Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering af en mus spontan autoimmun thyroiditis model

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Flere typer dyremodeller af Hashimotos thyroiditis er blevet etableret, ligesom spontan autoimmun thyroiditis i NOD-musen. H-2h4 mus er en enkel og pålidelig model til HT-induktion. Denne artikel beskriver denne tilgang og evaluerer den patologiske proces for en bedre forståelse af SAT-murinmodellen.

Abstract

I de senere år er Hashimotos thyroiditis (HT) blevet den mest almindelige autoimmune skjoldbruskkirtelsygdom. Det er karakteriseret ved lymfocytinfiltration og påvisning af specifikke serumautoantistoffer. Selvom den potentielle mekanisme stadig ikke er klar, er risikoen for Hashimotos thyroiditis relateret til genetiske og miljømæssige faktorer. På nuværende tidspunkt er der flere typer modeller af autoimmun thyroiditis, herunder eksperimentel autoimmun thyroiditis (EAT) og spontan autoimmun thyroiditis (SAT).

Spis hos mus er en almindelig model for HT, som immuniseres med lipopolysaccharid (LPS) kombineret med thyroglobulin (Tg) eller suppleres med komplet Freunds adjuvans (CFA). EAT-musemodellen er bredt etableret i mange typer mus. Imidlertid er sygdomsprogressionen mere sandsynligt forbundet med Tg-antistofresponsen, som kan variere i forskellige forsøg.

SAT bruges også i vid udstrækning i undersøgelsen af HT i NOD. H-2H4 mus. NIKKET. H2h4-mus er en ny stamme opnået fra krydsningen af den ikke-overvægtige diabetiske (NOD) mus med B10. A(4R), som induceres signifikant for HT med eller uden tilførsel af jod. Under induktionen, NOD. H-2h4 mus har et højt niveau af TgAb ledsaget af lymfocytinfiltration i skjoldbruskkirtlen follikulært væv. Men for denne type musemodel er der få undersøgelser til omfattende evaluering af den patologiske proces under induktion af jod.

En SAT-musemodel til HT-forskning etableres i denne undersøgelse, og den patologiske ændringsproces evalueres efter en lang periode med jodinduktion. Gennem denne model kan forskerne bedre forstå den patologiske udvikling af HT og screene nye behandlingsmetoder for HT.

Introduction

Hashimotos thyroiditis (HT), også kendt som kronisk lymfocytisk thyroiditis eller autoimmun thyroiditis, blev først rapporteret i 19121. HT er karakteriseret ved lymfocytinfiltration og skade på skjoldbruskkirtlen follikulært væv. Laboratorieundersøgelser manifesteres hovedsageligt som stigende skjoldbruskkirtelspecifikke antistoffer, herunder anti-thyroglobulinantistof (TgAb) og anti-thyroidperoxidase-antistof (TPOAb)2. Forekomsten af HT ligger i intervallet 0,4%-1,5%, hvilket tegner sig for 20%-25% af alle skjoldbruskkirtelsygdomme, og denne værdi er steget i de senere år3. Derudover har et stort antal undersøgelser rapporteret, at HT er forbundet med onkogenese og tilbagefald af papillært thyreoideakarcinom (PTC)4,5; De potentielle mekanismer er stadig kontroversielle. Autoimmun thyroiditis er også en vigtig faktor i kvindelig infertilitet6. Derfor skal patogenesen af HT være klar, for hvilken en stabil og enkel dyremodel er afgørende.

For at studere ætiologien af HT er der anvendt to hovedtyper af murine modeller, herunder eksperimentel autoimmun thyroiditis (EAT) og spontan autoimmun thyroiditis (SAT) i de nuværende undersøgelser 7,8. Modtagelige mus blev immuniseret med specifikke skjoldbruskkirtelantigener (herunder den rå skjoldbruskkirtel, renset thyroglobulin [TG], skjoldbruskkirtelperoxidase [TPO], rekombinant TPO-ektodomæne og udvalgte TPO-peptider) for at etablere EAT-murinmodellen. Derudover anvendes adjuvanserne, herunder lipopolysaccharid (LPS), komplet Freunds adjuvans (CFA) og andre usædvanlige adjuvanser, også under immuniseringen til at nedbryde immuntolerance 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

SAT-modellen er en vigtig model til at studere den spontane udvikling af autoimmun thyroiditis, som er baseret på NOD. H-2H4 mus. NIKKET. H-2h4 mus er en ny stamme opnået fra krydset af NOD og B10. A(4R) mus, efterfulgt af flere backcrosses til NOD, med det autoimmune thyroiditis modtagelighedsgen IAk18,19. NIKKE. H-2h4 mus udvikler ikke diabetes, men har en høj forekomst af autoimmun thyroiditis og Sjögrens syndrom (SS)19. Undersøgelser har vist, at intracellulært adhæsionsmolekyle-1 (ICAM-1) er stærkt udtrykt i skjoldbruskkirtelvævet af NOD. H-2h4 mus ved 3-4 ugers alderen. Desuden forbedres immunogeniciteten af thyroglobulinmolekylet med stigningen i jodindtagelse, hvilket yderligere opregulerer ekspressionen af ICAM-1, som spiller en vigtig rolle i processen med monocytinfiltration21. Denne model simulerer den autoimmune proces, samtidig med at forholdet mellem joddosis og sygdommens sværhedsgrad verificeres. Den etablerede metode er stabil, med stor sandsynlighed for succes. SAT-modellen er blevet anvendt til at fremkalde autoimmun thyroiditis i mange år og er fortsat en effektiv metode til at studere patogenesen af autoimmun thyroiditis. Den nuværende konstruktionsmetode for EAT-modellen er imidlertid mere kompliceret og dyr; Forskellige laboratorier bruger forskellige immuniseringsmetoder og injektionssteder. Desuden har mus med forskellige genetiske baggrunde forskellige induktionshastigheder, som kræver yderligere undersøgelse for at afsløre den potente mekanisme.

Udviklingen af thyroiditis i SAT-modellen er imidlertid forbundet med natriumiodid, seksuel dimorfisme og opdrætsbetingelserne. For at afsløre den passende procedure for autoimmun thyroiditis i SAT-modellen beskrev denne artikel metoden til induktion af autoimmun thyroiditis under forskellige forhold. Derudover giver det mulighed for undersøgelse af patogenesen og immunologiske fremskridt af autoimmun thyroiditis i forskellige stadier af denne sygdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen beskrevet nedenfor blev godkendt af retningslinjerne for pleje og brug, der er fastlagt af Institutional Animal Care and Use Committee of Sichuan University.

1. Forberedelse

  1. Opstald alle mus under specifikke patogenfrie forhold under 12 timers lys-mørke cyklusser (begyndende henholdsvis kl. 07:00 og 19:00). Hold rumtemperaturen på 22 °C. Skift sengetøjsmaterialer hver uge. Sørg for tilstrækkelige mængder standard gnaverchow og vand.
  2. Ved fremstilling af stamopløsningen af NaI i vand vejes 2,5 g af forbindelsen og opløses i 50 ml sterilt, rent vand under hvirvel for at give en stamopløsning på 5%. Opbevar denne stamopløsning i en 4 °C fryser, undgå lys, i op til 8 uger.
  3. For at forberede en arbejdsløsning af NaI skal du trække 2,5 ml stamopløsning og opløse den i 250 ml almindeligt vand som det daglige drikkevand til NOD. H-2h4 mus, for at give en arbejdsløsning på 0,05%.

2. Induktion af thyroiditis

  1. SAT-model
    1. Forbered NOD. H-2h4-mus (8 uger) til undersøgelsen ved at huse alle mus af et enkelt køn (ingen kønsdimorfisme) i barrierebure (fem dyr pr. bur) med fodringsbetingelserne beskrevet i trin 1.1.
    2. At inducere autoimmun thyroiditis i NOD. H-2h4 mus, fodre alle musene med 0,05% NaI i 8 uger. Skift NaI-vandet hver uge og vurder musenes status ugentligt, herunder udseende, vægt, appetit, mental status og mobilitet.
  2. Spis model
    1. Forbered BALB/c-musene (8 uger gamle) på undersøgelsen ved at anbringe alle mus af et enkelt køn (ingen kønsdimorfisme) i barrierebure (fem dyr pr. bur) med de fodringsbetingelser, der er beskrevet i trin 1.1. Foder alle mus med 0,05% NaI i 8 uger.
    2. I løbet af de første 2 uger injiceres subkutant en blanding af CFA og Tg (200 μL) en gang om ugen.
    3. Fra den tredje uge injiceres subkutant en blanding af IFA og Tg (200 μL) en gang om ugen i 3 uger.

3. Målinger

  1. Forberedelse af perifere blodprøver
    1. Efter induktionen bedøves musene med et volumen på 0,01 ml / g bedøvelsesmiddel ved intraperitoneal injektion. Forbered bedøvelsesmidlet ved at blande midazolam (40 μg/100 μL til sedation), medetomidin (7,5 μg/100 μL til sedation) og butorphanoltartrat (50 μg/100 μL til analgesi) i fosfatbufret saltvand (PBS).
      BEMÆRK: De specifikke koncentrationer af hver komponent i anæstesiblandingen er: midazolam 13.33μg / 100μL, medetomidin 2.5μg / 100μL og butorphanol 16.7μg / 100μL. For specifikke doser, der anvendes til mus, doserne er: midazolam 4μg / g, medetomidin 0.75μg / g og butorphanol 1.67μg / g. Anæstesidybden blev bekræftet, da musens lemmermuskler slappede af, knurhårene havde ingen berøringsrespons, og der var tab af pedalrefleks.
    2. Når musene er bedøvet, skal du forberede de perifere blodprøver ved at fastgøre musen med den ene hånd og trykke på øjenhuden for at stikke øjet ud. Indsæt derefter kapillarrøret i det indre hjørne af øjet og træng ind i en vinkel på 30-45 grader til næseborets plan. Påfør tryk, mens du forsigtigt roterer kapillarrøret. Blod vil strømme ind i røret via kapillær virkning.
    3. Sæt blodet i et 4 ° C køleskab i 2 timer og centrifuger derefter ved 1.000 × g i 10 minutter ved 4 ° C for at få prøven. Resten af prøven opbevares ved -80 °C til yderligere analyse.
  2. Fremstilling af vævsprøver fra skjoldbruskkirtlen
    1. Aflive dyret humant i henhold til de institutionelle politikker. Derefter dissekeres brystvæggen for at udsætte hjertet, skære højre atrium op og infundere saltvand i venstre ventrikel ved hjælp af en intravenøs infusionsnål fastgjort til en 20 ml sprøjte, indtil vævet bliver hvidt.
    2. Fastgør musen på dissektionsbordet med stifter. Steriliser nakken med 75% ethanol. Skær musens hud langs midterlinjen i nakken fra toppen af brystbenet til underkæben med vævsaks for fuldstændigt at udsætte nakkevævet.
    3. Overhold parret lyserøde kirtler, de submandibulære kirtler, hvorunder er den forreste luftrørmuskel. Adskil kirtlerne og musklerne med oftalmisk saks og tang for at udsætte luftrøret og skjoldbruskkirtlen.
    4. Adskil vævet under brusk ved hjælp af buede tang til at afhente brusk og luftrør sammen. Skær de distale og proksimale ender af henholdsvis brusk og luftrør, og fjern skjoldbruskkirtlen sammen med luftrøret.
    5. Dyp kirtlerne i 4% paraformaldehyd i 12-24 timer. Overfør derefter vævet til 70% ethanol.
    6. Placer de enkelte lobes af skjoldbruskkirtelbiopsimateriale i forarbejdningskassetterne og dehydrer gennem følgende serielle alkoholgradient: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, ethanol i 40 minutter hver; 1/2 xylen + 1/2 absolut ethanol i 2 timer; 100% xylen i 1,5 timer; 100% xylen i 1,5 timer; 1/2 xylen + 1/2 paraffin i 2 timer; ovn ved 40 ° C i 40 min; paraffin I i 30 min; og paraffin II i 30 min. Integrer dem i paraffinvoksblokke.
    7. Før farvningen afvokses 5 μm tykke skjoldbruskkirtelvævssektioner i xylen (som følger) og rehydreres gennem følgende faldende koncentrationer af ethanol: xylen I i 10 minutter; xylen II i 10 minutter; xylen III i 10 minutter; absolut ethanol I i 5 min; absolut ethanol II i 5 min; 90% alkohol i 5 minutter; 80% alkohol i 5 min; 70% alkohol i 5 minutter; og 50% alkohol i 5 min.
    8. Plet vævene med hæmatoxylin og eosin (H&E). Plet med hæmatoxylin i 15 min, skyl med ledningsvand i 15 min, tilsæt 1% saltsyreethanol i 10 s, skyl med rindende vand og derefter med 50%, 70% og 80% ethanol, hver i 3 min. Udfør 0,5% eosinethanolfarvning i 2 minutter og skyl med rindende vand. Paraffinsektionerne anbringes successivt i 75% ethanol i 2 min, 85% ethanol i 2 min, absolut ethanol i 5 minutter og xylen i 5 min. Fastgør skiverne med neutrale tyggegummi- og glasskinner.
    9. For at evaluere omfanget af lymfocytisk thyroiditis skal du score skjoldbruskkirtelsektionerne som følger: 0: lidt eller ingen lymfocytinfiltration i skjoldbruskkirtelvævet; 1+: mere end 1/8 af kirtlen infiltreres i en eller flere foci; 2+: højst 1/4 af kirtlen infiltreres med lymfocytter; 3+: 1/4-1/2 af kirtlen infiltreres med lymfocytter; 4+: mere end 1/2 af kirtlen ødelægges.
      BEMÆRK: Det anbefales at fjerne skjoldbruskkirtlen brusk for at holde hele strukturen af musens skjoldbruskkirtel, som er for lille til at fjerne fra luftrøret.
  3. Måling af TPOAb
    BEMÆRK: Ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO), der stabilt udtrykker muse-TPO, blev etableret i vores laboratorium. Mus TPO cDNA blev udskåret af XbaI og NheI. Derefter blev cDNA'et overført til pcDNA5/FRT. Efter at plasmidet var konstrueret med succes, blev det transfekteret ind i CHO-cellerne og udvalgt med hygromycin B (100 g / ml).
    1. Efter konstruktionen af mTPO-CHO-celler fortyndes musesera fra trin 3.1.3 (1:50) og inkuberes med mTPO-CHO-cellerne i 2 timer. Efter inkubation ekskluderes cellefarvning med propidiumiodid (1 g / ml) og prøven analyseres ved flowcytometri ved hjælp af fluoresceinisothiocyanatkonjugeret, affinitetsrenset ged anti-mus IgG. Screene overlevende enkeltcellepopulationer efter FSC-A- og SSC-A-kanaler, og vælg FITC- og PI-mærkede celler fra enkeltcellepopulationerne21.
    2. Inkluder serum fra uimmuniserede BALB/c- eller C57BL/6-mus bundet til IgG som den negative kontrol. Inkluder monoklonale antistoffer mod human TPO22 med mus som positive kontroller, der genkender muse-TPO23. Ekspres TPO-bindingsdata som geometriske midler.
  4. Måling af TgAb
    BEMÆRK: Brug et ELISA-sæt til at detektere thyroglobulin ved at følge producentens anvisninger.
    1. Fortynd standardprøverne i mikrocentrifugerøret i henhold til instruktionerne. Tag sættet ud af køleskabet og opbevar det ved stuetemperatur i 30 min.
    2. Indstil standardbrøndene, blankbrøndene og testbrøndene. Tomme brønde får kun buffer, mens standardbrønde får standardløsninger. Der tilsættes 10 μL prøver i prøvehullerne. Når du tilføjer prøverne, skal du prøve ikke at røre ved brøndens vægge og ryste pladen forsigtigt for at flytte prøverne til bunden af brøndene.
    3. Inkluder serum fra BALB / c-mus immuniseret med Tg, CFA og IFA24 som den positive kontrol og serum fra 8 uger gammel NOD. H-2h4 mus på almindeligt vand som den negative kontrol.
    4. Prøverne inkuberes i et 37 °C vandbad i 30 minutter. Fortynd vaskebufferen med destilleret vand i forholdet 1:30. Fjern derefter forseglingsfilmen, ryst væsken inde i enzympladen og dup den tør på absorberende papir, og tilsæt 350 μL vaskebuffer i 30 sekunder. Gentag denne procedure fem gange, og dup derefter brøndene tørre.
    5. Der tilsættes 50 μL enzymmærkningsreagens til hvert hul, bortset fra de tomme huller, og inkuberes i et 37 ° vandbad i 30 minutter. Fjern forseglingsfilmen, ryst væsken af inde i enzympladen, og dup den tør på absorberende papir.
    6. Der tilsættes 50 μL udvikler A til hvert hul efterfulgt af 50 μL udvikler B, og brøndene rystes forsigtigt for at blande dem i 5 minutter. Tilsæt 50 μL af termineringsopløsningen i hvert hul i 15 minutter for at stoppe reaktionen. Absorbansen (OD) af hvert hul måles ved bølgelængden 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser. Præsenter TgAb-dataene som den optiske densitet (OD) ved 490 nm.
  5. Måling af T4 og thyreoideastimulerende hormon (TSH)
    BEMÆRK: ELISA måler T4- og TSH-niveauerne (i 10 μL delprøver) ved at følge fabrikantens anvisninger.
    1. Enzymkonjugatet fortyndes til 1:11 med analysefortyndingsmidlet; De prøver, der skal måles (1:100), fortyndes med 0,01 M PBS.
    2. Der tilsættes 10 μL af standarden og prøven til de tilsvarende huller, der tilsættes 100 μL enzymkonjugat til hvert hul, og der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time.
    3. Kassér væsken i brøndene og rengør den med vaskebuffer tre gange.
    4. Der tilsættes 100 μl 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
    5. Tilsæt 50 μL stopopløsning og bland forsigtigt i 15-20 s.
    6. Absorbansen (OD) bestemmes ved hjælp af en mikropladelæser ved bølgelængden 450 nm, og prøvekoncentrationen beregnes.
    7. Brug statistisk software til at udføre t-test eller rangsum test og plotte resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De histologiske ændringer var påfaldende forskellige hos kvinder og mænd, varigheden af jodindtag og opløsningen af NaI. Som vist i figur 1, ~ 10% af NOD. H-2h4 mus udviklede SAT selv uden jodinduktion i en alder af 24 uger, og alle musene udviklede til sidst thyroiditis. Når man fik regelmæssigt vand, var der ingen signifikant forskel i de histologiske ændringer mellem mænd og kvinder. Tilsætningen af NaI til drikkevandet fremskyndede udviklingen af thyroiditis. I opløsningerne på 0,005%, 0,05% og 0,5% nåede SAT maksimal sværhedsgrad i henholdsvis uge 16, 8 og 8 efter at have givet NaI-vandet. Når thyroiditis blev induceret, lymfocytinfiltration fortsatte gennem hele musens liv. Under induktionen syntes hunmus at have en tendens til at udvikle mere alvorlig thyroiditis end hanner under samme tilstand, men der var ingen signifikante forskelle i sværhedsgraden af lymfocytisk infiltration, som kunne være begrænset af antallet af prøver.

