Summary
Immunolabeling onormalt prionprotein med hjälp av immunhistokemiska protokoll kräver specifika prov- och anti-PrP-antikroppsberedningsmetoder. Detta protokoll beskriver de viktigaste stegen i epitopdemaskering för att säkerställa korrekt PrP-immunmärkning och för att minimera icke-specifik bakgrundsfärgning. Detta tillvägagångssätt beaktar också biosäkerhetsåtgärder vid genomförande av immunhistokemiska studier med prioninfekterade vävnader.
Abstract
Onormala prionproteiner (PrPSc) är den sjukdomsassocierade isoformen av cellulärt prionprotein och diagnostiska markörer för transmissibel spongiform encefalopati (TSE). Dessa neurodegenerativa sjukdomar drabbar människor och flera djurarter och inkluderar skrapie, zoonotisk bovin spongiform encefalopati (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD) och den nyligen identifierade kamelprionsjukdomen (CPD). Diagnos av TSE bygger på immundetektion av PrPSc genom tillämpning av både immunhistokemi (IHC) och västerländska immunoblotmetoder (WB) på encefalonvävnader, nämligen hjärnstammen (obexnivå). IHC är en allmänt använd metod som använder primära antikroppar (monoklonala eller polyklonala) mot antigener av intresse i celler i en vävnadssektion. Antikropps-antigenbindningen kan visualiseras genom en färgreaktion som förblir lokaliserad i det område av vävnaden eller cellen där antikroppen riktades. Som sådan, i prionsjukdomar, liksom i andra forskningsområden, används immunhistokemiska tekniker inte enbart för diagnostiska ändamål utan också i patogenesstudier. Sådana studier innefattar detektering av PrPSc-mönster och typer från de tidigare beskrivna för att identifiera de nya prionstammarna. Eftersom BSE kan smitta människor rekommenderas att biosäkerhetslaboratorier på nivå 3 (BSL-3) och/eller metoder används för att hantera nötkreatur, mindre idisslare och hjortprover som omfattas av TSE-övervakningen. Dessutom rekommenderas inneslutnings- och prionsärskild utrustning, när så är möjligt, för att begränsa kontaminering. PrPSc IHC-förfarandet består av ett epitoptest av myrsyraepitoper som också fungerar som en prioninaktiveringsåtgärd, eftersom formalinfixerade och paraffininbäddade vävnader som används i denna teknik förblir smittsamma. Vid tolkning av resultaten måste man vara noga med att skilja icke-specifik immunmärkning från målmärkning. För detta ändamål är det viktigt att känna igen artefakter av immunmärkning som erhållits i kända TSE-negativa kontrolldjur för att skilja dem från specifika PrP Sc-immunmärkningstyper, som kan variera mellan TSE-stammar, värdarter och prnp-genotyp, som beskrivs närmare häri.
Introduction
Enligt prionhypotesen är den onormala isoformen (PrPSc) den primära eller enda komponenten i smittämnet vid transmissibel spongiform encefalopati (TSE). Bekräftelse för diagnos av TSE bygger på immunodetektion av PrPSc genom tillämpning av immunhistokemiprotokoll (IHC) och/eller västerländska immunoblotmetoder (WB) av encefalonvävnader1.
IHC är en metod som använder monoklonala eller i vissa fall polyklonala antikroppar (som primära antikroppar) som ett första steg i immunfärgning av specifikt riktade antigener av intresse belägna i celler i en vävnadssektion. Eventuell effektiv primär antikropps-antigenbindning visualiseras sedan med hjälp av sekundära antikroppar specifika för de primära antikropparna. Dessa sekundära antikroppar är konjugerade till enzymer, såsom pepparrotsperoxidas (HRP) eller alkaliskt fosfatas (AP). Visualisering uppnås sedan genom att tillsätta ett substrat till dessa enzymer, vilket ger olösliga färgprodukter lokaliserade i områden där de primära antikropparna är bundna till de riktade antigenerna. Förbättrad visualisering kan uppnås genom motfärgning, där ett färgämne används för att skapa en kontrast mellan immunomärkt och icke-immunmärkt vävnad2.
Med IHC med användning av formalinfixerade paraffininbäddade vävnader (FFPE) kan formalinfixering upphäva effektiviteten hos primära antikroppar på grund av tvärbindning genom formaldehyd och uppvärmning och uttorkning under paraffininbäddning. Dessa förändrar konformationen av proteiner, förstör, denaturerar eller maskerar epitoperna, vilket minskar eller upphäver deras upptäckt3. Som sådan kräver detta antigenhämtning (AR). AR-teknikerna stör formaldehydrelaterad kemisk grupptvärbindning i de antigena molekylerna, vilket återställer eller demaskerar den ursprungliga antigen-proteinkonformationen. Detta resulterar i återvinning av antikropps-antigen (epitop) affinitet för immunmärkning. Den slutliga effekten av AR beror på egenskaperna hos det riktade antigenet och/eller den primära antikroppen2.
Värmeinducerad antigen (epitop) hämtning (HIER) är en procedur av AR3 och används rutinmässigt för PrPSc IHC-detektion, som beskrivs häri. IHC är viktigt för diagnos och används i forskningslaboratorier för att bestämma vävnadsdistributionen av ett patologiassocierat antigen. Det används ofta för att diagnostisera och undersöka cancer, neurovetenskap och infektionssjukdomar4, bland andra. För TSE spelar IHC en viktig roll i diagnos och forskning för att bekräfta och undersöka PrPSc-distribution i naturliga värdar och experimentella modeller. IHC bidrar till prionpatogenesstudier och analys av PrP Sc-deponeringstyper och -mönster, nämligen i neurala vävnader5, för att upptäcka avvikelser från rutinmässigt beskrivna infektioner och identifiera förmodade nya prionstammar.
Eftersom prioner av bovin spongiform encefalopati (BSE) kan infektera människor, kan vissa laboratorieprotokoll som ingår i arbetet med BSE kräva användning av BSL-3-anläggningar och -metoder6. Dessa inkluderar användning av en förseglad sekundär behållare för att transportera potentiella BSE-infekterade vävnadsprover inom institutet och laboratoriet. Det omfattar också att utse inneslutningsområden och särskild prionutrustning för forskning och analys av BSE när så är möjligt. Detta görs för att förhindra kontaminering utanför arbetsområdet och ge ett begränsat utrymme eftersom dekontamineringsförfaranden blir nödvändiga.
Följaktligen följer Laboratory of Pathology of INIAV rekommenderade biosäkerhetsnivå-3 (BSL-3) anläggningar och praxis6 för att hantera potentiella prioninfekterade prover av vävnader från nötkreatur, små idisslare och hjortdjur som är associerade med TSE-övervakningen.
Formalinfixerade och paraffininbäddade vävnader som ingår i TSE-diagnostik eller TSE-forskningsförfaranden, särskilt i centrala nervsystemet, kan vara potentiellt smittsamma. Dessa fasta vävnader måste därför behandlas med myrsyra för att minska infektiviteten hos prioner, om sådana förekommer, före vävnadsbearbetningen. Detta utförs genom att placera fasta, trimmade vävnader (ca 2-4 mm tjocklek) i en bearbetningskassett. Kassetten nedsänks sedan i 98% myrsyra (i 1 h). Efter nedsänkning tvättas kassetterna med vävnader i rinnande kranvatten i 30 minuter och återförs till fixeringsmedlet före vidare bearbetning. Om vävnadssnitt inte behandlas före bearbetning måste postmikrotomiska vävnadssnitt nedsänkas i outspädd myrsyra i minst 5 minuter före histologisk färgning7. IHC-protokollet för PrPSc innehåller ett rutinmässigt myrsyraepitop-demasking steg, som också tjänar till att inaktivera prioner7. Efter dessa prioninaktiveringssteg kan de resulterande fasta vävnaderna bearbetas vid BSL-2 med användning av standard BSL-2-praxis.
Det minsta kravet på vävnadsprovtagning för TSE-diagnos hos alla djur som omfattas av TSE-övervakningen är insamling av hjärnstammen (på obexnivå). För att upptäcka atypisk BSE och skrapie rekommenderas dessutom att en del av lillhjärnan också samlas in 1,8. För CWD-diagnos bör både hjärnstammen (obex) och retrofaryngeala lymfkörtlar testas eftersom PrP Sc kan detekteras i lymfoida vävnader utan detekterbar PrPSc i obex9, granskad av Machado et al.10.
Obex-delen av hjärnstammen inkluderar diagnostiska TSE-målplatser, nämligen dorsal vaguskärna (DVN), enkroppskärna (STN) och ryggradskärnan i trigeminusnerven (V). Dessa områden uppvisar konsekvent bilateral ackumulering av PrPSc , även i de tidiga stadierna av BSE och klassisk skrapie. I kliniska fall av avancerad TSE uppvisar alla gråämnesområden inom hjärnstammen utbredd PrPSc-fördelning 11.
Före snittning och bearbetning utvärderas hjärnproverna (figur 1) för att fastställa graden av autolys och förekomsten av eventuell vävnadsskada som potentiellt äventyrar provets lämplighet för IHC-baserad bekräftande diagnos8. För att validera integriteten hos de preparativa protokollen och analysresultaten ingår TSE-positiva och negativa vävnadsprover som kontroller i samband med beredning av vävnader från testfall i varje analys.
Figur 1: PrPSc IHC-förfarandet. Representation som visar steg-för-steg-sekvensen av PrPSc IHC-proceduren från deparaffinisering av vävnadssnitt till eventuell immunfärgning och detektion (FFPE - Formalinfixerad paraffininbäddad; Mab - monoklonal antikropp; DAB - 3,3' diaminobensidin). Denna siffra skapades BioRender.com. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
IHC-förfarandet som beskrivs här är en del av forskningsprojektet FAIRJ-CT98-7021, "Inrättandet av ett europeiskt nätverk för övervakning av TSE hos idisslare och standardisering och harmonisering av processen och kriterierna för identifiering av misstänkta fall". Den följer de diagnostiska kriterier som fastställts av Världsorganisationen för djurhälsa, WOAH (tidigare Office International des Épizooties, OIE)1 och European Reference Laboratory for animal TSE 8,11. IHC-förfarandet som beskrivs är också ackrediterat enligt NPISOIEC17025 (allmänna krav på provnings- och kalibreringslaboratoriers kompetens) sedan 2008. Sådan ackreditering innebär ett högkvalitativt ledningssystem som innehåller standardiserade operativa förfaranden, kvalificerad personal, exakt kalibrerad utrustning, rigorös kontroll av data och reagenser, deltagande i kompetensanalyser mellan laboratorier, icke-överensstämmande arbete och riskbedömning för att öka ledningssystemets effektivitet, uppnå förbättrade resultat och förebygga laboratorierisker. Kontroller av prioninfekterad vävnad med BSE, klassisk skrapie, atypisk skrapie och CWD samlades in (formalinfixerad, paraffininbäddad, FFPE) från olika källor. Nötkreaturs- och fåravdelningarna kommer från de fall som diagnostiserats inom ramen för ett TSE-övervakningsprogram för djur. CWD-sektionerna är från kontrollprover som vänligen tillhandahölls av professor Stefanie Czub (Canadian Food Inspection Agency, National Center for Animal Diseases) 2003 och från CWD Proficiency testing 2008 organiserad av European Reference Laboratory for TSEs (APHA, Weybridge).
1. Vävnadssnittning och glidberedning
- Skär sektioner av formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnader med en tjocklek på 3–5 μm med hjälp av en mikrotom.
- Flyt sektioner på renat vatten med en temperatur som ligger cirka 10 °C under smältpunkten för det använda paraffinet. Lyft sektionerna från vattnet på specialbehandlade mikroskopglas (se Materialförteckning). Låt vattnet rinna av ordentligt från objektglasen.
- Inkubera objektglasen över natten vid 50 °C för att förbättra vävnadens vidhäftning av objektglas.
OBS: Det är att föredra att förbereda nyligen snittade vävnader för IHC-protokoll, även om TSE-positiva och negativa kontrollsektioner kan förberedas i förväg och lagras. Steg 2 till 4 måste utföras i en kemisk dragskåp.
2. Deparaffinisering och rehydrering
- Placera objektglasen med vävnadssektionerna i en färgningskorg av rostfritt stål (se Materialförteckning). Sänk ner korgen i ett xylenbad (färgningsbehållare i rostfritt stål) i 3 minuter, ta bort och sänk ner igen.
- Ta bort xylen- och rehydratsektioner genom att nedsänka dem i ett absolut etanolbad i 3 minuter. Ta bort och fördjupa igen.
- Lufttorka sektionerna och lägg i ett 90% etanolbad i 1 min. Överför till ett 70% etanolbad i ytterligare en minut, följt av en slutlig överföring till ett 50% etanolbad i 1 min. För varje behandling med etanolbad, skaka försiktigt glidkorgen två gånger och töm korgen före nästa överföring.
3. Hämtning av epitop
- Sänk försiktigt ner vävnadssektionerna i 98% myrsyra vid rumstemperatur i 30 minuter. Skölj sektionerna i kranvatten i 5 min, följt av skölj två gånger i destillerat vatten.
VARNING: Myrsyra är mycket frätande. Skyddsglasögon och handskar måste bäras. - Utför värmeinducerad antigenhämtning (HIER) genom att följa stegen nedan.
OBS: Detta steg utförs genom hydratiserad autoklavering vid 121 °C i 30 minuter i en specifik tryckkammare (se materialförteckning).- Förvärm citratbufferten (10 mM, pH 6,1, se materialförteckning) vid 98 °C i ca 20 minuter i en behållare av rostfritt stål placerad inuti tryckkammaren fylld med 500 ml destillerat vatten.
OBS: För den aktuella studien var programmet Set Point 1 (SP1) för den specifika utrustning som användes. - När larmet indikerar att utrustningen uppnådde den programmerade tiden och temperaturen, sänk ner korgen med bilder och starta programmet till Börvärde 2 (121 ° C i 30 minuter). För kvalitetskontrolländamål, placera en sektion av självhäftande autoklavindikatortejp på korgen för att övervaka temperatur och tryck och registrera initialt och slutligt tryck för detta program.
- Om antalet glas som ska immunfärgas inte når korgens kapacitet, använd rena, tomma glas för att uppta tomma positioner. Efter att programmet har avslutats, låt kammaren passivt återgå till omgivningstryck (minst 30 min).
OBS: Längre varaktigheter kan minska ospecifik bakgrundsfärgning. - Överför försiktigt glidkorgen till en färgbehållare av rostfritt stål fylld med destillerat vatten i 5 minuter.
- Förvärm citratbufferten (10 mM, pH 6,1, se materialförteckning) vid 98 °C i ca 20 minuter i en behållare av rostfritt stål placerad inuti tryckkammaren fylld med 500 ml destillerat vatten.
4. Inaktivering av endogent peroxidas
- Sänk ned glaskorgen med provsektionerna i ett bad med 3 % väteperoxid (H2O2) i metanol i 30 minuter. Skölj sektionerna under rinnande vatten (5 min). Töm och sänk ner sektionerna i 1x Tris-buffrad saltlösning (TBS) i ytterligare 5 minuter.
5. Immundetektion
OBS: För den aktuella studien utfördes immundetektion med kapillärgapformat7 med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt bildklämmonteringssystem (se materialtabell). Andra immunhistokemiska glidsystem är också tillämpliga.
- Placera varje glas på en kommersiellt tillgänglig täckplatthållare (se materialförteckning) förfuktad med TBS, undvik bubblor, med vävnadssidan vänd mot hållaren och glidkanterna som sammanfaller med hållarens två nedre punkter.
- Håll glidhållarenheten mellan tummen och pekfingret med ett finger ovanpå provglaset och det andra på undersidan av hållaren. Placera sedan enheten i systemets galleri.
- För att säkerställa att uppsättningen är väl monterad, fyll brunnen mellan provglaset och hållaren med TBS, som inte omedelbart får rinna över. Från och med nu, se till att cirka 80 μL TBS måste hållas kvar mellan hållaren och glaset. Låt inte sektionerna torka.
- Väl i systemet, för att minska bakgrundsfärgningen före behandling med primär antikropp (anti-PrP, se materialförteckning), förinkubera provglasen med 20% normalt serum från samma art som den sekundära antikroppsvärden som används för immunfärgning (i detta fall hästserum) i 30 minuter i TBS.
- Tina upp antalet alikvoter av antikroppar som ska användas beroende på vilken djurart som analyseras, antalet provsektioner som ska undersökas och mängden arbetsutspädning.
OBS: För bästa resultat, använd 10% normalt serum från samma art som källan till sekundära antikropps- och primära antikroppslösningar. Om möjligt, för bästa resultat, bör värdkällan för det normala serumet och sekundära antikroppen vara från samma art. - Utan att tvätta sektionerna, applicera den primära antikroppslösningen direkt (200 μl) i varje brunn i slidehållarsetet och inkubera i 60 minuter vid rumstemperatur.
- För tvätt, fyll brunnarna på glidhållarsatserna med TBS och vänta i 5 min. Upprepa två gånger.
- Späd den biotinylerade sekundära antikroppen (monoklonal antimurin Horse Ab, se Materialtabell) vid 1/200 i TBS med 10% hästserum. Förbered den volym som krävs beroende på antalet sektioner som ska behandlas.
- Applicera den sekundära antikroppslösningen (200 μl) på varje brunn i uppsättningen med objektglashållare. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta enligt beskrivningen i steg 5.5.
- För inkubation med avidin-biotinkomplexperoxidas (ABC/HRP-komplex, se Materialförteckning), bereds reagenset 30 min före användning. Applicera den komplexa ABC/HRP-lösningen (200 μl) i varje brunn i glidplattehållaren. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Tvätta enligt beskrivningen i steg 5.5.
6. Utveckling med DAB-kromogen
VARNING: DAB är ett potentiellt cancerframkallande ämne. Som ett resultat är lämplig vård nödvändig när du arbetar med detta reagens, inklusive ögonskydd, labbrockar, handskar och bra laboratorieprocedurer. Kassera följande lokala föreskrifter.
- Späd kromogen enligt tillverkarens anvisningar (se Materialförteckning) omedelbart före användning. Applicera kromogen lösning (400 μL) på varje brunn i glidplattan.
- Inkubera i upp till 30 minuter vid rumstemperatur. I PrPSc-positiva sektioner är en 10 minuters inkubationsperiod vanligtvis tillräcklig.
- Ta bort kvarvarande kromogen lösning genom att tvätta glasen i destillerat vatten. Ta bort objektglasen från täckplåtshållarna och lägg dem i en plastbehållare med destillerat vatten.
7. Motfärgning av hematoxylin
- Sänk ner färgningskorgen i rostfritt stål med sektionerna i hematoxylinlösningsbadet (se Materialförteckning) i 1 min. Skölj försiktigt i kallt rinnande vatten i 10 min eller ljummet vatten i 5 min.
- Torka ut sektionerna genom att placera dem i 90% etanol i 1 min, följt av ett bad i absolut etanol i 1 min. Lägg sedan rutschkanorna i ett xylenbad i 1 min.
- Montera sektionerna med ett kommersiellt tillgängligt monteringsmedium (se Materialförteckning).
OBS: Dessa steg utförs i en kemisk dragskåp vid rumstemperatur (19 °C-24 °C). Denna procedur inkluderar en testpost (kompletterande fil 1) för registrering av slutförandet av alla steg, den utrustning som används och laboratorieteknikern. Dessutom har ett kalkylblad (kompletterande fil 2) utformats för att enkelt bestämma reagensvolymerna enligt antalet sektioner i varje analys, arbetsutspädningarna och tillverkarens instruktioner samt för att registrera rumstemperatur, utrustning och reagenssatser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med tanke på att icke-specifik målimmunmärkning är möjlig är det viktigt att fastställa nivån av icke-specifik immunmärkning hos kända TSE-negativa kontrolldjur. Detta är ett viktigt steg för att korrekt tolka specifik PrPSc-immunmärkning 7 (figur 2). Icke-målmärkning av anti-PrP-antikroppar har noterats förekomma som diskret intraneuronal finpartikelfärgning (tydligare i hypoglossalkärnan och accessorisk cuneatkärna), oregelbundna finlinjära trådar av fläck i neuropilen (STN, V, olivkärna, tillbehörskurenkärna, lateral fascikulär kärna, retikulär bildning dorsal till olivkärnorna och området postrema)12 , diffus icke-partikelformig märkning i vissa grå och vita områden och diffus cytoplasmatisk märkning av neuroner13 (figur 3).
Baserat på flera studier kan specifik, riktad PrPSc-immunmärkning hittas i många olika typer beroende på TSE-stam, värdarter och prnp-genotyp . Följande PrPSc-typer har beskrivits (granskad av Orge et al.5): Intraneuronal; Intraglial; Stellat; kärlkärl; Subpial; Subependimal; Linjär; Fin granulär; Ballast (eller grovkorniga, grova partiklar till koalescens och mossliknande). perineuronal; Plackliknande (eller plack, vaskulära plack); punktera; Klotformig.
Figur 2: Representativa bilder efter immunmärkning för PrPSc av vävnadssnitt från icke-infekterade kontroller och prioninfekterade djur med BSE, klassisk skrapie, atypisk skrapie och CWD. (A, B, C) Sektioner från negativa kontroller av nötkreatur, får respektive hjortdjur. D) BSE-positiva: granulära PrP Sc-avlagringar i neuropilen av DVN och E) STN. F) Får klassisk skrapie positiv: granulär PrPSc i neuropil och intraneuronal i DVN och (G) stellat PrPsc i retikulär bildning; H) Atypisk skrapie för får: granulär PrP Sc i neuropilen av V i obexregionen, granulär vid molekylär (m) och (I) granulär (g) lager av lillhjärnan och (J) punkterad (pil) och klotformig (pilspets) PrPSc vid hjärnstammens vita substans. K) CWD: granulär PrPSc vid V och (L) retikulär bildning och perivaskulär vid retikulär bildning. För A, B, C och D- Skalstapel = 50 μm; E, F, G, H och L- Skalstång = 20 μm; I och K- Skalstång = 1 mm; J- Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder som visar exempel på immunfärgningsartefakter som observerats efter PrPSc IHC-proceduren. (A) Diffus neuropil bakgrund (DVN). (B) Diffus cytoplasmatisk (huvudpil) märkning av neuroner (retikulär bildning). (C) Artefaktiska kromogen avlagringar (pilar) (retikulär bildning). (D) Oregelbundna fina linjer (pilar) av färgning i neuropil (retikulär bildning). Prover av PrPSc-negativa bovina snitt från immunhistokemi teknisk kompetensundersökning anordnad av Europeiska referenslaboratoriet för TSE. A och B- Skalstång = 20 μm; C och D- Skalstapel = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1 sammanfattar beskrivningen av immunmärkta PrPSc-typer som observerats vid BSE, klassisk och atypisk skrapie och CWD för en positiv diagnos och fastställda kriterier för negativa, ofullständiga och olämpliga resultat11 och granskats av Orge et al.5.
Tabell 1: Sammanfattning av PrPSc-typer som observerats vid BSE, klassisk och atypisk skrapie och CWD för en positiv diagnos samt kriterier för negativa, ofullständiga och olämpliga resultat. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Kompletterande fil 1: Formulär som fungerar som INIAV "TSE Immunohistochemical test record". Uppgiften slutförs när varje steg i IHC-protokollet är slutfört och certifierat av teknikern som utför respektive uppgift. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Arbetsblad för reagensberedning för TSE-immunhistokemiskt protokoll. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TSE är potentiella zoonotiska sjukdomar. Efter uppkomsten av BSE 1986 i Förenade kungariket blev Portugal en av Europeiska unionens medlemsstater med en högre förekomst av denna sjukdom14,15. För att bekämpa denna sjukdom, andra TSE som har uppstått (klassisk och atypisk skrapie, BSE-varianter och för närvarande övervakning av chronic wasting disease hos hjortdjur), har övervakningsmekanismer utvecklats av generaldirektoratet för livsmedel och veterinära frågor (DGAV) och det nationella institutet för jordbruks- och veterinärforskning, IP (INIAV) som utför TSE-diagnosen som det nationella veterinärlaboratoriet för TSE. Detta laboratorium följer de rekommenderade biosäkerhetsanläggningarna och BSL-3-metoderna6 för att hantera potentiella prioninfekterade prover av vävnader från nötkreatur, små idisslare och hjortdjur i samband med TSE-övervakning. Immundetektion av PrPSc genom immunhistokemi (IHC) och/eller västerländska immunoblotmetoder (WB) av encefalon och lymfoida vävnader är referensmetoderna för att bekräfta diagnosen TSE1.
IHC-tekniken är ett användbart kompletterande verktyg för diagnos och anatomipatologisk undersökning inom veterinärmedicin och humanmedicin. Flera kritiska punkter identifieras, och i praktiken är det nödvändigt att justera i varje laboratorium för varje djurart, den använda antikroppen och även de olika vävnaderna som testas16,17. Fixering, antigenhämtning, bakgrund och artefakter, förutom den typ av antikropp som används (monoklonal kontra polyklonal, den klon som används, animaliskt ursprung) och testade djurarter, är exempel på faktorer som måste kontrolleras och standardiseras ordentligt i varje laboratorium så att de slutliga resultaten som erhållits med immunhistokemi skulle tolkas korrekt som specifik immunmärkning2, 17.
I det aktuella arbetet presenterades det protokoll som följts vid det nationella referenslaboratoriet för TSE i Portugal, med de kritiska punkter och all referensmetod som gjorts för att säkerställa en korrekt diagnos av TSE-sjukdomar. Resultaten av IHC beror på provets kvalitet, som måste omfatta målplatserna för TSE. Avsaknaden av dessa TSE-målplatser tillsammans med avsaknaden av specifik PrPSc-immunmärkning är en viktig begränsning av denna metod för att säkerställa en diagnos. Även i fall där frysning eller autolys främjar artefakter är det möjligt att göra en avgörande diagnos av huruvida en TSE är närvarande om dessa målplatser finns i provet. Vidare indikerar identifieringen av immunfärgning i icke-specifika mål i olika neuronala vävnader, baserat på daglig observation av negativa och positiva kontroller som alltid har introducerats när denna teknik utförs, kvaliteten på det protokoll som produceras och presenteras här och orsaken till dess certifiering 5,12,13.
Som möjliga händelser framhävs förlusten av vävnadssnitt under den hydratiserade autoklaveringen och/eller avlägsnandet av täckplåtshållarna, förekomsten av bubblor som fastnat mellan objektglasen och täckplattorna och otillräcklig utspädning av reagenserna. För att övervinna dessa händelser rekommenderas att använda positivt laddade mikroskopglas inom utgångsdatumet och som lagras väl, klippa vävnadssektionerna försiktigt med täckplattorna, använd kalibrerad utrustning, standardisera kalkylbladet för reagensberedning (kompletterande fil 2) och testa immunmärkning av batchreagens före användning.
Beskrivningen av nya TSE-varianter, nämligen atypisk skrapie, bekräftar också vikten av en standard IHC-teknik vid denna diagnos. Med denna teknik är det möjligt att observera förekomsten av olika mönster för PrP Sc-immunfärgning, beroende på prionstammen, värdarten och prnp-genotypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna artikel finansierades av projektet POCI-01-0145-FEDER-029947 "Chronic wasting disease risk assessment in Portugal" med stöd av FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) - FEDER -Balcão2020. Författarna till forskningsenheten CECAV fick också finansiering från FCT, under projektet UIDB/CVT/0772/2020.Vi tackar Bruce C. Campbell, forskningsdirektör (pensionerad), Western Regional Research Center, USDA, för hans hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | Undituled |
| Diluted 90%, 70% and 50% in distilled water | |||
| Avidin-biotin complex and peroxidase Vectastain Elite ABC kit Peroxidase |
Vector Laboratories | PK-6100 | Prepare and gently mix 30 min before use according to kit instructions. Do not mix after standing. |
| Biotinylated secondary antibody (Horse anti-mouse IgG H+L) | Vector Laboratories | BA-2000-1.5 | Dilute at 1/200 in TBS with 10% horse normal serum. Prepare the volume required depending on the number of sections. |
| Chromogen Diaminobenzidine- DAB, substrate kit, Peroxidase | Vector Laboratories | SK-4100 | Prepare before use according to kit instructions. Use 400 µL of solution per section. |
| DakoCytomation Pascal pressure chamber | DAKO | S2800 | |
| Ehrlich’s Hematoxylin: | |||
| Hematoxylin | Merck | 115938 | Dissolve 2 g of hematoxylin in 100 mL of absolute ethanol. Add 100 mL of distilled water, 10 mL of glacial acetic acid and 15 g of potassium alum with constant stirring. Add 100 mL of glycerin. The natural oxidation process takes 2 months, before use. |
| Absolute ethanol | Labchem | LB0507-9010 | |
| Glacial acetic acid | Merck | 101830 | |
| Potassium alum | Merck | 1.01047.1000 | |
| Glycerin | Merck | 1.04091.1000 | |
| Endogenous Peroxidase Block solution (3% concentration H2O2): | 40 mL Hydrogen peroxide (30% w/w) in 360 mL Methanol. Prepare before use |
||
| Hydrogen peroxide (30% w/w) | Scharlau | HI0136 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 322415-2L | |
| Formic acid 98% | Merck | 1.00264.1000 | Undiluted |
| Microtome | Shandon-AS325 | Microtome | Shandon-AS325 |
| Mounting medium Entellan | Merck | 107960 | Ready- to- use. |
| Normal serum (20% ) block solution in TBS: Horse normal serum |
Gibco |
16050-122 |
Prepare final volume according to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section). |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 2G11 | BIORAD | MCA2460 | PrP 146-R154R171182 Ovine including atypical scrapie, cervine, feline. Not suitable for bovine. According to the number of sections in the assay (200 µL of solution per section) and antibody dilution, prepare final volume in TBS supplemented with 10% of normal serum from the species the secondary antibody was raised in (horse normal serum) Usual antibody dilution: MAb 2G11 1/100 but working dilution should be established in every new batch to get the concentration to give the strongest labelling with lowest background. For storage, freeze aliquot volumes of a minimum of 10 μL into sterile microtubes. Defrost and use one aliquot at a time. |
| Primary antibody anti-PrP Mouse MAb 12F10 | Cayman Chemical Company | 189710 | PrP142-160 Bovine, not suitable for ovine Usual antibody dilution: 1/200 but working dilution should also be established. Prepare as MAb 2G11 |
| Shandon CoverplateTM chamber | Thermo Scientific | 72110017 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining center | Thermo Scientific | 73300001 | |
| Shandon Sequenza® Immunstaining slide rack | Thermo Scientific | 73310017 | |
| Solution Citrate Buffer (10 mM pH 6.1): | 2.55 g Tri-sodium citrate dihydrate and 0.255 g Citric acid in one litre purified water. Adjust pH of working solution to 6.1 using 10 mM citric acid solution (1.05 g citric acid in 500 mL purified water) Prepare on assay day. |
||
| Tri-sodium citrate dihydrate | Sigma-aldrich | S4641-500G | |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C0759 | |
| Staining jar and basket | Deltalab | 19360 | |
| 19361 | |||
| Superfrost Plus microscope slides | VWR | 631-0108 | |
| Tris-Buffered Saline solution (TBS) (50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6): | 10xTBS (stock solution 0.5 M TRIZMA BASE; 8% NaCI; pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 g and NaCl 80 g in 800 mL purified water. Adjust pH of stock solution using Hydrochloric acid 37% and final volume to one litre with purified water (keep 5± 3 °C until 2 months) Dilute TBS stock solution 1/10 on assay day. |
||
| TRIZMA BASE | Sigma Aldrich | T6066-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Merck | 106404 | |
| Xylene | Panreac Applied Chem ITW reagents | 251769 | Undiluted |
References
- WOAH, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals Online Access. Chapter 3.4.5.-Bovine Spongiform Encephalopathy (Version May 2021) and Chapter 3.8.11. - Scrapie (Version May 2022). , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2022).
- Ramos-Vara, J. A.
- Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Heat-Induced antigen retrieval for immunohistochemical reactions in routinely processed paraffin sections. Immunocytochemical Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Oliver, C., Jamur, M. 588, 103-119 (2010).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Orge, L., et al.
- US Department of Health and Human Services Public Health Service Centres for Disease Control and Prevention National Institutes of Health. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 6th Edition Revised June 2020. , Available from: https://www.cdc.gov/labs/pdf/SF_19_308133-A_BMBL6_00-BOOK-WEB-final-3.pdf (2022).
- APHA. Fixation, tissue processing, histology and immunohistochemistry procedures for diagnosis of animal TSE (BSE, scrapie, atypical scrapie, CWD). Histo & IHC protocols for TSE diagnosis_Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2022).
- Sample requirements for TSE testing and confirmation. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- TSE EU Reference Laboratory Guidelines for the detection of Chronic Wasting Disease in cervids. Version 1.0. TSE EURL. , Available from: https://www.izsplv.it/it/istituto/212-centri-eccellenza/laboratori-internazionali-riferimento/422-eurl_tses.html (2019).
- Machado, C. N., et al. TSE Monitoring in Wildlife Epidemiology, Transmission, Diagnosis, Genetics and Control. Wildlife Population Monitoring. IntechOpen. , (2019).
- APHA. Neuropathology: Confirmatory diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in cattle and small ruminants. Confirmatory (Histo & IHC) diagnostic criteria Rev_Jan2019.pdf. TSEglobalNet - International Reference Laboratory for TSE. , via.gov.uk (2019).
- Ryder, S. J., Spencer, Y. I., Bellerby, P. J., March, S. A. Immunohistochemical detection of PrP in the medulla oblongata of sheep: The spectrum of staining in normal and scrapie-affected sheep. The Veterinary Record. 148 (1), 7-13 (2001).
- Simmons, M. M., et al. Experimental classical bovine spongiform encephalopathy: definition and progression of neural PrP immunolabeling in relation to diagnosis and disease controls. Veterinary Pathology. 48 (5), 948-963 (2011).
- Orge, L., et al.
- Orge, L., Simas, J. P., Fernandes, A. C., Ramos, M., Galo, A. Similarity of the lesion profile of BSE in Portuguese cattle to that described in British cattle. Veterinary Record. 147 (17), 486-488 (2000).
- Pires, M. A., Travassos, F. S., Gärtner, F.
- Pires, M. A., et al.
