.1, zie materiaaltabel) gedurende ongeveer 20 minuten voor op 98 °C in een roestvrijstalen kleuringscontainer die in de drukkamer is geplaatst en is gevuld met 500 ml gedestilleerd water.
OPMERKING: Voor de huidige studie was het programma Set Point 1 (SP1) voor de specifieke gebruikte apparatuur. - Nadat het alarm aangeeft dat de apparatuur de geprogrammeerde tijd en temperatuur heeft bereikt, dompelt u de mand onder met dia's en start u het programma naar Punt 2 (121 ° C gedurende 30 minuten). Plaats voor kwaliteitscontroledoeleinden een gedeelte van zelfklevende autoclaafindicatortape op de mand om de temperatuur en druk te controleren en noteer de begin- en einddruk van dit programma.
- Als het aantal te absorberen dia's de capaciteit van de mand niet bereikt, gebruik dan schone, lege dia's om lege posities in te nemen. Nadat het programma is beëindigd, laat u de passieve terugkeer van de kamer naar omgevingsdruk (ten minste 30 minuten).
OPMERKING: Langere duur kan niet-specifieke achtergrondvlekken verminderen. - Breng de schuifmand voorzichtig over in een roestvrijstalen beitscontainer gevuld met gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
- Verwarm de citraatbuffer (10 mM, pH 6.1, zie materiaaltabel) gedurende ongeveer 20 minuten voor op 98 °C in een roestvrijstalen kleuringscontainer die in de drukkamer is geplaatst en is gevuld met 500 ml gedestilleerd water.
4. Inactivatie van endogene peroxidase
- Dompel de schuifkorf met de monstersecties gedurende 30 minuten onder in een bad van 3% waterstofperoxide (H 2 O2) in methanol. Spoel de secties af onder stromend water (5 min). Giet af en dompel de secties onder in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) voor nog eens 5 minuten.
5. Immunodetectie
OPMERKING: Voor deze studie werd immunodetectie uitgevoerd met behulp van het capillaire spleetformaat7 met behulp van een in de handel verkrijgbaar schuifclipassemblagesysteem (zie materiaaltabel). Andere immunohistochemische schuifsystemen zijn ook van toepassing.
- Plaats elke dia op een in de handel verkrijgbare afdekplaathouder (zie materiaaltabel) die vooraf is bevochtigd met TBS, waarbij bellen worden vermeden, waarbij de weefselzijde naar de houder is gericht en de schuifranden samenvallen met de twee onderste punten van de houder.
- Houd de schuifhouder tussen de duim en de wijsvinger, met één vinger bovenop de monsterplaat en de andere aan de onderkant van de houder. Plaats vervolgens de assemblage in de galerij van het systeem.
- Om ervoor te zorgen dat de set goed is gemonteerd, vult u de put tussen de monsterplaat en de houder met TBS, die niet onmiddellijk mag overlopen. Zorg er vanaf dit punt voor dat ongeveer 80 μL TBS tussen de houder en de dia moet worden gehouden. Laat de secties niet drogen.
- Eenmaal in het systeem, om achtergrondkleuring voorafgaand aan de behandeling met primair antilichaam (anti-PrP, zie tabel met materialen) te verminderen, incubeert u de monsterglaasjes vooraf met 20% normaal serum van dezelfde soort als de secundaire antilichaamgastheer die wordt gebruikt voor immunostaining (in dit geval paardenserum) gedurende 30 minuten in TBS.
- Ontdooi het aantal aliquots antilichamen dat moet worden gebruikt volgens de onderzochte diersoort, het aantal te onderzoeken monstersecties en de hoeveelheid werkverdunning.
OPMERKING: Gebruik voor de beste resultaten 10% normaal serum van dezelfde soort als de bron van het secundaire antilichaam en de primaire antilichaamoplossingen. Indien mogelijk, voor de beste resultaten, moet de gastheerbron van het normale serum en secundaire antilichaam van dezelfde soort zijn. - Breng zonder de secties te wassen de primaire antilichaamoplossing rechtstreeks (200 μL) aan in elk putje van de diahouderset en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Vul voor het wassen de putjes van de schuifhoudersets met TBS en wacht 5 minuten. Herhaal dit twee keer.
- Verdun het gebiotinyleerde secundaire antilichaam (monoklonaal anti-murine Horse Ab, zie Tabel van Materialen) bij 1/200 in TBS met 10% paardenserum. Bereid het benodigde volume voor, afhankelijk van het aantal te behandelen secties.
- Breng de secundaire antilichaamoplossing (200 μL) aan op elk putje van de diahouderset. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen zoals beschreven in stap 5.5.
- Voor incubatie met avidine-biotinecomplex peroxidase (ABC/HRP-complex, zie materiaaltabel), bereidt u het reagens 30 minuten voor gebruik voor. Breng de ABC/HRP complexe oplossing (200 μL) aan in elke put van de schuifplaathouderset. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Wassen zoals beschreven in stap 5.5.
6. Ontwikkeling met DAB-chromogeen
LET OP: DAB is een potentieel carcinogeen. Als gevolg hiervan is passende zorg nodig tijdens het werken met dit reagens, inclusief oogbescherming, laboratoriumjassen, handschoenen en goede laboratoriumprocedures. Verwijder de lokale regelgeving.
- Verdun chromogeen volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) onmiddellijk voor gebruik. Breng de chromogeenoplossing (400 μL) aan op elk putje van de schuifplaatset.
- Incubeer gedurende maximaal 30 minuten bij kamertemperatuur. In PrPSc-positieve secties is een incubatietijd van 10 minuten meestal voldoende.
- Verwijder de resterende chromogeenoplossing door de glaasjes in gedestilleerd water te wassen. Verwijder de dia's van de afdekplaathouders en plaats ze in een plastic container met gedestilleerd water.
7. Hematoxyline tegenkleuring
- Dompel de roestvrijstalen beitsmand met de secties gedurende 1 minuut onder in het bad met hematoxyline-oplossing (zie materiaaltabel). Spoel zachtjes af in koud stromend water gedurende 10 minuten of lauw water gedurende 5 minuten.
- Droog de secties uit door ze gedurende 1 minuut in 90% ethanol te plaatsen, gevolgd door één bad in absolute ethanol gedurende 1 min. Plaats vervolgens de dia's gedurende 1 minuut in een xyleenbad.
- Monteer de secties met een in de handel verkrijgbaar montagemedium (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Deze stappen worden uitgevoerd in een chemische zuurkast bij kamertemperatuur (19 °C-24 °C). Deze procedure omvat een testverslag (aanvullend dossier 1) voor het registreren van de voltooiing van alle stappen, de gebruikte apparatuur en de laborant. Bovendien is een werkblad (aanvullend dossier 2) ontworpen om eenvoudig de volumes van de reagentia te bepalen op basis van het aantal secties in elke test, de werkverdunningen en de instructies van de fabrikant, evenals om de kamertemperatuur, apparatuur en reagensbatches te registreren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aangezien niet-specifieke doelimmunolabeling mogelijk is, is het belangrijk om het niveau van niet-specifieke immunolabeling bij bekende TSE-negatieve controledieren vast te stellen. Dit is een belangrijke stap om specifieke PrPSc immunolabeling7 goed te interpreteren (figuur 2). Non-target labeling door anti-PrP-antilichamen is waargenomen als discrete intraneuronale fijnstofkleuring (duidelijker in de hypoglossale kern en accessoire cuneaatkern), onregelmatige fijn-lineaire draden van kleuring in de neuropil (STN, V, olivaire kern, accessoire cuneate nucleus, laterale fasciculaire kern, reticulaire formatie dorsaal aan de olivaire kernen en gebied postrema)12 , diffuse nonparticulate labeling in sommige grijze en witte stof gebieden, en diffuse cytoplasmatische labeling van neuronen13 (Figuur 3).
Op basis van verschillende studies kan specifieke, gerichte PrP Sc-immunolabeling worden gevonden in veel verschillende typen, afhankelijk van de TSE-stam, gastheersoort en prnp-genotype. De volgende PrPSc-typen zijn beschreven (beoordeeld door Orge et al.5): Intraneuronaal; Intragliaal; Stellaat; Perivascculair; Subpiel; Subependimaal; Lineair; Fijn korrelig; Aggregaten (of grof korrelig, grof deeltjes tot coalescerend en mosachtig); Perineuronaal; Plaque-Like (of plaques, vasculaire plaques); Punctate; Bolvormig.
Figuur 2: Representatieve beelden na immunolabeling voor PrPSc van weefselsecties van niet-geïnfecteerde controles en met prionen geïnfecteerde dieren met BSE, klassieke scrapie, atypische scrapie en CWD. (A,B,C) secties van negatieve controles van respectievelijk runderen, schapen en hertachtigen; D) BSE-positief: korrelige PrPSc-afzettingen in de neuropil van DVN en (E) STN; (F) Schapen klassieke scrapie positief: granulaire PrPSc in de neuropil en intraneuronale in DVN en (G) stellaat PrPsc in de reticulaire formatie; (H) Schapen atypische scrapie: korrelig PrP Sc in de neuropil van V in het obex-gebied, korrelig in moleculaire (m) en (I) korrelige (g) lagen van het cerebellum en (J) punctaat (pijl) en bolvormig (pijlpunt) PrPSc in witte stof van de hersenstam; (K) CWD: granulaire PrPSc bij V en (L) reticulaire formatie en perivasculair bij reticulaire formatie. Voor A, B, C en D- Schaalbalk = 50 μm; E, F, G, H en L- Schaalbalk = 20 μm; I en K- Schaalbalk = 1 mm; J- Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden met voorbeelden van immunostaining artefacten waargenomen na de PrPSc IHC procedure. (A) Diffuse neuropilachtergrond (DVN). (B) Diffuse cytoplasmatische (pijlkop) labeling van neuronen (reticulaire formatie). (C) Artifactual chromogen deposits (pijlen) (reticulaire vorming). (D) Onregelmatige fijne lijntjes (pijlen) van kleuring in de neuropil (reticulaire formatie). Monsters van PrPSc-negatieve rundersecties van immunohistochemische technische bekwaamheidstests georganiseerd door het Europees referentielaboratorium voor TSE's. A en B- Schaalbalk = 20 μm; C en D- Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1 geeft een overzicht van de beschrijving van immunogelabelde PrPSc-typen waargenomen bij BSE, klassieke en atypische scrapie en CWD voor een positieve diagnose en vastgestelde criteria voor negatieve, niet-overtuigende en ongeschikte resultaten11 en beoordeeld door Orge et al.5.
Tabel 1: Samenvatting van PrPSc-typen waargenomen bij BSE, klassieke en atypische scrapie en CWD voor een positieve diagnose, en criteria voor negatieve, niet-overtuigende en ongeschikte resultaten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Formulier dat dient als het INIAV "TSE Immunohistochemical test record". De taak wordt voltooid als elke stap van het IHC-protocol is voltooid en gecertificeerd door de technicus die de betreffende taak uitvoert. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 2: Werkblad voor reagensvoorbereiding voor het TSE-immunohistochemische protocol. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TSE's zijn potentiële zoönotische ziekten. Na het opduiken van BSE in 1986 in het Verenigd Koninkrijk werd Portugal een van de lidstaten van de Europese Unie met een hogere incidentie van deze ziekte14,15. Om deze ziekte onder controle te houden, zijn andere TSE's die zijn opgedoken (klassieke en atypische scrapie, BSE-varianten en momenteel de bewaking van chronische verspillingsziekte bij hertachtigen), bewakingsmechanismen ontwikkeld door het directoraat-generaal Voedsel en Veterinair (DGAV) en het Nationaal Instituut voor landbouw en veterinair onderzoek, IP (INIAV) dat de TSE-diagnose uitvoert als het nationale veterinaire laboratorium voor TSE's. Dit laboratorium volgt de aanbevolen bioveiligheid BSL-3-faciliteiten en -praktijken6 bij het beheren van de potentiële prion-geïnfecteerde monsters van weefsels van runderen, kleine herkauwers en hertachtigen die verband houden met TSE-surveillance. Immunodetectie van PrPSc door immunohistochemie (IHC) en/of westerse immunoblotmethoden (WB) van encefalon en lymfoïde weefsels zijn de referentiemethoden voor het bevestigen van de diagnose van TSE1.
De IHC-techniek is een nuttig aanvullend hulpmiddel voor diagnose en anatomopathologisch onderzoek in de diergeneeskunde en de menselijke geneeskunde. Verschillende kritieke punten worden geïdentificeerd en in de praktijk is het noodzakelijk om in elk laboratorium voor elke diersoort, het gebruikte antilichaam en ook de verschillende geteste weefsels aan te passen16,17. De fixatie, het ophalen van antigeen, de achtergrond en artefacten, naast het type antilichaam dat wordt gebruikt (monoklonaal versus polyklonaal, de gebruikte kloon, dierlijke oorsprong) en de geteste diersoort, zijn voorbeelden van factoren die in elk laboratorium naar behoren moeten worden gecontroleerd en gestandaardiseerd, zodat de uiteindelijke resultaten verkregen met immunohistochemie correct zouden worden geïnterpreteerd als specifieke immunolabeling2, 17.
De huidige werkzaamheden presenteerden het protocol dat werd gevolgd in het nationale referentielaboratorium voor TSE in Portugal, met de kritieke punten en alle referentiemethoden die zijn gemaakt om de juiste diagnose van TSE-ziekten te waarborgen. De IHC-resultaten zijn afhankelijk van de kwaliteit van het monster, dat de doellocaties voor TSE's moet omvatten. Het ontbreken van deze TSE-doellocaties, samen met de afwezigheid van specifieke PrP Sc-immunolabeling, is een belangrijke beperking van deze methodologie om een diagnose te verzekeren. Zelfs in gevallen waarin bevriezing of autolyse artefacten bevordert, is het mogelijk om een sluitende diagnose te stellen of er al dan niet een TSE aanwezig is als die doellocaties in het monster aanwezig zijn. Bovendien geeft de identificatie van immunostaining in niet-specifieke doelen in verschillende neuronale weefsels, gebaseerd op dagelijkse observatie van negatieve en positieve controles die altijd zijn geïntroduceerd wanneer deze techniek wordt uitgevoerd, de kwaliteit aan van het hier geproduceerde en gepresenteerde protocol en de reden voor de certificeringervan 5,12,13.
Als mogelijke incidenten worden het verlies van weefselsecties tijdens het gehydrateerde autoclaveren en/of verwijderen van de afdekplaathouders, de aanwezigheid van bellen die vastzitten tussen de dia's en de afdekplaten en de ontoereikende verdunning van de reagentia benadrukt. Om deze gebeurtenissen te ondervangen, wordt aanbevolen om positief geladen microscoopglaasjes te gebruiken binnen de vervaldatum en die goed zijn opgeslagen, de weefselsecties zorgvuldig te knippen met de afdekplaten, gekalibreerde apparatuur te gebruiken, het werkblad voor reagensvoorbereiding te standaardiseren (aanvullend bestand 2) en immunolabeling batchreagentia te testen voor gebruik.
De beschrijving van nieuwe TSE-varianten, namelijk atypische scrapie, bevestigt ook het belang van een standaard IHC-techniek bij deze diagnose. Met deze techniek is het mogelijk om het bestaan van verschillende patronen voor PrP Sc-immunokleuring te observeren, afhankelijk van de prionstam, gastheersoort en prnp-genotype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit artikel werd gefinancierd door het project POCI-01-0145-FEDER-029947 "Chronic wasting disease risk assessment in Portugal" ondersteund door FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Ook ontvingen de auteurs van de onderzoekseenheid CECAV financiering van de FCT, in het kader van het project UIDB / CVT / 0772 / 2020.We bedanken Bruce C. Campbell, Research Director (gepensioneerd), Western Regional Research Center, USDA, voor zijn hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
References
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A.
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Orge, L., et al.
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al.
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F.
- Pires, M. A., et al.
