Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

माउस सहज ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस मॉडल की पीढ़ी

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

हाशिमोटो के थायरॉयडिटिस के कई प्रकार के पशु मॉडल स्थापित किए गए हैं, जैसा कि एनओडी माउस में सहज ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस है। एच -2 एच 4 चूहे एचटी प्रेरण के लिए एक सरल और विश्वसनीय मॉडल हैं। यह लेख इस दृष्टिकोण का वर्णन करता है और एसएटी मुराइन मॉडल की बेहतर समझ के लिए पैथोलॉजिकल प्रक्रिया का मूल्यांकन करता है।

Abstract

हाल के वर्षों में, हाशिमोटो की थायरॉयडिटिस (एचटी) सबसे आम ऑटोइम्यून थायरॉयड रोग बन गई है। यह लिम्फोसाइट घुसपैठ और विशिष्ट सीरम ऑटोएंटीबॉडी का पता लगाने की विशेषता है। हालांकि संभावित तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है, हाशिमोटो के थायरॉयडिटिस का जोखिम आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों से संबंधित है। वर्तमान में, ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस के कई प्रकार के मॉडल हैं, जिनमें प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस (ईएटी) और सहज ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस (एसएटी) शामिल हैं।

चूहों में ईएटी एचटी के लिए एक आम मॉडल है, जिसे थायरोग्लोबुलिन (टीजी) के साथ संयुक्त लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) के साथ प्रतिरक्षित किया जाता है या पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए) के साथ पूरक किया जाता है। ईएटी माउस मॉडल व्यापक रूप से कई प्रकार के चूहों में स्थापित है। हालांकि, रोग की प्रगति टीजी एंटीबॉडी प्रतिक्रिया से जुड़ी होने की अधिक संभावना है, जो विभिन्न प्रयोगों में भिन्न हो सकती है।

एनओडी में एचटी के अध्ययन में एसएटी का भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। H-2h4 माउस. The NOD. H2H4 माउस B10 के साथ नॉनओबेसिटी डायबिटिक (NOD) माउस के क्रॉस से प्राप्त एक नया तनाव है। ए (4 आर), जो आयोडीन खिलाने के साथ या बिना एचटी के लिए काफी प्रेरित है। प्रेरण के दौरान, एनओडी। एच -2 एच 4 माउस में थायरॉयड कूपिक ऊतक में लिम्फोसाइट घुसपैठ के साथ टीजीएबी का उच्च स्तर होता है। हालांकि, इस प्रकार के माउस मॉडल के लिए, आयोडीन के प्रेरण के दौरान पैथोलॉजिकल प्रक्रिया का व्यापक रूप से मूल्यांकन करने के लिए कुछ अध्ययन हैं।

एचटी अनुसंधान के लिए एक एसएटी माउस मॉडल इस अध्ययन में स्थापित किया गया है, और आयोडीन प्रेरण की लंबी अवधि के बाद पैथोलॉजिकल परिवर्तन प्रक्रिया का मूल्यांकन किया जाता है। इस मॉडल के माध्यम से, शोधकर्ता एचटी के पैथोलॉजिकल विकास को बेहतर ढंग से समझ सकते हैं और एचटी के लिए नए उपचार विधियों को स्क्रीन कर सकते हैं।

Introduction

हाशिमोटो के थायरॉयडिटिस (एचटी), जिसे क्रोनिक लिम्फोसाइटिक थायरॉयडिटिस या ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस के रूप में भी जाना जाता है, पहली बार 1912 1 में रिपोर्ट किया गयाथा। एचटी लिम्फोसाइट घुसपैठ और थायराइड कूपिक ऊतक को नुकसान की विशेषता है। प्रयोगशाला परीक्षण मुख्य रूप से थायरॉयड-विशिष्ट एंटीबॉडी को बढ़ाने के रूप में प्रकट होते हैं, जिसमें एंटी-थायरोग्लोबुलिन एंटीबॉडी (टीजीएबी) और एंटी-थायरॉयड पेरोक्सीडेज एंटीबॉडी (टीपीओएबी)2 शामिल हैं। एचटी की घटना 0.4% -1.5% की सीमा में है, जो सभी थायराइड रोगों के 20% -25% के लिए जिम्मेदार है, और यह मूल्य हाल के वर्षों में बढ़ गयाहै। इसके अलावा, बड़ी संख्या में अध्ययनों ने बताया है कि एचटी ऑन्कोजेनेसिस और पैपिलरी थायराइड कार्सिनोमा (पीटीसी) 4,5 की पुनरावृत्ति से जुड़ा हुआ है; संभावित तंत्र अभी भी विवादास्पद हैं। ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस भी महिला बांझपनमें एक महत्वपूर्ण कारक है। इसलिए, एचटी के रोगजनन को स्पष्ट होने की आवश्यकता है, जिसके लिए एक स्थिर और सरल पशु मॉडल आवश्यक है।

एचटी के एटियलजि का अध्ययन करने के लिए, दो मुख्य प्रकार के मुराइन मॉडल नियोजित किए गए हैं, जिनमें प्रयोगात्मक ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस (ईएटी) औरवर्तमान अध्ययनों में सहज ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस (एसएटी) शामिल हैं। अतिसंवेदनशील चूहों को ईएटी मुराइन मॉडल स्थापित करने के लिए विशिष्ट थायरॉयड एंटीजन (कच्चे थायरॉयड, शुद्ध थायरोग्लोबुलिन [टीजी], थायराइड पेरोक्सीडेज [टीपीओ], पुनः संयोजक टीपीओ एक्टोडोमेन और चयनित टीपीओ पेप्टाइड्स सहित) के साथ प्रतिरक्षित किया गया था। इसके अलावा, लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस), पूर्ण फ्रायंड के सहायक (सीएफए), और अन्य असामान्य सहायक सहित सहायक दवाओं का उपयोग टीकाकरण के दौरान प्रतिरक्षा सहिष्णुता 9,10,11,12,13,14,15,16,17 को तोड़ने के लिए भी किया जाता है।