Når TgAb fik regelmæssigt vand uden yderligere jod, steg niveauet af TgAb ikke signifikant i en alder af 16 uger, og der blev ikke fundet nogen signifikant forskel mellem mænd og kvinder. TgAb niveauer i NOD. H-2h4-mus begyndte at stige efter 24 uger uden forskel mellem kønnene, og TgAb-niveauerne fortsatte med at stige indtil 72 uger (figur 2A). Med tilsætning af NaI til drikkevand begyndte niveauerne af TgAb at stige i uge 16, 8 og 8 med opløsninger på henholdsvis 0,005%, 0,05% og 0,5% NaI. Niveauerne af TgAb viste imidlertid ingen forskel mellem mænd og kvinder i nogen af opløsningerne (figur 2B-D). Uanset om NaI-vand blev givet, nåede niveauerne af TgAb deres højeste i en alder af 72 uger (eller 64 uger efter, at NaI-vand først blev givet).

Der var en længere forsinkelse i detekterbarheden af TPOAb-niveauer sammenlignet med TgAb. Disse antistoffer blev sjældent påvist i NOD. H-2h4 mus med regelmæssigt vand i en alder af 24 uger. Når de blev fodret med almindeligt vand, udviste hunnerne meget højere TPOAb-niveauer end hanner efter 72 uger (figur 2E). Den samme tendens til intersexforskel opstod også i NOD. H-2H4-mus i løbet af 16, 8 og 8 uger, når de fik NaI-vand på henholdsvis 0,005%, 0,05% og 0,5% (figur 2F-H) Bemærkelsesværdigt nok, da koncentrationen af NaI var over 0,05% under induktionen, nåede niveauerne af TPOAb deres højeste 64 uger efter, at NaI-vand først blev givet, og der var ingen forskel mellem mænd og kvinder (figur 2G, H).

Derudover er serum TSH niveauer i mandlige NOD. H-2h4-mus var signifikant højere end hos kvinder på forskellige fodringsstadier, uanset om NAI-vand blev givet eller ej. Når det gives regelmæssigt vand, TSH niveauer af NOD. H-2h4-mus begyndte at stige i en alder af 24 uger, og en lignende tendens blev observeret i joddiætgrupperne med koncentrationerne på henholdsvis 0,005%, 0,05% og 0,5% efter henholdsvis 16, 8 og 8 uger, efter at jod blev givet separat. TSH-niveauerne fortsatte med at stige i hele induktionsperioden og toppede ved 64 uger. Desuden var der en signifikant forskel i TSH-niveauer mellem mænd og kvinder i resten af NOD. H-2H4 mus (figur 3A-D). NIKKE. H-2h4 mus oplevede ikke struma eller hypothyroidisme efter indtagelse af jod. Uanset om jodmidler blev administreret, var der ingen kønsrelateret forskel i T4-niveauer i NOD. H-2H4 mus. Da induktionens varighed steg, havde niveauerne af T4 imidlertid en tendens til at falde hos begge køn i jodvandgrupperne (ingen signifikant forskel) (figur 3E-H).

Seksuel dimorfisme i den patologiske proces og TPOAb-niveauer blev fundet i afkom af NOD. H-2h4 mus, men ikke TgAb. I lighed med andre undersøgelser25,26 blev TPOAb-niveauerne signifikant forhøjet i modelmus efter at have modtaget diætiodid i 2-4 måneder, og der var en kønsrelateret forskel. Derudover var TSH-niveauerne højere hos mandlige end kvindelige NOD. H-2h4 mus med eller uden kostiodid tilskud, som ligner andre musestammer. Denne forskel forblev gennem dyrenes liv, som måske ikke har været påvirket af niveauerne af TPOAb eller TgAb.Når de blev udsat for 0,05% NaI, udviklede de fleste mus thyroiditis i 8 uger, hvilket havde en lignende virkning med 0,5% NaI. Mens 0,005% NaI havde en lignende effekt på NOD. H-2h4 mus fodret med almindeligt vand, koncentrationen af 0,05% NaI (efter 8 ugers induktion) kan være den foretrukne betingelse for at fremkalde autoimmun thyroiditis. T4 niveauer i NOD. H-2h4 mus havde ingen kønsrelaterede forskelle og blev ikke påvirket af jodmidler, hvilket er i overensstemmelse med andre undersøgelser27,28. Dette kan skyldes sygdommens relativt korte begyndelsestid og musenes kompenserende skjoldbruskkirtelfunktion, hvilket resulterer i et fænomen svarende til subklinisk hypothyroidisme hos musene. Vi spekulerer på, at musenes TSH-akse i sidste ende ville blive dekompenseret og producere forskelle over tid.

Figure 1
Figur 1: Patologiske ændringer og lymfocytinfiltration inflammatoriske score af skjoldbruskkirtler i NOD. H-2h4 mus med / uden jod kost. (A, C, E, G) Patologiske ændringer i skjoldbruskkirtlen under joddiet på 0%, 0,005%, 0,05% og 0,5% ved HE-farvning; 200x forstørrelse, N = 10/gruppe. (B, D, F, G) Skjoldbruskkirtelbetændelse blev bestemt i henhold til lymfocytinfiltrationsområdet; klassificering af graden af lymfocytinfiltration: 0: næsten ingen lymfocytinfiltration; 1+: mere end en ottendedel af kirtlen invaderes; 2+: en fjerdedel af kirtlen invaderes; 3+: en fjerdedel til halvdelen af kirtlen invaderes; 4+: mere end halvdelen af kirtlen ødelægges. N = 10/gruppe. Væsentlige forskelle: *p < 0,05; **p < 0,01. Forkortelser: F = kvinde; M = mand; NW = N uger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Autoantistoffer i NOD. H-2h4 mus på almindeligt og iodidholdigt vand. (A-D) Autoantistoffer mod Tg i NOD. H-2h4 mus på almindeligt vand (i en alder af 8, 16, 24 og 72 uger separat) og iodid vand-0,005%, 0,05% og 0,5% (ved 0, 8, 16, og 64 uger efter jodvandet blev begyndt). (E-H) Autoantistoffer mod TPO i NOD. H-2h4 mus på almindeligt vand (i en alder af 8, 16, 24 og 72 uger separat) og iodid vand-0,005%, 0,05% og 0,5% (ved 0, 8, 16, og 64 uger efter jodvandet blev begyndt). Værdier for TgAb rapporteres som ELISA optisk densitet (OD) 490 nm (gennemsnit ± standardfejl for den gennemsnitlige SEM), og værdier for TPOAb rapporteres som det geometriske gennemsnit i flowcytometri. N = 8/gruppe. Væsentlige forskelle: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Forkortelser: Tg = thyroglobulin; TgAb = autoantistoffer mod Tg; TPO = skjoldbruskkirtelperoxidase; TPOAb = autoantistoffer mod TPO; F = kvinde; M = mand; NW = N uger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: TSH og T4 niveauer i NOD. H-2h4 mus på almindeligt og iodidholdigt vand. (A-D) TSH og (E-H) T4 niveauer på almindeligt vand (i en alder af 8, 16, 24 og 72 uger separat) og iodid vand-0,005%, 0,05%, og 0,5% (på 0, 8, 16, og 64 uger efter jod vand blev begyndt). TSH-værdier blev målt ved radioimmunoassay (mU/L, gennemsnit ± standardfejl for den gennemsnitlige SEM). N = 8/gruppe. Væsentlige forskelle: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; *p < 0,0001. Forkortelser: TSH = skjoldbruskkirtelstimulerende hormon; F = kvinde; M = mand; NW = N uger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HT opstår på grund af en autoimmun systemforstyrrelse forårsaget af lymfocytter, der infiltrerer skjoldbruskkirtlen, hvilket yderligere forringer skjoldbruskkirtelfunktionen, mens der produceres skjoldbruskkirtelspecifikke antistoffer. Serum-TSH-, TgAb- og TPOAb-niveauer hos HT-patienter er signifikant forhøjede27. På nuværende tidspunkt anvendes to hovedtyper af murinmodeller i vid udstrækning til at studere ætiologien af autoimmun thyroiditis: Spis og SAT29. Spise mus er for det meste immuniseret ved hjælp af proteiner og adjuvanser for at skabe et unormalt immunmiljø in vivo. Denne tilgang har været brugt i mange år og fortsætter med at være effektiv30,31. Derudover inkluderer nye tilgange til at inducere thyroiditis injektion af dendric celler (DC'er) pulseret med Tg32, ekspression af Tg eller TPO in vivo af adenovirale vektorer eller plasmider31, transplantation af skjoldbruskkirtlen hos allogene mus og injektion af LPS. Imidlertid er den vellykkede konstruktion af thyroiditismodellen normalt mere begrænset af den genetiske baggrund for den eksperimentelle murinmodel, syngeneiske antigener og cellebiologiske teknologier. Desuden kan specifikke adjuvanser fremkalde et mere komplekst immunmiljø, hvilket gør det vanskeligt at undersøge den immunologiske proces af autoimmun thyroiditis. Derfor mener vi, at SAT af NOD. H-2h4-mus kan bedre illustrere patogenesen af Hashimotos thyroiditis sammenlignet med EAT-modellen. Specifikt er immunisering med potente adjuvanser og thyroglobulin ikke nødvendig for SAT33. For at fremskynde udviklingen af SAT tilsættes jod til drikkevandet af NOD. H-2H4 mus. Selvom den resulterende thyroiditis ikke deler den samme mekanisme, hvormed thyroiditis forekommer hos mennesker, er jod faktisk en vigtig indflydelsesfaktor for thyroiditis. Desuden kan jodmidler i denne model hurtigt fremkalde thyroiditis i NOD. H-2H4 mus og NOD. H-2h4 mus, der ikke modtager jod kan i sidste ende udvikle thyroiditis samt. Da den eksperimentelle protokol i de fleste laboratorier er forskellig, udførte vi en mere omfattende evaluering til NOD. H-2H4 mus under induktion af thyroiditis.

I processen med modelkonstruktion har nogle punkter brug for omhyggelig opmærksomhed. Ved at tilføje drikkevand regelmæssigt og evaluere musenes generelle tilstand undgås utilsigtet musedød. Det anbefales ikke at holde mere end fem mus pr. bur under induktionen for at give tilstrækkelig NaI-fodring til hver mus. Antallet af mus kan dog også ændre sig efter den specifikke institutions regler og forskrifter for dyr. Da seksuel dimorfisme findes i vores laboratorium, foreslås mus af samme køn til eksperimentet (til eksperimenter med særlige krav til påvisning af skjoldbruskkirtelspecifikke antistoffer anbefales hun). Det foreslås at vælge 8 uger gamle mus, da 10% af musene udvikler spontan thyroiditis i en alder af 16 uger, og alle musene udvikler thyroiditis til sidst uden NaI-vand. Skjoldbruskkirtlen læsioner vedvarer hele musenes levetid, og den næste generation udvikler thyroiditis, når de fødes. Derfor anbefales det at bruge 8 uger gamle mus til bevarelse af mus. Det er vigtigt at bemærke, at TPOAb er mere egnet som detektionsindikator end TgAb, når du bruger NOD. H-2H4 mus til at efterligne thyroiditis. Ved måling af niveauerne af TPOAb skal varigheden af induktion dog være mere forsinket end TgAb.

Afslutningsvis beskriver dette papir etableringen af en SAT-model med NOD. H-2h4 mus og udforskningen af indflydelsen af forskellige faktorer på denne model. Selvom det ikke perfekt simulerer patogenesen og mekanismen for autoimmun skjoldbruskkirtelsygdom, NOD. H-2h4 mus er en stabil dyremodel med stort potentiale inden for autoimmun skjoldbruskkirtelsygdom. Da dette er en let dyremodel at konstruere og er meget reproducerbar, er det håbet, at denne metode vil bidrage til at forbedre anvendelsen af SAT-murinmodeller i forskellige forskningsinstitutioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Monoklonale antistoffer mod human TPO (anvendt som positive kontroller) blev leveret af Dr. P. Carayon og Dr. J. Ruf (Marseille, Frankrig). Forfatterne takker alle deltagerne i denne undersøgelse og medlemmerne af vores forskergruppe. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Postdoctoral Sustentation Fund of West China Hospital, Sichuan University, Kina (2020HXBH057) og Sichuan Province Science and Technology Support Program (projekt nr. 2021YFS0166)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ralli, M., et al. Hashimoto's thyroiditis: An update on pathogenic mechanisms, diagnostic protocols, therapeutic strategies, and potential malignant transformation. Autoimmunity Reviews. 19 (10), 102649 (2020).
  2. Zhang, Q. Y., et al. Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto's thyroiditis. Nature Communications. 13 (1), 775 (2022).
  3. Ruggeri, R. M., et al. Autoimmune comorbidities in Hashimoto's thyroiditis: different patterns of association in adulthood and childhood/adolescence. European Journal of Endocrinology. 176 (2), 133-141 (2017).
  4. Resende de Paiva, C., Grønhøj, C., Feldt-Rasmussen, U., von Buchwald, C. Association between Hashimoto's thyroiditis and thyroid cancer in 64,628 patients. Frontiers in Oncology. 7, 53 (2017).
  5. Ehlers, M., Schott, M. Hashimoto's thyroiditis and papillary thyroid cancer: are they immunologically linked. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (12), 656-664 (2014).
  6. Medenica, S., et al. The role of cell and gene therapies in the treatment of infertility in patients with thyroid autoimmunity. International Journal of Endocrinology. 2022, 4842316 (2022).
  7. Rose, N. R. The genetics of autoimmune thyroiditis: the first decade. Journal of Autoimmunity. 37 (2), 88-94 (2011).
  8. Kolypetri, P., King, J., Larijani, M., Carayanniotis, G. Genes and environment as predisposing factors in autoimmunity: acceleration of spontaneous thyroiditis by dietary iodide in NOD.H2(h4) mice. International Reviews of Immunology. 34 (6), 542-556 (2015).
  9. Terplan, K. L., Witebsky, E., Rose, N. R., Paine, J. R., Egan, R. W. Experimental thyroiditis in rabbits, guinea pigs and dogs, following immunization with thyroid extracts of their own and of heterologous species. The American Journal of Pathology. 36 (2), 213-239 (1960).
  10. Alexopoulos, H., Dalakas, M. C. The immunobiology of autoimmune encephalitides. Journal of Autoimmunity. 104, 102339 (2019).
  11. Noviello, C. M., Kreye, J., Teng, J., Prüss, H., Hibbs, R. E. Structural mechanisms of GABA receptor autoimmune encephalitis. Cell. 185 (14), 2469-2477 (2022).
  12. Pudifin, D. J., Duursma, J., Brain, P. Experimental autoimmune thyroiditis in the vervet monkey. Clinical and Experimental Immunology. 29 (2), 256-260 (1977).
  13. Esquivel, P. S., Rose, N. R., Kong, Y. C. Induction of autoimmunity in good and poor responder mice with mouse thyroglobulin and lipopolysaccharide. The Journal of Experimental Medicine. 145 (5), 1250-1263 (1977).
  14. Kong, Y. C., et al. HLA-DRB1 polymorphism determines susceptibility to autoimmune thyroiditis in transgenic mice: definitive association with HLA-DRB1*0301 (DR3) gene. The Journal of Experimental Medicine. 184 (3), 1167-1172 (1996).
  15. Kotani, T., Umeki, K., Hirai, K., Ohtakia, S. Experimental murine thyroiditis induced by porcine thyroid peroxidase and its transfer by the antigen-specific T cell line. Clinical and Experimental Immunology. 80 (1), 11-18 (1990).
  16. Ng, H. P., Banga, J. P., Kung, A. W. C. Development of a murine model of autoimmune thyroiditis induced with homologous mouse thyroid peroxidase. Endocrinology. 145 (2), 809-816 (2004).
  17. Ng, H. P., Kung, A. W. C. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology. 147 (6), 3085-3092 (2006).
  18. Ellis, J. S., Braley-Mullen, H. Mechanisms by which B cells and regulatory T Cells influence development of murine organ-specific autoimmune diseases. Journal of Clinical Medicine. 6 (2), 13 (2017).
  19. Fang, Y., Yu, S., Braley-Mullen, H. Contrasting roles of IFN-gamma in murine models of autoimmune thyroid diseases. Thyroid. 17 (10), 989-994 (2007).
  20. Fang, Y., Zhao, L., Yan, F. Chemokines as novel therapeutic targets in autoimmune thyroiditis. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 4 (1), 52-57 (2010).
  21. Chen, C. R., et al. Antibodies to thyroid peroxidase arise spontaneously with age in NOD.H-2h4 mice and appear after thyroglobulin antibodies. Endocrinology. 151 (9), 4583-4593 (2010).
  22. Ruf, J., et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology. 125 (3), 1211-1218 (1989).
  23. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., Chong, G., Rapoport, B. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword'. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  24. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., et al. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword’[J]. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  25. Hutchings, P. R., et al. Both CD4(+) T cells and CD8(+) T cells are required for iodine accelerated thyroiditis in NOD mice. Cellular Immunology. 192 (2), 113-121 (1999).
  26. Xue, H., et al. Dynamic changes of CD4+CD25 + regulatory T cells in NOD.H-2h4 mice with iodine-induced autoimmune thyroiditis. Biological Trace Element Research. 143 (1), 292-301 (2011).
  27. Hou, X., et al. Effect of halofuginone on the pathogenesis of autoimmune thyroid disease in different mice models. Endocrine, Metabolic & Immune Disorders Drug Targets. 17 (2), 141-148 (2017).
  28. McLachlan, S. M., et al. Dissociation between iodide-induced thyroiditis and antibody-mediated hyperthyroidism in NOD.H-2h4 mice. Endocrinology. 146 (1), 294-300 (2005).
  29. Danailova, Y., et al. Nutritional management of thyroiditis of hashimoto. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 5144 (2022).
  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
  31. Verginis, P., Li, H. S., Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. Journal of Immunology. 174 (11), 7433-7439 (2005).
  32. Flynn, J. C., et al. Superiority of thyroid peroxidase DNA over protein immunization in replicating human thyroid autoimmunity in HLA-DRB1*0301 (DR3) transgenic mice. Clinical and Experimental Immunology. 137 (3), 503-512 (2004).
  33. Akeno, N., et al. IFN-α mediates the development of autoimmunity both by direct tissue toxicity and through immune cell recruitment mechanisms. Journal of Immunology. 186 (8), 4693-4706 (2011).

Tags

Tilbagetrækning nr. 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Generering af en mus spontan autoimmun thyroiditis model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter