Summary
תיוג חיסוני של חלבון פריון חריג באמצעות פרוטוקולים אימונוהיסטוכימיים דורש דגימה ספציפית ומתודולוגיות להכנת נוגדנים נגד PrP. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים העיקריים בהסרת אפיטופים כדי להבטיח תיוג חיסוני תקין של PrP ולמזער כתמי רקע לא ספציפיים. כמו כן, גישה זו לוקחת בחשבון אמצעי בטיחות ביולוגית בעת ביצוע מחקרים אימונוהיסטוכימיים עם רקמות נגועות פריון.
Abstract
חלבוני פריון חריגים (PrPSc) הם איזופורם הקשור למחלה של חלבון פריון תאי וסמנים אבחנתיים של אנצפלופתיות ספוגיפורמיות מועברות (TSEs). מחלות נוירודגנרטיביות אלה פוגעות בבני אדם ובמספר מינים של בעלי חיים וכוללות סקראפי, אנצפלופתיה ספוגית זואונוטית של בקר (BSE), מחלת בזבוז כרונית של צוואר הרחם (CWD) ומחלת פריון הגמלים שזוהתה לאחרונה (CPD). אבחון TSEs מסתמך על זיהוי חיסוני של PrPSc על ידי יישום של שיטות אימונוהיסטוכימיה (IHC) ושיטות אימונובלוט מערביות (WB) על רקמות אנצפלון, כלומר, גזע המוח (רמת obex). IHC היא שיטה נפוצה המשתמשת בנוגדנים ראשוניים (חד שבטיים או רב-שבטיים) כנגד אנטיגנים בעלי עניין בתאים של חתך רקמה. ניתן לדמיין את קשירת הנוגדן-אנטיגן על ידי תגובת צבע שנשארת מקומית באזור הרקמה או התא שבו הנוגדן היה ממוקד. לכן, במחלות פריונים, כמו בתחומי מחקר אחרים, טכניקות האימונוהיסטוכימיה אינן משמשות אך ורק למטרות אבחון אלא גם במחקרי פתוגנזה. מחקרים כאלה כוללים זיהוי דפוסי PrPSc וסוגים מאלה שתוארו קודם לכן כדי לזהות את זני הפריונים החדשים. מכיוון ש- BSE יכול להדביק בני אדם, מומלץ להשתמש במתקנים ו / או שיטות מעבדה לבטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3) לטיפול בבקר, מעלי גירה קטנים ודגימות צוואר הרחם הכלולות במעקב TSE. בנוסף, מומלץ להכלה ולציוד ייעודי לפריון, במידת האפשר, כדי להגביל את הזיהום. הליך PrPSc IHC מורכב משלב פירוק אפיטופ חומצה פורמית הפועל גם כאמצעי לנטרול פריונים, מכיוון שרקמות קבועות פורמלין ומשובצות פרפין המשמשות בטכניקה זו נשארות זיהומיות. כאשר מפרשים את התוצאות, יש להקפיד להבחין בין תיוג חיסוני לא ספציפי לבין תיוג מטרה. למטרה זו, חשוב להכיר ממצאים של תיוג חיסוני המתקבלים בחיות בקרה ידועות של TSE שלילי כדי להבדיל בין אלה לבין סוגים ספציפיים של תיוג חיסוני PrPSc , אשר יכולים להשתנות בין זני TSE, מינים מארחים וגנוטיפ prnp , המתוארים בהמשך.
Introduction
על פי השערת הפריון, האיזופורם החריג (PrPSc) הוא המרכיב העיקרי, או היחיד, של הגורם הזיהומי באנצפלופתיות ספוגיפורמיות מועברות (TSEs). אישור לאבחון TSE מסתמך על זיהוי חיסוני של PrPSc על ידי יישום פרוטוקולים של אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו / או שיטות אימונובלוט מערביות (WB) של רקמות אנצפלון1.
IHC היא שיטה המשתמשת בנוגדנים חד-שבטיים או, במקרים מסוימים, רב-שבטיים (כנוגדנים ראשוניים) כצעד ראשון בצביעת מערכת החיסון של אנטיגנים ממוקדים במיוחד הממוקמים בתאים של חתך רקמה. כל קשירת נוגדנים-אנטיגן ראשונית יעילה מומחשת לאחר מכן באמצעות נוגדנים משניים ספציפיים לנוגדנים הראשוניים. נוגדנים משניים אלה מצומדים לאנזימים, כגון חזרת פרוקסידאז (HRP) או פוספטאז אלקליין (AP). הדמיה מושגת לאחר מכן על ידי הוספת מצע לאנזימים אלה, המייצרים תוצרי צבע בלתי מסיסים הממוקמים באזורים שבהם הנוגדנים העיקריים קשורים לאנטיגנים הממוקדים. הדמיה משופרת יכולה להיות מושגת על ידי צביעה נגדית, שבו צבע משמש ליצירת ניגוד בין רקמה immunolabeled ולא immunolabeled2.
עם IHC באמצעות רקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE), קיבוע פורמלין יכול לבטל את היעילות של נוגדנים ראשוניים עקב קישור צולב על ידי פורמלדהיד וחימום והתייבשות במהלך הטמעת פרפין. אלה משנים את הקונפורמציה של חלבונים, הורסים או מסווים את האפיטופים, ובכך מפחיתים או מבטלים את זיהויים3. ככזה, זה דורש אחזור אנטיגן (AR). טכניקות המציאות הרבודה משבשות את הקישור הצולבות של קבוצות כימיות הקשורות לפורמלדהיד במולקולות האנטיגניות, ובכך משחזרות או חושפות את הקונפורמציה המקורית של אנטיגן-חלבון. התוצאה היא שחזור זיקת נוגדן-אנטיגן (אפיטופ) לתיוג חיסוני. היעילות הסופית של AR תלויה באיכויות של האנטיגן הממוקד ו / או הנוגדן העיקרי2.
אחזור אנטיגן (אפיטופ) המושרה בחום (HIER) הוא הליך אחד של AR3 ומשמש באופן שגרתי לזיהוי PrPSc IHC, כמתואר כאן. IHC חיוני לאבחון ומשמש במעבדות מחקר כדי לקבוע את התפלגות הרקמות של אנטיגן הקשור לפתולוגיה. הוא נמצא בשימוש נרחב באבחון ומחקר סרטן, מדעי המוח ומחלות זיהומיות4, בין היתר. עבור TSEs, IHC ממלא תפקיד חשוב באבחון ובמחקר לאישור וחקירה של התפלגות PrPSc במארחים טבעיים ובמודלים ניסיוניים. IHC תורם למחקרי פתוגנזה של פריונים ולניתוח סוגים ודפוסים של תצהיר PrPSc , כלומר ברקמות עצביות5, כדי לזהות סטיות מזיהומים המתוארים באופן שגרתי ולזהות זני פריונים חדשים לכאורה.
מכיוון שפריונים של אנצפלופתיה ספוגית בקר (BSE) יכולים להדביק בני אדם, פרוטוקולי מעבדה מסוימים המעורבים בעבודה עם BSE עשויים לדרוש שימוש במתקנים ובשיטות BSL-36. אלה כוללים שימוש במיכל משני אטום להובלת דגימות רקמה פוטנציאליות נגועות ב- BSE בתוך המכון והמעבדה. הוא כולל גם ייעוד אזורי הכלה וציוד ייעודי למחקר וניתוח BSE במידת האפשר. הדבר נעשה על מנת למנוע זיהום מחוץ לאזור העבודה ולספק חלל סגור מאחר ויש צורך בהליכי טיהור.
בהתאם לכך, המעבדה לפתולוגיה של INIAV עוקבת אחר מתקנים ושיטות עבודה מומלצים ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3)6 לניהול דגימות פוטנציאליות נגועות בפריונים של רקמות מבקר, מעלי גירה קטנים וצווארים הקשורים למעקב TSE.
רקמות קבועות פורמלין ומשובצות פרפין הכלולות בהליכי אבחון או מחקר TSE, במיוחד במערכת העצבים המרכזית, עלולות להיות זיהומיות. לפיכך, רקמות קבועות אלה חייבות להיות מטופלות בחומצה פורמית כדי להפחית את ההדבקה של פריונים, אם קיימים, לפני עיבוד הרקמות. זה מבוצע על ידי הצבת רקמות קבועות, גזוז (כ 2-4 מ"מ עובי) בתוך קלטת עיבוד. לאחר מכן הקלטת טובלת ב-98% חומצה פורמית (למשך שעה). לאחר טבילה, הקלטות עם רקמות נשטפות במי ברז זורמים במשך 30 דקות, ומוחזרות לקיבוע לפני עיבוד נוסף. אם מקטעי הרקמה אינם מטופלים לפני העיבוד, יש לטבול קטעי רקמה פוסט-מיקרוטומיים בחומצה פורמית לא מדוללת למשך 5 דקות לפחות לפני צביעה היסטולוגית7. פרוטוקול IHC עבור PrPSc כולל שלב שגרתי של פירוק אפיטופ חומצה פורמית, המשמש גם לנטרול פריונים7. לאחר שלבי השבתת פריונים אלה, ניתן לעבד את הרקמות הקבועות המתקבלות ב- BSL-2 באמצעות שיטות BSL-2 סטנדרטיות.
דרישת דגימת הרקמה המינימלית לאבחון TSE בכל בעל חיים הכלול במעקב TSE היא איסוף גזע המוח (ברמת האובקס). בנוסף, עבור גילוי BSE לא טיפוסי ו scrapie, מומלץ כי חלק המוח הקטן צריך להיות גם לאסוף 1,8. לאבחון CWD, יש לבדוק הן את גזע המוח (obex) והן את בלוטות הלימפה הרטרופרינגיאליות מכיוון שניתן לזהות PrP Sc ברקמות לימפה ללא PrPSc ניתן לזיהוי ב- obex9, נסקר על ידי Machado et al.10.
החלק האובקס של גזע המוח כולל אתרי מטרה של TSE אבחנתיים, כלומר, הגרעין הווגאלי הגבי (DVN), גרעין דרכי הבידוד (STN) וגרעין דרכי השדרה של העצב הטריגמינלי (V). אזורים אלה מציגים באופן עקבי הצטברות PrPSc דו-צדדית, אפילו בשלבים המוקדמים של BSE וגירוד קלאסי. במקרים קליניים של TSE מתקדם, כל אזורי החומר האפור בגזע המוח מראים התפלגות PrPSc נרחבת11.
לפני החתך והעיבוד, דגימות המוח מוערכות (איור 1) כדי לוודא את רמת האוטוליזה ואת נוכחותו של נזק כלשהו לרקמות שעלול לסכן את התאמת הדגימה לאבחנה מאשרת מבוססת IHC8. כדי לאמת את שלמות פרוטוקולי ההכנה ואת התוצאות האנליטיות, דגימות הרקמה החיוביות והשליליות של TSE נכללות כבקרות בשילוב עם הכנת רקמות ממקרי בדיקה בכל בדיקה.
איור 1: נוהל PrPSc IHC. ייצוג המציג את הרצף שלב אחר שלב של הליך PrPSc IHC מדה-פרפיניזציה של חלקי רקמות ועד אימונוסטיין וזיהוי בסופו של דבר (FFPE - פורמלין-קבוע פרפין מוטבע; Mab - נוגדן חד שבטי; DAB - 3,3' diaminobenzidine). דמות זו נוצרה בשנת BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
נוהל IHC המתואר כאן הוא מרכיב בפרויקט המחקר FAIRJ-CT98-7021, "הקמת רשת אירופית למעקב אחר TSE מעלי גירה וסטנדרטיזציה והרמוניה של התהליך והקריטריונים לזיהוי מקרים חשודים". הוא עוקב אחר קריטריוני האבחון שהוגדרו על ידי הארגון העולמי לבריאות בעלי חיים, WOAH (שנקרא בעבר Office International des Épizooties, OIE)1 ומעבדת הייחוס האירופית לבעלי חיים TSEs 8,11. הליך IHC המתואר מוכר גם על פי NPISOIEC17025 (דרישות כלליות לכשירות מעבדות בדיקה וכיול) מאז 2008. הסמכה כזו מרמזת על מערכת ניהול איכותית המשלבת נהלים אופרטיביים סטנדרטיים, כוח אדם מוסמך, ציוד מכויל במדויק, בקרה קפדנית של נתונים וריאגנטים, השתתפות בבדיקות מיומנות בין-מעבדתיות, עבודה לא תואמת והערכת סיכונים להגברת האפקטיביות של מערכת הניהול, השגת תוצאות משופרות ומניעת סיכוני מעבדה. בקרות רקמות נגועות בפריון עם BSE, scrapie קלאסי, scrapie לא טיפוסי, ו CWD נאספו (פורמלין קבוע, פרפין משובץ, FFPE) ממקורות שונים. חלקי הבקר והכבשים הם מהמקרים שאובחנו במסגרת תוכנית מעקב TSE של בעלי חיים. קטעי CWD הם מדגימות הבקרה שסופקו באדיבות על ידי פרופסור סטפני צ'וב (הסוכנות הקנדית לפיקוח על מזון, המרכז הלאומי למחלות בעלי חיים) בשנת 2003 ומבדיקת מיומנות CWD 2008 שאורגנה על ידי מעבדת הייחוס האירופית ל- TSE (APHA, Weybridge).
1. חתך רקמות והכנת שקופיות
- חתכו מקטעים של רקמות מקובעות פורמלין משובצות פרפין (FFPE) בעובי 3-5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום.
- יש לצוף על גבי מים מטוהרים בטמפרטורה של כ-10 מעלות צלזיוס מתחת לנקודת ההתכה של הפרפין בו משתמשים. הרימו את המקטעים מהמים אל שקופיות מיקרוסקופ שטופלו במיוחד (ראו טבלת חומרים). אפשר למים להתנקז היטב מהמגלשות.
- יש לדגור על המגלשות למשך הלילה בטמפרטורה של 50°C כדי לשפר את הידבקות הרקמות.
הערה: עדיף להכין רקמות חתוכות טריות לפרוטוקולי IHC, אם כי ניתן להכין מראש קטעי בקרה חיוביים ושליליים של TSE ולאחסן. שלבים 2 עד 4 חייבים להתבצע במכסה אדים כימי.
2. Deparaffinization ו rehydration
- הניחו את השקופיות עם חלקי הרקמה בסלסלת צביעה מפלדת אל-חלד (ראו טבלת חומרים). טובלים את הסלסלה באמבט קסילן (מיכל צביעת נירוסטה) למשך 3 דקות, מוציאים וטובלים שוב.
- הסר קסילן ו rehydrate חלקים על ידי טבילתם באמבט אתנול מוחלט במשך 3 דקות. מוציאים וטובלים שוב.
- ייבשו באוויר את החלקים והכניסו לאמבט אתנול 90% למשך דקה. מעבירים לאמבט אתנול 70% למשך דקה נוספת, ולאחר מכן מעבירים סופית לאמבט אתנול 50% למשך דקה. בכל טיפול באמבט אתנול, יש להסעיר בעדינות את סל המגלשה פעמיים ולרוקן את הסלסלה לפני ההעברה הבאה.
3. שליפת אפיטופים
- טבלו בזהירות את חלקי הרקמה בחומצה פורמית 98% בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את המקטעים במי ברז במשך 5 דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים במים מזוקקים.
זהירות: חומצה פורמית היא חומר מאכל מאוד. יש ללבוש משקפי מגן וכפפות. - בצע אחזור אנטיגן המושרה בחום (HIER) לפי השלבים הבאים.
הערה: שלב זה מבוצע על-ידי autoclaving hydrated ב 121 ° C במשך 30 דקות בתא לחץ מסוים (ראה טבלה של חומרים).- חממו מראש את חיץ הציטראט (10 mM, pH 6.1, ראו טבלת חומרים) ב-98°C למשך כ-20 דקות במיכל צביעת נירוסטה הממוקם בתוך תא הלחץ המלא ב-500 מ"ל מים מזוקקים.
הערה: עבור המחקר הנוכחי, התוכנית Set Point הייתה 1 (SP1) עבור הציוד הספציפי שבו נעשה שימוש. - לאחר שהאזעקה מציינת שהציוד הגיע לזמן ולטמפרטורה המתוכננים, טובלים את הסל בשקופיות ויוזמים את התוכנית לנקודה 2 (121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות). למטרות בקרת איכות, הניחו על הסל קטע של סרט חיווי אוטוקלאבי דביק כדי לפקח על הטמפרטורה והלחץ, ולהקליט את הלחץ הראשוני והסופי של תוכנית זו.
- אם מספר המגלשות שיש לצבוע בהן חיסון אינו מגיע לקיבולת הסל, השתמש בשקופיות נקיות וריקות כדי לתפוס מיקומים ריקים. לאחר סיום התוכנית, לאפשר את החזרה פסיבית של החדר ללחץ הסביבה (לפחות 30 דקות).
הערה: משכי זמן ארוכים יותר עשויים להפחית צביעת רקע לא ספציפית. - מעבירים בזהירות את סלסלת השקופיות למיכל צביעה מנירוסטה מלא במים מזוקקים למשך 5 דקות.
- חממו מראש את חיץ הציטראט (10 mM, pH 6.1, ראו טבלת חומרים) ב-98°C למשך כ-20 דקות במיכל צביעת נירוסטה הממוקם בתוך תא הלחץ המלא ב-500 מ"ל מים מזוקקים.
4. השבתה של peroxidase אנדוגני
- טבלו את סלסלת המגלשה המכילה את קטעי הדגימה באמבטיה של 3% מי חמצן (H 2 O2) במתנול למשך 30 דקות. יש לשטוף את המקטעים תחת מים זורמים (5 דקות). סננו וטבלו את המקטעים במי מלח חוצצים (TBS) למשך 5 דקות נוספות.
5. זיהוי חיסוני
הערה: במחקר הנוכחי, זיהוי חיסוני בוצע באמצעות פורמט פער נימי7 באמצעות מערכת הרכבה מסחרית של קליפ שקופיות (ראה טבלת חומרים). מערכות שקופיות אימונוהיסטוכימיות אחרות ישימות גם כן.
- הניחו כל שקופית על מחזיק לוחית כיסוי מסחרי (ראו טבלת חומרים) רטוב מראש עם TBS, תוך הימנעות מבועות, כאשר צד הרקמה פונה למחזיק וקצוות ההחלקה חופפים לשתי הנקודות התחתונות של המחזיק.
- החזק את מכלול מחזיק השקופיות בין האגודל לאצבע המורה, כאשר אצבע אחת נמצאת מעל השקופית לדוגמה והשנייה בתחתית המחזיק. לאחר מכן, מקם את ההרכבה בגלריה של המערכת.
- כדי להבטיח שהסט מורכב היטב, מלא את הבאר בין השקופית לדוגמה לבין המחזיק ב- TBS, שאסור שיגלוש מיד. מנקודה זו ואילך, ודא שיש לשמור כ- 80 μL של TBS בין המחזיק לבין המגלשה. אין לאפשר לחלקים להתייבש.
- לאחר הכניסה למערכת, כדי להפחית את צביעת הרקע לפני הטיפול בנוגדן ראשוני (anti-PrP, ראה טבלת חומרים), יש לדגור מראש על שקופיות הדגימה עם 20% סרום תקין מאותו זן כמו המארח הנוגדן המשני המשמש לצביעת מערכת החיסון (במקרה הנוכחי, נסיוב סוסים) למשך 30 דקות ב- TBS.
- הפשירו את מספר הנוגדנים שיש להשתמש בהם בהתאם למיני בעלי החיים הנבדקים, מספר חלקי הדגימה שייבדקו וכמות דילול העבודה.
הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בסרום 10% רגיל מאותו זן כמו המקור של הנוגדן המשני ותמיסות הנוגדנים הראשוניות. במידת האפשר, לקבלת התוצאות הטובות ביותר, המקור המארח של הסרום הרגיל והנוגדן המשני צריך להיות מאותו מין. - מבלי לשטוף את המקטעים, יש למרוח את תמיסת הנוגדנים הראשונית ישירות (200 μL) בכל באר של ערכת מחזיק השקופיות ולדגור במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטיפה, מלאו את הבארות של ערכות מחזיקי המגלשות ב-TBS והמתינו 5 דקות. חזרו על הפעולה פעמיים.
- לדלל את הנוגדן המשני biotinylated (monoclonal anti-murine Horse Ab, ראה טבלה של חומרים) ב 1/200 ב TBS עם 10% סרום סוס. הכינו את הנפח הנדרש בהתאם למספר הסעיפים שיש לטפל בהם.
- החל את תמיסת הנוגדנים המשנית (200 μL) על כל באר של ערכת מחזיק השקופיות. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לכבס כמתואר בשלב 5.5.
- לדגירה עם תרכובת אבידין-ביוטין פרוקסידאז (קומפלקס ABC/HRP, ראו טבלת חומרים), הכינו את המגיב 30 דקות לפני השימוש. החל את הפתרון המורכב ABC/HRP (200 μL) בכל באר של ערכת מחזיק לוחות השקופיות. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש לכבס כמתואר בשלב 5.5.
6. פיתוח עם כרומוגן DAB
זהירות: DAB הוא מסרטן פוטנציאלי. כתוצאה מכך, יש צורך בטיפול מתאים בעת עבודה עם מגיב זה, כולל הגנה על העיניים, מעילי מעבדה, כפפות, ונהלי מעבדה טובים. יש להשליך את התקנות המקומיות הבאות.
- יש לדלל כרומוגן בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים) מיד לפני השימוש. החל את תמיסת הכרומוגן (400 μL) על כל באר של ערכת לוחות השקופיות.
- יש לדגור עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. בקטעים חיוביים של PrPSc , תקופת דגירה של 10 דקות מספיקה בדרך כלל.
- הסר את תמיסת הכרומוגן השיורית על ידי שטיפת המגלשות במים מזוקקים. הסירו את המגלשות ממחזיקי הכיסוי והניחו אותן במיכל פלסטיק עם מים מזוקקים.
7. Hematoxylin counterstaining
- טבלו את סלסלת הצביעה מפלדת אל-חלד עם החלקים לתוך אמבט תמיסת המטוקסילין (ראו טבלת חומרים) למשך דקה אחת. יש לשטוף בעדינות במים זורמים קרים במשך 10 דקות או במים פושרים במשך 5 דקות.
- יש לייבש את החלקים על ידי הכנסתם לאתנול 90% למשך דקה אחת, ולאחר מכן אמבטיה אחת באתנול מוחלט למשך דקה אחת. לאחר מכן, הניחו את המגלשות באמבט קסילן למשך דקה.
- הרכבה של המקטעים עם אמצעי הרכבה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
הערה: שלבים אלה מתבצעים במכסה אדים כימי בטמפרטורת החדר (19°C-24°C). הליך זה כולל רשומת בדיקה (קובץ משלים 1) לרישום השלמת כל השלבים, הציוד בו נעשה שימוש וטכנאי המעבדה. בנוסף, גליון עבודה (קובץ משלים 2) תוכנן כדי לקבוע בקלות את נפחי הריאגנטים על פי מספר המקטעים בכל בדיקה, דילולי העבודה והוראות היצרן, כמו גם לרשום את טמפרטורת החדר, הציוד ואצוות המגיבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתחשב בכך שתיוג חיסוני מטרה לא ספציפי אפשרי, חשוב לוודא את רמת התיוג החיסוני הלא ספציפי בחיות ביקורת ידועות עם TSE שלילי. זהו צעד חשוב כדי לפרש כראוי תיוג חיסוני ספציפי של PrPSc 7 (איור 2). תיוג לא ממוקד על ידי נוגדנים נגד PrP נצפה כצביעה תוך-עצבית בדידה של חלקיקים עדינים (הניכרת יותר בגרעין ההיפוגלוסלי ובגרעין cuneate האביזר), חוטים דקים-ליניאריים לא סדירים של כתמים בנוירופיל (STN, V, גרעין אוליברי, גרעין cuneate אביזר, גרעין fascicular לטרלי, היווצרות רשתית גבי לגרעיני האוליברי, ואזור postrema)12 תיוג לא חלקיקי מפוזר בכמה אזורי חומר אפור ולבן, ותיוג ציטופלזמי מפוזר של תאי עצב13 (איור 3).,
בהתבסס על מספר מחקרים, ניתן למצוא תיוג חיסוני ספציפי וממוקד PrPSc בסוגים רבים ושונים בהתאם לזן TSE, המינים המארחים והגנוטיפ prnp . סוגי PrPSc הבאים תוארו (נבדקו על ידי Orge et al.5): תוך עצבי; intraglial; סטלט; פריווסקולרי; תת-פיאלי; Subependimal; ליניארי; גרגירים עדינים; אגרגטים (או גרגירים גסים, חלקיקים גסים עד התמזגות ודמויי טחב); פרינוירונלי; פלאק דמוי (או פלאקים, פלאקים וסקולריים); לנקב; כדורי.
איור 2: תמונות מייצגות לאחר תיוג חיסוני עבור PrPSc של קטעי רקמות מקבוצת ביקורת לא נגועה וחיות נגועות בפריון עם BSE, scrapie קלאסי, scrapie לא טיפוסי ו- CWD. (A,B,C) קטעים מבקרות שליליות של בקר, כבש וצווארביד, בהתאמה; (D) BSE חיובי: משקעי PrPSc גרעיניים בנוירופיל של DVN ו-(E) STN; (F) כבשים קלאסיות scrapie חיובי: prPSc גרעיני ב neuropil ו intraneurnal ב DVN ו (G) stellate PrPsc בתצורה הרשתית; (H) כבשים לא טיפוסיות: PrP Sc גרעיני בנוירופיל של V באזור האובקס, גרגירי בשכבות המולקולריות (m) ו-(I) גרגיריות (g) של המוח הקטן ו-(J) מנוקב (חץ) וכדורי (ראש חץ) PrPSc בחומר הלבן של גזע המוח; (K) CWD: PrPSc גרעיני ב-V ו-(L) היווצרות רשתית ו-perivascular בהיווצרות רשתית. עבור A, B, C ו- D - סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר; E, F, G, H ו- L- סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר; I ו- K- סרגל קנה מידה = 1 מ"מ; J- סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מייצגות המציגות דוגמאות של ממצאים מכתימים חיסוניים שנצפו בעקבות הליך PrPSc IHC. (A) רקע נוירופיל מפוזר (DVN). (B) תיוג ציטופלזמי מפוזר (חץ ראש) של תאי עצב (היווצרות רשתית). (C) משקעי כרומוגנים מלאכותיים (חיצים) (היווצרות רשתית). (D) קווים עדינים לא סדירים (חיצים) של כתמים בנוירופיל (היווצרות רשתית). דגימות של קטעי בקר שליליים PrPSc מבדיקות מיומנות טכנית של אימונוהיסטוכימיה שאורגנו על ידי מעבדת הייחוס האירופית ל- TSEs. A ו- B- סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר; C ו- D- סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
טבלה 1 מסכמת את התיאור של סוגי PrPSc בעלי תווית חיסונית שנצפו ב- BSE, סקראפי קלאסי ולא טיפוסי ו- CWD לאבחנה חיובית וקבעה קריטריונים לתוצאות שליליות, לא חד משמעיות ולא מתאימות11 ונסקרה על ידי Orge et al.5.
טבלה 1: סיכום סוגי PrPSc שנצפו ב- BSE, מגרד קלאסי ולא טיפוסי ו- CWD לאבחנה חיובית, וקריטריונים לתוצאות שליליות, לא חד משמעיות ולא מתאימות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: טופס המשמש כ"רשומת הבדיקה האימונוהיסטוכימית TSE" של INIAV. המשימה הושלמה כאשר כל שלב בפרוטוקול IHC הושלם ואושר על ידי הטכנאי המבצע את המשימה המתאימה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: דף עבודה להכנת מגיבים עבור פרוטוקול אימונוהיסטוכימי TSE. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TSEs הן מחלות זואונוטיות פוטנציאליות. לאחר הופעתה של BSE בשנת 1986 בבריטניה, פורטוגל הפכה לאחת המדינות החברות באיחוד האירופי עם שכיחות גבוהה יותר של מחלה זו14,15. על מנת לשלוט במחלה זו, TSEs אחרים שהתפתחו (scrapie קלאסי ולא טיפוסי, גרסאות BSE, וכיום מעקב אחר מחלת בזבוז כרונית בצוואר הרחם), מנגנוני מעקב פותחו על ידי המנהל הכללי של מזון ווטרינרי (DGAV) והמכון הלאומי למחקר חקלאי ווטרינרי, IP (INIAV) המבצע את אבחון TSE כמעבדה הווטרינרית הלאומית TSE. מעבדה זו עוקבת אחר מתקני הבטיחות הביולוגית המומלצים BSL-3 ושיטות עבודה6 בניהול דגימות פוטנציאליות נגועות פריונים של רקמות מבקר, מעלי גירה קטנים וצרווידים הקשורים למעקב TSE. זיהוי חיסוני של PrPSc על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) ו / או שיטות אימונובלוט מערביות (WB) של אנצפלון ורקמות לימפה הן שיטות הייחוס לאישור האבחנה של TSE1.
טכניקת IHC היא כלי משלים שימושי לאבחון וחקירה אנטומופתולוגית ברפואה וטרינרית ואנושית. מזוהות מספר נקודות קריטיות, ובפועל יש צורך להתאים בכל מעבדה לכל מין של בעלי חיים, את הנוגדנים שבהם נעשה שימוש, וגם את הרקמות השונות שנבדקו16,17. הקיבוע, שליפת האנטיגן, הרקע והחפצים, בנוסף לסוג הנוגדן המשמש (חד שבטי לעומת רב-שבטי, השיבוט המשמש, מוצא מן החי) ומיני בעלי חיים שנבדקו, הם דוגמאות לגורמים שיש לשלוט בהם כראוי ולתקנן אותם בכל מעבדה, כך שהתוצאות הסופיות המתקבלות עם אימונוהיסטוכימיה יתפרשו כראוי כתיוג חיסוני ספציפי2, 17.
העבודה הנוכחית הציגה את הפרוטוקול שבוצע במעבדת הייחוס הלאומית TSE בפורטוגל, עם הנקודות הקריטיות וכל מתודולוגיית הייחוס שנעשתה כדי להבטיח את האבחנה הנכונה של מחלות TSE. תוצאות IHC תלויות באיכות המדגם, אשר חייב לכלול את אתרי היעד עבור TSE. היעדר אתרי יעד TSE אלה יחד עם היעדר תיוג חיסוני ספציפי של PrPSc, הוא מגבלה חשובה של מתודולוגיה זו כדי להבטיח אבחנה. גם במקרים בהם הקפאה או אוטוליזה מקדמת חפצים, ניתן לבצע אבחנה חד משמעית האם TSE קיים או לא אם אתרי מטרה אלה נמצאים בדגימה. יתר על כן, זיהוי של immunostaining במטרות לא ספציפיות ברקמות עצביות שונות, המבוסס על תצפית יומית של בקרות שליליות וחיוביות שתמיד הוצגו בכל פעם טכניקה זו מבוצעת, מצביע על איכות הפרוטוקול המיוצר ומוצג כאן ואת הסיבה להסמכתו 5,12,13.
כמקרים אפשריים, מודגשים אובדן חלקי רקמה במהלך האוטוקלאבינג ו/או הסרת מחזיקי לוחיות הכיסוי, נוכחות בועות הכלואות בין המגלשות ללוחות הכיסוי, ודילול לקוי של הריאגנטים. כדי להתגבר על אירועים אלה, מומלץ להשתמש בשקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובית בתוך תאריך התפוגה ומאוחסנות היטב, לגזור את חלקי הרקמה בזהירות עם לוחות הכיסוי, להשתמש בציוד מכויל, לתקנן את גליון העבודה להכנת מגיבים (קובץ משלים 2), ולבדוק ריאגנטים אצווה של תיוג חיסוני לפני השימוש.
התיאור של וריאנטים חדשים של TSE, כלומר, גירוד לא טיפוסי, גם מאמת את החשיבות של טכניקת IHC סטנדרטית באבחנה זו. בעזרת טכניקה זו, ניתן לצפות בקיומם של דפוסים שונים עבור PrPSc immunostaining, בהתאם לזן פריון, מין מארח, וגנוטיפ prnp .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מאמר זה מומן על ידי פרויקט POCI-01-0145-FEDER-029947 "הערכת סיכון למחלות בזבוז כרוני בפורטוגל" הנתמך על ידי FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. כמו כן, מחברי יחידת המחקר CECAV קיבלו מימון מה- FCT, במסגרת הפרויקט UIDB/CVT/0772/2020.אנו מודים לברוס קמפבל, מנהל מחקר (בדימוס), מרכז המחקר האזורי המערבי, USDA, על עזרתו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
References
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A.
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Orge, L., et al.
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al.
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F.
- Pires, M. A., et al.
