Summary
इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल का उपयोग करके इम्यूनोलेबलिंग असामान्य प्रियन प्रोटीन के लिए विशिष्ट नमूना और एंटी-पीआरपी एंटीबॉडी तैयारी पद्धतियों की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल उचित पीआरपी इम्यूनोलेबलिंग सुनिश्चित करने और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधलापन को कम करने के लिए एपिटोप डिमास्किंग में प्रमुख चरणों का वर्णन करता है। इसके अलावा, यह दृष्टिकोण प्रियन-संक्रमित ऊतकों के साथ इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अध्ययन करते समय जैव सुरक्षा उपायों पर विचार करता है।
Abstract
असामान्य प्रियन प्रोटीन (पीआरपीएससी) सेलुलर प्रियन प्रोटीन के रोग से जुड़े आइसोफॉर्म और ट्रांसमिसिबल स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथिस (टीएसई) के नैदानिक मार्कर हैं। ये न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग मनुष्यों और कई जानवरों की प्रजातियों को प्रभावित करते हैं और इसमें स्क्रैपी, जूनोटिक गोजातीय स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथी (बीएसई), क्रोनिक वेस्टिंग डिजीज ऑफ सेरविड्स (सीडब्ल्यूडी), और नए पहचाने गए ऊंट प्रियन रोग (सीपीडी) शामिल हैं। टीएसई का निदान एन्सेफैलॉन ऊतकों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) और पश्चिमी इम्यूनोब्लोट विधियों (डब्ल्यूबी) दोनों के आवेदन द्वारा पीआरपीएससी के इम्यूनोडिटेक्शन पर निर्भर करता है, अर्थात्, ब्रेनस्टेम (ओबेक्स स्तर)। आईएचसी एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है जो एक ऊतक अनुभाग की कोशिकाओं में रुचि के एंटीजन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी (मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल) का उपयोग करती है। एंटीबॉडी-एंटीजन बाइंडिंग को एक रंग प्रतिक्रिया द्वारा देखा जा सकता है जो ऊतक या कोशिका के क्षेत्र में स्थानीयकृत रहता है जहां एंटीबॉडी को लक्षित किया गया था। जैसे, प्रियन रोगों में, अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों की तरह, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीकों का उपयोग न केवल नैदानिक उद्देश्यों के लिए किया जाता है, बल्कि रोगजनन अध्ययनों में भी किया जाता है। इस तरह के अध्ययनों में नए प्रियन उपभेदों की पहचान करने के लिए पहले वर्णित लोगों से पीआरपीएससी पैटर्न और प्रकारों का पता लगाना शामिल है। चूंकि बीएसई मनुष्यों को संक्रमित कर सकता है, इसलिए यह सिफारिश की जाती है कि जैव सुरक्षा प्रयोगशाला स्तर -3 (बीएसएल -3) सुविधाओं और / या प्रथाओं का उपयोग टीएसई निगरानी में शामिल मवेशियों, छोटे जुगाली करने वालों और सेरविड नमूनों को संभालने के लिए किया जाता है। इसके अतिरिक्त, संदूषण को सीमित करने के लिए, जब भी संभव हो, रोकथाम और प्रियन-समर्पित उपकरणों की सिफारिश की जाती है। पीआरपीएससी आईएचसी प्रक्रिया में एक फॉर्मिक एसिड एपिटोप-डिमास्किंग चरण होता है जो प्रियन निष्क्रियता उपाय के रूप में भी कार्य करता है, क्योंकि इस तकनीक में उपयोग किए जाने वाले फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक संक्रामक रहते हैं। परिणामों की व्याख्या करते समय, लक्ष्य लेबलिंग से गैर-विशिष्ट इम्यूनोलेबलिंग को अलग करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए, ज्ञात टीएसई-नकारात्मक नियंत्रण जानवरों में प्राप्त इम्यूनोलेबलिंग की कलाकृतियों को पहचानना महत्वपूर्ण है ताकि विशिष्ट पीआरपीएससी इम्यूनोलेबलिंग प्रकारों से अलग किया जा सके, जो टीएसई उपभेदों, मेजबान प्रजातियों और पीआरएनपी जीनोटाइप के बीच भिन्न हो सकते हैं, जो यहां वर्णित हैं।
Introduction
प्रियन परिकल्पना के अनुसार, असामान्य आइसोफॉर्म (पीआरपीएससी) संक्रामक स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथिस (टीएसई) में संक्रामक एजेंट का प्राथमिक, या एकमात्र घटक है। टीएसई के निदान के लिए पुष्टि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) प्रोटोकॉल और / या एन्सेफैलोनऊतकों के पश्चिमी इम्यूनोब्लोट विधियों (डब्ल्यूबी) के आवेदन द्वारा पीआरपीएससी के इम्यूनोडिटेक्शन पर निर्भर करती है।
आईएचसी एक ऐसी विधि है जो मोनोक्लोनल या, कुछ मामलों में, पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में) को एक ऊतक खंड की कोशिकाओं में स्थित विशेष रूप से लक्षित एंटीजन के इम्यूनोस्टेनिंग में पहले कदम के रूप में नियोजित करती है। किसी भी प्रभावी प्राथमिक एंटीबॉडी-एंटीजन बाइंडिंग को तब प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट द्वितीयक एंटीबॉडी का उपयोग करके देखा जाता है। ये द्वितीयक एंटीबॉडी एंजाइमों के लिए संयुग्मित होते हैं, जैसे हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) या क्षारीय फॉस्फेट (एपी)। विज़ुअलाइज़ेशन तब इन एंजाइमों में एक सब्सट्रेट जोड़कर प्राप्त किया जाता है, उन क्षेत्रों में स्थानीयकृत अघुलनशील रंग उत्पादों का उत्पादन करता है जहां प्राथमिक एंटीबॉडी लक्षित एंटीजन से बंधे होते हैं। बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन को काउंटरस्टेनिंग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जिसमें एक डाई का उपयोग इम्यूनोलेबल और अन-इम्यूनोलेबल ऊतक2 के बीच एक अंतर बनाने के लिए किया जाता है।
फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों (एफएफपीई) का उपयोग करके आईएचसी के साथ, फॉर्मेलिन निर्धारण फॉर्मलाडेहाइड द्वारा क्रॉस-लिंकिंग और पैराफिन एम्बेडिंग के दौरान हीटिंग और निर्जलीकरण के कारण प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रभावशीलता को समाप्त कर सकता है। ये प्रोटीन की रचना को बदलते हैं, एपिटोप्स को नष्ट, विकृत या मास्क करते हैं, इस प्रकार उनकीपहचान को कम या निरस्त करते हैं। जैसे, इसके लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति (एआर) की आवश्यकता होती है। एआर तकनीक एंटीजेनिक अणुओं में फॉर्मलाडेहाइड से संबंधित रासायनिक समूह क्रॉस-लिंकिंग को बाधित करती है, इस प्रकार मूल एंटीजन-प्रोटीन रचना को बहाल या अनमास्क करती है। इसके परिणामस्वरूप इम्यूनोलेबलिंग के लिए एंटीबॉडी-एंटीजन (एपिटोप) आत्मीयता को पुनर्प्राप्त किया जाता है। एआर की अंतिम प्रभावकारिता लक्षित एंटीजन और / या प्राथमिक एंटीबॉडी 2 के गुणों पर निर्भर करतीहै।
गर्मी-प्रेरित एंटीजन (एपिटोप) पुनर्प्राप्ति (एचआईईआर) एआर3 की एक प्रक्रिया है और इसका उपयोग नियमित रूप से पीआरपीएससी आईएचसी का पता लगाने के लिए किया जाता है, जैसा कि यहां वर्णित है। आईएचसी निदान के लिए आवश्यक है और पैथोलॉजी से जुड़े एंटीजन के ऊतक वितरण को निर्धारित करने के लिए अनुसंधान प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है। यह व्यापक रूप से कैंसर, तंत्रिका विज्ञान और संक्रामकरोगों 4 के निदान और शोध में उपयोग किया जाता है। टीएसई के लिए, आईएचसी प्राकृतिक मेजबानों और प्रयोगात्मक मॉडल में पीआरपीएससी वितरण की पुष्टि और जांच के लिए निदान और अनुसंधान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। आईएचसी प्रियन रोगजनन अध्ययन और पीआरपी एससी जमाव प्रकारों और पैटर्न के विश्लेषण में योगदान देताहै , अर्थात्, तंत्रिका ऊतक5 में, नियमित रूप से वर्णित संक्रमणों से विचलन का पता लगाने और कथित नए प्रियन उपभेदों की पहचान करने के लिए।
चूंकि बोवाइन स्पंजीफॉर्म एन्सेफैलोपैथी (बीएसई) के प्रियन मनुष्यों को संक्रमित कर सकते हैं, बीएसई के साथ काम में शामिल कुछ प्रयोगशाला प्रोटोकॉल को बीएसएल -3 सुविधाओं और प्रथाओं 6 के उपयोग की आवश्यकता हो सकतीहै। इनमें संस्थान और प्रयोगशाला के भीतर संभावित बीएसई संक्रमित ऊतक नमूनों के परिवहन के लिए एक सीलबंद माध्यमिक कंटेनर का उपयोग करना शामिल है। इसमें जब भी संभव हो बीएसई अनुसंधान और विश्लेषण के लिए नियंत्रण क्षेत्रों और प्रियन-समर्पित उपकरणों को नामित करना भी शामिल है। यह कार्य क्षेत्र के बाहर संदूषण को रोकने और एक सीमित स्थान प्रदान करने के लिए किया जाता है क्योंकि परिशोधन प्रक्रियाएं आवश्यक हो जाती हैं।
तदनुसार, आईएनआईएवी की पैथोलॉजी प्रयोगशाला टीएसई निगरानी से जुड़े मवेशियों, छोटे जुगाली करने वालों और सेरविड्स से ऊतकों के संभावित प्रियन-संक्रमित नमूनों का प्रबंधन करने के लिए अनुशंसित जैव सुरक्षा स्तर -3 (बीएसएल -3) सुविधाओं और प्रथाओं6 का पालन करती है।
टीएसई नैदानिक या अनुसंधान प्रक्रियाओं में शामिल फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक, विशेष रूप से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, संभावित रूप से संक्रामक हो सकते हैं। इसलिए, इन निश्चित ऊतकों को फॉर्मिक एसिड के साथ इलाज किया जाना चाहिए ताकि ऊतक प्रसंस्करण से पहले, यदि मौजूद हो, तो प्रियोन्स की संक्रामकता को कम किया जा सके। यह एक प्रसंस्करण कैसेट में निश्चित, छंटनी ऊतकों (लगभग 2-4 मिमी मोटाई) को रखकर किया जाता है। कैसेट को तब 98% फॉर्मिक एसिड (1 घंटे के लिए) में डुबोया जाता है। विसर्जन के बाद, ऊतकों के साथ कैसेट को 30 मिनट के लिए बहते नल के पानी में धोया जाता है, और आगे की प्रक्रिया से पहले फिक्सेटिव में वापस कर दिया जाता है। यदि ऊतक वर्गों को प्रसंस्करण से पहले इलाज नहीं किया जाता है, तो पोस्ट-माइक्रोटॉमिक ऊतक वर्गों को हिस्टोलॉजिकल धुंधला होने से पहले कम से कम 5 मिनट के लिए बिना पतला फॉर्मिक एसिड में डुबोया जानाचाहिए। पीआरपीएससी के लिए आईएचसी प्रोटोकॉल में एक नियमित फॉर्मिक एसिड एपिटोप-डिमास्किंग चरण शामिल है, जो प्रियोन 7 को निष्क्रिय करने के लिए भी काम करताहै। इन प्रियन निष्क्रियता चरणों के बाद, परिणामस्वरूप निश्चित ऊतकों को मानक बीएसएल -2 प्रथाओं का उपयोग करके बीएसएल -2 पर संसाधित किया जा सकता है।
टीएसई निगरानी में शामिल किसी भी जानवर में टीएसई निदान के लिए न्यूनतम ऊतक नमूना करण आवश्यकता ब्रेनस्टेम (ओबेक्स स्तर पर) एकत्र कर रही है। इसके अतिरिक्त, एटिपिकल बीएसई और स्क्रैपी का पता लगाने के लिए, यह सलाह दी जाती है कि सेरिबैलम का हिस्सा भी एकत्र किया जाना चाहिए। सीडब्ल्यूडी निदान के लिए, ब्रेनस्टेम (ओबेक्स) और रिट्रोफैरेनजील लिम्फ नोड्स दोनों का परीक्षण किया जाना चाहिए क्योंकि पीआरपीएससी को लिम्फोइड ऊतकों में पाया जा सकता है, जिसमें ओबेक्स9 में कोई पता लगाने योग्य पीआरपीएससी नहीं है, जिसकी समीक्षा मचाडो एट अल.10 द्वारा की गई है।
ब्रेनस्टेम के ओबेक्स भाग में नैदानिक टीएसई लक्ष्य साइटें शामिल हैं, अर्थात्, पृष्ठीय योनि नाभिक (डीवीएन), एकान्त पथ नाभिक (एसटीएन) और ट्राइजेमिनल तंत्रिका (वी) के रीढ़ की हड्डी के नाभिक। ये क्षेत्र लगातार द्विपक्षीय पीआरपी एससी संचय प्रस्तुत करतेहैं, यहां तक कि बीएसई और क्लासिकल स्क्रैपी के शुरुआती चरणों में भी। उन्नत टीएसई के नैदानिक मामलों में, ब्रेनस्टेम के भीतर सभी ग्रे-मैटर क्षेत्र व्यापक पीआरपी एससी वितरण11 दिखाते हैं।
सेक्शनिंग और प्रोसेसिंग से पहले, मस्तिष्क के नमूनों का मूल्यांकन किया जाता है (चित्रा 1) ऑटोलिसिस के स्तर और किसी भी ऊतक क्षति की उपस्थिति का पता लगाने के लिए संभावित रूप से आईएचसी-आधारित पुष्टिकरण निदान के लिए नमूने की उपयुक्तता से समझौताकरना। प्रारंभिक प्रोटोकॉल और विश्लेषणात्मक परिणामों की अखंडता को मान्य करने के लिए, टीएसई सकारात्मक और नकारात्मक ऊतक नमूने प्रत्येक परख में परीक्षण मामलों से ऊतकों की तैयारी के साथ संयोजन के रूप में नियंत्रण के रूप में शामिल किए जाते हैं।
चित्रा 1: पीआरपीएससी आईएचसी प्रक्रिया। ऊतक वर्गों के डीपैराफिनाइजेशन से लेकर अंतिम इम्यूनोस्टेनिंग और डिटेक्शन (एफएफपीई - फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड) तकपीआरपीएससी आईएचसी प्रक्रिया के चरण-दर-चरण अनुक्रम को दिखाने वाला प्रतिनिधित्व; माब - मोनोक्लोनल एंटीबॉडी; डीएबी - 3,3 'डायमिनोबेंज़िडाइन)। यह आंकड़ा BioRender.com में बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Protocol
यहां वर्णित आईएचसी प्रक्रिया अनुसंधान परियोजना FAIRJ-CT98-7021 का एक घटक है, "जुगाली करने वाले टीएसई की निगरानी के लिए एक यूरोपीय नेटवर्क की स्थापना और संदिग्ध मामलों की पहचान के लिए प्रक्रिया और मानदंडों का मानकीकरण और सामंजस्य"। यह पशु स्वास्थ्य के लिए विश्व संगठन, डब्ल्यूओएएच (पहले कार्यालय इंटरनेशनल डेस एपिज़ोटिस, ओआईई) 1 और पशु टीएसई 8,11 के लिए यूरोपीय संदर्भ प्रयोगशाला द्वारा परिभाषित नैदानिकमानदंडों का पालन करता है। वर्णित आईएचसी प्रक्रिया 2008 से एनपीआईएसओआईईसी 17025 (परीक्षण और अंशांकन प्रयोगशालाओं की क्षमता के लिए सामान्य आवश्यकताओं) के अनुसार भी मान्यता प्राप्त है। इस तरह की मान्यता का अर्थ है एक उच्च गुणवत्ता वाली प्रबंधन प्रणाली जिसमें मानक ऑपरेटिव प्रक्रियाएं, योग्य कर्मियों, सटीक रूप से कैलिब्रेटेड उपकरण, डेटा और अभिकर्मकों का कठोर नियंत्रण, अंतर-प्रयोगशाला प्रवीणता परख, गैर-अनुरूप कार्य में भागीदारी, और प्रबंधन प्रणाली की प्रभावशीलता बढ़ाने, बेहतर परिणाम प्राप्त करने और प्रयोगशाला खतरों को रोकने के लिए जोखिम मूल्यांकन शामिल है। बीएसई, क्लासिकल स्क्रैपी, एटिपिकल स्क्रैपी और सीडब्ल्यूडी के साथ प्रियन-संक्रमित ऊतक नियंत्रण विभिन्न स्रोतों से एकत्र किए गए थे (फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड, एफएफपीई)। गोजातीय और भेड़ अनुभाग एक पशु टीएसई निगरानी कार्यक्रम के तहत निदान किए गए मामलों से हैं। सीडब्ल्यूडी अनुभाग 2003 में प्रोफेसर स्टेफनी सीज़ब (कनाडाई खाद्य निरीक्षण एजेंसी, राष्ट्रीय पशु रोग केंद्र) द्वारा प्रदान किए गए नियंत्रण नमूनों से और टीएसई के लिए यूरोपीय संदर्भ प्रयोगशाला (एपीएचए, वेब्रिज) द्वारा आयोजित सीडब्ल्यूडी प्रवीणता परीक्षण 2008 से हैं।
1. ऊतक अनुभागन और स्लाइड तैयारी
- माइक्रोटोम का उपयोग करके 3-5 μm मोटाई पर फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड (FFPE) ऊतकों के खंडों को काटें।
- उपयोग किए गए पैराफिन के पिघलने बिंदु से लगभग 10 डिग्री सेल्सियस नीचे तापमान के साथ शुद्ध पानी पर तैरते हैं। विशेष रूप से उपचारित माइक्रोस्कोप स्लाइड्स पर पानी से अनुभागों को उठाएं ( सामग्री की तालिका देखें)। स्लाइड्स से पानी को अच्छी तरह से निकलने दें।
- ऊतकों के स्लाइड आसंजन को बढ़ाने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर रात भर स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
नोट: आईएचसी प्रोटोकॉल के लिए ताजा खंडित ऊतकों को तैयार करना बेहतर है, हालांकि टीएसई सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण अनुभागों को पहले से तैयार और संग्रहीत किया जा सकता है। चरण 2 से 4 को रासायनिक फ्यूम हुड में किया जाना चाहिए।
2. डीपैराफिनाइजेशन और पुनर्जलीकरण
- ऊतक वर्गों के साथ स्लाइड्स को स्टेनलेस-स्टील स्टेनिंग टोकरी में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। टोकरी को 3 मिनट के लिए एक जाइलीन स्नान (स्टेनलेस स्टील धुंधला कंटेनर) में डुबोएं, हटा दें और एक बार फिर से डुबोएं।
- 3 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल स्नान में डुबोकर जाइलीन और पुनर्जलीकरण अनुभागों को हटा दें। निकालें और एक बार फिर से डुबोएं।
- हवा में खंडों को सुखाएं और 1 मिनट के लिए 90% इथेनॉल स्नान में रखें। एक और मिनट के लिए 70% इथेनॉल स्नान में स्थानांतरित करें, इसके बाद 1 मिनट के लिए 50% इथेनॉल स्नान में अंतिम स्थानांतरण करें। प्रत्येक इथेनॉल स्नान उपचार के लिए, धीरे से स्लाइड टोकरी को दो बार उत्तेजित करें और अगले हस्तांतरण से पहले टोकरी को सूखा दें।
3. एपिटोप पुनर्प्राप्ति
- 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 98% फॉर्मिक एसिड में ऊतक वर्गों को सावधानीपूर्वक डुबोएं। 5 मिनट के लिए नल के पानी में खंडों को धोएं, इसके बाद आसुत जल में दो बार कुल्ला करें।
चेतावनी: फॉर्मिक एसिड अत्यधिक संक्षारक है। सुरक्षात्मक चश्मे और दस्ताने पहने जाने चाहिए। - नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए गर्मी-प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति (HIER) करें।
नोट: यह चरण एक विशिष्ट दबाव कक्ष में 30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रेटेड ऑटोक्लेविंग द्वारा किया जाता है (सामग्री की तालिका देखें)।- साइट्रेट बफर (10 mM, pH 6.1, सामग्री की तालिका देखें) को 500 मिलीलीटर आसुत पानी से भरे दबाव कक्ष के अंदर रखे स्टेनलेस-स्टील स्टेनिंग कंटेनर में लगभग 20 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, प्रोग्राम सेट पॉइंट उपयोग किए गए विशिष्ट उपकरणों के लिए 1 (एसपी 1) था। - अलार्म इंगित करने के बाद कि उपकरण ने क्रमादेशित समय और तापमान प्राप्त कर लिया है, टोकरी को स्लाइड के साथ डुबोएं और सेट पॉइंट 2 (30 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस) पर प्रोग्राम शुरू करें। गुणवत्ता नियंत्रण उद्देश्यों के लिए, तापमान और दबाव की निगरानी के लिए टोकरी पर चिपकने वाला आटोक्लेव संकेतक टेप का एक खंड रखें, और इस कार्यक्रम के प्रारंभिक और अंतिम दबाव को रिकॉर्ड करें।
- यदि इम्यूनोस्टेन्ड होने वाली स्लाइड्स की संख्या टोकरी की क्षमता तक नहीं पहुंचती है, तो किसी भी खाली पदों पर कब्जा करने के लिए साफ, खाली स्लाइड का उपयोग करें। कार्यक्रम समाप्त होने के बाद, कक्ष की निष्क्रिय वापसी को परिवेश दबाव (कम से कम 30 मिनट) में अनुमति दें।
नोट: लंबी अवधि गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधलापन को कम कर सकती है। - सावधानीपूर्वक स्लाइड टोकरी को 5 मिनट के लिए आसुत पानी से भरे स्टेनलेस-स्टील स्टेनिंग कंटेनर में स्थानांतरित करें।
- साइट्रेट बफर (10 mM, pH 6.1, सामग्री की तालिका देखें) को 500 मिलीलीटर आसुत पानी से भरे दबाव कक्ष के अंदर रखे स्टेनलेस-स्टील स्टेनिंग कंटेनर में लगभग 20 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
4. अंतर्जात पेरोक्सीडेज की निष्क्रियता
- 30 मिनट के लिए मेथनॉल में 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) के स्नान में नमूना वर्गों वाली स्लाइड टोकरी को डुबोएं। बहते पानी के नीचे के हिस्सों को धोएं (5 मिनट)। अतिरिक्त 5 मिनट के लिए 1x Tris-buffered saline (TBS) में अनुभागों को छानें और डुबोएं।
5. इम्यूनोडिटेक्शन
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्लाइड क्लिप असेंबली सिस्टम का उपयोग करके केशिका गैप प्रारूप7 का उपयोग करके इम्यूनोडिटेक्शन निष्पादित किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। अन्य इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्लाइड सिस्टम भी लागू होते हैं।
- प्रत्येक स्लाइड को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कवर-प्लेट धारक ( सामग्री की तालिका देखें) पर रखें, जो टीबीएस के साथ पूर्व-नम हो, बुलबुले से बचें, ऊतक पक्ष धारक के सामने हो और स्लाइड किनारों को धारक के दो निचले बिंदुओं के साथ मेल खाते हों।
- अंगूठे और फोरफिंगर के बीच स्लाइड-होल्डर असेंबली रखें, जिसमें एक उंगली नमूना स्लाइड के शीर्ष पर और दूसरी धारक के निचले हिस्से पर है। फिर, सिस्टम की गैलरी में असेंबली रखें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेट अच्छी तरह से इकट्ठा किया गया है, नमूना स्लाइड और टीबीएस के साथ धारक के बीच कुएं को भरें, जिसे तुरंत ओवरफ्लो नहीं होना चाहिए। इस बिंदु से, सुनिश्चित करें कि धारक और स्लाइड के बीच लगभग 80 μL TBS को बनाए रखा जाना चाहिए। अनुभागों को सूखने न दें।
- एक बार सिस्टम में, प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-पीआरपी, सामग्री की तालिका देखें) के साथ उपचार से पहले पृष्ठभूमि धुंधलापन को कम करने के लिए, टीबीएस में 30 मिनट के लिए इम्यूनोस्टेनिंग (वर्तमान मामले में, घोड़े के सीरम) के लिए उपयोग किए जा रहे द्वितीयक एंटीबॉडी मेजबान के समान प्रजातियों से 20% सामान्य सीरम के साथ नमूना स्लाइड को प्री-इनक्यूबेट करें।
- विश्लेषण के तहत पशु प्रजातियों के अनुसार उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के एलिकोट की संख्या, जांच किए जाने वाले नमूना वर्गों की संख्या और काम करने की कमजोर पड़ने की मात्रा।
नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के स्रोत के रूप में एक ही प्रजाति से 10% सामान्य सीरम का उपयोग करें। यदि संभव हो, तो सर्वोत्तम परिणामों के लिए, सामान्य सीरम और माध्यमिक एंटीबॉडी का मेजबान स्रोत एक ही प्रजाति से होना चाहिए। - अनुभागों को धोए बिना, स्लाइड-धारक सेट के प्रत्येक कुएं में सीधे प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान (200 μL) लागू करें और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- धोने के लिए, स्लाइड-होल्डर सेट के कुओं को टीबीएस से भरें और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- 10% घोड़े के सीरम के साथ टीबीएस में 1/200 पर बायोटिनिलेटेड द्वितीयक एंटीबॉडी (मोनोक्लोनल एंटी-मुराइन हॉर्स एबी, सामग्री की तालिका देखें) को पतला करें। उपचार किए जाने वाले अनुभागों की संख्या के आधार पर आवश्यक मात्रा तैयार करें।
- स्लाइड-धारक सेट के प्रत्येक कुएं पर द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान (200 μL) लागू करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- चरण 5.5 में वर्णित के रूप में धोएं।
- एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स पेरोक्सीडेज (एबीसी / एचआरपी कॉम्प्लेक्स, सामग्री की तालिका देखें) के साथ इनक्यूबेशन के लिए, उपयोग से 30 मिनट पहले अभिकर्मक तैयार करें। स्लाइड-प्लेट धारक सेट के प्रत्येक कुएं में एबीसी / एचआरपी कॉम्प्लेक्स समाधान (200 μL) लागू करें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- चरण 5.5 में वर्णित के रूप में धोएं।
6. डीएबी क्रोमोजेन के साथ विकास
सावधानी: डीएबी एक संभावित कार्सिनोजेन है। नतीजतन, इस अभिकर्मक के साथ काम करते समय उचित देखभाल आवश्यक है, जिसमें आंखों की सुरक्षा, प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और अच्छी प्रयोगशाला प्रक्रियाएं शामिल हैं। स्थानीय नियमों का पालन करने का निपटान करें।
- उपयोग से तुरंत पहले निर्माता के निर्देशों के अनुसार क्रोमोजेन को पतला करें ( सामग्री की तालिका देखें)। स्लाइड-प्लेट सेट के प्रत्येक कुएं पर क्रोमोजेन समाधान (400 μL) लागू करें।
- कमरे के तापमान पर 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें। पीआरपीएससी पॉजिटिव सेक्शन में, 10 मिनट इनक्यूबेशन अवधि आमतौर पर पर्याप्त होती है।
- आसुत जल में स्लाइड्स को धोकर अवशिष्ट क्रोमोजेन घोल को हटा दें। कवरप्लेट धारकों से स्लाइड्स निकालें और उन्हें आसुत पानी के साथ एक प्लास्टिक कंटेनर में रखें।
7. हेमेटॉक्सिलिन काउंटरस्टेनिंग
- 1 मिनट के लिए हेमटोक्सिलिन समाधान स्नान ( सामग्री की तालिका देखें) में अनुभागों के साथ स्टेनलेस-स्टील धुंधला टोकरी को डुबोएं। ठंडे बहते पानी में 10 मिनट के लिए या 5 मिनट के लिए गुनगुने पानी में धीरे से धो लें।
- 1 मिनट के लिए 90% इथेनॉल में रखकर खंडों को निर्जलित करें, इसके बाद 1 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल में एक स्नान करें। फिर, स्लाइड्स को 1 मिनट के लिए जाइलीन स्नान में रखें।
- व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माउंटिंग माध्यम के साथ अनुभागों को माउंट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: ये चरण कमरे के तापमान (19 डिग्री सेल्सियस -24 डिग्री सेल्सियस) पर एक रासायनिक फ्यूम हुड में किए जाते हैं। इस प्रक्रिया में सभी चरणों, उपयोग किए गए उपकरण और प्रयोगशाला तकनीशियन के पूरा होने की रिकॉर्डिंग के लिए एक परीक्षण रिकॉर्ड (पूरक फ़ाइल 1) शामिल है। इसके अलावा, एक वर्कशीट (पूरक फ़ाइल 2) को प्रत्येक परख में अनुभागों की संख्या, कामकाजी कमजोर पड़ने और निर्माता के निर्देशों के साथ-साथ कमरे के तापमान, उपकरण और अभिकर्मक बैचों को रिकॉर्ड करने के लिए अभिकर्मकों की मात्रा को आसानी से निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।
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Representative Results
यह देखते हुए कि गैर-विशिष्ट लक्ष्य इम्यूनोलेबलिंग संभव है, ज्ञात टीएसई-नकारात्मक नियंत्रण जानवरों में गैर-विशिष्ट इम्यूनोलेबलिंग के स्तर का पता लगाना महत्वपूर्ण है। यह विशिष्ट पीआरपीएससी इम्यूनोलेबलिंग7 (चित्रा 2) की ठीक से व्याख्या करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। एंटी-पीआरपी एंटीबॉडी द्वारा गैर-लक्ष्य लेबलिंग को असतत इंट्रान्यूरोनल फाइन-पार्टिकुलेट स्टेनिंग (हाइपोग्लोसल न्यूक्लियस और एक्सेसरी क्यूनेट न्यूक्लियस में अधिक स्पष्ट), न्यूरोपिल (एसटीएन, वी, ओलिवेरी न्यूक्लियस, एक्सेसरी क्यूनेट न्यूक्लियस, लेटरल फेसिकुलर न्यूक्लियस, ओलिवेरी नाभिक के पृष्ठीय जालीदार गठन, और क्षेत्र पोस्ट्रेमा) में दाग के अनियमित महीन-रैखिक धागे के रूप में देखा गया है। , कुछ ग्रे और सफेद पदार्थ क्षेत्रों में गैर-आंशिक लेबलिंग फैलाते हैं, और न्यूरॉन्स के साइटोप्लाज्मिक लेबलिंग को फैलाते हैं13 (चित्रा 3)।
कई अध्ययनों के आधार पर, विशिष्ट, लक्षित पीआरपीएससी इम्यूनोलेबलिंग टीएसई तनाव, मेजबान प्रजातियों और पीआरएनपी जीनोटाइप के आधार पर कई अलग-अलग प्रकारों में पाया जा सकता है। निम्नलिखित पीआरपीएससी प्रकारों का वर्णन किया गया है (ऑर्गे एट अल.5 द्वारा समीक्षा की गई): इंट्रान्यूरोनल; इंट्राग्लियल; स्टेलेट; पेरिवास्कुलर; सबपियल; सुबेपेनडिमल; रेखीय; बारीक दानेदार; समुच्चय (या मोटे दानेदार, मोटे कण से कोयला और काई जैसे); पेरिन्यूरोनल; पट्टिका-जैसे (या सजीले टुकड़े, संवहनी सजीले टुकड़े); पुंक्टेट; गोलाकार।
चित्र 2: बीएसई, क्लासिकल स्क्रैपी, एटिपिकल स्क्रैपी और सीडब्ल्यूडी के साथ गैर-संक्रमित नियंत्रणों और प्रियन-संक्रमित जानवरों के ऊतक वर्गों के पीआरपीएससी के लिए इम्यूनोलेबलिंग के बाद प्रतिनिधि छवियां। (डी) बीएसई पॉजिटिव: डीवीएन और (ई) एसटीएन के न्यूरोपिल में दानेदार पीआरपीएससी जमा; (एफ) भेड़ शास्त्रीय स्क्रैपी पॉजिटिव: डीवीएन में न्यूरोपिल और इंट्रान्यूरोनल में दानेदार पीआरपीएससी और (जी) रेटिकुलर गठन में स्टेलेट पीआरपीएससी; (एच) भेड़ एटिपिकल स्क्रैपी: ओबेक्स क्षेत्र में वी के न्यूरोपिल में दानेदार पीआरपीएससी, आणविक (एम) पर दानेदार (एम) और (आई) सेरिबैलम की दानेदार (जी) परतें और (जे) पंक्टेट (तीर) और ग्लोबुलर (एरोहेड) पीआरपीएससी ब्रेनस्टेम के सफेद पदार्थ पर; (के) सीडब्ल्यूडी: वी पर दानेदार पीआरपीएससी और (एल) जालीदार गठन और जालीदार गठन पर पेरिवास्कुलर। ए, बी, सी, और डी के लिए- स्केल बार = 50 μm; E, F, G, H, और L- स्केल बार = 20 μm; I और K- स्केल बार = 1 मिमी; J- स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: पीआरपीएससी आईएचसी प्रक्रिया के बाद देखे गए इम्यूनोस्टेनिंग कलाकृतियों के उदाहरण दिखाने वाली प्रतिनिधि छवियां। (बी) न्यूरॉन्स (जालीदार गठन) के साइटोप्लाज्मिक (सिर तीर) लेबलिंग को फैलाना। (सी) कृत्रिम क्रोमोजेन जमा (तीर) (जालीदार गठन)। (डी) न्यूरोपिल (जालीदार गठन) में धुंधलापन की अनियमित महीन रेखाएं (तीर)। टीएसई के लिए यूरोपीय संदर्भ प्रयोगशाला द्वारा आयोजित इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीकी प्रवीणता परीक्षण से पीआरपीएससी नकारात्मक गोजातीय वर्गों के नमूने। ए और बी- स्केल बार = 20 μm; C और D- स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1 सकारात्मक निदान के लिए बीएसई, शास्त्रीय और एटिपिकल स्क्रैपी और सीडब्ल्यूडी में देखे गए इम्यूनोलेबल पीआरपीएससी प्रकारों के विवरण को सारांशित करती है और नकारात्मक, अनिर्णायक और अनुपयुक्तपरिणामों के लिए मानदंड स्थापित करती है और ओर्ज एट अल.5 द्वारा समीक्षा की जाती है।
तालिका 1: बीएसई में देखे गए पीआरपीएससी प्रकारों का सारांश, शास्त्रीय और एटिपिकल स्क्रैपी, और सकारात्मक निदान के लिए सीडब्ल्यूडी, और नकारात्मक, अनिर्णायक और अनुपयुक्त परिणामों के लिए मानदंड। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 1: फॉर्म INIAV "TSE इम्यूनोहिस्टोकेमिकल परीक्षण रिकॉर्ड" के रूप में कार्य करता है। कार्य पूरा हो जाता है क्योंकि आईएचसी प्रोटोकॉल का प्रत्येक चरण पूरा हो जाता है और संबंधित कार्य करने वाले तकनीशियन द्वारा प्रमाणित होता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइल 2: टीएसई इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रोटोकॉल के लिए अभिकर्मक तैयारी कार्यपत्रक। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
टीएसई संभावित जूनोटिक रोग हैं। यूनाइटेड किंगडम में 1986 में बीएसई के उद्भव के बाद, पुर्तगालइस बीमारी की उच्च घटनाओं के साथ यूरोपीय संघ के सदस्य राज्यों में से एक बन गया। इस बीमारी को नियंत्रित करने के लिए, अन्य टीएसई जो उभरे हैं (शास्त्रीय और एटिपिकल स्क्रैपी, बीएसई वेरिएंट, और वर्तमान में सेरविड्स में पुरानी बर्बादी की बीमारी की निगरानी), निगरानी तंत्र खाद्य और पशु चिकित्सा महानिदेशालय (डीजीएवी) और राष्ट्रीय कृषि और पशु चिकित्सा अनुसंधान संस्थान, आईपी (आईएनआईएवी) द्वारा विकसित किए गए थे जो टीएसई राष्ट्रीय पशु चिकित्सा प्रयोगशाला के रूप में टीएसई निदान का संचालन करते हैं। यह प्रयोगशाला टीएसई निगरानी से जुड़े मवेशियों, छोटे जुगाली करने वालों और सेरविड्स से ऊतकों के संभावित प्रियन-संक्रमित नमूनों के प्रबंधन में अनुशंसित जैव सुरक्षा बीएसएल -3 सुविधाओं और प्रथाओं6 का पालन करती है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा पीआरपीएससी का इम्यूनोडिटेक्शन और / या एन्सेफैलोन और लिम्फोइड ऊतकों के पश्चिमी इम्यूनोब्लोट विधियां (डब्ल्यूबी) टीएसई1 के निदान की पुष्टि करने के लिए संदर्भ विधियां हैं।
आईएचसी तकनीक पशु चिकित्सा और मानव चिकित्सा में निदान और एनाटोमोपैथोलॉजिकल जांच के लिए एक उपयोगी पूरक उपकरण है। कई महत्वपूर्ण बिंदुओं की पहचान की जाती है, और, व्यवहार में, प्रत्येक पशु प्रजाति, उपयोग किए गए एंटीबॉडी औरपरीक्षण किए गए विभिन्न ऊतकों के लिए प्रत्येक प्रयोगशाला में समायोजित करना आवश्यक है। निर्धारण, एंटीजन पुनर्प्राप्ति, पृष्ठभूमि और कलाकृतियों, उपयोग किए गए एंटीबॉडी के प्रकार (मोनोक्लोनल बनाम पॉलीक्लोनल, उपयोग किए गए क्लोन, पशु उत्पत्ति) और पशु प्रजातियों के अलावा, उन कारकों के उदाहरण हैं जिन्हें प्रत्येक प्रयोगशाला में ठीक से नियंत्रित और मानकीकृत करने की आवश्यकता है ताकि इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ प्राप्त अंतिम परिणामों को विशिष्ट इम्यूनोलेबलिंग2 के रूप में ठीक से व्याख्या किया जा सके। 17.
वर्तमान कार्य ने पुर्तगाल में टीएसई राष्ट्रीय संदर्भ प्रयोगशाला में पालन किए गए प्रोटोकॉल को प्रस्तुत किया, जिसमें टीएसई रोगों के सही निदान को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण बिंदु और सभी संदर्भ पद्धति बनाई गई थी। आईएचसी परिणाम नमूने की गुणवत्ता पर निर्भर करते हैं, जिसमें टीएसई के लिए लक्ष्य साइटें शामिल होनी चाहिए। विशिष्ट पीआरपीएससी इम्यूनोलेबलिंग की अनुपस्थिति के साथ इन टीएसई लक्ष्य साइटों की कमी, निदान सुनिश्चित करने के लिए इस पद्धति की एक महत्वपूर्ण सीमा है। यहां तक कि उन मामलों में जहां ठंड या ऑटोलिसिस कलाकृतियों को बढ़ावा देता है, इस बात का निर्णायक निदान करना संभव है कि यदि वे लक्षित साइटें नमूने में मौजूद हैं तो टीएसई मौजूद है या नहीं। इसके अलावा, विभिन्न न्यूरोनल ऊतकों में गैर-विशिष्ट लक्ष्यों में इम्यूनोस्टेनिंग की पहचान, नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रणों के दैनिक अवलोकन के आधार पर, जो हमेशा इस तकनीक का प्रदर्शन किए जाने पर पेश किए गए हैं, यहां उत्पादित और प्रस्तुत प्रोटोकॉल की गुणवत्ता और इसके प्रमाणीकरणका कारण 5,12,13 इंगित करता है।
संभावित घटनाओं के रूप में, हाइड्रेटेड ऑटोक्लेविंग और / या कवर-प्लेट धारकों को हटाने के दौरान ऊतक वर्गों का नुकसान, स्लाइड और कवर-प्लेटों के बीच फंसे बुलबुले की उपस्थिति, और अभिकर्मकों के अपर्याप्त कमजोर पड़ने पर प्रकाश डाला गया है। इन घटनाओं को दूर करने के लिए, समाप्ति तिथि के भीतर सकारात्मक रूप से चार्ज माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है और जो अच्छी तरह से संग्रहीत होते हैं, ऊतक वर्गों को कवर प्लेटों के साथ सावधानीपूर्वक क्लिप करते हैं, कैलिब्रेटेड उपकरण का उपयोग करते हैं, अभिकर्मक तैयारी कार्यपत्रक (पूरक फ़ाइल 2) को मानकीकृत करते हैं, और उपयोग से पहले इम्यूनोलेबलिंग बैच अभिकर्मकों का परीक्षण करते हैं।
नए टीएसई वेरिएंट का विवरण, अर्थात्, एटिपिकल स्क्रैपी, इस निदान में एक मानक आईएचसी तकनीक के महत्व को भी मान्य करता है। इस तकनीक के साथ, प्रियन स्ट्रेन, मेजबान प्रजातियों और पीआरएनपी जीनोटाइप के आधार पर पीआरपीएससी इम्यूनोस्टेनिंग के लिए विभिन्न पैटर्न के अस्तित्व का निरीक्षण करना संभव है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस लेख को प्रोजेक्ट POCI-01-0145-FEDER-029947 "पुर्तगाल में क्रोनिक वेस्टिंग रोग जोखिम मूल्यांकन" द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो FCT द्वारा समर्थित है (Fundaço para a Cincia e a Tecnologia) - FEDER-Balcao2020। इसके अलावा, अनुसंधान इकाई सीईसीएवी के लेखकों ने परियोजना यूआईडीबी / सीवीटी / 0772/2020 के तहत एफसीटी से धन प्राप्त किया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
References
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- Ramos-Vara, J. A.
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Orge, L., et al.
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
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- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
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- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
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- Pires, M. A., et al.
