Detecção de Proteína Priônica Anormal por Imunohistoquímica

Summary

A imunomarcação de proteínas priônicas anormais usando protocolos de imunohistoquímica requer amostras específicas e metodologias de preparação de anticorpos anti-PrP. O presente protocolo descreve os principais passos na remoção de epítopos para garantir a imunomarcação adequada de PrP e minimizar a coloração de fundo inespecífica. Além disso, essa abordagem considera medidas de biossegurança ao realizar estudos imunohistoquímicos com os tecidos infectados por príons.

Abstract

As proteínas priônicas anormais (PrP^Sc) são a isoforma associada à doença da proteína priônica celular e marcadores diagnósticos de encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET). Estas doenças neurodegenerativas afectam os seres humanos e várias espécies animais e incluem o tremor epizoótico, a encefalopatia espongiforme bovina zoonótica (EEB), a doença crónica dos cervídeos (CWD) e a recém-identificada doença do prião dos camelos (DPC). O diagnóstico de EET baseia-se na imunodetecção de^{PrP Sc} pela aplicação dos métodos de imunohistoquímica (IHQ) e imunoblot ocidental (WB) em tecidos encéfalos, ou seja, o tronco cerebral (nível obex). A imunoistoquímica é um método amplamente utilizado que utiliza anticorpos primários (monoclonais ou policlonais) contra antígenos de interesse em células de um corte tecidual. A ligação anticorpo-antígeno pode ser visualizada por uma reação de cor que permanece localizada na área do tecido ou célula onde o anticorpo foi alvo. Assim, nas doenças priônicas, como em outros campos de pesquisa, as técnicas de imuno-histoquímica não são utilizadas apenas para fins diagnósticos, mas também em estudos de patogênese. Tais estudos envolvem a detecção dos padrões e tipos de^{PrP Sc} a partir daqueles descritos anteriormente para identificar as novas cepas de príons. Uma vez que a EEB pode infectar seres humanos, recomenda-se que sejam utilizadas instalações e/ou práticas de laboratório de biossegurança nível 3 (BSL-3) para manusear bovinos, pequenos ruminantes e amostras de cervídeos incluídas na vigilância das EET. Além disso, recomendam-se, sempre que possível, equipamentos de contenção e dedicados a príons para limitar a contaminação. O procedimento de IHQ^{PrP Sc} consiste em uma etapa de desmascaramento de epítopos de ácido fórmico também atuando como uma medida de inativação do príon, uma vez que os tecidos fixados em formalina e emblocados em parafina usados nesta técnica permanecem infecciosos. Ao interpretar os resultados, deve-se ter cuidado para distinguir a imunomarcação não específica da rotulação alvo. Para esse propósito, é importante reconhecer artefatos de imunomarcação obtidos em animais controles conhecidos negativos para EET para diferenciá-los de tipos específicos de imunomarcação^{PrP Sc} , que podem variar entre cepas de EET, espécie hospedeira e genótipo prnp , descritos mais detalhadamente neste artigo.

Introduction

De acordo com a hipótese do príon, a isoforma anormal (^{PrP Sc}) é o componente primário, ou único, do agente infeccioso nas encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET). A confirmação para o diagnóstico de EET baseia-se na imunodetecção de^{PrP Sc} por meio da aplicação de protocolos de imunohistoquímica (IHQ) e/ou métodos de immunoblot ocidental (WB) de tecidos encéfalos¹.

A imunoistoquímica é um método que emprega anticorpos monoclonais ou, em alguns casos, policlonais (como anticorpos primários) como primeiro passo na imunomarcação de antígenos especificamente direcionados de interesse localizados em células de um corte tecidual. Qualquer ligação anticorpo-antígeno primário eficaz é então visualizada usando anticorpos secundários específicos para os anticorpos primários. Esses anticorpos secundários são conjugados a enzimas, como a peroxidase de raiz forte (HRP) ou a fosfatase alcalina (FA). A visualização é então obtida pela adição de um substrato a essas enzimas, produzindo produtos de cor insolúveis localizados em áreas onde os anticorpos primários estão ligados aos antígenos alvo. Uma melhor visualização pode ser obtida pela contracoloração, em que um corante é usado para criar um contraste entre tecido imunomarcado e não imunomarcado².

Com a IHQ usando tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE), a fixação de formalina pode anular a eficácia dos anticorpos primários devido à reticulação por formaldeído e ao aquecimento e desidratação durante a inclusão da parafina. Estas alteram a conformação das proteínas, destruindo, desnaturando ou mascarando os epítopos, diminuindo ou anulando sua detecção³. Como tal, isso requer recuperação de antígeno (AR). As técnicas de RA interrompem a ligação cruzada de grupos químicos relacionados ao formaldeído nas moléculas antigênicas, restaurando ou desmascarando a conformação antígeno-proteína original. Isso resulta na recuperação da afinidade anticorpo-antígeno (epítopo) para a imunomarcação. A eventual eficácia da RA depende das qualidades do antígeno alvo e/ou do anticorpo primário².

A recuperação do antígeno induzido pelo calor (epítopo) (HIER) é um procedimento do AR³ e é usado rotineiramente para detecção de IHQ^{PrP Sc} , conforme descrito aqui. A imunoistoquímica é essencial para o diagnóstico e utilizada em laboratórios de pesquisa para determinar a distribuição tecidual de um antígeno associado à patologia. É amplamente utilizada no diagnóstico e pesquisa de câncer, neurociências, doenças infecciosas⁴, entre outras. Para EET, a IHQ desempenha um papel importante no diagnóstico e na pesquisa para confirmar e investigar a distribuição de^{PrP Sc} em hospedeiros naturais e modelos experimentais. A IHQ contribui para estudos de patogênese priônica e análise de tipos e padrões de deposição de^{PrP Sc} , ou seja, em tecidos^neurais5, para detectar desvios de infecções rotineiramente descritas e identificar possíveis novas cepas de príons.

Uma vez que os priões da encefalopatia espongiforme bovina (EEB) podem infectar seres humanos, certos protocolos laboratoriais envolvidos no trabalho com a EEB podem exigir a utilização de instalações e práticas de BSL-3⁶. Estes incluem a utilização de um recipiente secundário selado para transportar potenciais amostras de tecidos infectados com EEB dentro do instituto e do laboratório. Inclui também a designação de áreas de contenção e de equipamento dedicado ao prião para a investigação e análise da BSE, sempre que possível. Isso é feito para evitar a contaminação fora da área de trabalho e proporcionar um espaço confinado, uma vez que os procedimentos de descontaminação se tornam necessários.

Assim, o Laboratório de Patologia do INIAV segue as instalações^{e práticas de} nível de biossegurança 3 (BSL-3) recomendadas 6 para gerenciar amostras potenciais de tecidos infectados por príons de bovinos, pequenos ruminantes e cervídeos associados à vigilância de EET.

Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina incluídos em procedimentos de diagnóstico ou pesquisa de EET, especialmente no sistema nervoso central, podem ser potencialmente infecciosos. Assim, esses tecidos fixados devem ser tratados com ácido fórmico para reduzir a infectividade dos príons, se presentes, antes do processamento do tecido. Isso é realizado através da colocação de tecidos fixos e aparados (aproximadamente 2-4 mm de espessura) em um de processamento. O é então imerso em ácido fórmico a 98% (por 1 h). Após a imersão, os com tecidos são lavados em água corrente da torneira por 30 min e retornam ao fixador antes do processamento posterior. Se os cortes de tecido não forem tratados antes do processamento, os cortes de tecido pós-microtômicos devem ser imersos em ácido fórmico não diluído por pelo menos 5 minutos antes da coloração histológica⁷. O protocolo IHQ para PrP^Sc inclui uma etapa rotineira de desmascaramento de epítopos de ácido fórmico, servindo também para inativar príons⁷. Após essas etapas de inativação do príon, os tecidos fixados resultantes podem então ser processados em BSL-2 usando práticas BSL-2 padrão.

O requisito mínimo de amostragem de tecidos para o diagnóstico de EET em qualquer animal incluído na vigilância de EET é a recolha do tronco encefálico (ao nível do obex). Além disso, para a detecção de EEB e tremor epizoótico atípicos, recomenda-se que parte do cerebelo também seja coletada ^1,8. Para o diagnóstico de DC, tanto os linfonodos do tronco encefálico (obex) quanto os retrofaríngeos devem ser testados, pois a PrP Sc pode ser detectada em tecidos linfoides sem^{PrP Sc} detectável no ^obex9, revisada por Machado et ^al.10.

A porção obex do tronco encefálico inclui os locais-alvo diagnósticos da EET, a saber, o núcleo vagal dorsal (DVN), o núcleo do trato solitário (NST) e o núcleo do trato espinhal do nervo trigêmeo (V). Estas zonas apresentam consistentemente acumulação bilateral de^{PrP Sc} , mesmo nas fases iniciais da EEB e do tremor epizoótico clássico. Nos casos clínicos de EET avançada, todas as áreas de substância cinzenta no tronco encefálico apresentam ampla distribuição de^{PrP Sc11}.

Antes da secção e processamento, as amostras de encéfalo são avaliadas (Figura 1) para verificar o grau de autólise e a presença de qualquer dano tecidual que possa comprometer a adequação da amostra para o diagnóstico confirmatório baseado em IHQ8. Para validar a integridade dos protocolos preparativos e dos resultados analíticos, as amostras de tecido positivas e negativas para EET são incluídas como controles em conjunto com a preparação de tecidos de casos de teste em cada ensaio.

Figura 1: O procedimento de IHC^{PrP Sc} . Representação mostrando o passo-a-passo do procedimento de IHQ^{PrP Sc} , desde a desparafinização dos cortes teciduais até a eventual imunomarcação e detecção (FFPE - Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab - anticorpo monoclonal; DAB - 3,3' diaminobenzidina). Esta figura foi criada em BioRender.com. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

O procedimento IHC aqui descrito é um componente do projeto de pesquisa FAIRJ-CT98-7021, "O estabelecimento de uma rede europeia para a vigilância de EET de ruminantes e a padronização e harmonização do processo e critérios para a identificação de casos suspeitos". Segue os critérios diagnósticos definidos pela Organização Mundial de Saúde Animal, WOAH (anteriormente denominado Office International des Épizooties, OIE)¹ e Laboratório Europeu de Referência para EET em^animais8,11. O procedimento IHC descrito também é acreditado de acordo com NPISOIEC17025 (requisitos gerais para a competência de laboratórios de ensaio e calibração) desde 2008. Tal acreditação implica um sistema de gestão de alta qualidade incorporando procedimentos operacionais padrão, pessoal qualificado, equipamentos calibrados com precisão, controle rigoroso de dados e reagentes, participação em ensaios de proficiência interlaboratorial, trabalho não conforme e avaliação de risco para aumentar a eficácia do sistema de gestão, alcançar melhores resultados e prevenir riscos laboratoriais. Controles teciduais infectados com príons com EEB, tremor epizoótico clássico, tremor epizoótico atípico e CWD foram coletados (fixados em formalina, embebidos em parafina, FFPE) de várias fontes. As secções de bovinos e ovinos são provenientes dos casos diagnosticados no âmbito de um programa de vigilância de EET animal. As seções de CWD são provenientes das amostras de controle gentilmente fornecidas pela professora Stefanie Czub (Canadian Food Inspection Agency, National Center for Animal Diseases) em 2003 e do CWD Proficiency testing 2008 organizado pelo Laboratório Europeu de Referência para EET (APHA, Weybridge).

1. Secção dos tecidos e preparação das lâminas

1. Corte cortes de tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) a 3-5 μm de espessura usando um micrótomo.
2. Flutuar secções em água purificada a uma temperatura aproximadamente 10 °C abaixo do ponto de fusão da parafina utilizada. Levante as seções da água para lâminas de microscópio especialmente tratadas (ver Tabela de Materiais). Deixe a água escorrer completamente das lâminas.
3. Incubar as lâminas durante a noite a 50 °C para aumentar a adesão das lâminas dos tecidos.
   NOTA: É preferível preparar tecidos recém-seccionados para protocolos de IHQ, embora as seções de controle positivo e negativo de EET possam ser preparadas com antecedência e armazenadas. As etapas 2 a 4 devem ser realizadas em uma capela de fumaça química.

2. Desparafinização e reidratação

1. Coloque as lâminas com as seções de tecido em um cesto de coloração de aço inoxidável (consulte a Tabela de Materiais). Mergulhe o cesto em um banho de xileno (recipiente de coloração de aço inoxidável) por 3 min, retire e mergulhe novamente.
2. Retire o xileno e reidrate as seções mergulhando-as em um banho absoluto de etanol por 3 min. Retire e mergulhe mais uma vez.
3. Seque as seções ao ar e coloque em banho de etanol 90% por 1 min. Transfira para um banho de etanol a 70% por mais um minuto, seguido de uma transferência final para um banho de etanol a 50% por 1 min. Para cada tratamento em banho de etanol, agite suavemente o cesto deslizante duas vezes e escorra o cesto antes da próxima transferência.

3. Recuperação de epítopos

1. Imergir cuidadosamente os cortes de tecido em ácido fórmico a 98% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Enxaguar as seções em água corrente por 5 min, seguido de enxaguar duas vezes em água destilada.
   CUIDADO: O ácido fórmico é altamente corrosivo. Óculos de proteção e luvas devem ser usados.
2. Execute a recuperação de antígeno induzida pelo calor (HIER) seguindo as etapas abaixo.
   NOTA: Esta etapa é realizada por autoclavagem hidratada a 121 °C por 30 min em uma câmara de pressão específica (ver Tabela de Materiais).
   1. Pré-aqueça o tampão citrato (10 mM, pH 6,1, ver Tabela de Materiais) a 98 °C por cerca de 20 min em um recipiente de coloração de aço inoxidável colocado dentro da câmara de pressão preenchida com 500 mL de água destilada.
      OBS: Para o presente estudo, o programa Set Point foi 1 (SP1) para o equipamento específico utilizado.
   2. Após o alarme indicar que o equipamento atingiu o tempo e a temperatura programados, mergulhe o cesto com lâminas e inicie o programa para o Set Point 2 (121°C por 30 min). Para fins de controle de qualidade, coloque uma seção de fita indicadora de autoclave adesiva no cesto para monitorar a temperatura e a pressão e registre a pressão inicial e final deste programa.
   3. Se o número de lâminas a serem imunomarcadas não atingir a capacidade da cesta, use lâminas limpas e em branco para ocupar as posições vazias. Após o término do programa, permitir o retorno passivo da câmara à pressão ambiente (pelo menos 30 min).
      Observação : durações mais longas podem reduzir a coloração de fundo não específica.
   4. Transfira cuidadosamente o cesto de corrediças para um recipiente de coloração de aço inoxidável cheio de água destilada por 5 minutos.

4. Inativação da peroxidase endógena

1. Imergir o cesto de lâminas contendo as seções da amostra em um banho de peróxido de hidrogênio a 3% (H 2 O₂) em metanol por 30 min. Enxágue as seções em água corrente (5 min). Escorra e mergulhe as seções em 1x solução salina tamponada com Tris (TBS) por mais 5 min.

5. Imunodetecção

NOTA: Para o presente estudo, a imunodetecção foi executada usando o formato de gap^{capilar 7} usando um sistema de montagem de clipe de lâmina disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais). Outros sistemas de lâminas de imuno-histoquímica também são aplicáveis.

1. Coloque cada lâmina em um suporte de placa de cobertura disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais) pré-umedecido com TBS, evitando bolhas, com o lado do tecido voltado para o suporte e as bordas da lâmina coincidindo com os dois pontos inferiores do suporte.
   1. Segure o conjunto do suporte deslizante entre o polegar e o indicador, com um dedo na parte superior da lâmina de amostra e o outro na parte inferior do suporte. Em seguida, coloque a montagem na galeria do sistema.
   2. Para garantir que o conjunto esteja bem montado, preencha o poço entre a lâmina de amostra e o suporte com TBS, que não deve transbordar imediatamente. A partir deste ponto, certifique-se de que aproximadamente 80 μL de TBS devem ser retidos entre o suporte e a lâmina. Não deixe as seções secarem.
2. Uma vez no sistema, para diminuir a coloração de fundo antes do tratamento com anticorpo primário (anti-PrP, ver Tabela de Materiais), pré-incubar as lâminas de amostra com 20% de soro normal da mesma espécie que o hospedeiro do anticorpo secundário que está sendo usado para imunomarcação (no presente caso, soro de cavalo) por 30 minutos em TBS.
3. Descongelar o número de alíquotas de anticorpos a utilizar em função da espécie animal em análise, o número de secções de amostra a examinar e a quantidade de diluição de trabalho.
   NOTA: Para obter melhores resultados, use 10% de soro normal da mesma espécie que a fonte das soluções de anticorpos secundários e anticorpos primários. Se possível, para melhores resultados, a fonte hospedeira do soro normal e do anticorpo secundário deve ser da mesma espécie.
4. Sem lavar as seções, aplicar a solução de anticorpos primários diretamente (200 μL) em cada poço do conjunto de suporte deslizante e incubar por 60 min à temperatura ambiente.
5. Para a lavagem, encha os poços dos conjuntos de suporte deslizante com TBS e aguarde 5 min.
6. Diluir o anticorpo secundário biotinilado (monoclonal antimurino Horse Ab, ver Tabela de Materiais) a 1/200 em TBS com 10% de soro de cavalo. Preparar o volume necessário em função do número de secções a tratar.
7. Aplicar a solução de anticorpos secundários (200 μL) em cada poço do conjunto de suporte deslizante. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
8. Lavar conforme descrito no passo 5.5.
9. Para incubação com peroxidase do complexo avidina-biotina (complexo ABC/HRP, ver Tabela de Materiais), prepare o reagente 30 minutos antes da utilização. Aplicar a solução complexa ABC/HRP (200 μL) em cada poço do conjunto de suporte da placa deslizante. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
10. Lavar conforme descrito no passo 5.5.

6. Desenvolvimento com cromogênio DAB

CUIDADO: O DAB é um potencial cancerígeno. Como resultado, cuidados adequados são necessários ao trabalhar com esse reagente, incluindo proteção ocular, jalecos, luvas e bons procedimentos laboratoriais. Descarte de acordo com as normas locais.

1. Diluir o cromógeno de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais) imediatamente antes da utilização. Aplicar a solução de cromógeno (400 μL) em cada poço do conjunto de placas deslizantes.
2. Incubar por até 30 min à temperatura ambiente. Em seções positivas para^{PrP Sc} , um período de incubação de 10 min é geralmente suficiente.
3. Retire a solução de cromogénio residual lavando as lâminas em água destilada. Retire as lâminas dos suportes da placa de cobertura e coloque-as em um recipiente plástico com água destilada.

7. Contracoloração com hematoxilina

1. Imergir o cesto de coloração de aço inoxidável com as seções no banho de solução de hematoxilina (ver Tabela de Materiais) por 1 min. Enxágue suavemente em água corrente fria por 10 min ou água morna por 5 min.
2. Desidratar as seções colocando-as em etanol 90% por 1 min, seguido de um banho em etanol absoluto por 1 min. Em seguida, coloque as lâminas em um banho de xileno por 1 min.
3. Monte as seções com um meio de montagem disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Estas etapas são realizadas em um exaustor de fumaça química à temperatura ambiente (19 °C-24 °C). Esse procedimento inclui um registro de teste (Arquivo Suplementar 1) para registrar a conclusão de todas as etapas, o equipamento utilizado e o técnico de laboratório. Além disso, uma planilha (Arquivo Suplementar 2) foi projetada para determinar facilmente os volumes dos reagentes de acordo com o número de seções em cada ensaio, as diluições de trabalho e as instruções do fabricante, bem como para registrar a temperatura ambiente, o equipamento e os lotes de reagentes.

Representative Results

Dado que a imunomarcação alvo não específica é possível, é importante determinar o nível de imunomarcação inespecífica em animais controles conhecidos negativos para EET. Esse é um passo importante para interpretar adequadamente a imunomarcação específica para^{PrP Sc7} (Figura 2). Observou-se que a marcação não-alvo por anticorpos anti-PrP ocorre como discreta coloração intraneuronal de partículas finas (mais evidente no núcleo do hipoglosso e no núcleo cuneado acessório), fios lineares finos irregulares de coloração no neurópilo (STN, V, núcleo olivar, núcleo cuneado acessório, núcleo fascicular lateral, formação reticular dorsal aos núcleos olivares e área pós-rema)¹² , marcação difusa de não-particulados em algumas áreas de substância cinzenta e branca e marcação citoplasmática difusa de neurônios¹³ (Figura 3).

Com base em vários estudos, a imunomarcação específica e direcionada para^{PrP Sc} pode ser encontrada em muitos tipos diferentes, dependendo da cepa de EET, da espécie hospedeira e do genótipo do prnp . Os seguintes tipos de^{PrP Sc} foram descritos (revisados por Orge et ^al.5): Intraneuronal; Intraglial; Estrelado; Perivascular; Subpial; Subependim; Linear; Granulado fino; Agregados (ou granulados grosseiros, particulados grosseiros a coalescentes e semelhantes a musgos); Perineuronal; Plaque-Like (ou placas, placas vasculares); Puntiforme; Esférico.

Figura 2: Imagens representativas após imunomarcação para^{PrP Sc} de cortes de tecido de controles não infectados e animais infectados com príons com EEB, tremor epizoótico clássico, tremor epizoótico atípico e DCT. (A,B,C) Cortes de controles negativos de bovinos, ovinos e cervídeos, respectivamente; (D) BSE positivo: depósitos granulares de^{PrP Sc} no neurópilo de DVN e (E) STN; (F) Scrapie clássico de ovinos positivo:^{PrP Sc} granular no neurópilo e intraneuronal no DVN e (G) PrP^sc estrelado na formação reticular; (H) Tremor epizoótico atípico de ovinos: PrP Sc granular no neurópilo de V na região obexal, granular nas camadas molecular (m) e (I) granular (g) do cerebelo e (J) puntiforme (seta) e globular (cabeça de seta)^{PrP Sc} na substância branca do tronco encefálico; (K) DC: PrP^Sc granular em V e (L) formação reticular e perivascular na formação reticular. Para A, B, C e D- Barra de escala = 50 μm; E, F, G, H e L- Barra de escala = 20 μm; I e K- Barra de escala = 1 mm; J- Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens representativas mostrando exemplos de artefatos de imunomarcação observados após o procedimento de imunofluorescência magnética (IHQ)^{PrP Sc} . (A) Fundo difuso do neurópilo (DVN). (B) Marcação citoplasmática difusa (seta cabeça) dos neurônios (formação reticular). (C) Depósitos cromógenos artefatuais (setas) (formação reticular). (D) Linhas finas irregulares (setas) de coloração no neurópilo (formação reticular). Amostras de cortes bovinos^{PrP Sc} negativos provenientes de ensaios de proficiência técnica em imunohistoquímica organizados pelo Laboratório Europeu de Referência para EET. A e B- Barra de escala = 20 μm; C e D- Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Tabela 1 resume a descrição dos tipos de^{PrP Sc} imunomarcados observados no EEB, no tremor epizoótico clássico e atípico e na DCT para o diagnóstico positivo e estabelece critérios para resultados negativos, inconclusivos e inadequados¹¹ e revisados por Orge et al.5.

Tabela 1: Resumo dos tipos de^{PrP Sc} observados no EEB, tremor epizoótico clássico e atípico e DCT para diagnóstico positivo e critérios para resultados negativos, inconclusivos e inadequados. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Formulário que serve como o INIAV "Registro de teste imunohistoquímico de EET". A tarefa é concluída à medida que cada etapa do protocolo IHC é concluída e certificada pelo técnico que executa a respectiva tarefa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 2: Planilha de preparação de reagentes para protocolo de imunohistoquímica do TSE. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

As EET são doenças zoonóticas potenciais. Após o surgimento da BSE em 1986 no Reino Unido, Portugal tornou-se um dos Estados-Membros da União Europeia com maior incidência desta doença^14,15. Para controlar esta doença, surgiram outras EET (tremor epizoótico clássico e atípico, variantes da EEB e, atualmente, a vigilância da doença crónica emaciante nos cervídeos), foram desenvolvidos mecanismos de vigilância pela Direção-Geral da Alimentação e Veterinária (DGAV) e pelo Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária, IP (INIAV) que realiza o diagnóstico de EET como o Laboratório Nacional Veterinário de EET. Este laboratório segue as instalações^{e práticas de} biossegurança BSL-3 recomendadas 6 no manejo de amostras potencialmente infectadas por príons de tecidos de bovinos, pequenos ruminantes e cervídeos associados à vigilância de EET. A imunodetecção de^{PrP Sc} por imunohistoquímica (IHQ) e/ou métodos de western immunoblot (WB) de encéfalo e tecidos linfoides são os métodos de referência para confirmar o diagnóstico de EET¹.

A técnica de IHQ é uma ferramenta complementar útil para o diagnóstico e investigação anatomopatológica em medicina veterinária e humana. Vários pontos críticos são identificados e, na prática, é necessário ajustar em cada laboratório, para cada espécie animal, o anticorpo utilizado e também os diferentes tecidos testados^16,17. A fixação, a recuperação antigênica, o background e os artefatos, além do tipo de anticorpo utilizado (monoclonal versus policlonal, clone utilizado, origem animal) e da espécie animal testada, são exemplos de fatores que precisam ser devidamente controlados e padronizados em cada laboratório para que os resultados finais obtidos com a imunohistoquímica sejam adequadamente interpretados como imunomarcação ^{específica2, 17º}.

O presente trabalho apresentou o protocolo seguido no Laboratório Nacional de Referência em EET em Portugal, com os pontos críticos e toda a metodologia de referência feita para garantir o correto diagnóstico das doenças das EET. Os resultados da IHQ dependem da qualidade da amostra, que deve incluir os locais de destino para EET. A falta desses sítios alvo de EET, juntamente com a ausência de imunomarcação específica para^{PrP Sc}, é uma limitação importante dessa metodologia para garantir o diagnóstico. Mesmo nos casos em que o congelamento ou a autólise promovem artefatos, é possível fazer um diagnóstico conclusivo da presença ou não de EET se esses locais-alvo estiverem presentes na amostra. Além disso, a identificação de imunomarcação em alvos inespecíficos em diferentes tecidos neuronais, baseada na observação diária de controles negativos e positivos que sempre foram introduzidos sempre que essa técnica é realizada, indica a qualidade do protocolo aqui produzido e apresentado e o motivo de sua certificação 5,12,13.

Como possíveis incidentes, destacam-se a perda de cortes teciduais durante a autoclavagem hidratada e/ou remoção dos suportes da placa-cobertura, a presença de bolhas aprisionadas entre as lâminas e as placas de cobertura e a diluição inadequada dos reagentes. Para superar esses eventos, recomenda-se o uso de lâminas de microscópio carregadas positivamente dentro do prazo de validade e que estejam bem armazenadas, clipar cuidadosamente os cortes de tecido com as placas de cobertura, usar equipamentos calibrados, padronizar a planilha de preparação de reagentes (Arquivo Suplementar 2) e testar reagentes de lote de imunomarcação antes do uso.

A descrição de novas variantes da EET, nomeadamente o tremor epizoótico atípico, também valida a importância de uma técnica padrão de IHQ neste diagnóstico. Com essa técnica, é possível observar a existência de diferentes padrões de imunomarcação para^{PrP Sc} , dependendo da cepa priônica, da espécie hospedeira e do genótipo prnp .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted