Nachweis von abnormalem Prionprotein durch Immunhistochemie

Summary

Die Immunmarkierung abnormaler Prionproteine unter Verwendung immunhistochemischer Protokolle erfordert spezifische Methoden zur Herstellung von Proben- und Anti-PrP-Antikörpern. Das vorliegende Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Epitop-Demaskierung, um eine korrekte PrP-Immunmarkierung sicherzustellen und die unspezifische Hintergrundfärbung zu minimieren. Dieser Ansatz berücksichtigt auch Biosicherheitsmaßnahmen bei der Durchführung immunhistochemischer Studien mit den Prionen-infizierten Geweben.

Abstract

Abnorme Prionproteine (PrP^Sc) sind die krankheitsassoziierte Isoform des zellulären Prionproteins und diagnostische Marker für transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE). Diese neurodegenerativen Erkrankungen betreffen Menschen und verschiedene Tierarten und umfassen Scrapie, zoonotische bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), chronische Auszehrungskrankheit von Hirschen (CWD) und die neu identifizierte Kamel-Prionen-Krankheit (CPD). Die Diagnose von TSE beruht auf dem Immunnachweis von PrP^Sc durch Anwendung sowohl der Immunhistochemie (IHC) als auch der westlichen Immunoblot-Methoden (WB) auf Enzephalongewebe, nämlich den Hirnstamm (Obex-Spiegel). IHC ist eine weit verbreitete Methode, die primäre Antikörper (monoklonal oder polyklonal) gegen Antigene von Interesse in Zellen eines Gewebeschnitts verwendet. Die Antikörper-Antigen-Bindung kann durch eine Farbreaktion sichtbar gemacht werden, die in dem Bereich des Gewebes oder der Zelle, auf den der Antikörper gerichtet wurde, lokalisiert bleibt. Daher werden die immunhistochemischen Techniken bei Prionenerkrankungen, wie auch in anderen Forschungsgebieten, nicht nur zu diagnostischen Zwecken, sondern auch in Pathogenesestudien eingesetzt. Solche Studien beinhalten den Nachweis der PrP^Sc-Muster und -Typen aus den zuvor beschriebenen, um die neuen Prionenstämme zu identifizieren. Da BSE den Menschen infizieren kann, wird empfohlen, Einrichtungen und/oder Praktiken des Biosicherheitslabors der Stufe 3 (BSL-3) für den Umgang mit Rindern, kleinen Wiederkäuern und Hirschproben zu verwenden, die in die TSE-Überwachung einbezogen werden. Darüber hinaus werden nach Möglichkeit Containment- und Prionengeräte empfohlen, um die Kontamination zu begrenzen. Das PrP^Sc IHC-Verfahren besteht aus einem Ameisensäure-Epitop-Demaskierungsschritt, der auch als Prioneninaktivierungsmaßnahme fungiert, da formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebe, die in dieser Technik verwendet werden, infektiös bleiben. Bei der Interpretation der Ergebnisse muss darauf geachtet werden, die unspezifische Immunmarkierung von der Zielmarkierung zu unterscheiden. Zu diesem Zweck ist es wichtig, Artefakte der Immunmarkierung zu erkennen, die bei bekannten TSE-negativen Kontrolltieren erhalten wurden, um diese von spezifischen PrP Sc-Immunmarkierungstypen zu unterscheiden, die zwischen TSE-Stämmen, Wirtsspezies und prnp-Genotyp variieren können, die hierin näher beschrieben werden.

Introduction

Nach der Prionenhypothese ist die abnorme Isoform (PrP^Sc) die primäre oder einzige Komponente des Infektionserregers bei transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE). Die Bestätigung für die Diagnose von TSE beruht auf dem Immunnachweis von PrP^Sc durch Anwendung von immunhistochemischen (IHC) Protokollen und/oder westlichen Immunoblot-Methoden (WB) von Enzephalongeweben¹.