एसएटी मॉडल ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस के सहज विकास का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है, जो एनओडी पर आधारित है। एच -2 एच 4 चूहे। The NOD. एच -2 एच 4 माउस एनओडी और बी 10 के क्रॉस से प्राप्त एक नया तनाव है। ए (4 आर) चूहों, इसके बाद एनओडी के लिए कई बैकक्रॉस, ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस संवेदनशीलता जीन आईएके18,19 के साथ। सिर हिलाना। एच -2 एच 4 चूहों में मधुमेह विकसित नहीं होता है, लेकिन ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस और स्जोग्रेन सिंड्रोम (एसएस) 19 की उच्च घटनाएं होती हैं। अध्ययनों में पाया गया है कि इंट्रासेल्युलर आसंजन अणु -1 (आईसीएएम -1) एनओडी के थायरॉयड ऊतक में अत्यधिक व्यक्त किया जाता है। 3-4 सप्ताह की उम्र में एच -2 एच 4 चूहे। इसके अलावा, आयोडीन के सेवन में वृद्धि के साथ, थायरोग्लोबुलिन अणु की इम्युनोजेनेसिटी को बढ़ाया जाता है, जो आईसीएएम -1 की अभिव्यक्ति को आगे बढ़ाता है, जो मोनोसाइट घुसपैठ21 की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह मॉडल आयोडीन खुराक और रोग की गंभीरता के बीच संबंधों को सत्यापित करते हुए ऑटोइम्यून प्रक्रिया का अनुकरण करता है। स्थापित विधि स्थिर है, सफलता की उच्च संभावना के साथ। एसएटी मॉडल को कई वर्षों से ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस को प्रेरित करने के लिए लागू किया गया है और ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी तरीका जारी है। हालांकि, ईएटी मॉडल की वर्तमान निर्माण विधि अधिक जटिल और महंगी है; विभिन्न प्रयोगशालाएं विभिन्न टीकाकरण विधियों और इंजेक्शन साइटों का उपयोग करती हैं। इसके अलावा, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि वाले चूहों में प्रेरण की अलग-अलग दर होती है, जिन्हें शक्तिशाली तंत्र को प्रकट करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता होती है।

हालांकि, एसएटी मॉडल में थायरॉयडिटिस का विकास सोडियम आयोडाइड, यौन द्विरूपता और पालन की स्थिति से जुड़ा हुआ है। एसएटी मॉडल में ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस की उचित प्रक्रिया को प्रकट करने के लिए, इस लेख ने विभिन्न स्थितियों में ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस के प्रेरण की विधि का वर्णन किया। इसके अलावा, यह इस बीमारी के विभिन्न चरणों में ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस के रोगजनन और प्रतिरक्षात्मक प्रगति के अध्ययन की अनुमति देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

नीचे वर्णित प्रोटोकॉल सिचुआन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा स्थापित देखभाल और उपयोग दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. तैयारी

  1. सभी चूहों को 12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्रों के तहत विशिष्ट रोगज़नक़-मुक्त स्थितियों में घर दें (क्रमशः 07:00 बजे और 07:00 बजे शुरू होता है)। कमरे के तापमान को 22 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। बिस्तर सामग्री हर हफ्ते बदलें। मानक कृंतक चाउ और पानी की पर्याप्त मात्रा प्रदान करें।
  2. पानी में एनएआई के स्टॉक समाधान तैयार करते समय, यौगिक के 2.5 ग्राम का वजन करें और इसे 5% का स्टॉक समाधान देने के लिए भंवर के तहत 50 मिलीलीटर बाँझ, शुद्ध पानी में घोलें। इस स्टॉक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें, प्रकाश से बचें, 8 सप्ताह तक।
  3. एनएआई का एक कार्यशील समाधान तैयार करने के लिए, 2.5 एमएल स्टॉक समाधान तैयार करें और इसे एनओडी के लिए दैनिक पेयजल के रूप में 250 मिलीलीटर नियमित पानी में घोलें। एच -2 एच 4 चूहों, 0.05% का कामकाजी समाधान देने के लिए।

2. थायरॉयडिटिस का प्रेरण

  1. SAT मॉडल
    1. NOD तैयार करें। एच -2 एच 4 चूहों (8 सप्ताह की उम्र) ने चरण 1.1 में वर्णित भोजन की स्थिति के साथ बाधा पिंजरों (प्रति पिंजरे में पांच जानवर) में एकल लिंग (कोई यौन द्विरूपता नहीं) के सभी चूहों को आवास करके अध्ययन किया।
    2. एनओडी में ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस को प्रेरित करने के लिए। एच -2 एच 4 चूहों, सभी चूहों को 8 सप्ताह के लिए 0.05% एनएआई के साथ खिलाएं। हर हफ्ते एनएआई पानी बदलें और साप्ताहिक आधार पर चूहों की स्थिति का आकलन करें, जिसमें उपस्थिति, वजन, भूख, मानसिक स्थिति और गतिशीलता शामिल है।
  2. ईएटी मॉडल
    1. चरण 1.1 में वर्णित भोजन की स्थिति के साथ बैरियर पिंजरों (प्रति पिंजरे में पांच जानवर) में एकल लिंग (कोई यौन द्विरूपता नहीं) के सभी चूहों को आवास देकर अध्ययन के लिए बीएएलबी / सी चूहों (8 सप्ताह की आयु) को तैयार करें। 8 सप्ताह के लिए 0.05% एनएआई के साथ सभी चूहों को खिलाएं।
    2. पहले 2 हफ्तों के दौरान, चमड़े के नीचे सप्ताह में एक बार सीएफए और टीजी (200 μL) का मिश्रण इंजेक्ट करें।
    3. तीसरे सप्ताह से, चमड़े के नीचे 3 सप्ताह के लिए सप्ताह में एक बार आईएफए और टीजी (200 μL) के मिश्रण को इंजेक्ट करें।

3. माप

  1. परिधीय रक्त के नमूने तैयार करना
    1. प्रेरण के बाद, इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा 0.01 एमएल / जी एनेस्थेटिक की मात्रा के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में मिडाज़ोलम (बेहोश करने के लिए 40 μg/100 μL), मेडेटोमिडीन (बेहोश करने के लिए 7.5 μg/100 μL), और ब्यूट्रोफेनोल टार्टरेट (एनाल्जेसिया के लिए 50 μg/100 μL) मिलाकर एनेस्थेटिक तैयार करें।
      नोट: संज्ञाहरण मिश्रण में प्रत्येक घटक की विशिष्ट सांद्रता हैं: मिडाज़ोलम 13.33μg / 100μL, मेडेटोमिडीन 2.5μg / 100μL, और ब्यूट्रोफोनॉल 16.7μg / 100μL। चूहों में उपयोग की जाने वाली विशिष्ट खुराक के लिए, खुराक हैं: मिडाज़ोलम 4μg / g, मेडेटोमिडीन 0.75μg / g, और ब्यूट्रोफानॉल 1.67μg / एनेस्थीसिया की गहराई की पुष्टि तब की गई जब माउस के अंग की मांसपेशियों को आराम मिला, मूंछों में कोई स्पर्श प्रतिक्रिया नहीं थी, और पेडल रिफ्लेक्स का नुकसान हुआ था।
    2. चूहों को एनेस्थेटाइज करने के बाद, एक हाथ से माउस को ठीक करके और आंख की त्वचा को नेत्रगोलक को बाहर निकालने के लिए दबाकर परिधीय रक्त के नमूने तैयार करें। फिर, केशिका ट्यूब को आंख के आंतरिक कोने में डालें और नाक के तल में 30-45 डिग्री कोण पर प्रवेश करें। केशिका ट्यूब को धीरे से घुमाते हुए दबाव लागू करें। रक्त केशिका कार्रवाई के माध्यम से ट्यूब में प्रवाहित होगा।
    3. रक्त को 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में रखें और फिर नमूना प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। आगे के विश्लेषण के लिए, शेष नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. थायराइड ऊतक के नमूने की तैयारी
    1. संस्थागत नीतियों के अनुसार मानवीय रूप से पशु को इच्छामृत्यु दें। फिर, दिल को उजागर करने के लिए छाती की दीवार को विच्छेदित करें, दाएं आलिंद को काट दें, और 20 एमएल सिरिंज से जुड़ी अंतःशिरा जलसेक सुई द्वारा बाएं वेंट्रिकल में खारा डालें जब तक कि ऊतक सफेद न हो जाए।
    2. पिन के साथ विच्छेदन तालिका पर माउस ठीक करें। 75% इथेनॉल के साथ गर्दन को स्टरलाइज़ करें। गर्दन के ऊतकों को पूरी तरह से उजागर करने के लिए ऊतक कैंची के साथ उरोस्थि के शीर्ष से निचले जबड़े तक गर्दन की मध्य रेखा के साथ माउस की त्वचा को काटें।
    3. गुलाबी ग्रंथियों की जोड़ी का निरीक्षण करें, सबमैंडिबुलर ग्रंथियां, जिसके नीचे पूर्ववर्ती श्वासनली की मांसपेशी है। श्वासनली और थायरॉयड उपास्थि को उजागर करने के लिए नेत्र कैंची और बल के साथ ग्रंथियों और मांसपेशियों को अलग करें।
    4. उपास्थि और श्वासनली को एक साथ लेने के लिए घुमावदार बल का उपयोग करके उपास्थि के नीचे ऊतक को अलग करें। क्रमशः उपास्थि और श्वासनली के बाहर और समीपस्थ सिरों को काट लें, और श्वासनली के साथ थायरॉयड ग्रंथि को हटा दें।
    5. ग्रंथियों को 12-24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में डुबोएं। फिर, ऊतक को 70% इथेनॉल में स्थानांतरित करें।
    6. प्रसंस्करण कैसेट में थायराइड बायोप्सी सामग्री के अलग-अलग लोब रखें और निम्नलिखित सीरियल अल्कोहल ढाल के माध्यम से निर्जलित करें: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, प्रत्येक 40 मिनट के लिए इथेनॉल; 2 घंटे के लिए 1/2 जाइलीन + 1/2 पूर्ण इथेनॉल; 1.5 घंटे के लिए 100% जाइलीन; 1.5 घंटे के लिए 100% जाइलीन; 2 घंटे के लिए 1/2 जाइलीन + 1/2 पैराफिन; 40 मिनट के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ओवन; 30 मिनट के लिए पैराफिन आई; और 30 मिनट के लिए पैराफिन II। उन्हें पैराफिन मोम ब्लॉक में एम्बेड करें।
    7. धुंधला होने से पहले, जाइलीन में 5 μm मोटी थायराइड ऊतक अनुभाग (निम्नानुसार) और इथेनॉल की निम्नलिखित घटती सांद्रता के माध्यम से पुन: हाइड्रेट करें: 10 मिनट के लिए जाइलीन I; 10 मिनट के लिए जाइलीन II; 10 मिनट के लिए जाइलीन III; 5 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल I; 5 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल II; 5 मिनट के लिए 90% शराब; 5 मिनट के लिए 80% शराब; 5 मिनट के लिए 70% शराब; और 5 मिनट के लिए 50% शराब।
    8. ऊतकों को हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) के साथ दाग दें। 15 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन के साथ दाग लगाएं, 15 मिनट के लिए नल के पानी से कुल्ला करें, 10 सेकंड के लिए 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड इथेनॉल जोड़ें, बहते पानी से कुल्ला करें, और फिर 3 मिनट के लिए 50%, 70%, और 80% इथेनॉल के साथ कुल्ला करें। 2 मिनट के लिए 0.5% इओसिन इथेनॉल धुंधला करें और बहते पानी से कुल्ला करें। पैराफिन अनुभागों को क्रमिक रूप से 2 मिनट के लिए 75% इथेनॉल, 2 मिनट के लिए 85% इथेनॉल, 5 मिनट के लिए पूर्ण इथेनॉल और 5 मिनट के लिए जाइलीन में रखें। स्लाइस को तटस्थ गम और ग्लास स्लाइड के साथ ठीक करें।
    9. लिम्फोसाइटिक थायरॉयडिटिस की सीमा का मूल्यांकन करने के लिए, थायरॉयड वर्गों को निम्नानुसार स्कोर करें: 0: थायराइड ऊतक में बहुत कम या कोई लिम्फोसाइट घुसपैठ नहीं; 1+: ग्रंथि का 1/8 से अधिक एक या कई फॉसी में घुसपैठ करता है; 2+: ग्रंथि के 1/4 से अधिक लिम्फोसाइटों के साथ घुसपैठ नहीं की जाती है; 3+: ग्रंथि का 1/4-1/2 लिम्फोसाइटों के साथ घुसपैठ किया जाता है; 4+: ग्रंथि का 1/2 से अधिक हिस्सा नष्ट हो जाता है।
      नोट: माउस थायरॉयड की पूरी संरचना को रखने के लिए थायरॉयड उपास्थि को हटाने की सिफारिश की जाती है, जो श्वासनली से हटाने के लिए बहुत छोटा है।
  3. टीपीओएबी का मापन
    नोट: चीनी हैम्स्टर अंडाशय (सीएचओ) कोशिकाएं माउस टीपीओ को स्थिर रूप से व्यक्त करती हैं जो हमारी प्रयोगशाला में स्थापित की गई थीं। माउस टीपीओ सीडीएनए को एक्सबीएआई और एनएचईआई द्वारा उत्पादित किया गया था। फिर, सीडीएनए को पीसीडीएनए 5 / एफआरटी में स्थानांतरित कर दिया गया था। प्लास्मिड का सफलतापूर्वक निर्माण होने के बाद, इसे सीएचओ कोशिकाओं में स्थानांतरित कर दिया गया और हाइग्रोमाइसिन बी (100 ग्राम / एमएल) के साथ चुना गया।
    1. एमटीपीओ-सीएचओ कोशिकाओं के निर्माण के बाद, माउस सेरा को चरण 3.1.3 (1:50) से पतला करें और 2 घंटे के लिए एमटीपीओ-सीएचओ कोशिकाओं के साथ इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, प्रोपिडियम आयोडाइड (1 ग्राम / एमएल) के साथ सेल धुंधला करने को बाहर करें और फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट-संयुग्मित, आत्मीयता-शुद्ध बकरी एंटी-माउस आईजीजी का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा नमूने का विश्लेषण करें। एफएससी-ए और एसएससी-ए चैनलों द्वारा जीवित एकल-कोशिका आबादी को स्क्रीन करें और एकल-कोशिकाआबादी से एफआईटीसी- और पीआई-टैग की गई कोशिकाओं का चयन करें।
    2. नकारात्मक नियंत्रण के रूप में आईजीजी से बंधे अप्रतिरक्षित बीएएलबी / सी या सी 57बीएल / 6 चूहों के सीरम को शामिल करें। माउस टीपीओ 22 को सकारात्मक नियंत्रण के रूप में मानव टीपीओ22 के लिए माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी शामिल करें जो माउस टीपीओ23 को पहचानते हैं। ज्यामितीय साधनों के रूप में टीपीओ बाइंडिंग डेटा व्यक्त करें।
  4. टीजीएबी का माप
    नोट: निर्माता के निर्देशों का पालन करके थायरोग्लोबुलिन का पता लगाने के लिए एलिसा किट का उपयोग करें।
    1. निर्देशों के अनुसार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में मानक नमूने को पतला करें। किट को रेफ्रिजरेटर से बाहर निकालें और इसे 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रखें।
    2. मानक कुओं, खाली कुओं और परीक्षण कुओं को सेट करें। खाली कुओं को केवल बफर मिलता है, जबकि मानक कुओं को मानक समाधान मिलते हैं। परीक्षण कुओं में 10 μL नमूने जोड़ें। नमूने जोड़ते समय, कुओं की दीवारों को छूने की कोशिश न करें, और नमूने को कुओं के तल पर ले जाने के लिए प्लेट को धीरे से हिलाएं।
    3. टीजी, सीएफए और आईएफए24 के साथ प्रतिरक्षित बीएएलबी / सी चूहों से सीरम को 8 सप्ताह के एनओडी से सकारात्मक नियंत्रण और सीरम के रूप में शामिल करें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नियमित पानी पर एच -2 एच 4 चूहे।
    4. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नमूने को इनक्यूबेट करें। 1: 30 के अनुपात में आसुत जल के साथ वॉशिंग बफर को पतला करें। फिर, सीलिंग फिल्म को हटा दें, एंजाइम प्लेट के अंदर तरल को हिलाएं और शोषक कागज पर सूखा दें, और 30 सेकंड के लिए 350 μL वॉशिंग बफर जोड़ें। इस प्रक्रिया को पांच बार दोहराएं और फिर कुओं को सूखा दें।
    5. रिक्त कुओं को छोड़कर, प्रत्येक कुएं में एंजाइम लेबलिंग अभिकर्मक के 50 μL जोड़ें, और 30 मिनट के लिए 37 ° पानी के स्नान में इनक्यूबेट करें। सीलिंग फिल्म को हटा दें, एंजाइम प्लेट के अंदर तरल को हिलाएं, और शोषक कागज पर सूखा दें।
    6. प्रत्येक कुएं में डेवलपर ए के 50 μL जोड़ें और उसके बाद डेवलपर B के 50 μL जोड़ें और धीरे से 5 मिनट के लिए मिश्रण करने के लिए कुओं को हिलाएं। प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 15 मिनट के लिए प्रत्येक कुएं में समाप्ति समाधान के 50 μL जोड़ें। माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर प्रत्येक कुएं के अवशोषण (ओडी) को मापें। टीजीएबी डेटा को ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) के रूप में 490 एनएम पर प्रस्तुत करें।
  5. टी 4 और थायराइड उत्तेजक हार्मोन (टीएसएच) का माप
    नोट: निर्माता के निर्देशों का पालन करके एलिसा द्वारा टी 4 और टीएसएच स्तर (10 μL एलिकोट में) मापें।
    1. परख डिल्यूनेट के साथ एंजाइम संयुग्म को 1: 11 तक पतला करें; 0.01 एम पीबीएस का उपयोग करके मापा जाने वाला (1:100) नमूने पतला करें।
    2. मानक और नमूने के 10 μL को संबंधित कुओं में जोड़ें, प्रत्येक कुएं में 100 μL एंजाइम संयुग्म जोड़ें, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. तरल को कुओं में फेंक दें और इसे तीन बार वॉशिंग बफर से साफ करें।
    4. 3,3',5,5'-टेट्रामिथाइल बेंज़िडीन (टीएमबी) के 100 μL जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    5. स्टॉप घोल के 50 μL जोड़ें और 15-20 s के लिए धीरे से मिलाएं।
    6. 450 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके अवशोषण (ओडी) निर्धारित करें और नमूना एकाग्रता की गणना करें।
    7. टी-टेस्ट या रैंक सम टेस्ट करने के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और परिणामों को प्लॉट करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन महिला और पुरुषों में काफी भिन्न थे, आयोडीन सेवन की अवधि, और एनएआई का समाधान। जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, NOD का ~ 10%। एच -2 एच 4 चूहों ने 24 सप्ताह की उम्र में आयोडीन प्रेरण के बिना भी एसएटी विकसित किया, और सभी चूहों ने अंततः थायरॉयडिटिस विकसित किया। जब नियमित पानी दिया जाता है, तो पुरुषों और महिलाओं के बीच हिस्टोलॉजिकल परिवर्तनों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। पीने के पानी में एनएआई के अलावा थायरॉयडिटिस के विकास में तेजी आई। एनएआई पानी देने के बाद 0.005%, 0.05%, और 0.5% के समाधान में, एसएटी क्रमशः सप्ताह 16, 8 और 8 में अधिकतम गंभीरता तक पहुंच गया। एक बार थायरॉयडिटिस प्रेरित होने के बाद, माउस के पूरे जीवन में लिम्फोसाइट घुसपैठ जारी रही। प्रेरण के दौरान, मादा चूहों को एक ही स्थिति के तहत पुरुषों की तुलना में अधिक गंभीर थायरॉयडिटिस विकसित करने की प्रवृत्ति थी, लेकिन लिम्फोसाइटिक घुसपैठ की गंभीरता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, जो नमूनों की संख्या से सीमित हो सकता है।

जब अतिरिक्त आयोडीन के बिना नियमित पानी दिया जाता है, तो 16 सप्ताह की उम्र में टीजीएबी का स्तर काफी नहीं बढ़ा, और पुरुषों और महिलाओं के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। NOD में TGAB का स्तर। एच -2 एच 4 चूहों ने 24 सप्ताह में बढ़ना शुरू कर दिया, लिंगों के बीच कोई अंतर नहीं था, और टीजीएबी का स्तर 72 सप्ताह तक बढ़ता रहा (चित्रा 2 ए)। पीने के पानी में एनएआई को जोड़ने के साथ, टीजीएबी का स्तर क्रमशः 0.005%, 0.05% और 0.5% एनएआई के समाधान के साथ सप्ताह 16, 8 और 8 में बढ़ना शुरू हुआ। हालांकि, टीजीएबी के स्तर ने किसी भी समाधान में पुरुषों और महिलाओं के बीच कोई अंतर नहीं दिखाया (चित्रा 2 बी-डी)। भले ही एनएआई पानी दिया गया था, टीजीएबी का स्तर 72 सप्ताह की उम्र में अपने उच्चतम स्तर पर पहुंच गया (या एनएआई पानी पहली बार दिए जाने के 64 सप्ताह बाद)।

टीजीएबी की तुलना में टीपीओएबी स्तरों की पता लगाने की क्षमता में अधिक देरी हुई। इन एंटीबॉडी को शायद ही कभी एनओडी में पाया गया था। 24 सप्ताह की उम्र में नियमित पानी के साथ एच -2 एच 4 चूहे। जब नियमित पानी के साथ खिलाया जाता है, तो महिलाओं ने 72 सप्ताह में पुरुषों की तुलना में बहुत अधिक टीपीओएबी स्तर का प्रदर्शन किया (चित्रा 2 ई)। इंटरसेक्स अंतर की यही प्रवृत्ति एनओडी में भी उभर रही थी। 16, 8 और 8 सप्ताह की अवधि के दौरान एच -2 एच 4 चूहों को क्रमशः 0.005%, 0.05%, और 0.5% का एनएआई पानी दिया गया (चित्रा 2 एफ-एच) उल्लेखनीय रूप से, हालांकि, जब प्रेरण के दौरान एनएआई की एकाग्रता 0.05% से अधिक थी, तो टीपीओएबी का स्तर पहली बार एनएआई पानी दिए जाने के 64 सप्ताह बाद अपने उच्चतम स्तर पर पहुंच गया, और पुरुषों और महिलाओं के बीच कोई अंतर नहीं था (चित्रा 2 जी, एच)।

इसके अलावा, पुरुष एनओडी में सीरम टीएसएच का स्तर। एच -2 एच 4 चूहे विभिन्न भोजन चरणों में महिलाओं की तुलना में काफी अधिक थे, भले ही एनएआई पानी दिया गया हो या नहीं। जब नियमित रूप से पानी दिया जाता है, तो एनओडी का टीएसएच स्तर। एच -2 एच 4 चूहों ने 24 सप्ताह की उम्र में वृद्धि शुरू की, और आयोडीन आहार समूहों में आयोडीन आहार समूहों में क्रमशः 16, 8 और 8 सप्ताह में 0.005%, 0.05% और 0.5% की सांद्रता के साथ एक समान प्रवृत्ति देखी गई, जब आयोडीन अलग से दिया गया था। टीएसएच का स्तर प्रेरण अवधि के दौरान बढ़ता रहा, 64 सप्ताह में चरम पर पहुंच गया। इसके अलावा, एनओडी के बाकी हिस्सों में पुरुषों और महिलाओं के बीच टीएसएच के स्तर में महत्वपूर्ण अंतर था। एच -2 एच 4 चूहों (चित्रा 3 ए-डी)। सिर हिलाना। एच -2 एच 4 चूहों को आयोडीन अंतर्ग्रहण के बाद गोइटर या हाइपोथायरायडिज्म का अनुभव नहीं हुआ। भले ही आयोडीन एजेंटों को प्रशासित किया गया था, एनओडी में टी 4 स्तरों में सेक्स से संबंधित कोई अंतर नहीं था। एच -2 एच 4 चूहे। हालांकि, प्रेरण की अवधि बढ़ने के साथ, टी 4 के स्तर में आयोडीन जल समूहों में दोनों लिंगों में कमी की प्रवृत्ति थी (कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं) (चित्रा 3 ई-एच)।

पैथोलॉजिकल प्रक्रिया में यौन द्विरूपता और एनओडी की संतान में टीपीओएबी स्तर पाए गए। एच -2 एच 4 चूहे, लेकिन टीजीएबी नहीं। अन्य अध्ययनों25,26 के समान, 2-4 महीने के लिए आहार आयोडाइड प्राप्त करने के बाद मॉडल चूहों में टीपीओएबी का स्तर काफी बढ़ गया था, और सेक्स से संबंधित अंतर था। इसके अलावा, टीएसएच का स्तर महिला एनओडी की तुलना में पुरुष में अधिक था। आहार आयोडाइड पूरकता के साथ या बिना एच -2 एच 4 चूहे, जो अन्य माउस उपभेदों के समान है। यह अंतर जानवरों के पूरे जीवन में बना रहा, जो टीपीओएबी या टीजीएबी के स्तर से प्रभावित नहीं हो सकता है। 0.05% एनएआई के संपर्क में आने पर, अधिकांश चूहों ने 8 सप्ताह में थायरॉयडिटिस विकसित किया, जिसका 0.5% एनएआई के साथ समान प्रभाव पड़ा। जबकि 0.005% एनएआई का एनओडी पर समान प्रभाव पड़ा। एच -2 एच 4 चूहों को नियमित पानी के साथ खिलाया जाता है, 0.05% एनएआई की एकाग्रता (प्रेरण के 8 सप्ताह के बाद) ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस को प्रेरित करने के लिए बेहतर स्थिति हो सकती है। NOD में T4 का स्तर। एच -2 एच 4 चूहों में कोई सेक्स से संबंधित अंतर नहीं था और आयोडीन एजेंटों से प्रभावित नहीं थे, जो अन्य अध्ययनों27,28 के अनुरूप है। यह रोग के अपेक्षाकृत कम शुरुआत समय और चूहों के प्रतिपूरक थायरॉयड फ़ंक्शन के कारण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप चूहों में सबक्लिनिकल हाइपोथायरायडिज्म के समान घटना होती है। हम अनुमान लगाते हैं कि चूहों की टीएसएच धुरी अंततः विघटित हो जाएगी और समय के साथ अंतर पैदा करेगी।

Figure 1
चित्रा 1: एनओडी में थायरॉयड ग्रंथियों के पैथोलॉजिकल परिवर्तन और लिम्फोसाइट घुसपैठ भड़काऊ स्कोर। आयोडीन आहार के साथ / बिना एच -2 एच 4 चूहे। (ए, सी, ई, जी) आयोडीन आहार के तहत थायराइड ग्रंथि के पैथोलॉजिकल परिवर्तन 0%, 0.005%, 0.05%, और 0.5% एचई धुंधला होने से; 200x आवर्धन, N = 10/समूह। (बी, डी, एफ, जी) थायराइड सूजन लिम्फोसाइट घुसपैठ क्षेत्र के अनुसार निर्धारित किया गया था; लिम्फोसाइट घुसपैठ की डिग्री की ग्रेडिंग: 0: लगभग कोई लिम्फोसाइट घुसपैठ नहीं; 1+: ग्रंथि के आठवें से अधिक पर आक्रमण किया जाता है; 2+: ग्रंथि के एक-चौथाई हिस्से पर आक्रमण किया जाता है; 3+: ग्रंथि के एक-चौथाई से एक-आधे हिस्से पर आक्रमण किया जाता है; 4+: ग्रंथि का आधे से अधिक हिस्सा नष्ट हो जाता है। N = 10/समूह महत्वपूर्ण अंतर: * पी < 0.05; ** पी < 0.01. संक्षेप: एफ = महिला; एम = पुरुष; NW = N सप्ताह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एनओडी में ऑटोएंटीबॉडी। नियमित और आयोडाइड युक्त पानी पर एच -2 एच 4 चूहे। (A-D) एनओडी में टीजी के लिए ऑटोएंटीबॉडी। नियमित पानी (8, 16, 24, और 72 सप्ताह की उम्र में अलग-अलग) और आयोडाइड पानी -0.005%, 0.05%, और 0.5% (आयोडीन पानी शुरू होने के 0, 8, 16 और 64 सप्ताह बाद) पर एच -2 एच 4 चूहे। (E-H) एनओडी में टीपीओ के लिए ऑटोएंटीबॉडी। नियमित पानी (8, 16, 24, और 72 सप्ताह की उम्र में अलग-अलग) और आयोडाइड पानी -0.005%, 0.05%, और 0.5% (आयोडीन पानी शुरू होने के 0, 8, 16 और 64 सप्ताह बाद) पर एच -2 एच 4 चूहे। टीजीएबी के लिए मानों को एलिसा ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) 490 एनएम (औसत एसईएम की औसत ± मानक त्रुटि) के रूप में रिपोर्ट किया जाता है और टीपीओएबी के लिए मानों को फ्लो साइटोमेट्री में ज्यामितीय माध्य के रूप में रिपोर्ट किया जाता है। N = 8/समूह महत्वपूर्ण अंतर: * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.001. संक्षेप: टीजी = थायरोग्लोबुलिन; टीजीएबी = टीजी के लिए ऑटोएंटीबॉडी; टीपीओ = थायराइड पेरोक्सीडेज; टीपीओएबी = टीपीओ के लिए ऑटोएंटीबॉडी; एफ = महिला; एम = पुरुष; NW = N सप्ताह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: NOD में TSH और T4 स्तर। नियमित और आयोडाइड युक्त पानी पर एच -2 एच 4 चूहे। (A-D) नियमित पानी पर टीएसएच और (ई-एच) टी 4 का स्तर (8, 16, 24, और 72 सप्ताह की उम्र में अलग-अलग) और आयोडाइड पानी -0.005%, 0.05%, और 0.5% (आयोडीन पानी शुरू होने के 0, 8, 16 और 64 सप्ताह बाद)। टीएसएच मूल्यों को रेडियोइम्यूनोसे (एमयू / एल, मतलब ± एसईएम की मानक त्रुटि) द्वारा मापा गया था। N = 8/समूह महत्वपूर्ण अंतर: * पी < 0.05; ** पी < 0.01; पी < 0.001; * पी < 0.0001. संक्षेप: टीएसएच = थायराइड उत्तेजक हार्मोन; एफ = महिला; एम = पुरुष; NW = N सप्ताह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एचटी एक ऑटोइम्यून सिस्टम विकार के कारण होता है जो लिम्फोसाइटों द्वारा थायरॉयड ग्रंथि में घुसपैठ करता है, थायरॉयड-विशिष्ट एंटीबॉडी का उत्पादन करते समय थायराइड फ़ंक्शन को और खराब करता है। एचटी रोगियों में सीरम टीएसएच, टीजीएबी और टीपीओएबी का स्तर काफी ऊंचाहै। वर्तमान में, ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस के एटियलजि का अध्ययन करने के लिए दो मुख्य प्रकार के मुराइन मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है: ईएटी और एसएटी29। ईएटी चूहों को ज्यादातर विवो में असामान्य प्रतिरक्षा वातावरण बनाने के लिए प्रोटीन और सहायक दवाओं का उपयोग करके प्रतिरक्षित किया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग कई वर्षों से किया जा रहा है और यह प्रभावी30,31 है। इसके अलावा, थायरॉयडिटिस को प्रेरित करने के लिए नए तरीकों में टीजी32 के साथ स्पंदित डेंड्रिक कोशिकाओं (डीसी) को इंजेक्ट करना, एडेनोवायरल वैक्टर या प्लास्मिड31 द्वारा विवो में टीजी या टीपीओ की अभिव्यक्ति, एलोजेनिक चूहों की थायरॉयड ग्रंथि को प्रत्यारोपित करना और एलपीएस को इंजेक्ट करना शामिल है। हालांकि, थायरॉयडिटिस मॉडल का सफल निर्माण आमतौर पर प्रयोगात्मक मुराइन मॉडल, सिंजेनिक एंटीजन और सेल जीव विज्ञान प्रौद्योगिकियों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि से अधिक प्रतिबंधित होता है। इसके अलावा, विशिष्ट सहायक एक अधिक जटिल प्रतिरक्षा वातावरण को प्रेरित कर सकते हैं, जिससे ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस की प्रतिरक्षात्मक प्रक्रिया की जांच करना मुश्किल हो जाता है। इसलिए, हम मानते हैं कि NOD का SAT। एच -2 एच 4 चूहे ईएटी मॉडल की तुलना में हाशिमोटो के थायरॉयडिटिस के रोगजनन को बेहतर ढंग से चित्रित कर सकते हैं। विशेष रूप से, एसएटी33 के लिए शक्तिशाली सहायक और थायरोग्लोबुलिन के साथ टीकाकरण आवश्यक नहीं है। एसएटी की प्रगति को तेज करने के लिए, आयोडीन को एनओडी के पीने के पानी में जोड़ा जाता है। एच -2 एच 4 चूहे। यद्यपि परिणामी थायरॉयडिटिस उसी तंत्र को साझा नहीं करता है जिसके द्वारा मनुष्यों में थायरॉयडिटिस होता है, आयोडीन वास्तव में थायरॉयडिटिस का एक महत्वपूर्ण प्रभाव कारक है। इसके अलावा, इस मॉडल में, आयोडीन एजेंट जल्दी से एनओडी में थायरॉयडिटिस को प्रेरित कर सकते हैं। एच -2 एच 4 चूहे, और एनओडी। एच -2 एच 4 चूहे जो आयोडीन प्राप्त नहीं करते हैं, वे अंततः थायरॉयडिटिस भी विकसित कर सकते हैं। चूंकि अधिकांश प्रयोगशालाओं में प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल अलग है, इसलिए हमने एनओडी के लिए अधिक व्यापक मूल्यांकन किया। थायरॉयडिटिस के प्रेरण के दौरान एच -2 एच 4 चूहे।

मॉडल निर्माण की प्रक्रिया में, कुछ बिंदुओं पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता है। नियमित रूप से पीने के पानी को जोड़ने और चूहों की सामान्य स्थिति का मूल्यांकन करने से आकस्मिक माउस मौतों से बचा जा सकता है। प्रत्येक माउस को पर्याप्त एनएआई फीडिंग प्रदान करने के लिए प्रेरण के दौरान प्रति पिंजरे में पांच से अधिक चूहों को नहीं रखने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, जानवरों के लिए विशिष्ट संस्थान के नियमों और विनियमों के बाद चूहों की संख्या भी बदल सकती है। जैसा कि हमारी प्रयोगशाला में यौन द्विरूपता पाई जाती है, प्रयोग के लिए एकल-सेक्स चूहों का सुझाव दिया जाता है (थायराइड-विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए विशेष आवश्यकताओं वाले प्रयोगों के लिए, मादा की सिफारिश की जाती है)। 8 सप्ताह के चूहों का चयन करने का सुझाव दिया जाता है, क्योंकि 10% चूहों में 16 सप्ताह की उम्र तक सहज थायरॉयडिटिस विकसित होता है और सभी चूहों को अंततः एनएआई पानी के बिना थायरॉयडिटिस विकसित होता है। थायरॉयड घाव चूहों के पूरे जीवनकाल में बने रहते हैं और अगली पीढ़ी पैदा होने पर थायरॉयडिटिस विकसित करती है। इसलिए, चूहों के संरक्षण के लिए, 8 सप्ताह के चूहों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एनओडी का उपयोग करते समय टीपीओएबी टीजीएबी की तुलना में पहचान संकेतक के रूप में अधिक उपयुक्त है। थायरॉयडिटिस की नकल करने के लिए एच -2 एच 4 चूहे। हालांकि, टीपीओएबी के स्तर को मापते समय, प्रेरण की अवधि को टीजीएबी की तुलना में अधिक देरी की आवश्यकता होती है।

निष्कर्ष में, यह पेपर NOD के साथ एक SAT मॉडल की स्थापना का वर्णन करता है। एच -2 एच 4 चूहों और इस मॉडल पर विभिन्न कारकों के प्रभाव की खोज। हालांकि यह ऑटोइम्यून थायरॉयड रोग के रोगजनन और तंत्र को पूरी तरह से अनुकरण नहीं करता है, एनओडी। एच -2 एच 4 माउस ऑटोइम्यून थायराइड रोग के क्षेत्र में बड़ी क्षमता के साथ एक स्थिर पशु मॉडल है। यह देखते हुए कि यह निर्माण के लिए एक आसान पशु मॉडल है और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, यह आशा की जाती है कि यह विधि विभिन्न अनुसंधान संस्थानों में एसएटी मुराइन मॉडल के अनुप्रयोगों को बेहतर बनाने में मदद करेगी।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सभी लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

मानव टीपीओ के लिए माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है) डॉ पी कैरियन और डॉ जे रूफ (मार्सिले, फ्रांस) द्वारा प्रदान किए गए थे। लेखक इस अध्ययन में सभी प्रतिभागियों और हमारी शोध टीम के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। यह काम वेस्ट चाइना हॉस्पिटल, सिचुआन विश्वविद्यालय, चीन (2020एचएक्सबीएच057) और सिचुआन प्रांत विज्ञान और प्रौद्योगिकी सहायता कार्यक्रम (परियोजना संख्या 2021वाईएफएस0166) के पोस्टडॉक्टरल सस्टेंटेशन फंड से अनुदान द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ralli, M., et al. Hashimoto's thyroiditis: An update on pathogenic mechanisms, diagnostic protocols, therapeutic strategies, and potential malignant transformation. Autoimmunity Reviews. 19 (10), 102649 (2020).
  2. Zhang, Q. Y., et al. Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto's thyroiditis. Nature Communications. 13 (1), 775 (2022).
  3. Ruggeri, R. M., et al. Autoimmune comorbidities in Hashimoto's thyroiditis: different patterns of association in adulthood and childhood/adolescence. European Journal of Endocrinology. 176 (2), 133-141 (2017).
  4. Resende de Paiva, C., Grønhøj, C., Feldt-Rasmussen, U., von Buchwald, C. Association between Hashimoto's thyroiditis and thyroid cancer in 64,628 patients. Frontiers in Oncology. 7, 53 (2017).
  5. Ehlers, M., Schott, M. Hashimoto's thyroiditis and papillary thyroid cancer: are they immunologically linked. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (12), 656-664 (2014).
  6. Medenica, S., et al. The role of cell and gene therapies in the treatment of infertility in patients with thyroid autoimmunity. International Journal of Endocrinology. 2022, 4842316 (2022).
  7. Rose, N. R. The genetics of autoimmune thyroiditis: the first decade. Journal of Autoimmunity. 37 (2), 88-94 (2011).
  8. Kolypetri, P., King, J., Larijani, M., Carayanniotis, G. Genes and environment as predisposing factors in autoimmunity: acceleration of spontaneous thyroiditis by dietary iodide in NOD.H2(h4) mice. International Reviews of Immunology. 34 (6), 542-556 (2015).
  9. Terplan, K. L., Witebsky, E., Rose, N. R., Paine, J. R., Egan, R. W. Experimental thyroiditis in rabbits, guinea pigs and dogs, following immunization with thyroid extracts of their own and of heterologous species. The American Journal of Pathology. 36 (2), 213-239 (1960).
  10. Alexopoulos, H., Dalakas, M. C. The immunobiology of autoimmune encephalitides. Journal of Autoimmunity. 104, 102339 (2019).
  11. Noviello, C. M., Kreye, J., Teng, J., Prüss, H., Hibbs, R. E. Structural mechanisms of GABA receptor autoimmune encephalitis. Cell. 185 (14), 2469-2477 (2022).
  12. Pudifin, D. J., Duursma, J., Brain, P. Experimental autoimmune thyroiditis in the vervet monkey. Clinical and Experimental Immunology. 29 (2), 256-260 (1977).
  13. Esquivel, P. S., Rose, N. R., Kong, Y. C. Induction of autoimmunity in good and poor responder mice with mouse thyroglobulin and lipopolysaccharide. The Journal of Experimental Medicine. 145 (5), 1250-1263 (1977).
  14. Kong, Y. C., et al. HLA-DRB1 polymorphism determines susceptibility to autoimmune thyroiditis in transgenic mice: definitive association with HLA-DRB1*0301 (DR3) gene. The Journal of Experimental Medicine. 184 (3), 1167-1172 (1996).
  15. Kotani, T., Umeki, K., Hirai, K., Ohtakia, S. Experimental murine thyroiditis induced by porcine thyroid peroxidase and its transfer by the antigen-specific T cell line. Clinical and Experimental Immunology. 80 (1), 11-18 (1990).
  16. Ng, H. P., Banga, J. P., Kung, A. W. C. Development of a murine model of autoimmune thyroiditis induced with homologous mouse thyroid peroxidase. Endocrinology. 145 (2), 809-816 (2004).
  17. Ng, H. P., Kung, A. W. C. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology. 147 (6), 3085-3092 (2006).
  18. Ellis, J. S., Braley-Mullen, H. Mechanisms by which B cells and regulatory T Cells influence development of murine organ-specific autoimmune diseases. Journal of Clinical Medicine. 6 (2), 13 (2017).
  19. Fang, Y., Yu, S., Braley-Mullen, H. Contrasting roles of IFN-gamma in murine models of autoimmune thyroid diseases. Thyroid. 17 (10), 989-994 (2007).
  20. Fang, Y., Zhao, L., Yan, F. Chemokines as novel therapeutic targets in autoimmune thyroiditis. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 4 (1), 52-57 (2010).
  21. Chen, C. R., et al. Antibodies to thyroid peroxidase arise spontaneously with age in NOD.H-2h4 mice and appear after thyroglobulin antibodies. Endocrinology. 151 (9), 4583-4593 (2010).
  22. Ruf, J., et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology. 125 (3), 1211-1218 (1989).
  23. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., Chong, G., Rapoport, B. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword'. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  24. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., et al. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword’[J]. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  25. Hutchings, P. R., et al. Both CD4(+) T cells and CD8(+) T cells are required for iodine accelerated thyroiditis in NOD mice. Cellular Immunology. 192 (2), 113-121 (1999).
  26. Xue, H., et al. Dynamic changes of CD4+CD25 + regulatory T cells in NOD.H-2h4 mice with iodine-induced autoimmune thyroiditis. Biological Trace Element Research. 143 (1), 292-301 (2011).
  27. Hou, X., et al. Effect of halofuginone on the pathogenesis of autoimmune thyroid disease in different mice models. Endocrine, Metabolic & Immune Disorders Drug Targets. 17 (2), 141-148 (2017).
  28. McLachlan, S. M., et al. Dissociation between iodide-induced thyroiditis and antibody-mediated hyperthyroidism in NOD.H-2h4 mice. Endocrinology. 146 (1), 294-300 (2005).
  29. Danailova, Y., et al. Nutritional management of thyroiditis of hashimoto. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 5144 (2022).
  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
  31. Verginis, P., Li, H. S., Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. Journal of Immunology. 174 (11), 7433-7439 (2005).
  32. Flynn, J. C., et al. Superiority of thyroid peroxidase DNA over protein immunization in replicating human thyroid autoimmunity in HLA-DRB1*0301 (DR3) transgenic mice. Clinical and Experimental Immunology. 137 (3), 503-512 (2004).
  33. Akeno, N., et al. IFN-α mediates the development of autoimmunity both by direct tissue toxicity and through immune cell recruitment mechanisms. Journal of Immunology. 186 (8), 4693-4706 (2011).

Tags

वापसी अंक 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

माउस सहज ऑटोइम्यून थायरॉयडिटिस मॉडल की पीढ़ी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter