Detección de proteína priónica anormal por inmunohistoquímica

Summary

El inmunomarcaje de proteínas priónicas anormales mediante protocolos inmunohistoquímicos requiere metodologías específicas de preparación de muestras y anticuerpos anti-PrP. El presente protocolo describe los pasos clave en el desenmascaramiento de epítopos para garantizar un inmunoetiquetado adecuado de PrP y minimizar la tinción de fondo no específica. Además, este enfoque considera medidas de bioseguridad al realizar estudios inmunohistoquímicos con los tejidos infectados por priones.

Abstract

Las proteínas priónicas anormales (PrP^Sc) son la isoforma asociada a la enfermedad de la proteína priónica celular y los marcadores diagnósticos de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). Estas enfermedades neurodegenerativas afectan a los seres humanos y a varias especies animales e incluyen la tembladera, la encefalopatía espongiforme bovina zoonótica (EEB), la desgaste crónica de los cérvidos (CWD) y la recientemente identificada enfermedad priónica del camello (CPD). El diagnóstico de las EET se basa en la inmunodetección de PrP^Sc mediante la aplicación de métodos de inmunohistoquímica (IHC) e inmunoblot occidental (WB) en los tejidos del encéfalo, es decir, el tronco encefálico (nivel obex). IHQ es un método ampliamente utilizado que utiliza anticuerpos primarios (monoclonales o policlonales) contra antígenos de interés en células de una sección de tejido. La unión anticuerpo-antígeno se puede visualizar mediante una reacción de color que permanece localizada en el área del tejido o célula donde se dirigió el anticuerpo. Como tal, en las enfermedades priónicas, como en otros campos de investigación, las técnicas de inmunohistoquímica no se utilizan únicamente con fines diagnósticos, sino también en estudios de patogénesis. Dichos estudios implican la detección de los patrones y tipos de PrP^Sc a partir de los descritos anteriormente para identificar las nuevas cepas de priones. Como la EEB puede infectar a los seres humanos, se recomienda que se utilicen instalaciones y/o prácticas de laboratorio de bioseguridad de nivel 3 (BSL-3) para manipular muestras de ganado, pequeños rumiantes y cérvidos incluidas en la vigilancia de las EET. Además, se recomiendan equipos de contención y dedicados a priones, siempre que sea posible, para limitar la contaminación. El procedimiento IHC de PrP^Sc consiste en un paso de desenmascaramiento de epítopos de ácido fórmico que también actúa como una medida de inactivación priónica, ya que los tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina utilizados en esta técnica siguen siendo infecciosos. Al interpretar los resultados, se debe tener cuidado para distinguir el inmunomarcaje no específico del etiquetado objetivo. Para este propósito, es importante reconocer los artefactos de inmunomarcaje obtenidos en animales de control TSE-negativos conocidos para diferenciarlos de los tipos específicos de inmunomarcaje PrP^Sc , que pueden variar entre cepas de EET, especies hospedadoras y genotipo prnp , descrito más detalladamente en este documento.

Introduction

Según la hipótesis del prión, la isoforma anormal (PrP^Sc) es el componente primario, o único, del agente infeccioso en las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET). La confirmación para el diagnóstico de EET se basa en la inmunodetección de PrP^Sc mediante la aplicación de protocolos de inmunohistoquímica (IHC) y/o métodos de inmunoblot occidentales (WB) de tejidos de encéfalo¹.

IHQ es un método que emplea anticuerpos monoclonales o, en algunos casos, policlonales (como anticuerpos primarios) como primer paso en la inmunotinción de antígenos de interés específicamente dirigidos localizados en células de una sección de tejido. Cualquier unión primaria efectiva anticuerpo-antígeno se visualiza utilizando anticuerpos secundarios específicos para los anticuerpos primarios. Estos anticuerpos secundarios se conjugan con enzimas, como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP). La visualización se logra agregando un sustrato a estas enzimas, produciendo productos de color insolubles localizados en áreas donde los anticuerpos primarios están unidos a los antígenos objetivo. Se puede lograr una mejor visualización mediante la contratinción, en la que se utiliza un tinte para crear un contraste entre el tejido inmunomarcado y el no inmunomarcado².

Con IHQ utilizando tejidos embebidos en parafina fijados en formalina (FFPE), la fijación de formalina puede anular la efectividad de los anticuerpos primarios debido a la reticulación por formaldehído y el calentamiento y la deshidratación durante la incrustación de parafina. Estos cambian la conformación de las proteínas, destruyendo, desnaturalizando o enmascarando los epítopos, disminuyendo o abrogando así su detección³. Como tal, esto requiere recuperación de antígenos (AR). Las técnicas de AR interrumpen la reticulación del grupo químico relacionado con el formaldehído en las moléculas antigénicas, restaurando o desenmascarando así la conformación antígeno-proteína original. Esto da como resultado la recuperación de la afinidad anticuerpo-antígeno (epítopo) para el inmunomarcaje. La eficacia eventual de la RA depende de las cualidades del antígeno diana y/o del anticuerpo primario².

La recuperación de antígenos (epítopos) inducidos por calor (HIER) es un procedimiento de AR³ y se usa de forma rutinaria para la detección de IHC de PrP^Sc , como se describe en este documento. La IHQ es esencial para el diagnóstico y se utiliza en laboratorios de investigación para determinar la distribución tisular de un antígeno asociado a la patología. Es ampliamente utilizado en el diagnóstico e investigación del cáncer, la neurociencia y las enfermedades infecciosas⁴, entre otros. Para las EET, la IHQ desempeña un papel importante en el diagnóstico y la investigación para confirmar e investigar la distribución de PrP^Sc en huéspedes naturales y modelos experimentales. IHQ contribuye a los estudios de patogénesis de priones y al análisis de los tipos y patrones de depósito de PrP^Sc , es decir, en tejidos neurales⁵, para detectar desviaciones de infecciones descritas rutinariamente e identificar nuevas cepas de priones putativas.

Debido a que los priones de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) pueden infectar a los seres humanos, ciertos protocolos de laboratorio involucrados en el trabajo con la EEB pueden requerir el uso de instalaciones y prácticas BSL-3⁶. Estos incluyen el uso de un recipiente secundario sellado para transportar posibles muestras de tejido infectadas con EEB dentro del instituto y el laboratorio. También incluye la designación de áreas de contención y equipos dedicados a priones para la investigación y el análisis de la EEB siempre que sea posible. Esto se hace para evitar la contaminación fuera del área de trabajo y proporcionar un espacio confinado ya que los procedimientos de descontaminación se hacen necesarios.

En consecuencia, el Laboratorio de Patología del INIAV sigue las instalaciones y prácticas recomendadas de bioseguridad nivel 3 (BSL-3)⁶ para manejar posibles muestras de tejidos infectados por priones de bovinos, pequeños rumiantes y cérvidos asociados con la vigilancia de EET.

Los tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina incluidos en los procedimientos de diagnóstico o investigación de EET, especialmente en el sistema nervioso central, pueden ser potencialmente infecciosos. Por lo tanto, estos tejidos fijos deben tratarse con ácido fórmico para reducir la infectividad de los priones, si están presentes, antes del procesamiento del tejido. Esto se realiza colocando tejidos fijos y recortados (aproximadamente 2-4 mm de espesor) en un casete de procesamiento. El casete se sumerge en ácido fórmico al 98% (durante 1 h). Después de la inmersión, los casetes con pañuelos de papel se lavan en agua corriente del grifo durante 30 minutos y se devuelven al fijador antes de su posterior procesamiento. Si las secciones de tejido no se tratan antes del procesamiento, las secciones de tejido postmicrotómico deben sumergirse en ácido fórmico sin diluir durante al menos 5 minutos antes de la tinción histológica⁷. El protocolo IHC para PrP^Sc incluye un paso rutinario de desenmascaramiento de epítopos de ácido fórmico, que también sirve para inactivar los priones⁷. Después de estos pasos de inactivación de priones, los tejidos fijos resultantes se pueden procesar en BSL-2 utilizando prácticas estándar de BSL-2.

El requisito mínimo de muestreo de tejido para el diagnóstico de EET en cualquier animal incluido en la vigilancia de EET es la recolección del tronco encefálico (a nivel de la ex). Además, para detectar la EEB y la tembladera atípicas, se aconseja que también se recoja parte del cerebelo ^1,8. Para el diagnóstico de CWD, tanto los ganglios linfáticos del tronco encefálico (obex) como los retrofaríngeos deben ser probados, ya que PrP Sc podría detectarse en tejidos linfoides sin PrP^Sc detectable en el obex⁹, revisado por Machado et ^al.10.

La porción obex del tronco encefálico incluye sitios diana de diagnóstico de EET, a saber, el núcleo vagal dorsal (DVN), el núcleo del tracto solitario (STN) y el núcleo del tracto espinal del nervio trigémino (V). Estas zonas presentan sistemáticamente acumulación bilateral de^{PrP Sc} , incluso en las primeras fases de la EEB y la tembladera clásica. En los casos clínicos de EET avanzada, todas las áreas de materia gris dentro del tronco encefálico muestran una distribución generalizada de PrP^{Sc 11}.

Antes de la sección y el procesamiento, las muestras de cerebro se evalúan (Figura 1) para determinar el nivel de autólisis y la presencia de cualquier daño tisular que pueda comprometer la idoneidad de la muestra para el diagnóstico confirmatorio basado en IHQ⁸. Para validar la integridad de los protocolos preparatorios y los resultados analíticos, las muestras de tejido positivas y negativas para EET se incluyen como controles junto con la preparación de tejidos a partir de casos de prueba en cada ensayo.

Figura 1: El procedimiento IHC de PrP^Sc . Representación que muestra la secuencia paso a paso del procedimiento IHC de PrP^Sc desde la desparafinización de secciones de tejido hasta la eventual inmunotinción y detección (FFPE - Formalin-fixed paraffin-embedded; Mab - anticuerpo monoclonal; DAB - 3,3' diaminobencidina). Esta figura fue creada en BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

El procedimiento IHQ descrito en este documento es un componente del proyecto de investigación FAIRJ-CT98-7021, "El establecimiento de una red europea para la vigilancia de las EET de rumiantes y la normalización y armonización del proceso y los criterios para la identificación de casos sospechosos". Sigue los criterios diagnósticos definidos por la Organización Mundial de Sanidad Animal, WOAH (anteriormente denominada Office International des Épizooties, OIE)¹ y el Laboratorio Europeo de Referencia para las EET animales ^8,11. El procedimiento IHC descrito también está acreditado de acuerdo con NPISOIEC17025 (requisitos generales para la competencia de los laboratorios de prueba y calibración) desde 2008. Dicha acreditación implica un sistema de gestión de alta calidad que incorpora procedimientos operativos estándar, personal calificado, equipo calibrado con precisión, control riguroso de datos y reactivos, participación en ensayos de competencia entre laboratorios, trabajo no conforme y evaluación de riesgos para aumentar la efectividad del sistema de gestión, lograr mejores resultados y prevenir peligros de laboratorio. Se recogieron controles tisulares infectados por priones con EEB, tembladera clásica, tembladera atípica y CWD (fijada en formalina, incrustada en parafina, FFPE) de diversas fuentes. Las secciones bovinas y ovinas son de los casos diagnosticados bajo un programa de vigilancia de EET animal. Las secciones de CWD provienen de las muestras de control amablemente proporcionadas por la profesora Stefanie Czub (Agencia Canadiense de Inspección de Alimentos, Centro Nacional de Enfermedades Animales) en 2003 y de las pruebas de aptitud de CWD 2008 organizadas por el Laboratorio Europeo de Referencia para EET (APHA, Weybridge).

1. Sección de tejidos y preparación de portaobjetos

1. Corte secciones de tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina (FFPE) con un espesor de 3-5 μm utilizando un micrótomo.
2. Flotar secciones sobre agua purificada con una temperatura de aproximadamente 10 °C por debajo del punto de fusión de la parafina utilizada. Levante las secciones del agua en portaobjetos de microscopio especialmente tratados (consulte la Tabla de materiales). Permita que el agua drene completamente de los toboganes.
3. Incubar los portaobjetos durante la noche a 50 °C para mejorar la adhesión de los tejidos al portaobjetos.
   NOTA: Es preferible preparar los tejidos recién seccionados para los protocolos de IHQ, aunque las secciones de control positivo y negativo de EET se pueden preparar con anticipación y almacenar. Los pasos 2 a 4 deben realizarse en una campana extractora química.

2. Desparafinización y rehidratación

1. Coloque los portaobjetos con las secciones de tejido en una cesta de tinción de acero inoxidable (consulte la Tabla de materiales). Sumerja la cesta en un baño de xileno (recipiente para manchas de acero inoxidable) durante 3 minutos, retire y sumerja una vez más.
2. Retire las secciones de xileno y rehidrate sumergiéndolas en un baño de etanol absoluto durante 3 minutos. Retire y sumerja una vez más.
3. Seque al aire las secciones y colóquelas en un baño de etanol al 90% durante 1 min. Transfiera a un baño de etanol al 70% durante otro minuto, seguido de una transferencia final a un baño de etanol al 50% durante 1 minuto. Para cada tratamiento de baño de etanol, agite suavemente la cesta deslizante dos veces y drene la canasta antes de la próxima transferencia.

3. Recuperación de epítopos

1. Sumerja cuidadosamente las secciones de tejido en ácido fórmico al 98% a temperatura ambiente durante 30 min. Enjuague las secciones con agua del grifo durante 5 minutos, seguido de enjuagar dos veces con agua destilada.
   PRECAUCIÓN: El ácido fórmico es altamente corrosivo. Se deben usar gafas protectoras y guantes.
2. Realice la recuperación de antígenos inducidos por calor (HIER) siguiendo los pasos a continuación.
   NOTA: Este paso se realiza mediante autoclave hidratado a 121 °C durante 30 min en una cámara de presión específica (ver Tabla de materiales).
   1. Precaliente el tampón de citrato (10 mM, pH 6.1, ver Tabla de materiales) a 98 °C durante unos 20 minutos en un recipiente de tinción de acero inoxidable colocado dentro de la cámara de presión llena con 500 ml de agua destilada.
      NOTA: Para el presente estudio, el Set Point del programa fue 1 (SP1) para el equipo específico utilizado.
   2. Después de que la alarma indique que el equipo alcanzó el tiempo y la temperatura programados, sumerja la cesta con guías e inicie el programa en el punto de ajuste 2 (121 ° C durante 30 min). Para fines de control de calidad, coloque una sección de cinta indicadora adhesiva de autoclave en la cesta para controlar la temperatura y la presión, y registre la presión inicial y final de este programa.
   3. Si el número de portaobjetos a inmunoteñir no alcanza la capacidad de la cesta, utilice portaobjetos limpios y en blanco para ocupar cualquier posición vacía. Después de que el programa haya terminado, permita el retorno pasivo de la cámara a la presión ambiente (al menos 30 min).
      NOTA: Las duraciones más largas pueden reducir la tinción de fondo no específica.
   4. Transfiera con cuidado la cesta deslizante a un recipiente de tinción de acero inoxidable lleno de agua destilada durante 5 minutos.

4. Inactivación de la peroxidasa endógena

1. Sumerja la cesta de portaobjetos que contiene las secciones de muestra en un baño de peróxido de hidrógeno al 3% (_H2O2) en metanol durante 30 min. Enjuagar las secciones con agua corriente (5 min). Escurrir y sumergir las secciones en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 5 minutos adicionales.

5. Inmunodetección

NOTA: Para el presente estudio, la inmunodetección se ejecutó utilizando el formato de espacio capilar⁷ utilizando un sistema de ensamblaje de clip deslizante disponible comercialmente (ver Tabla de materiales). Otros sistemas de portaobjetos de inmunohistoquímica también son aplicables.

1. Coloque cada portaobjetos sobre un soporte de placa de cubierta disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) prehumedecido con TBS, evitando burbujas, con el lado del tejido orientado hacia el soporte y los bordes deslizantes coincidiendo con los dos puntos inferiores del soporte.
   1. Sostenga el conjunto portaportaobjetos entre el pulgar y el índice, con un dedo encima del portaobjetos de muestra y el otro en la parte inferior del soporte. A continuación, coloque el ensamblaje en la galería del sistema.
   2. Para asegurarse de que el conjunto esté bien ensamblado, llene el pozo entre el portaobjetos de muestra y el soporte con TBS, que no debe desbordarse inmediatamente. A partir de este momento, asegúrese de que se deben retener aproximadamente 80 μL de TBS entre el soporte y el portaobjetos. No permita que las secciones se sequen.
2. Una vez en el sistema, para disminuir la tinción de fondo antes del tratamiento con anticuerpos primarios (anti-PrP, ver Tabla de materiales), preincubar los portaobjetos de muestra con un 20% de suero normal de la misma especie que el anticuerpo hospedador secundario que se utiliza para la inmunotinción (en el presente caso, suero de caballo) durante 30 min en TBS.
3. Descongelar el número de alícuotas de anticuerpos que deben utilizarse según la especie animal objeto de análisis, el número de secciones de muestra que deben examinarse y la cantidad de dilución de trabajo.
   NOTA: Para obtener mejores resultados, use suero normal al 10% de la misma especie que la fuente del anticuerpo secundario y las soluciones de anticuerpos primarios. Si es posible, para obtener mejores resultados, la fuente huésped del suero normal y el anticuerpo secundario debe ser de la misma especie.
4. Sin lavar las secciones, aplicar la solución de anticuerpos primarios directamente (200 μL) en cada pocillo del conjunto portaportaobjetos e incubar durante 60 min a temperatura ambiente.
5. Para el lavado, llene los pocillos de los juegos portaportadeslizadores con TBS y espere 5 minutos. Repita dos veces.
6. Diluir el anticuerpo secundario biotinilado (monoclonal anti-murino Caballo Ab, ver Tabla de materiales) a 1/200 en TBS con 10% de suero de caballo. Preparar el volumen requerido en función del número de secciones a tratar.
7. Aplicar la solución de anticuerpos secundarios (200 μL) en cada pocillo del juego portaportaobjetos. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
8. Lavar como se describe en el paso 5.5.
9. Para la incubación con la peroxidasa del complejo avidina-biotina (complejo ABC/HRP, ver Tabla de materiales), prepare el reactivo 30 min antes de su uso. Aplicar la solución compleja ABC/HRP (200 μL) en cada pocillo del juego portaportaobjetos. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
10. Lavar como se describe en el paso 5.5.

6. Desarrollo con cromógeno DAB

PRECAUCIÓN: DAB es un carcinógeno potencial. Como resultado, es necesario un cuidado adecuado mientras se trabaja con este reactivo, incluida la protección ocular, batas de laboratorio, guantes y buenos procedimientos de laboratorio. Deséchese de seguir las regulaciones locales.

1. Diluir el cromógeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales) inmediatamente antes de usar. Aplicar la solución cromógena (400 μL) en cada pocillo del juego de placas portaobjetos.
2. Incubar hasta 30 min a temperatura ambiente. En las secciones positivas de PrP^Sc , un período de incubación de 10 minutos suele ser suficiente.
3. Retire la solución de cromógeno residual lavando los portaobjetos en agua destilada. Retire los portaobjetos de los soportes de la placa de cobertura y colóquelos en un recipiente de plástico con agua destilada.

7. Contratinción de hematoxilina

1. Sumerja la cesta de tinción de acero inoxidable con las secciones en el baño de solución de hematoxilina (consulte la Tabla de materiales) durante 1 minuto. Enjuague suavemente con agua corriente fría durante 10 minutos o agua tibia durante 5 minutos.
2. Deshidratar las secciones colocándolas en etanol al 90% durante 1 min, seguido de un baño en etanol absoluto durante 1 min. Luego, coloque los toboganes en un baño de xileno durante 1 minuto.
3. Monte las secciones con un medio de montaje disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Estos pasos se llevan a cabo en una campana extractora de humos químicos a temperatura ambiente (19 °C-24 °C). Este procedimiento incluye un registro de prueba (Archivo Suplementario 1) para registrar la finalización de todos los pasos, el equipo utilizado y el técnico de laboratorio. Además, se ha diseñado una hoja de trabajo (Archivo complementario 2) para determinar fácilmente los volúmenes de los reactivos de acuerdo con el número de secciones en cada ensayo, las diluciones de trabajo y las instrucciones del fabricante, así como para registrar la temperatura ambiente, el equipo y los lotes de reactivos.

Representative Results

Dado que es posible el inmunomarcaje diana no específico, es importante determinar el nivel de inmunomarcaje no específico en animales control con EET negativas conocidas. Este es un paso importante para interpretar adecuadamente el inmunomarcaje específico de PrP^{Sc 7} (Figura 2). Se ha observado que el marcado no diana por anticuerpos anti-PrP ocurre como tinción intraneuronal discreta de partículas finas (más evidente en el núcleo hipogloso y el núcleo cuneado accesorio), hilos lineales finos irregulares de tinción en el neuropilo (STN, V, núcleo olivárico, núcleo cuneado accesorio, núcleo fascicular lateral, formación reticular dorsal a los núcleos del ovario y área postrema)¹² , marcado difuso no particulado en algunas áreas de materia gris y blanca, y marcado citoplasmático difuso de neuronas¹³ (Figura 3).

Sobre la base de varios estudios, se puede encontrar inmunomarcaje específico y dirigido de^{PrP Sc} en muchos tipos diferentes dependiendo de la cepa de EET, la especie huésped y el genotipo de prnp . Se han descrito los siguientes tipos de^{PrP Sc} (revisados por Orge et ^al.5): Intraneuronal; Intraglial; Radiados; Perivascular; Subpial; Subependimal; Lineal; Granular fino; Agregados (o granulares gruesos, partículas gruesas a coalescentes y similares al musgo); Perineuronal; Placa similar (o placas, placas vasculares); Punteada; Globular.

Figura 2: Imágenes representativas tras el inmunomarcaje para PrP^Sc de secciones de tejido de controles no infectados y animales infectados con priones con EEB, tembladera clásica, tembladera atípica y CWD. (A, B, C) Secciones de controles negativos de bovinos, ovinos y cérvidos, respectivamente; (D) EEB positivo: depósitos granulares de PrP^Sc en el neuropilo de DVN y (E) STN; (F) Tembladera clásica ovina positiva: PrP^Sc granular en el neuropilo e intraneuronal en DVN y (G) PrP^sc estrellada en la formación reticular; (H) Tembladera atípica ovina: PrP Sc granular en el neuropilo de V en la región obex, granular en las capas moleculares (m) e (I) granulares (g) del cerebelo y (J) puntiaguda (flecha) y globular (punta de flecha)^{PrP Sc} en la sustancia blanca del tronco encefálico; (K) CWD: PrP^Sc granular en V y (L) formación reticular y perivascular en formación reticular. Para A, B, C y D- Barra de escala = 50 μm; E, F, G, H y L- Barra de escala = 20 μm; I y K- Barra de escala = 1 mm; J- Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Imágenes representativas que muestran ejemplos de artefactos de inmunotinción observados después del procedimiento PrP^Sc IHC. (A) Fondo neuropil difuso (DVN). (B) Marcado citoplasmático difuso (flecha de cabeza) de neuronas (formación reticular). (C) Depósitos de cromógenos artificiales (flechas) (formación reticular). (D) Líneas finas irregulares (flechas) de tinción en el neuropilo (formación reticular). Muestras de secciones bovinas negativas para PrP^Sc procedentes de ensayos de aptitud técnica inmunohistoquímica organizados por el Laboratorio Europeo de Referencia para EET. A y B- Barra de escala = 20 μm; C y D- Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Tabla 1 resume la descripción de los tipos de^{PrP Sc} inmunomarcados observados en la EEB, la tembladera clásica y atípica y la CWD para un diagnóstico positivo y los criterios establecidos para resultados negativos, no concluyentes e inadecuados¹¹ y revisados por Orge et ^al.5.

Tabla 1: Resumen de los tipos de^{PrP Sc} observados en la EEB, la tembladera clásica y atípica y la CWD para un diagnóstico positivo, y criterios para resultados negativos, no concluyentes e inadecuados. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Expediente complementario 1: Formulario que sirve como registro de prueba inmunohistoquímica de INIAV "EET". La tarea se completa a medida que cada paso del protocolo IHC se completa y es certificado por el técnico que realiza la tarea respectiva. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Hoja de trabajo de preparación de reactivos para el protocolo inmunohistoquímico de EET. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

Las EET son enfermedades zoonóticas potenciales. Tras la aparición de la EEB en 1986 en el Reino Unido, Portugal se convirtió en uno de los Estados miembros de la Unión Europea con mayor incidencia de esta enfermedad^14,15. Para controlar esta enfermedad, han surgido otras EET (tembladera clásica y atípica, variantes de la EEB, y actualmente la vigilancia de la desgaste crónica en cérvidos), mecanismos de vigilancia desarrollados por la Dirección General de Alimentación y Veterinaria (DGAV) y el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias y Veterinarias, IP (INIAV) que realiza el diagnóstico de EET como Laboratorio Nacional Veterinario de EET. Este laboratorio sigue las instalaciones y prácticas recomendadas de bioseguridad^{BSL-3 6} en el manejo de las posibles muestras infectadas por priones de tejidos de ganado, pequeños rumiantes y cérvidos asociados con la vigilancia de EET. La inmunodetección de PrP^Sc por inmunohistoquímica (IHC) y/o métodos de inmunoblot occidental (WB) de tejidos encéfalos y linfoides son los métodos de referencia para confirmar el diagnóstico de EET¹.

La técnica IHQ es una herramienta complementaria útil para el diagnóstico y la investigación anatomopatológica en medicina veterinaria y humana. Se identifican varios puntos críticos y, en la práctica, es necesario ajustar en cada laboratorio para cada especie animal, el anticuerpo utilizado y también los diferentes tejidos probados^16,17. La fijación, recuperación de antígenos, antecedentes y artefactos, además del tipo de anticuerpo utilizado (monoclonal versus policlonal, clon utilizado, origen animal) y especies animales probadas, son ejemplos de factores que necesitan ser adecuadamente controlados y estandarizados en cada laboratorio para que los resultados finales obtenidos con inmunohistoquímica se interpreten adecuadamente como inmunomarcaje específico^{2, 17}.

El presente trabajo presentó el protocolo seguido en el Laboratorio Nacional de Referencia de EET en Portugal, con los puntos críticos y toda la metodología de referencia hecha para garantizar el diagnóstico correcto de las enfermedades de EET. Los resultados de la IHQ dependen de la calidad de la muestra, que debe incluir los sitios objetivo para la EET. La falta de estos sitios diana de EET, junto con la ausencia de inmunomarcaje específico de PrP^Sc, es una limitación importante de esta metodología para asegurar un diagnóstico. Incluso en los casos en que la congelación o la autólisis promueven artefactos, es posible hacer un diagnóstico concluyente de si hay o no una EET presente si esos sitios objetivo están presentes en la muestra. Además, la identificación de inmunotinción en dianas no específicas en diferentes tejidos neuronales, basada en la observación diaria de controles negativos y positivos que siempre se han introducido cada vez que se realiza esta técnica, indica la calidad del protocolo producido y presentado aquí y el motivo de su certificación 5,12,13.

Como posibles incidentes, se destacan la pérdida de secciones de tejido durante el autoclave hidratado y/o la retirada de los soportes de la placa de cobertura, la presencia de burbujas atrapadas entre los portaobjetos y las placas de cobertura, y la dilución inadecuada de los reactivos. Para superar estos eventos, se recomienda usar portaobjetos de microscopio cargados positivamente dentro de la fecha de vencimiento y que estén bien almacenados, recortar cuidadosamente las secciones de tejido con las placas de cobertura, usar equipo calibrado, estandarizar la hoja de trabajo de preparación de reactivos (Archivo complementario 2) y probar los reactivos por lotes de inmunoetiquetado antes de su uso.

La descripción de nuevas variantes de EET, a saber, la tembladera atípica, también valida la importancia de una técnica estándar de IHQ en este diagnóstico. Con esta técnica, es posible observar la existencia de diferentes patrones para la inmunotinción de^{PrP Sc} , dependiendo de la cepa priónica, la especie huésped y el genotipo de prnp .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010	Undituled
			Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water
Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase	Vector Laboratories	PK-6100	Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing.
Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L)	Vector Laboratories	BA-2000-1.5	Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections.
Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase	Vector Laboratories	SK-4100	Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section.
DakoCytomation Pascal pressure chamber	DAKO	S2800
Ehrlich’s Hematoxylin:
Hematoxylin	Merck	115938	Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use.
Absolute ethanol	Labchem	LB0507-9010
Glacial acetic acid	Merck	101830
Potassium alum	Merck	1.01047.1000
Glycerin	Merck	1.04091.1000
Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2):			40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use
Hydrogen peroxide (30% w/w)	Scharlau	HI0136
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Formic acid 98%	Merck	1.00264.1000	Undiluted
Microtome	Shandon-AS325	Microtome	Shandon-AS325
Mounting medium Entellan	Merck	107960	Ready- to- use.
Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum	Gibco	16050-122	Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section).
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11	BIORAD	MCA2460	PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time.
Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10	Cayman  Chemical Company	189710	PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11
Shandon CoverplateTM chamber	Thermo Scientific	72110017
Shandon Sequenza® Immunstaining center	Thermo Scientific	73300001
Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack	Thermo Scientific	73310017
Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1):			2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate  and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day.
Tri-sodium citrate dihydrate	Sigma-aldrich	S4641-500G
Citric acid	Sigma Aldrich	C0759
Staining jar and basket	Deltalab	19360
		19361
Superfrost Plus microscope slides	VWR	631-0108
Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day.
TRIZMA BASE	Sigma Aldrich	T6066-1KG
Sodium Chloride (NaCl)	Merck	106404
Xylene	Panreac Applied Chem ITW reagents	251769	Undiluted