IHC ist eine Methode, bei der monoklonale oder in einigen Fällen polyklonale Antikörper (als primäre Antikörper) als erster Schritt bei der Immunfärbung von spezifisch zielgerichteten Antigenen von Interesse, die sich in Zellen eines Gewebeschnitts befinden, verwendet werden. Jede effektive primäre Antikörper-Antigen-Bindung wird dann unter Verwendung von Sekundärantikörpern visualisiert, die für die primären Antikörper spezifisch sind. Diese sekundären Antikörper sind an Enzyme wie Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP) konjugiert. Die Visualisierung wird dann erreicht, indem diesen Enzymen ein Substrat hinzugefügt wird, wodurch unlösliche Farbprodukte entstehen, die in Bereichen lokalisiert sind, in denen die primären Antikörper an die Zielantigene gebunden sind. Eine verbesserte Visualisierung kann durch Gegenfärbung erreicht werden, wobei ein Farbstoff verwendet wird, um einen Kontrast zwischen immunmarkiertem und nicht immunmarkiertem Gewebe^{zu erzeugen 2}.

Bei IHC unter Verwendung von formalinfixiertem Paraffingewebe (FFPE) kann die Formalinfixierung die Wirksamkeit von Primärantikörpern aufgrund der Vernetzung durch Formaldehyd und Erwärmung und Dehydratisierung während der Paraffineinbettung zunichte machen. Diese verändern die Konformation von Proteinen, zerstören, denaturieren oder maskieren die Epitope, wodurch ihre Erkennung verringert oder aufgehoben^{wird 3}. Dies erfordert daher eine Antigen-Retrieval (AR). Die AR-Techniken stören die Vernetzung der Formaldehyd-verwandten chemischen Gruppen in den antigenen Molekülen und stellen so die ursprüngliche Antigen-Protein-Konformation wieder her oder entlarven sie. Dies führt zur Wiederherstellung der Antikörper-Antigen-Affinität (Epitop) für die Immunmarkierung. Die letztendliche Wirksamkeit von AR hängt von den Eigenschaften des Zielantigens und/oder des Primärantikörpers² ab.

Die Hitze-induzierte Antigen (Epitop) Retrieval (HIER) ist ein Verfahren von AR³ und wird routinemäßig für den PrP^Sc IHC-Nachweis verwendet, wie hierin beschrieben. IHC ist essentiell für die Diagnose und wird in Forschungslabors verwendet, um die Gewebeverteilung eines pathologieassoziierten Antigens zu bestimmen. Es wird unter anderem häufig bei der Diagnose und Erforschung von Krebs, Neurowissenschaften und Infektionskrankheiten⁴ eingesetzt. Bei TSE spielt IHC eine wichtige Rolle in der Diagnose und Forschung zur Bestätigung und Untersuchung der PrP^{Sc-Verteilung} in natürlichen Wirten und experimentellen Modellen. IHC trägt zu Prionen-Pathogenese-Studien und zur Analyse von PrP-Sc-Ablagerungstypen und -mustern bei, insbesondere in neuralen Geweben⁵, um Abweichungen von routinemäßig beschriebenen Infektionen zu erkennen und mutmaßliche neue Prionenstämme zu identifizieren.

Da Prionen der bovinen spongiformen Enzephalopathie (BSE) den Menschen infizieren können, können bestimmte Laborprotokolle, die an der Arbeit mit BSE beteiligt sind, die Verwendung von BSL-3-Einrichtungen und -Praktiken erfordern⁶. Dazu gehört die Verwendung eines versiegelten Sekundärbehälters für den Transport potenziell BSE-infizierter Gewebeproben innerhalb des Instituts und des Labors. Dazu gehört auch die Ausweisung von Eindämmungsbereichen und Prionen-Spezialgeräten für die BSE-Forschung und -Analyse, wann immer dies möglich ist. Dies geschieht, um eine Kontamination außerhalb des Arbeitsbereichs zu verhindern und einen begrenzten Raum zu schaffen, da Dekontaminationsverfahren erforderlich werden.

Dementsprechend befolgt das Labor für Pathologie des INIAV die empfohlenen Einrichtungen und Praktiken der Biosicherheitsstufe 3 (BSL-3) 6, um potenziell mit Prionen infizierte Gewebeproben von Rindern, kleinen Wiederkäuern und Hirschen im Zusammenhang mit^der TSE-Überwachung zu verwalten.

Formalinfixierte und in Paraffin eingebettete Gewebe, die in TSE-Diagnose- oder Forschungsverfahren enthalten sind, insbesondere im Zentralnervensystem, können potenziell infektiös sein. Daher müssen diese fixierten Gewebe vor der Gewebeverarbeitung mit Ameisensäure behandelt werden, um die Infektiosität von Prionen, falls vorhanden, zu verringern. Dies geschieht durch Einlegen von fixierten, beschnittenen Geweben (ca. 2-4 mm Dicke) in eine Verarbeitungskassette. Die Kassette wird dann in 98% Ameisensäure getaucht (für 1 h). Nach dem Eintauchen werden die Kassetten mit Taschentüchern 30 Minuten lang in fließendem Leitungswasser gewaschen und vor der weiteren Verarbeitung in das Fixiermittel zurückgeführt. Wenn Gewebeschnitte vor der Verarbeitung nicht behandelt werden, müssen postmikrotomische Gewebeschnitte vor der histologischen Färbung mindestens 5 Minuten lang in unverdünnte Ameisensäure getaucht werden⁷. Das IHC-Protokoll für PrP^Sc enthält einen routinemäßigen Ameisensäure-Epitop-Demaskierungsschritt, der auch zur Inaktivierung von Prionen⁷ dient. Nach diesen Prion-Inaktivierungsschritten kann das resultierende fixierte Gewebe dann an BSL-2 unter Verwendung von Standard-BSL-2-Praktiken verarbeitet werden.

Die Mindestanforderung an die Gewebeentnahme für die TSE-Diagnose bei jedem Tier, das in die TSE-Überwachung einbezogen wird, ist die Entnahme des Hirnstamms (auf obex-Ebene). Darüber hinaus wird empfohlen, zum Nachweis von atypischer BSE und Scrapie auch einen Teil des Kleinhirns zu sammeln ^1,8. Für die CWD-Diagnose sollten sowohl Hirnstamm (Obex) als auch retropharyngeale Lymphknoten getestet werden, da PrP Sc in lymphatischen Geweben ohne nachweisbares PrP^Sc in Obex⁹ nachgewiesen werden konnte, überprüft von Machado et ^al.10.

Der obex-Teil des Hirnstamms umfasst diagnostische TSE-Zielstellen, nämlich den dorsalen Vaguskern (DVN), den solitären Traktkern (STN) und den spinalen Traktkern des Trigeminusnervs (V). In diesen Bereichen kommt es auch in den frühen Stadien von BSE und klassischer Scrapie durchweg zu einer bilateralen PrP-Sc-Akkumulation. In klinischen Fällen von fortgeschrittener TSE zeigen alle Bereiche der grauen Substanz innerhalb des Hirnstamms eine weit verbreitete PrP^{Sc-Verteilung 11}.

Vor dem Schneiden und Verarbeiten werden die Hirnproben ausgewertet (Abbildung 1), um den Grad der Autolyse und das Vorhandensein von Gewebeschäden zu ermitteln, die möglicherweise die Eignung der Probe für eine IHC-basierte Bestätigungsdiagnose beeinträchtigen⁸. Um die Integrität der präparativen Protokolle und der Analyseergebnisse zu validieren, werden die TSE-positiven und -negativen Gewebeproben als Kontrollen in Verbindung mit der Präparation von Geweben aus Testfällen in jeden Assay einbezogen.

Abbildung 1: Das PrP^Sc IHC-Verfahren. Darstellung des schrittweisen Ablaufs des PrP^Sc IHC-Verfahrens von der Entparaffinisierung von Gewebeschnitten bis zur eventuellen Immunfärbung und Detektion (FFPE - Formalin-fixiertes Paraffin-eingebettet; Mab - monoklonaler Antikörper; DAB - 3,3' Diaminobenzidin). Diese Figur wurde BioRender.com erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Protocol

Das hier beschriebene IHC-Verfahren ist Bestandteil des Forschungsprojekts FAIRJ-CT98-7021, "Aufbau eines europäischen Netzwerks zur Überwachung von Wiederkäuern TSE und Standardisierung und Harmonisierung des Verfahrens und der Kriterien zur Identifizierung von Verdachtsfällen". Es folgt den Diagnosekriterien, die von der Weltorganisation für Tiergesundheit (WOAH) (vormals Office International des Épizooties, OIE)¹ und dem Europäischen Referenzlabor für TSE bei Tieren ^8,11 festgelegt wurden. Das beschriebene IHC-Verfahren ist seit 2008 auch nach NPISOIEC17025 (Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien) akkreditiert. Eine solche Akkreditierung setzt ein qualitativ hochwertiges Managementsystem voraus, das Standardarbeitsanweisungen, qualifiziertes Personal, genau kalibrierte Geräte, strenge Kontrolle von Daten und Reagenzien, die Teilnahme an Ringversuchen zwischen Laboratorien, nicht konforme Arbeiten und Risikobewertungen umfasst, um die Wirksamkeit des Managementsystems zu erhöhen, bessere Ergebnisse zu erzielen und Laborgefahren zu vermeiden. Es wurden Prion-infizierte Gewebekontrollen mit BSE, klassischer Scrapie, atypischer Scrapie und CWD (formalinfixiert, paraffineingebettet, FFPE) aus verschiedenen Quellen gesammelt. Die Rinder- und Schafabschnitte stammen aus den Fällen, die im Rahmen eines TSE-Überwachungsprogramms für Tiere diagnostiziert wurden. Die CWD-Abschnitte stammen aus den Kontrollproben, die freundlicherweise von Professor Stefanie Czub (Canadian Food Inspection Agency, National Center for Animal Diseases) im Jahr 2003 zur Verfügung gestellt wurden, und aus dem CWD-Ringversuch 2008, der vom Europäischen Referenzlabor für TSE (APHA, Weybridge) organisiert wurde.

1. Gewebeschnitt und Objektträgervorbereitung

1. Schneiden Sie Abschnitte von formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Geweben mit einer Dicke von 3-5 μm mit einem Mikrotom.
2. Schwimmabschnitte auf gereinigtem Wasser mit einer Temperatur von ca. 10 °C unter dem Schmelzpunkt des verwendeten Paraffins. Heben Sie die Schnitte aus dem Wasser auf speziell behandelte Objektträger (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Wasser gründlich von den Objektträgern ablaufen.
3. Inkubieren Sie die Objektträger über Nacht bei 50 °C, um die Haftung des Objektträgers zu verbessern.
   HINWEIS: Es ist vorzuziehen, frisch geschnittene Gewebe für IHC-Protokolle vorzubereiten, obwohl TSE-Positiv- und Negativkontrollabschnitte im Voraus vorbereitet und gelagert werden können. Die Schritte 2 bis 4 müssen in einem chemischen Abzug durchgeführt werden.

2. Entparaffinisierung und Rehydratisierung

1. Legen Sie die Objektträger mit den Gewebeschnitten in einen Edelstahl-Färbekorb (siehe Materialtabelle). Tauchen Sie den Korb für 3 Minuten in ein Xylolbad (Edelstahl-Färbebehälter), nehmen Sie ihn heraus und tauchen Sie ihn erneut ein.
2. Entfernen Sie Xylol und rehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie 3 Minuten lang in ein absolutes Ethanolbad tauchen. Herausnehmen und erneut eintauchen.
3. Trocknen Sie die Abschnitte an der Luft und legen Sie sie 1 Minute lang in ein 90%iges Ethanolbad. Für eine weitere Minute in ein 70%iges Ethanolbad überführen, gefolgt von einer abschließenden Übergabe in ein 50%iges Ethanolbad für 1 min. Bewegen Sie den Objektträgerkorb bei jeder Ethanolbadbehandlung zweimal vorsichtig und entleeren Sie den Korb vor dem nächsten Transfer.

3. Epitop-Retrieval

1. Tauchen Sie die Gewebeschnitte vorsichtig 30 Minuten lang in 98% ige Ameisensäure bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in Leitungswasser und spülen Sie sie anschließend zweimal in destilliertem Wasser ab.
   ACHTUNG: Ameisensäure ist stark ätzend. Schutzbrille und Handschuhe müssen getragen werden.
2. Führen Sie den hitzeinduzierten Antigenabruf (HIER) durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   ANMERKUNG: Dieser Schritt wird durch hydratisiertes Autoklavieren bei 121 °C für 30 Minuten in einer bestimmten Druckkammer durchgeführt (siehe Materialtabelle).
   1. Der Citratpuffer (10 mM, pH 6,1, siehe Materialtabelle) wird bei 98 °C für ca. 20 min in einem Edelstahl-Färbebehälter vorgewärmt, der sich in der mit 500 ml destilliertem Wasser gefüllten Druckkammer befindet.
      ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie war der Programm-Sollwert 1 (SP1) für die spezifische verwendete Ausrüstung.
   2. Nachdem der Alarm anzeigt, dass das Gerät die programmierte Zeit und Temperatur erreicht hat, tauchen Sie den Korb mit Objektträgern ein und starten Sie das Programm auf Sollwert 2 (121° C für 30 Minuten). Legen Sie zur Qualitätskontrolle einen Abschnitt des selbstklebenden Autoklaven-Anzeigebandes auf den Korb, um die Temperatur und den Druck zu überwachen, und zeichnen Sie den Anfangs- und Enddruck dieses Programms auf.
   3. Wenn die Anzahl der Objektträger, die immungefärbt werden sollen, die Kapazität des Korbs nicht erreicht, verwenden Sie saubere, leere Objektträger, um leere Positionen zu belegen. Lassen Sie die Kammer nach Beendigung des Programms passiv auf Umgebungsdruck zurückkehren (mindestens 30 min).
      HINWEIS: Längere Zeiträume können unspezifische Hintergrundfärbungen reduzieren.
   4. Übertragen Sie den Objektträgerkorb vorsichtig für 5 Minuten in einen mit destilliertem Wasser gefüllten Edelstahlfärbebehälter.

4. Inaktivierung der endogenen Peroxidase

1. Der Objektträgerkorb mit den Probenabschnitten wird 30 min lang in ein Bad aus 3%igem Wasserstoffperoxid (_H2O2) in Methanol getaucht. Spülen Sie die Abschnitte unter fließendem Wasser ab (5 min). Die Abschnitte abtropfen lassen und weitere 5 Minuten in 1x Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) tauchen.

5. Immundetektion

ANMERKUNG: Für die vorliegende Studie wurde die Immundetektion unter Verwendung des Kapillarspaltformats⁷ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Objektträgerclip-Montagesystems durchgeführt (siehe Materialtabelle). Andere immunhistochemische Objektträgersysteme sind ebenfalls anwendbar.

1. Legen Sie jeden Objektträger auf einen handelsüblichen Abdeckplattenhalter (siehe Materialtabelle), der mit TBS vorbefeuchtet ist, und vermeiden Sie Blasen, wobei die Gewebeseite dem Halter zugewandt ist und die Objektträgerkanten mit den beiden unteren Punkten des Halters übereinstimmen.
   1. Halten Sie die Objektträgerhalterbaugruppe zwischen Daumen und Zeigefinger, wobei ein Finger oben auf dem Objektträger und der andere auf der Unterseite des Objektträgers liegt. Platzieren Sie dann die Baugruppe in der Galerie des Systems.
   2. Um sicherzustellen, dass das Set gut montiert ist, füllen Sie die Vertiefung zwischen dem Objektträger und dem Halter mit TBS, das nicht sofort überlaufen darf. Stellen Sie ab diesem Zeitpunkt sicher, dass ca. 80 μl TBS zwischen der Halterung und dem Objektträger zurückgehalten werden müssen. Lassen Sie die Abschnitte nicht trocknen.
2. Um die Hintergrundfärbung vor der Behandlung mit primärem Antikörper (Anti-PrP, siehe Materialtabelle) zu verringern, werden die Objektträger mit 20 % normalem Serum derselben Spezies wie der sekundäre Antikörperwirt, der für die Immunfärbung verwendet wird (im vorliegenden Fall Pferdeserum), 30 Minuten lang in TBS vorinkubiert.
3. Tauen Sie die Anzahl der zu verwendenden Aliquote von Antikörpern entsprechend der zu analysierenden Tierart, die Anzahl der zu untersuchenden Probenabschnitte und die Menge der Arbeitsverdünnung auf.
   HINWEIS: Die besten Ergebnisse erzielen Sie, wenn Sie 10 % normales Serum derselben Spezies als Quelle für den Sekundärantikörper und die Primärantikörperlösungen verwenden. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollte die Wirtsquelle des normalen Serums und des sekundären Antikörpers nach Möglichkeit von derselben Spezies stammen.
4. Ohne die Schnitte zu waschen, tragen Sie die primäre Antikörperlösung direkt (200 μl) in jede Vertiefung des Objektträgerhalter-Sets auf und inkubieren Sie sie 60 Minuten lang bei Raumtemperatur.
5. Füllen Sie zum Waschen die Vertiefungen der Objektträger-Sets mit TBS und warten Sie 5 min. Zweimal wiederholen.
6. Verdünnen Sie den biotinylierten Sekundärantikörper (monoklonales Anti-Maus-Pferd Ab, siehe Materialtabelle) bei 1/200 in TBS mit 10% Pferdeserum. Bereiten Sie das erforderliche Volumen in Abhängigkeit von der Anzahl der zu behandelnden Abschnitte vor.
7. Tragen Sie die sekundäre Antikörperlösung (200 μl) auf jede Vertiefung des Objektträgerhalters auf. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
8. Waschen Sie wie in Schritt 5.5 beschrieben.
9. Für die Inkubation mit Avidin-Biotin-Komplex-Peroxidase (ABC/HRP-Komplex, siehe Materialtabelle) bereiten Sie das Reagenz 30 Minuten vor Gebrauch vor. Tragen Sie die komplexe ABC/HRP-Lösung (200 μl) in jede Vertiefung des Gleitplattenhaltersatzes auf. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
10. Waschen Sie wie in Schritt 5.5 beschrieben.

6. Entwicklung mit DAB-Chromogen

ACHTUNG: DAB ist ein potenzielles Karzinogen. Daher ist bei der Arbeit mit diesem Reagenz eine angemessene Sorgfalt erforderlich, einschließlich Augenschutz, Laborkittel, Handschuhe und gute Laborverfahren. Entsorgen Sie die örtlichen Vorschriften.

1. Chromogen unmittelbar vor Gebrauch gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) verdünnen. Tragen Sie die Chromogenlösung (400 μl) auf jede Vertiefung des Slide-Plate-Sets auf.
2. Bis zu 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. In PrP^Sc positiven Schnitten ist in der Regel eine Inkubationszeit von 10 min ausreichend.
3. Entfernen Sie die restliche Chromogenlösung, indem Sie die Objektträger in destilliertem Wasser waschen. Entfernen Sie die Objektträger aus den Abdeckplattenhaltern und legen Sie sie in einen Plastikbehälter mit destilliertem Wasser.

7. Hämatoxylin-Gegenfärbung

1. Tauchen Sie den Edelstahl-Färbekorb mit den Schnitten für 1 Minute in das Hämatoxylinlösungsbad (siehe Materialtabelle). 10 Minuten lang vorsichtig unter fließendem kaltem Wasser oder 5 Minuten in lauwarmem Wasser abspülen.
2. Dehydrieren Sie die Abschnitte, indem Sie sie 1 Minute lang in 90% Ethanol legen, gefolgt von einem Bad in absolutem Ethanol für 1 Minute. Legen Sie dann die Objektträger für 1 Minute in ein Xylolbad.
3. Montieren Sie die Profile mit einem handelsüblichen Montagemedium (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Diese Schritte werden in einem chemischen Abzug bei Raumtemperatur (19 °C-24 °C) durchgeführt. Dieses Verfahren umfasst ein Prüfprotokoll (Ergänzungsdatei 1), in dem die Durchführung aller Schritte, die verwendeten Geräte und der Labortechniker aufgezeichnet werden. Darüber hinaus wurde ein Arbeitsblatt (Ergänzungsdatei 2) erstellt, um die Volumina der Reagenzien anhand der Anzahl der Abschnitte in jedem Assay, der Arbeitsverdünnungen und der Anweisungen des Herstellers sowie die Raumtemperatur, die Ausrüstung und die Reagenzienchargen einfach zu bestimmen.

Representative Results

Da eine unspezifische Ziel-Immunmarkierung möglich ist, ist es wichtig, das Ausmaß der unspezifischen Immunmarkierung bei bekannten TSE-negativen Kontrolltieren zu ermitteln. Dies ist ein wichtiger Schritt, um die spezifische PrP^{Sc-Immunmarkierung} richtig zu interpretieren⁷ (Abbildung 2). Es wurde festgestellt, dass die Nicht-Ziel-Markierung durch Anti-PrP-Antikörper als diskrete intraneuronale feinpartikuläre Färbung (deutlicher im Hypoglossuskern und im akzessorischen Cuneatkern), unregelmäßige feinlineare Färbungsfäden im Neuropil (STN, V, olivarer Kern, akzessorischer cuneat-Kern, lateraler faszikulärer Kern, retikuläre Formation dorsal zu den Olivenkernen und Bereich postrema) ^auftritt12 , diffuse nichtpartikuläre Markierung in einigen Bereichen der grauen und weißen Substanz und diffuse zytoplasmatische Markierung von Neuronen¹³ (Abbildung 3).

Basierend auf mehreren Studien kann eine spezifische, zielgerichtete PrP Sc-Immunmarkierung in Abhängigkeit von TSE-Stamm, Wirtsspezies und prnp-Genotyp in vielen verschiedenen Typen gefunden werden. Die folgenden^PrP-Sc-Typen wurden beschrieben (überprüft von Orge et ^al.5): Intraneuronal; Intraglial; Sternen; Perivaskulär; Subpial; Subependimal; Linear; Feinkörnig; Aggregate (oder grobkörnige, grobkörnige bis koaleszierende und moosartige); Perineuronal; Plaque-artig (oder Plaques, vaskuläre Plaques); Punktförmig; Kugelförmig.

Abbildung 2: Repräsentative Bilder nach Immunmarkierung auf PrP^Sc von Gewebeschnitten von nicht infizierten Kontrollen und Prionen-infizierten Tieren mit BSE, klassischer Traberkrankheit, atypischer Traberkrankheit und CWD. (A,B,C) Schnitte aus Negativkontrollen von Rindern, Schafen bzw. Hirschen; (D) BSE-positiv: granuläre PrP Sc-Ablagerungen im Neuropil von DVN und (E) STN; (F) Schafe klassisch Scrapie-positiv: granuläres PrP^Sc im Neuropil und intraneuronal im DVN und (G) stellates PrP^sc in der retikulären Formation; (H) Atypische Traberkrankheit bei Schafen: körniges PrP Sc im Neuropil von V in der Obex-Region, körnig an molekularen (m) und (I) körnigen (g) Schichten des Kleinhirns und (J) punktförmiges (Pfeil) und kugelförmiges (Pfeilspitzen) prP^Sc an der weißen Substanz des Hirnstamms; (K) CWD: granuläres PrP^Sc bei V und (L) retikulärer Formation und perivaskulär bei retikulärer Formation. Für A, B, C und D- Maßstabsbalken = 50 μm; E-, F-, G-, H- und L-Maßstabsbalken = 20 μm; I und K- Maßstabsbalken = 1 mm; J- Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Repräsentative Bilder mit Beispielen von Immunfärbungsartefakten, die nach dem PrP^Sc IHC-Verfahren beobachtet wurden. (A) Diffuser Neuropil-Hintergrund (DVN). (B) Diffuse zytoplasmatische (Kopfpfeil) Markierung von Neuronen (retikuläre Bildung). (C) Künstliche Chromogenablagerungen (Pfeile) (retikuläre Formation). (D) Unregelmäßige feine Linien (Pfeile) der Färbung im Neuropil (retikuläre Formation). Proben von PrP^Sc-negativen Rinderschnitten aus immunhistochemischen technischen Eignungstests, die vom Europäischen Referenzlabor für TSE organisiert wurden. A und B- Maßstabsbalken = 20 μm; C und D- Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Tabelle 1 fasst die Beschreibung der immunmarkierten PrP^Sc-Typen zusammen, die bei BSE, klassischer und atypischer Traberkrankheit und CWD für eine positive Diagnose beobachtet wurden, sowie festgelegte Kriterien für negative, nicht schlüssige und ungeeignete Ergebnisse¹¹ und wurde von Orge et ^al.5 überprüft.

Tabelle 1: Zusammenfassung der^PrP-Sc-Typen , die bei BSE, klassischer und atypischer Traberkrankheit und CWD für eine positive Diagnose beobachtet wurden, sowie Kriterien für negative, nicht schlüssige und ungeeignete Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergänzungsakte 1: Formular als INIAV "TSE Immunohistochemical test record". Die Aufgabe ist abgeschlossen, wenn jeder Schritt des IHC-Protokolls von dem Techniker, der die jeweilige Aufgabe ausführt, abgeschlossen und zertifiziert wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Arbeitsblatt zur Vorbereitung von Reagenzien für das immunhistochemische TSE-Protokoll. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

TSE sind potentielle Zoonosen. Nach dem Auftreten von BSE im Vereinigten Königreich im Jahr 1986 wurde Portugal zu einem der Mitgliedstaaten der Europäischen Union mit einer höheren Inzidenz dieser Krankheit^14,15. Um diese Krankheit und andere TSE, die aufgetreten sind (klassische und atypische Traberkrankheit, BSE-Varianten und derzeit die Überwachung der chronischen Auszehrung bei Hirschen), zu kontrollieren, wurden von der Generaldirektion für Lebensmittel und Veterinärmedizin (DGAV) und dem Nationalen Institut für Agrar- und Veterinärforschung, IP (INIAV), das als TSE National Veterinary Laboratory die TSE-Diagnose durchführt, Überwachungsmechanismen entwickelt. Dieses Labor befolgt die empfohlenen BSL-3-Einrichtungen und -Praktiken⁶ für die biologische Sicherheit bei der Verwaltung potenziell mit Prionen infizierter Gewebeproben von Rindern, kleinen Wiederkäuern und Hirschen im Zusammenhang mit der TSE-Überwachung. Der Immunnachweis von PrP^Sc durch Immunhistochemie (IHC) und/oder westliche Immunoblot-Methoden (WB) von Enzephalon und lymphatischem Gewebe sind die Referenzmethoden zur Bestätigung der Diagnose von TSE¹.

Die IHC-Technik ist ein nützliches ergänzendes Werkzeug für die Diagnose und anatomopathologische Untersuchung in der Veterinär- und Humanmedizin. Es werden mehrere kritische Punkte identifiziert, und in der Praxis ist es notwendig, in jedem Labor für jede Tierart, den verwendeten Antikörper und auch die verschiedenen getesteten Gewebe anzupassen^16,17. Die Fixierung, der Antigenabruf, der Hintergrund und die Artefakte sind neben der Art des verwendeten Antikörpers (monoklonal versus polyklonal, verwendeter Klon, tierischen Ursprungs) und der getesteten Tierart Beispiele für Faktoren, die in jedem Labor ordnungsgemäß kontrolliert und standardisiert werden müssen, damit die mit der Immunhistochemie erzielten Endergebnisse richtig als spezifische Immunmarkierung interpretiert werden^{2. 17}. Sonstiges

In der aktuellen Arbeit wurde das Protokoll vorgestellt, das im nationalen TSE-Referenzlabor in Portugal befolgt wurde, wobei die kritischen Punkte und alle Referenzmethoden zur Gewährleistung der korrekten Diagnose von TSE-Erkrankungen durchgeführt wurden. Die IHC-Ergebnisse hängen von der Qualität der Probe ab, die die Zielorte für TSE enthalten muss. Das Fehlen dieser TSE-Zielstellen zusammen mit dem Fehlen einer spezifischen PrP-Sc-Immunmarkierung ist eine wichtige Einschränkung dieser Methodik, um eine Diagnose zu stellen. Selbst in Fällen, in denen das Einfrieren oder die Autolyse Artefakte fördert, ist es möglich, eine schlüssige Diagnose zu stellen, ob eine TSE vorliegt oder nicht, wenn diese Zielstellen in der Probe vorhanden sind. Darüber hinaus zeigt die Identifizierung von Immunfärbungen in unspezifischen Zielen in verschiedenen neuronalen Geweben, basierend auf der täglichen Beobachtung von Negativ- und Positivkontrollen, die immer eingeführt wurden, wenn diese Technik durchgeführt wird, die Qualität des hier erstellten und vorgestellten Protokolls und den Grund für seine Zertifizierung^{an 5,12,13}.

Als mögliche Vorkommnisse werden der Verlust von Gewebeschnitten während des hydratisierten Autoklavierens und/oder der Entfernung der Deckplattenhalter, das Vorhandensein von Blasen zwischen den Objektträgern und den Deckplatten sowie die unzureichende Verdünnung der Reagenzien hervorgehoben. Um diese Ereignisse zu überwinden, wird empfohlen, positiv geladene Objektträger innerhalb des Verfallsdatums zu verwenden, die gut gelagert sind, die Gewebeschnitte vorsichtig mit den Deckplatten zu befestigen, kalibrierte Geräte zu verwenden, das Arbeitsblatt zur Reagenzienvorbereitung zu standardisieren (Zusatzdatei 2) und immunmarkierende Chargenreagenzien vor der Verwendung zu testen.

Die Beschreibung neuer TSE-Varianten, nämlich der atypischen Traberkrankheit, bestätigt auch die Bedeutung einer Standard-IHC-Technik für diese Diagnose. Mit dieser Technik ist es möglich, die Existenz unterschiedlicher Muster für die PrP-Sc-Immunfärbung zu beobachten, abhängig vom Prionenstamm, der Wirtsspezies und dem prnp-Genotyp.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted