Summary
Immunmerking av unormalt prionprotein ved bruk av immunhistokjemiske protokoller krever spesifikke prøve- og anti-PrP-antistoffpreparasjonsmetoder. Den nåværende protokollen beskriver de viktigste trinnene i epitopdemasking for å sikre riktig PrP-immunmerking og for å minimere uspesifikk bakgrunnsfarging. Også denne tilnærmingen vurderer biosikkerhetstiltak når man utfører immunhistokjemiske studier med prioninfiserte vev.
Abstract
Unormale prionproteiner (PrPSc) er den sykdomsassosierte isoformen av cellulært prionprotein og diagnostiske markører for overførbare spongiforme encefalopatier (TSE). Disse nevrodegenerative sykdommene påvirker mennesker og flere dyrearter og inkluderer skrapesyke, zoonotisk bovin spongiform encefalopati (BSE), kronisk sløsende sykdom av hjortedyr (CWD) og den nylig identifiserte kamelprionsykdommen (CPD). Diagnostisering av TSE er avhengig av immundeteksjon av PrPSc ved bruk av både immunhistokjemi (IHC) og vestlige immunoblotmetoder (WB) på encefalonvev, nemlig hjernestammen (obex-nivå). IHC er en mye brukt metode som bruker primære antistoffer (monoklonal eller polyklonal) mot antigener av interesse i celler i en vevsseksjon. Antistoff-antigenbindingen kan visualiseres ved en fargereaksjon som forblir lokalisert i området av vevet eller cellen der antistoffet ble målrettet. Som sådan, i prionsykdommer, som i andre forskningsfelt, brukes immunhistokjemiteknikkene ikke bare til diagnostiske formål, men også i patogenesestudier. Slike studier innebærer å oppdage PrPSc-mønstre og -typer fra de som tidligere er beskrevet for å identifisere de nye prionstammene. Siden BSE kan infisere mennesker, anbefales det at biosikkerhetslaboratoriet nivå-3 (BSL-3) fasiliteter og / eller praksis brukes til å håndtere storfe, små drøvtyggere og hjortedyrprøver som inngår i TSE-overvåkingen. I tillegg anbefales oppsamlingsutstyr og prion-dedikert utstyr, når det er mulig, for å begrense forurensning. PrPSc IHC-prosedyren består av et maursyre-epitop-demasking trinn som også fungerer som et prioninaktiveringsmål, da formalinfiksert og parafininnebygd vev som brukes i denne teknikken forblir smittsomt. Ved tolkning av resultatene må det utvises forsiktighet for å skille uspesifikk immunmerking fra målmerking. For dette formålet er det viktig å gjenkjenne artefakter av immunmerking oppnådd i kjente TSE-negative kontrolldyr for å skille de fra spesifikke PrP Sc-immunmerkingstyper, som kan variere mellom TSE-stammer, vertsarter og prnp-genotype, nærmere beskrevet her.
Introduction
Ifølge prionhypotesen er den unormale isoformen (PrPSc) den primære eller eneste komponenten av det smittsomme stoffet i overførbare spongiforme encefalopatier (TSE). Bekreftelse for diagnostisering av TSE er avhengig av immundeteksjon av PrPSc ved bruk av immunhistokjemi (IHC) protokoller og / eller vestlige immunoblotmetoder (WB) av encephalon vev1.
IHC er en metode som benytter monoklonale eller, i noen tilfeller, polyklonale antistoffer (som primære antistoffer) som et første skritt i immunfarging av spesifikt målrettede antigener av interesse lokalisert i celler i en vevsseksjon. Enhver effektiv primær antistoff-antigenbinding visualiseres deretter ved bruk av sekundære antistoffer som er spesifikke for de primære antistoffene. Disse sekundære antistoffene konjugeres til enzymer, slik som pepperrotperoksidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP). Visualisering oppnås deretter ved å legge til et substrat til disse enzymene, og produsere uoppløselige fargeprodukter lokalisert i områder der de primære antistoffene er bundet til de målrettede antigenene. Forbedret visualisering kan oppnås ved motfarging, hvor et fargestoff brukes til å skape en kontrast mellom immunmerket og ikke-immunmerket vev2.
Med IHC ved bruk av formalinfast parafininnebygd vev (FFPE), kan formalinfiksering oppheve effektiviteten av primære antistoffer på grunn av kryssbinding ved formaldehyd og oppvarming og dehydrering under parafininnbygging. Disse endrer konformasjonen av proteiner, ødelegger, denaturerer eller maskerer epitopene, og reduserer eller opphever dermed deres deteksjon3. Som sådan krever dette antigengjenfinning (AR). AR-teknikkene forstyrrer formaldehydrelatert kjemisk gruppe-kryssbinding i de antigene molekylene, og gjenoppretter eller avdekker dermed den opprinnelige antigen-proteinkonformasjonen. Dette resulterer i gjenoppretting av antistoff-antigen (epitop) affinitet for immunmerking. Den endelige effekten av AR avhenger av egenskapene til det målrettede antigenet og / eller det primære antistoffet2.
Heat-induced antigen (epitope) retrieval (HIER) er en prosedyre for AR3 og brukes rutinemessig for PrPSc IHC-deteksjon, som beskrevet her. IHC er avgjørende for diagnose og brukes i forskningslaboratorier for å bestemme vevsfordelingen av et patologiassosiert antigen. Det er mye brukt i diagnostisering og forskning på kreft, nevrovitenskap og smittsomme sykdommer4, blant andre. For TSE spiller IHC en viktig rolle i diagnostisering og forskning for å bekrefte og undersøke PrPSc-distribusjon i naturlige verter og eksperimentelle modeller. IHC bidrar til prionpatogenesestudier og analyse av PrP Sc-avsetningstyper og mønstre, nemlig i nevrale vev5, for å oppdage avvik fra rutinemessig beskrevne infeksjoner og identifisere antatte nye prionstammer.
Fordi prioner av bovin spongiform encefalopati (BSE) kan infisere mennesker, kan visse laboratorieprotokoller involvert i arbeidet med BSE kreve bruk av BSL-3-fasiliteter og praksis6. Disse inkluderer bruk av en forseglet sekundær beholder for å transportere potensielle BSE-infiserte vevsprøver i instituttet og laboratoriet. Det inkluderer også utpeking av inneslutningsområder og prion-dedikert utstyr for BSE-forskning og analyse når det er mulig. Dette gjøres for å forhindre forurensning utenfor arbeidsområdet og gi et begrenset rom siden dekontamineringsprosedyrer blir nødvendige.
Følgelig følger laboratoriet for patologi av INIAV anbefalte biosikkerhetsnivå-3 (BSL-3) fasiliteter og praksis6 for å håndtere potensielle prioninfiserte prøver av vev fra storfe, små drøvtyggere og hjortedyr forbundet med TSE-overvåkingen.
Formalinfiksert og parafininnebygd vev som inngår i TSE-diagnostiske eller forskningsprosedyrer, spesielt i sentralnervesystemet, kan være potensielt smittsomt. Derfor må disse faste vevene behandles med maursyre for å redusere smittsomheten til prioner, hvis tilstede, før vevsbehandling. Dette utføres ved å plassere faste, trimmede vev (ca. 2-4 mm tykkelse) i en prosesseringskassett. Kassetten senkes deretter ned i 98% maursyre (i 1 time). Etter nedsenking vaskes kassettene med vev i rennende vann fra springen i 30 minutter, og returneres til fikseringsmiddelet før videre behandling. Dersom vevssnitt ikke behandles før behandling, må postmikrotomiske vevssnitt senkes ned i ufortynnet maursyre i minst 5 minutter før histologisk farging7. IHC-protokollen for PrPSc inkluderer et rutinemessig maursyre-epitop-demasking trinn, som også tjener til å inaktivere prioner7. Etter disse prioninaktiveringstrinnene kan de resulterende faste vevene deretter behandles ved BSL-2 ved hjelp av standard BSL-2-praksis.
Minimumskravet til vevsprøvetaking for TSE-diagnose hos dyr som inngår i TSE-overvåking, er innsamling av hjernestammen (på obexnivå). For å påvise atypisk BSE og skrapesyke anbefales det i tillegg at en del av lillehjernen også samles 1,8. For CWD-diagnose bør både hjernestamme (obex) og retropharyngeale lymfeknuter testes, da PrP Sc kan påvises i lymfoid vev uten påviselig PrPSc i obex9, gjennomgått av Machado et al.10.
Obex-delen av hjernestammen inkluderer diagnostiske TSE-målsteder, nemlig den dorsale vagalkjernen (DVN), ensomhetskjernen (STN) og spinalkanalkjernen i trigeminusnerven (V). Disse områdene presenterer konsekvent bilateral PrPSc-akkumulering , selv i de tidlige stadiene av BSE og klassisk skrapesyke. I kliniske tilfeller av avansert TSE viser alle gråsubstansområdene i hjernestammen utbredt PrPSc-distribusjon 11.
Før snitting og prosessering evalueres hjerneprøvene (figur 1) for å fastslå grad av autolyse og tilstedeværelse av eventuelle vevsskader som potensielt kan svekke prøvens egnethet for IHC-basert bekreftende diagnose8. For å validere integriteten til de forberedende protokollene og analyseresultatene, er TSE-positive og negative vevsprøver inkludert som kontroller i forbindelse med fremstilling av vev fra testtilfeller i hver analyse.
Figur 1: PrPSc IHC-prosedyren. Representasjon som viser trinnvis sekvens av PrPSc IHC-prosedyre fra deparaffinisering av vevsseksjoner til eventuell immunfarging og deteksjon (FFPE - Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab - monoklonalt antistoff; DAB - 3,3' diaminobenzidin). Denne figuren ble opprettet i BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
IHC-prosedyren beskrevet her er en del av forskningsprosjektet FAIRJ-CT98-7021, "Etablering av et europeisk nettverk for overvåking av drøvtyggende TSE og standardisering og harmonisering av prosessen og kriterier for identifisering av mistenkelige tilfeller". Det følger de diagnostiske kriteriene definert av Verdens dyrehelseorganisasjon, WOAH (tidligere kalt Office International des Épizooties, OIE)1 og European Reference Laboratory for animal TSEs 8,11. Den beskrevne IHC-prosedyren er også akkreditert i henhold til NPISOIEC17025 (generelle krav til test- og kalibreringslaboratoriers kompetanse) siden 2008. Slik akkreditering innebærer et styringssystem av høy kvalitet som omfatter standard operative prosedyrer, kvalifisert personell, nøyaktig kalibrert utstyr, streng kontroll av data og reagenser, deltakelse i laboratoriekunnskapsanalyser, avviksarbeid og risikovurdering for å øke effektiviteten til styringssystemet, oppnå forbedrede resultater og forhindre laboratoriefarer. Prioninfiserte vevskontroller med BSE, klassisk skrapesyke, atypisk skrapesyke og CWD ble samlet inn (formalinfiksert, parafininnebygd, FFPE) fra ulike kilder. Storfe- og saueseksjonene er fra tilfellene diagnostisert under et TSE-overvåkingsprogram for dyr. CWD-seksjonene er fra kontrollprøvene fra professor Stefanie Czub (Canadian Food Inspection Agency, National Center for Animal Diseases) i 2003 og fra CWD Proficiency testing 2008 organisert av European Reference Laboratory for TSE (APHA, Weybridge).
1. Vevssnitt og lysbildepreparering
- Skjær seksjoner av formalinfast, parafininnebygd (FFPE) vev ved 3-5 μm tykkelse ved hjelp av en mikrotom.
- Flyt seksjoner på renset vann med en temperatur ca. 10 °C under smeltepunktet til den anvendte parafinen. Løft seksjonene fra vannet til spesialbehandlede mikroskopsklier (se materialfortegnelse). La vannet renne grundig fra skliene.
- Inkuber lysbildene over natten ved 50 °C for å forbedre glideadhesjonen av vev.
MERK: Det er å foretrekke å tilberede nysnittede vev for IHC-protokoller, selv om TSE-positive og negative kontrollseksjoner kan tilberedes på forhånd og lagres. Trinn 2 til 4 må utføres i en kjemisk avtrekkshette.
2. Deparaffinisering og rehydrering
- Plasser lysbildene med vevsseksjonene i en fargekurv i rustfritt stål (se materialfortegnelse). Fordyp kurven i et xylenbad (fargebeholder i rustfritt stål) i 3 minutter, fjern og senk igjen.
- Fjern xylen- og rehydreringsseksjoner ved å senke dem i et absolutt etanolbad i 3 minutter. Fjern og fordyp igjen.
- Lufttørk seksjonene og sett i et 90% etanolbad i 1 min. Overfør til et 70% etanolbad i ytterligere et minutt, etterfulgt av en endelig overføring til et 50% etanolbad i 1 minutt. For hver etanolbadbehandling, berør glidekurven forsiktig to ganger og tøm kurven før neste overføring.
3. Henting av epitop
- Senk vevsseksjonene forsiktig i 98% maursyre ved romtemperatur i 30 minutter. Skyll seksjonene i vann fra springen i 5 min, etterfulgt av skylling to ganger i destillert vann.
FORSIKTIG: Maursyre er sterkt etsende. Vernebriller og hansker må brukes. - Utfør varmeindusert antigenuthenting (HIER) ved å følge trinnene nedenfor.
MERK: Dette trinnet utføres ved hydrert autoklavering ved 121 °C i 30 minutter i et spesifikt trykkammer (se materialfortegnelse).- Forvarm sitratbufferen (10 mM, pH 6,1, se materialfortegnelse) ved 98 °C i ca. 20 minutter i en fargebeholder i rustfritt stål plassert inne i trykkammeret fylt med 500 ml destillert vann.
MERK: For denne studien var programmet Set Point 1 (SP1) for det spesifikke utstyret som ble brukt. - Etter at alarmen indikerer at utstyret oppnådde den programmerte tiden og temperaturen, senk kurven med lysbilder og start programmet til settpunkt 2 (121 ° C i 30 minutter). For kvalitetskontrollformål, plasser en del av selvklebende autoklavindikatorbånd på kurven for å overvåke temperatur og trykk, og registrer det første og endelige trykket til dette programmet.
- Hvis antall lysbilder som skal immunfarges ikke når kurvens kapasitet, bruk rene, tomme lysbilder for å okkupere tomme posisjoner. Etter at programmet er avsluttet, la passiv retur av kammeret til omgivelsestrykk (minst 30 minutter).
MERK: Lengre varighet kan redusere uspesifikk bakgrunnsfarging. - Overfør glidekurven forsiktig til en fargebeholder i rustfritt stål fylt med destillert vann i 5 minutter.
- Forvarm sitratbufferen (10 mM, pH 6,1, se materialfortegnelse) ved 98 °C i ca. 20 minutter i en fargebeholder i rustfritt stål plassert inne i trykkammeret fylt med 500 ml destillert vann.
4. Inaktivering av endogen peroxidase
- Senk glidekurven som inneholder prøveseksjonene i et bad med 3% hydrogenperoksid (H 2 O2) i metanol i 30 minutter. Skyll seksjonene under rennende vann (5 min). Tøm og senk seksjonene i 1x Tris-bufret saltvann (TBS) i ytterligere 5 minutter.
5. Immunodeteksjon
MERK: For denne studien ble immunodeteksjon utført ved hjelp av kapillærgapformatet7 ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig lysbildeklippsamlingssystem (se materialfortegnelse). Andre immunhistokjemiske glidesystemer er også aktuelle.
- Plasser hvert lysbilde på en kommersielt tilgjengelig dekkplateholder (se materialfortegnelse) som er fuktet med TBS, unngå bobler, med vevssiden mot holderen og skyvekantene sammenfallende med de to nedre punktene på holderen.
- Hold glideholderenheten mellom tommelen og pekefingeren, med én finger på toppen av prøvelysbildet og den andre på bunnen av holderen. Plasser deretter samlingen i galleriet til systemet.
- For å sikre at settet er godt montert, fyll brønnen mellom prøvesklien og holderen med TBS, som ikke umiddelbart må overløpe. Fra dette tidspunktet må du sørge for at ca. 80 μL TBS må holdes mellom holderen og lysbildet. Ikke la seksjonene tørke.
- En gang i systemet, for å redusere bakgrunnsfarging før behandling med primært antistoff (anti-PrP, se materialfortegnelse), pre-inkubere prøveslidene med 20% normalt serum fra samme art som den sekundære antistoffverten som brukes til immunfarging (i dette tilfellet hesteserum) i 30 minutter i TBS.
- Tine antall alikoter av antistoff som skal brukes i henhold til dyrearten som analyseres, antall prøveseksjoner som skal undersøkes, og mengden arbeidsfortynning.
MERK: For best resultat, bruk 10% normalt serum fra samme art som kilden til det sekundære antistoffet og primære antistoffløsninger. Hvis mulig, for best resultat, bør vertskilden til normalt serum og sekundært antistoff være fra samme art. - Uten å vaske seksjonene, påfør den primære antistoffløsningen direkte (200 μL) i hver brønn i glideholdersettet og inkuber i 60 minutter ved romtemperatur.
- For vask, fyll brønnene til glideholdersettene med TBS og vent i 5 minutter. Gjenta to ganger.
- Fortynn det biotinylerte sekundære antistoffet (monoklonalt anti-murine Horse Ab, se materialtabell) ved 1/200 i TBS med 10 % hesteserum. Forbered volumet som kreves, avhengig av antall seksjoner som skal behandles.
- Påfør den sekundære antistoffløsningen (200 μL) på hver brønn i glideholdersettet. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask som beskrevet i trinn 5.5.
- For inkubering med avidin-biotinkompleksperoksidase (ABC / HRP-kompleks, se materialtabell), klargjør reagenset 30 minutter før bruk. Påfør ABC / HRP kompleks løsning (200 μL) i hver brønn i glideplateholdersettet. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Vask som beskrevet i trinn 5.5.
6. Utvikling med DAB-kromogen
FORSIKTIG: DAB er et potensielt kreftfremkallende stoff. Som et resultat er passende omsorg nødvendig mens du arbeider med dette reagenset, inkludert øyevern, laboratoriefrakker, hansker og gode laboratorieprosedyrer. Kast etter lokale forskrifter.
- Fortynn kromogen i henhold til produsentens instruksjoner (se materialfortegnelse) umiddelbart før bruk. Påfør kromogenoppløsningen (400 μL) på hver brønn i glideplatesettet.
- Inkuber i opptil 30 minutter ved romtemperatur. I PrPSc-positive seksjoner er en 10 minutters inkubasjonsperiode vanligvis tilstrekkelig.
- Fjern den gjenværende kromogenoppløsningen ved å vaske lysbildene i destillert vann. Fjern lysbildene fra dekkplateholderne og legg dem i en plastbeholder med destillert vann.
7. Hematoksylin motfarging
- Dypp fargekurven i rustfritt stål med seksjonene i hematoksylinløsningsbadet (se materialfortegnelse) i 1 min. Skyll forsiktig i kaldt rennende vann i 10 min eller lunkent vann i 5 min.
- Dehydrer seksjonene ved å plassere dem i 90% etanol i 1 min, etterfulgt av ett bad i absolutt etanol i 1 min. Plasser deretter lysbildene i et xylenbad i 1 min.
- Monter seksjonene med et kommersielt tilgjengelig monteringsmedium (se Materialfortegnelse).
MERK: Disse trinnene utføres i en kjemisk avtrekkshette ved romtemperatur (19 °C - 24 °C). Denne prosedyren inkluderer en testoppføring (tilleggsfil 1) for registrering av fullføringen av alle trinnene, utstyret som brukes og laboratorieteknikeren. I tillegg er et regneark (tilleggsfil 2) designet for enkelt å bestemme volumene av reagensene i henhold til antall seksjoner i hver analyse, arbeidsfortynningene og produsentens instruksjoner, samt å registrere romtemperatur, utstyr og reagenspartier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gitt at ikke-spesifikk immunmerking er mulig, er det viktig å fastslå nivået av uspesifikk immunmerking hos kjente TSE-negative kontrolldyr. Dette er et viktig skritt for å tolke spesifikk PrPSc-immunmerking 7 (figur 2) riktig. Ikke-målmerking av anti-PrP-antistoffer har blitt observert å forekomme som diskret intranevronal finpartikkelfarging (tydeligere i hypoglossalkjernen og tilbehørskileatkjernen), uregelmessige finlineære flekktråder i nevropilen (STN, V, olivariekjernen, tilbehørskileatkjernen, lateral faskulær kjerne, retikulær dannelse dorsal til ovariekjernene og arealpostrema)12 , diffus ikke-partikulær merking i noen områder med grå og hvit substans, og diffus cytoplasmatisk merking av nevroner13 (figur 3).
Basert på flere studier kan spesifikk, målrettet PrP Sc-immunmerking finnes i mange forskjellige typer, avhengig av TSE-stammen, vertsarten og prnp-genotypen. Følgende PrPSc-typer er beskrevet (gjennomgått av Orge et al.5): Intraneuronal; Intraglial; Stjerne; Perivaskulær; Subpial; Subependimal; Lineær; Fin granulær; Aggregater (eller grove granulære, grove partikler til koalescerende og moslignende); perineuronal; Plakklignende (eller plakk, vaskulære plakk); Punktere; Globular.
Figur 2: Representative bilder etter immunmerking for PrPSc av vevssnitt fra ikke-infiserte kontroller og prioninfiserte dyr med BSE, klassisk skrapesyke, atypisk skrapesyke og CWD. (A,B,C) Avsnitt fra negative kontroller av henholdsvis storfe, sau og hjortevilt; (D) BSE positiv: granulære PrPSc innskudd i nevropilen av DVN og (E) STN; (F) Sauer klassisk skrapesyke positiv: granulær PrPSc i nevropilen og intraneuronal i DVN og (G) stellat PrPsc i retikulær formasjon; (H) Sauetypisk skrapesyke: granulær PrP Sc i nevropilen av V i obex-regionen, granulær ved molekylære (m) og (I) granulære (g) lag av cerebellum og (J) punktert (pil) og kuleformet (pilspiss) PrPSc ved hvit substans i hjernestammen; (K) CWD: granulær PrPSc ved V og (L) retikulær dannelse og perivaskulær ved retikulær dannelse. For A, B, C og D- skala bar = 50 μm; E, F, G, H og L- Skala bar = 20 μm; I og K- Skala bar = 1 mm; J- Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder som viser eksempler på immunfargingsartefakter observert etter PrPSc IHC-prosedyren. (A) Diffus neuropil bakgrunn (DVN). (B) Diffus cytoplasmatisk (hodepil) merking av nevroner (retikulær dannelse). (C) Artiffaktiske kromogenavsetninger (piler) (retikulær dannelse). (D) Uregelmessige fine linjer (piler) av farging i nevropilen (retikulær formasjon). Prøver av PrPSc negative storfesnitt fra immunhistokjemi teknisk ferdighetstesting organisert av European Reference Laboratory for TSEs. A og B- Skala bar = 20 μm; C og D- Skala bar = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1 oppsummerer beskrivelsen av immunmerkede PrPSc-typer observert i BSE, klassisk og atypisk skrapesyke og CWD for positiv diagnose og etablerte kriterier for negative, inkonklusive og uegnede resultater11 og gjennomgått av Orge et al.5.
Tabell 1: Sammendrag av PrPSc-typer observert i BSE, klassisk og atypisk skrapesyke og CWD for positiv diagnose, og kriterier for negative, inkonklusive og uegnede resultater. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: Skjema som fungerer som INIAV "TSE Immunohistochemical test record". Oppgaven fullføres når hvert trinn i IHC-protokollen fullføres og sertifiseres av teknikeren som utfører den respektive oppgaven. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Regneark for klargjøring av reagens for TSE immunhistokjemisk protokoll. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TSE er potensielle zoonotiske sykdommer. Etter fremveksten av BSE i 1986 i Storbritannia, ble Portugal en av EUs medlemsstater med en høyere forekomst av denne sykdommen14,15. For å kontrollere denne sykdommen, andre TSE som har dukket opp (klassisk og atypisk skrapesyke, BSE-varianter, og for tiden overvåking av skrantesyke hos hjortedyr), ble overvåkingsmekanismer utviklet av Generaldirektoratet for mat og veterinær (DGAV) og Nasjonalt institutt for landbruks- og veterinærforskning, IP (INIAV) som utfører TSE-diagnosen som TSE National Veterinary Laboratory. Dette laboratoriet følger de anbefalte biosikkerhets BSL-3-fasilitetene og praksis6 i håndtering av potensielle prioninfiserte prøver av vev fra storfe, små drøvtyggere og hjortedyr forbundet med TSE-overvåking. Immundeteksjon av PrPSc ved immunhistokjemi (IHC) og/eller vestlige immunoblotmetoder (WB) av encephalon og lymfoide vev er referansemetodene for å bekrefte diagnosen TSE1.
IHC-teknikken er et nyttig komplementært verktøy for diagnostisering og anatomopatologisk undersøkelse innen veterinær- og humanmedisin. Flere kritiske punkter er identifisert, og i praksis er det nødvendig å justere i hvert laboratorium for hver dyreart, antistoffet som brukes, og også de forskjellige vevene som er testet16,17. Fiksering, antigeninnhenting, bakgrunn og artefakter, i tillegg til typen antistoff som brukes (monoklonal versus polyklonal, klonen som brukes, animalsk opprinnelse) og testede dyrearter, er eksempler på faktorer som må kontrolleres og standardiseres riktig i hvert laboratorium slik at de endelige resultatene oppnådd med immunhistokjemi vil bli tolket riktig som spesifikk immunmerking2, 17.
Det nåværende arbeidet presenterte protokollen som ble fulgt i TSE National Reference Laboratory i Portugal, med kritiske punkter og all referansemetodikk laget for å sikre riktig diagnose av TSE-sykdommer. IHC-resultatene avhenger av kvaliteten på prøven, som må inkludere målstedene for TSE. Mangelen på disse TSE-målstedene sammen med fraværet av spesifikk PrPSc-immunmerking, er en viktig begrensning av denne metoden for å sikre en diagnose. Selv i tilfeller der frysing eller autolyse fremmer artefakter, er det mulig å foreta en avgjørende diagnose av hvorvidt en TSE er tilstede hvis disse målstedene er tilstede i prøven. Videre indikerer identifiseringen av immunfarging i ikke-spesifikke mål i forskjellige nevronvev, basert på daglig observasjon av negative og positive kontroller som alltid har blitt introdusert når denne teknikken utføres, kvaliteten på protokollen produsert og presentert her og årsaken til sertifiseringen 5,12,13.
Som mulige hendelser fremheves tap av vevsseksjoner under hydrert autoklavering og/eller fjerning av dekkplateholderne, tilstedeværelsen av bobler fanget mellom lysbildene og dekkplatene, og utilstrekkelig fortynning av reagensene. For å overvinne disse hendelsene anbefales det å bruke positivt ladede mikroskoplysbilder innen utløpsdatoen og som er godt lagret, klipp vevsseksjonene forsiktig med dekselplatene, bruk kalibrert utstyr, standardiser reagensprepareringsarket (tilleggsfil 2) og test immunmerkingsbatchreagenser før bruk.
Beskrivelsen av nye TSE-varianter, nemlig atypisk skrapesyke, validerer også betydningen av en standard IHC-teknikk i denne diagnosen. Med denne teknikken er det mulig å observere eksistensen av forskjellige mønstre for PrP Sc-immunfarging, avhengig av prionstammen, vertsarten og prnp-genotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne artikkelen ble finansiert av prosjektet POCI-01-0145-FEDER-029947 "Risikovurdering av kronisk sløsende sykdom i Portugal" støttet av FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Også forfatterne av forskningsenheten CECAV mottok finansiering fra FCT, under prosjektet UIDB / CVT / 0772/2020.Vi takker Bruce C. Campbell, forskningsdirektør (pensjonert), Western Regional Research Center, USDA, for hans hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
References
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A.
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Orge, L., et al.
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al.
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F.
- Pires, M. A., et al.
