Summary
免疫組織化学プロトコルを使用して異常なプリオンタンパク質を免疫標識するには、特定のサンプルおよび抗PrP抗体調製方法が必要です。本プロトコルは、適切なPrP免疫標識を確保し、非特異的バックグラウンド染色を最小限に抑えるためのエピトープデマスキングの重要なステップを説明しています。また、このアプローチは、プリオン感染組織を用いて免疫組織化学研究を行う際のバイオセーフティ対策を考慮する。
Abstract
異常プリオンタンパク質(PrPSc)は、細胞プリオンタンパク質の疾患関連アイソフォームであり、伝染性海綿状脳症(TSE)の診断マーカーです。これらの神経変性疾患は、ヒトおよびいくつかの動物種に影響を及ぼし、スクレイピー、人獣共通感染症のウシ海綿状脳症(BSE)、子宮頸部の慢性消耗性疾患(CWD)、および新たに特定されたラクダプリオン病(CPD)が含まれます。TSEの診断は、脳組織、すなわち脳幹(obexレベル)に対する免疫組織化学(IHC)およびウェスタンイムノブロット法(WB)の両方の適用によるPrPSc の免疫検出に依存しています。IHCは、組織切片の細胞における目的の抗原に対する一次抗体(モノクローナルまたはポリクローナル)を使用する広く使用されている方法です。抗体-抗原結合は、抗体が標的となった組織または細胞の領域に局在したままの呈色反応によって視覚化することができる。このように、プリオン病では、他の研究分野と同様に、免疫組織化学技術は診断目的だけでなく、病因研究にも使用されます。このような研究は、新しいプリオン株を同定するために、前述のものからPrPSc パターンおよびタイプを検出することを含む。BSEはヒトに感染する可能性があるため、東証サーベイランスに含まれる牛、小型反芻動物、および子宮頸管サンプルの取り扱いには、バイオセーフティ研究所レベル3(BSL-3)の施設および/または診療所を使用することが推奨されます。さらに、汚染を制限するために、可能な限り封じ込めおよびプリオン専用装置が推奨されます。PrPSc IHC手順は、この技術で使用されるホルマリン固定およびパラフィン包埋組織が感染性のままであるため、プリオン不活化手段としても機能するギ酸エピトープデマスキングステップで構成されています。結果を解釈する際には、非特異的免疫標識と標的標識を区別するように注意する必要があります。この目的のために、既知のTSE陰性対照動物において得られた免疫標識のアーティファクトを認識し、それらを特定のPrPSc 免疫標識タイプから区別することが重要であり、これはTSE株、宿主種、および prnp 遺伝子型の間で異なり得る。
Introduction
プリオン仮説によれば、異常なアイソフォーム(PrPSc)は、伝染性海綿状脳症(TSE)における感染因子の主要な、または唯一の成分です。TSEの診断の確認は、脳組織の免疫組織化学(IHC)プロトコルおよび/またはウェスタンイムノブロット法(WB)の適用によるPrPSc の免疫検出に依存しています1。
IHCは、組織切片の細胞にある目的の特異的標的抗原の免疫染色の最初のステップとして、モノクローナル抗体または場合によってはポリクローナル抗体(一次抗体として)を使用する方法です。次に、一次抗体に特異的な二次抗体を使用して、有効な一次抗体-抗原結合を視覚化します。これらの二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)やアルカリホスファターゼ(AP)などの酵素に結合しています。次に、これらの酵素に基質を添加し、一次抗体が標的抗原に結合している領域に局在する不溶性カラー生成物を生成することによって、視覚化が達成されます。改善された可視化は、対比染色によって達成することができ、ここで、色素は、免疫標識組織と非免疫標識組織との間のコントラストを作り出すために使用される2。
ホルマリン固定パラフィン包埋組織(FFPE)を用いたIHCでは、ホルマリン固定は、ホルムアルデヒドによる架橋やパラフィン包埋時の加熱脱水により、一次抗体の有効性を無効にする可能性があります。これらはタンパク質の立体構造を変化させ、エピトープを破壊、変性、またはマスクし、したがってそれらの検出を減少または消失させる3。そのため、これには抗原賦活化(AR)が必要です。AR技術は、抗原分子内のホルムアルデヒド関連の化学基架橋を破壊し、元の抗原-タンパク質立体構造を復元またはマスク解除します。これにより、免疫標識に対する抗体抗原(エピトープ)親和性が回復します。ARの最終的な有効性は、標的抗原および/または一次抗体の品質に依存します2。
熱誘導抗原(エピトープ)賦活化(HIER)は、AR3 の1つの手順であり、本明細書に記載されるように、PrPSc IHC検出のために日常的に使用される。IHCは診断に不可欠であり、病理学関連抗原の組織分布を決定するために研究室で使用されます。がん、神経科学、感染症の診断と研究に広く使用されています4。東証にとってIHCは、自然宿主や実験モデルにおけるPrPSc 分布を確認・調査するための診断・研究において重要な役割を果たしています。IHCは、プリオン病因研究およびPrPSc 沈着のタイプおよびパターンの分析、すなわち神経組織5において、日常的に記載されている感染からの逸脱を検出し、推定される新しいプリオン株を特定することに貢献する。
牛海綿状脳症(BSE)のプリオンはヒトに感染する可能性があるため、BSEの作業に関与する特定の検査プロトコルでは、BSL-3施設および実践の使用が必要になる場合があります6。これには、BSE感染の可能性のある組織サンプルを研究所や実験室内で輸送するための密閉された二次容器の使用が含まれます。また、可能な限り、BSEの研究と分析のための封じ込めエリアとプリオン専用機器を指定することも含まれます。これは、作業エリア外の汚染を防ぎ、除染手順が必要になるため、限られたスペースを提供するために行われます。
したがって、INIAVの病理学研究所は、TSEサーベイランスに関連する牛、小型反芻動物、および子宮頸管からの組織の潜在的なプリオン感染サンプルを管理するために、推奨されるバイオセーフティレベル3(BSL-3)施設および慣行6 に従います。
TSEの診断または研究手順に含まれるホルマリン固定およびパラフィン包埋組織は、特に中枢神経系において、潜在的に感染性である可能性があります。したがって、これらの固定組織は、組織処理の前にプリオンが存在する場合は、その感染力を低下させるためにギ酸で処理する必要があります。これは、固定されたトリミングされた組織(厚さ約2〜4 mm)を加工カセットに入れることによって行われます。次いで、カセットを98%ギ酸に浸す(1時間)。浸漬後、ティッシュを含むカセットを水道水で30分間洗浄し、さらに処理する前に固定液に戻します。組織切片が処理前に処理されない場合、組織学的染色の前に、ミクロトミック後の組織切片を希釈されていないギ酸に少なくとも5分間浸す必要があります7。PrPSc のためのIHCプロトコルは、プリオン7を不活性化する役割を果たすルーチンのギ酸エピトープデマスキング工程を含む。これらのプリオン不活性化ステップの後、得られた固定組織は、次いで、標準的なBSL-2慣行を用いてBSL-2で処理することができる。
TSEサーベイランスに含まれる動物のTSE診断の最小組織サンプリング要件は、脳幹を(obexレベルで)収集することです。さらに、非定型BSEとスクレイピーを検出するには、小脳の一部も収集することをお勧めします1,8。CWD診断では、脳幹(obex)と後咽頭リンパ節の両方を検査する必要があります PrP Scはリンパ組織で検出され、obex9では検出可能なPrPScがなかったため、Machado et al.10によってレビューされました。
脳幹の肛骨部分は、診断用TSE標的部位、すなわち、背迷走神経核(DVN)、孤立性路核(STN)および三叉神経の脊髄核(V)を含む。これらの地域は、BSEや古典的なスクレイピーの初期段階においても、一貫して二国間のPrPSc 蓄積を示しています。進行性TSEの臨床例では、脳幹内のすべての灰白質領域が広範囲のPrPSc 分布を示しています11。
切片作成と処理の前に、脳サンプルを評価し(図1)、自己消化のレベルと、IHCベースの確認診断へのサンプルの適合性を損なう可能性のある組織損傷の存在を確認します8。分取プロトコルと分析結果の完全性を検証するために、TSE陽性および陰性組織サンプルは、各アッセイのテストケースからの組織の調製と併せてコントロールとして含まれます。
図1:PrPSc IHC手順。 組織切片の脱パラフィンから最終的な免疫染色および検出までのPrPSc IHC手順の段階的なシーケンスを示す表現(FFPE-ホルマリン固定パラフィン包埋;マブ - モノクローナル抗体。DAB - 3,3'ジアミノベンジジン)。この図は BioRender.com 年に作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
ここに記載されているIHC手順は、研究プロジェクトFAIRJ-CT98-7021「反芻動物TSEの監視のためのヨーロッパネットワークの確立、および疑わしい症例を特定するためのプロセスと基準の標準化と調和」の構成要素です。これは、世界獣疫事務局、WOAH(以前は国際版動物事務局、OIE)1および動物TSEの欧州参照研究所8,11によって定義された診断基準に従います。記載されているIHC手順は、17025年以来、NPISOIEC2008(試験および校正機関の能力に関する一般要件)に従って認定されています。このような認定は、標準的な操作手順、有資格者、正確に校正された機器、データと試薬の厳格な管理、ラボ間の習熟度アッセイへの参加、不適合作業、およびリスク評価を組み込んだ高品質の管理システムを意味します管理システムの有効性を高め、結果を改善し、実験室の危険を防ぎます。BSE、古典的スクレイピー、非定型スクレイピー、およびCWDによるプリオン感染組織コントロールは、さまざまなソースから収集されました(ホルマリン固定、パラフィン包埋、FFPE)。ウシとヒツジのセクションは、動物のTSEサーベイランスプログラムの下で診断された症例からのものです。CWDセクションは、2003年にStefanie Czub教授(カナダ食品検査庁、国立動物病センター)から提供された対照サンプルと、TSEの欧州参照研究所(APHA、ウェイブリッジ)が主催するCWD技能試験2008からのものです。
1.組織切片作成とスライドの準備
- ミクロトームを使用して、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織の切片を3〜5μmの厚さで切断します。
- 使用するパラフィンの融点より約10°C低い温度の精製水に切片を浮かべます。切片を水から持ち上げて、特別に処理された顕微鏡スライドに載せます( 材料表を参照)。スライドから水を完全に排出させます。
- スライドを50°Cで一晩インキュベートして、組織のスライド接着を強化します。
注:IHCプロトコル用に新たに切片化した組織を準備することが望ましいですが、TSE陽性および陰性対照切片を事前に準備して保管することができます。ステップ2〜4は、化学ヒュームフードで実行する必要があります。
2.脱パラフィンと水分補給
- 組織切片を含むスライドをステンレス鋼の染色バスケットに入れます( 材料表を参照)。バスケットをキシレンバス(ステンレス鋼の染色容器)に3分間浸し、取り出してもう一度浸します。
- キシレンを取り除き、切片を無水エタノール浴に3分間浸して再水和します。取り外してもう一度浸します。
- 切片を風乾し、90%エタノール浴に1分間入れます。70%エタノール浴にさらに1分間移し、続いて最後に50%エタノール浴に1分間移す。エタノール浴処理ごとに、スライドバスケットを2回静かに攪拌し、次の移送の前にバスケットを排出します。
3. エピトープ検索
- 組織切片を室温で98%ギ酸に30分間注意深く浸します。切片を水道水で5分間すすぎ、続いて蒸留水で2回すすぎます。
注意: ギ酸は非常に腐食性があります。保護メガネと手袋を着用する必要があります。 - 以下の手順に従って、熱誘発抗原賦活化(HIER)を実行します。
注:このステップは、特定の圧力チャンバーで121°Cで30分間の水和オートクレーブによって実行されます(材料の表を参照)。- クエン酸緩衝液(10 mM、pH 6.1、 材料表参照)を、500 mLの蒸留水で満たされた耐圧チャンバー内に置いたステンレス鋼染色容器内で約20分間、98°Cで予熱します。
注:本研究では、プログラムセットポイントは、使用された特定の機器に対して1(SP1)でした。 - 機器がプログラムされた時間と温度に達したことをアラームが示した後、バスケットをスライドに浸し、セットポイント2(121°Cで30分間)までプログラムを開始します。品質管理の目的で、バスケットに粘着性オートクレーブインジケータテープのセクションを置き、温度と圧力を監視し、このプログラムの初期圧力と最終圧力を記録します。
- 免疫染色するスライドの数がバスケットの容量に達しない場合は、清潔で空白のスライドを使用して、空の位置を占めます。プログラムが終了したら、チャンバーを周囲圧力にパッシブに戻します(少なくとも30分)。
注:持続時間を長くすると、非特異的なバックグラウンド染色が減少する可能性があります。 - スライドバスケットを蒸留水で満たされたステンレス鋼の染色容器に5分間慎重に移します。
- クエン酸緩衝液(10 mM、pH 6.1、 材料表参照)を、500 mLの蒸留水で満たされた耐圧チャンバー内に置いたステンレス鋼染色容器内で約20分間、98°Cで予熱します。
4.内因性ペルオキシダーゼの不活性化
- サンプル切片を含むスライドバスケットをメタノール中の3%過酸化水素(H2O2)の浴に30分間浸します。セクションを流水ですすいでください(5分)。切片を排水し、1xトリス緩衝生理食塩水(TBS)にさらに5分間浸します。
5. 免疫検出
注:本研究では、免疫検出は、市販のスライドクリップアセンブリシステムを使用してキャピラリーギャップフォーマット7 を使用して実行されました( 材料の表を参照)。他の免疫組織化学スライドシステムも適用可能である。
- 各スライドをTBSであらかじめ湿らせた市販のカバープレートホルダー( 材料の表を参照)に置き、気泡を避け、ティッシュ面をホルダーに向け、スライドの端をホルダーの2つの下点と一致させます。
- スライドホルダーアセンブリを親指と人差し指の間に挟み、片方の指をサンプルスライドの上に、もう片方の指をホルダーの下部に置きます。次に、アセンブリをシステムのギャラリーに配置します。
- セットが適切に組み立てられていることを確認するために、サンプルスライドとホルダーの間のウェルにTBSを満たします。この時点から、ホルダーとスライドの間に約80μLのTBSを保持する必要があります。切片を乾かさないでください。
- システム内に入ったら、一次抗体(抗PrP、 材料の表を参照)で処理する前にバックグラウンド染色を減らすために、免疫染色に使用されている二次抗体宿主と同じ種からの20%正常血清(この場合はウマ血清)でサンプルスライドをTBSで30分間プレインキュベートします。
- 分析中の動物種に応じて使用する抗体のアリコート数、検査するサンプル切片の数、および作業希釈量に応じて解凍します。
注:最良の結果を得るには、二次抗体および一次抗体溶液の供給源と同じ種からの10%正常血清を使用してください。可能であれば、最良の結果を得るには、正常血清と二次抗体の宿主源が同じ種からのものである必要があります。 - 切片を洗浄せずに、一次抗体溶液(200 μL)をスライドホルダーセットの各ウェルに直接塗布し、室温で60分間インキュベートします。
- 洗浄するには、スライドホルダーセットのウェルにTBSを入れ、5分間待ちます。
- ビオチン化二次抗体(モノクローナル抗マウスウマAb、 材料表参照)をTBS中で1/200に希釈し、10%ウマ血清で希釈する。治療する切片の数に応じて必要な量を用意してください。
- 二次抗体溶液(200 μL)をスライドホルダーセットの各ウェルに塗布します。室温で30分間インキュベートします。
- 手順5.5の説明に従って洗浄します。
- アビジン-ビオチン複合体ペルオキシダーゼ(ABC/HRP複合体、 材料表を参照)とのインキュベーションの場合は、使用の30分前に試薬を調製してください。ABC/HRP複合溶液(200 μL)をスライドプレートホルダーセットの各ウェルに塗布します。室温で30分間インキュベートします。
- 手順5.5の説明に従って洗浄します。
6. DAB色原体による開発
注意: DABは潜在的な発がん性物質です。その結果、この試薬を取り扱う際には、目の保護具、白衣、手袋、適切な実験室手順など、適切な注意が必要です。以下の地域の規制は廃棄してください。
- 使用直前に製造元の指示に従って色原体を希釈してください( 材料表を参照)。色原体溶液(400 μL)をスライドプレートセットの各ウェルに塗布します。
- 室温で最大30分間インキュベートします。PrPSc 陽性切片では、通常10分のインキュベーション期間で十分です。
- スライドを蒸留水で洗浄することにより、残留色原体溶液を除去します。カバープレートホルダーからスライドを取り外し、蒸留水を入れたプラスチック容器に入れます。
7. ヘマトキシリン対比染色
- 切片の入ったステンレス鋼染色バスケットをヘマトキシリン溶液浴( 材料の表を参照)に1分間浸します。冷たい流水で10分間、またはぬるま湯で5分間やさしくすすいでください。
- 切片を90%エタノールに1分間入れて脱水し、続いて無水エタノールに1分間1浴します。次に、スライドをキシレン浴に1分間置きます。
- 市販の封入剤を使用してセクションを取り付けます(材料表を参照)。
注意: これらのステップは、室温(19°C-24°C)の化学ヒュームフードで実行されます。この手順には、すべてのステップの完了、使用した機器、およびラボ技術者を記録するためのテストレコード(補足ファイル1)が含まれています。さらに、ワークシート(補足ファイル2)は、各アッセイのセクション数、作業希釈率、および製造元の指示に従って試薬の量を簡単に決定し、室温、装置、および試薬バッチを記録するように設計されています。
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Representative Results
非特異的標的免疫標識が可能であることを考えると、既知のTSE陰性対照動物における非特異的免疫標識のレベルを確認することが重要です。これは、特異的なPrPSc 免疫標識7 (図2)を適切に解釈するための重要なステップである。 抗PrP抗体による非標的標識は、離散的な神経内微粒子染色(舌下核および副核でより顕著)、ニューロパイルの不規則な細線状染色糸(STN、V、オリバリー核、副クネエート核、外側筋膜核、オリバリー核背側の網状形成、および領域ポストレマ)として発生することが指摘されています12。、いくつかの灰白質および白質領域におけるびまん性非粒子標識、およびニューロン13 のびまん性細胞質標識(図3)。
いくつかの研究に基づいて、特異的で標的化されたPrPSc 免疫標識は、TSE株、宿主種、および prnp 遺伝子型に応じて、さまざまなタイプで見つけることができます。以下のPrPSc タイプが記載されている(Orge et al.5によるレビュー):ニューロン内;グリア内;星;血管周囲;サブピアル;サブペンディマル;リニア;細かい粒状;凝集体(または粗粒状、粗粒状から合体および苔状);神経周囲;プラーク様(またはプラーク、血管プラーク);点状;丸い。
図2:BSE、古典的スクレイピー、非定型スクレイピー、およびCWDの非感染対照およびプリオン感染動物からの組織切片のPrPScの免疫標識後の代表的な画像。 (A、B、C)それぞれウシ、ヒツジ、および子宮頸管の陰性対照からのセクション。(D)BSE陽性:DVNのニューロパイルにおける顆粒状PrP Sc沈着物および(E)STN;(F)ヒツジ古典的スクレイピー陽性:DVNにおける神経框粒状PrPScおよび神経細胞内および(G)網状形成における星状PrPsc;(H)ヒツジ非定型スクレイピー:卵骨領域のVのニューロパイルにおける顆粒状PrP Sc、分子(m)および(I)小脳の顆粒状(g)層および(J)脳幹の白質における点状(矢印)および球状(矢じり)PrPSc;(k)CWD:Vおよび(L)網状形成および網状形成における血管周囲の顆粒状PrPSc。A、B、C、D-スケールバー= 50μmの場合。E、F、G、H、およびL-スケールバー= 20μm;IおよびK-スケールバー= 1 mm;J-スケールバー= 10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:PrPSc IHC手順に続いて観察された免疫染色アーチファクトの例を示す代表的な画像。 (A)びまん性ニューロパイルバックグラウンド(DVN)。(B)ニューロンのびまん性細胞質(頭の矢印)標識(網状形成)。(C)人工的な色原体沈着物(矢印)(網状形成)。(D)ニューロパイル(網状形成)の染色の不規則な細線(矢印)。東証欧州リファレンスラボが主催する免疫組織化学技術能力試験からのPrPSc 陰性ウシ切片のサンプル。AおよびB-スケールバー= 20μm;CおよびD-スケールバー= 10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1 は、陽性診断のためにBSE、古典的および非定型のスクレイピー、およびCWDで観察された免疫標識PrPSc タイプの説明と、陰性、不確定、および不適切な結果の確立された基準を要約しています11 およびOrgeらによってレビューされた5。
表1:陽性診断のためのBSE、古典的および非定型スクレイピー、およびCWDで観察されたPrPScタイプの要約、および陰性、不確定、および不適切な結果の基準。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:INIAV「東証免疫組織化学検査記録」となるフォーム。 IHCプロトコルの各ステップが完了し、それぞれのタスクを実行する技術者によって認定されると、タスクが完了します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:TSE免疫組織化学プロトコルの試薬調製ワークシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
TSEは潜在的な人獣共通感染症です。1986年に英国でBSEが出現した後、ポルトガルはこの病気の発生率が高い欧州連合加盟国の1つになりました14,15。この病気を制御するために、出現した他のTSE(古典的および非定型のスクレイピー、BSEバリアント、および現在は子宮頸管の慢性消耗性疾患のサーベイランス)、食品獣医総局(DGAV)および国立農業獣医研究所、IP(INIAV)によってサーベイランスメカニズムが開発されました。このラボは、TSEサーベイランスに関連する牛、小型反芻動物、および子宮頸管からの組織の潜在的なプリオン感染サンプルを管理する際に、推奨されるバイオセーフティBSL-3施設および実践6に従います。脳およびリンパ組織の免疫組織化学(IHC)および/またはウェスタンイムノブロット法(WB)によるPrPScの免疫検出は、TSE1の診断を確認するための参照方法です。
IHC技術は、獣医学およびヒト医学における診断および解剖病理学的調査のための有用な補完ツールです。いくつかの重要なポイントが特定されており、実際には、各動物種、使用される抗体、および試験された異なる組織について、すべての実験室で調整する必要があります16,17。使用される抗体の種類(モノクローナル対ポリクローナル、使用されるクローン、動物起源)および試験された動物種に加えて、固定、抗原賦活化、バックグラウンド、およびアーティファクトは、免疫組織化学で得られた最終結果が特異的免疫標識として適切に解釈されるように、各実験室で適切に制御および標準化する必要がある要因の例です2。17.
現在の研究では、ポルトガルのTSE国立リファレンスラボで採用されているプロトコルが提示されており、TSE疾患の正しい診断を確実にするために重要なポイントとすべてのリファレンス方法論が示されています。IHCの結果は、TSEのターゲットサイトを含める必要があるサンプルの品質によって異なります。これらのTSE標的部位の欠如は、特異的なPrPSc免疫標識の欠如とともに、診断を保証するためのこの方法論の重要な制限である。凍結や自己消化によって人工物が促進される場合でも、それらの標的部位がサンプル中に存在すれば、TSEが存在するかどうかの決定的な診断を下すことができます。さらに、この技術が実行されるたびに常に導入されてきた陰性および陽性対照の毎日の観察に基づく、異なる神経組織における非特異的標的における免疫染色の同定は、ここで作成および提示されたプロトコルの品質およびその認証の理由を示す5,12,13。
考えられるインシデントとして、水和オートクレーブおよび/またはカバープレートホルダーの取り外し中の組織切片の損失、スライドとカバープレートの間に閉じ込められた気泡の存在、および試薬の不十分な希釈が強調されています。これらのイベントを克服するために、有効期限内に十分に保管されている正に帯電した顕微鏡スライドを使用し、組織切片をカバープレートで慎重にクリップし、校正された機器を使用し、試薬調製ワークシート(補足ファイル2)を標準化し、使用前に免疫標識バッチ試薬をテストすることをお勧めします。
新しいTSEバリアント、すなわち非定型スクレイピーの説明も、この診断における標準的なIHC技術の重要性を検証します。この技術により、プリオン株、宿主種、およびprnp遺伝子型に応じて、PrPSc免疫染色の異なるパターンの存在を観察することができます。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この記事は、FCT(Fundação para a Ciência e a Tecnologia)-FEDER -Balcão2020の支援を受けたプロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-029947「ポルトガルにおける慢性消耗性疾患リスク評価」によって資金提供されました。また、研究ユニットCECAVの著者は、プロジェクトUIDB/CVT/0772/2020の下でFCTから資金提供を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
References
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