Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av en mus spontan autoimmun tyreoidit modell

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Flera typer av djurmodeller av Hashimotos tyreoidit har etablerats, liksom spontan autoimmun tyreoidit i NOD-musen. H-2h4-möss är en enkel och pålitlig modell för HT-induktion. Denna artikel beskriver detta tillvägagångssätt och utvärderar den patologiska processen för en bättre förståelse av SAT-murinmodellen.

Abstract

Under de senaste åren har Hashimotos tyreoidit (HT) blivit den vanligaste autoimmuna sköldkörtelsjukdomen. Det kännetecknas av lymfocytinfiltration och detektion av specifika serumautoantikroppar. Även om den potentiella mekanismen fortfarande inte är klar, är risken för Hashimotos tyreoidit relaterad till genetiska och miljömässiga faktorer. För närvarande finns det flera typer av modeller av autoimmun tyreoidit, inklusive experimentell autoimmun tyreoidit (EAT) och spontan autoimmun tyreoidit (SAT).

EAT hos möss är en vanlig modell för HT, som immuniseras med lipopolysackarid (LPS) kombinerat med tyroglobulin (Tg) eller kompletteras med komplett Freunds adjuvans (CFA). EAT-musmodellen är allmänt etablerad i många typer av möss. Sjukdomsprogressionen är dock mer sannolikt associerad med Tg-antikroppssvaret, vilket kan variera i olika experiment.

SAT används också i stor utsträckning i studien av HT i NOD. H-2H4 mus. NICKEN. H2h4-mus är en ny stam som erhålls från korset av den icke-överviktiga diabetiska (NOD) musen med B10. A(4R), som induceras signifikant för HT med eller utan utfodring av jod. Under induktionen, NOD. H-2h4-mus har en hög nivå av TgAb åtföljd av lymfocytinfiltration i sköldkörtelns follikulära vävnad. Men för denna typ av musmodell finns det få studier för att omfattande utvärdera den patologiska processen under induktionen av jod.

En SAT-musmodell för HT-forskning etableras i denna studie, och den patologiska förändringsprocessen utvärderas efter en lång period av jodinduktion. Genom denna modell kan forskare bättre förstå den patologiska utvecklingen av HT och screena nya behandlingsmetoder för HT.

Introduction

Hashimotos tyreoidit (HT), även känd som kronisk lymfatisk tyreoidit eller autoimmun tyreoidit, rapporterades först 19121. HT kännetecknas av lymfocytinfiltration och skador på sköldkörtelns follikulära vävnad. Laboratorietester manifesteras huvudsakligen som ökande sköldkörtelspecifika antikroppar, inklusive anti-tyreoglobulinantikropp (TgAb) och anti-tyreoideaperoxidasantikropp (TPOAb)2. Incidensen av HT ligger i intervallet 0,4% -1,5%, vilket står för 20% -25% av alla sköldkörtelsjukdomar, och detta värde har ökat de senaste åren3. Dessutom har ett stort antal studier rapporterat att HT är associerat med onkogenes och återkommande papillärt sköldkörtelcancer (PTC)4,5; De potentiella mekanismerna är fortfarande kontroversiella. Autoimmun tyreoidit är också en viktig faktor vid kvinnlig infertilitet6. Därför måste patogenesen av HT vara tydlig, för vilken en stabil och enkel djurmodell är nödvändig.

För att studera etiologin för HT har två huvudtyper av murina modeller använts, inklusive experimentell autoimmun tyreoidit (EAT) och spontan autoimmun tyreoidit (SAT) i de aktuella studierna 7,8. Mottagliga möss immuniserades med specifika sköldkörtelantigener (inklusive rå sköldkörtel, renat tyroglobulin [TG], sköldkörtelperoxidas [TPO], rekombinant TPO-ektodomän och utvalda TPO-peptider) för att etablera EAT-murinmodellen. Dessutom används adjuvanserna, inklusive lipopolysackarid (LPS), komplett Freunds adjuvans (CFA) och andra ovanliga adjuvanser, under immuniseringen för att bryta ner immuntolerans 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

SAT-modellen är en viktig modell för att studera spontan utveckling av autoimmun tyreoidit, som bygger på NOD. H-2H4 möss. NICKEN. H-2h4-musen är en ny stam erhållen från korset av NOD och B10. A(4R)-möss, följt av flera backcrossar till NOD, med den autoimmuna tyreoiditkänslighetsgenen IAk18,19. NICKA. H-2h4-möss utvecklar inte diabetes, men har en hög förekomst av autoimmun tyreoidit och Sjögrens syndrom (SS)19. Studier har visat att intracellulär adhesionsmolekyl-1 (ICAM-1) uttrycks starkt i sköldkörtelvävnaden i NOD. H-2h4 möss vid 3-4 veckors ålder. Dessutom, med ökningen av jodintaget, förbättras immunogeniciteten hos tyroglobulinmolekylen, vilket ytterligare uppreglerar uttrycket av ICAM-1, vilket spelar en viktig roll i processen med monocytinfiltration21. Denna modell simulerar den autoimmuna processen samtidigt som man verifierar förhållandet mellan joddos och sjukdomens svårighetsgrad. Den etablerade metoden är stabil, med stor sannolikhet för framgång. SAT-modellen har tillämpats för att inducera autoimmun tyreoidit i många år och fortsätter att vara en effektiv metod för att studera patogenesen av autoimmun tyreoidit. Den nuvarande konstruktionsmetoden för EAT-modellen är dock mer komplicerad och dyr; Olika laboratorier använder olika immuniseringsmetoder och injektionsställen. Dessutom har möss med olika genetisk bakgrund olika induktionshastigheter, som behöver ytterligare studier för att avslöja den potenta mekanismen.

Utvecklingen av tyreoidit i SAT-modellen är emellertid associerad med natriumjodid, sexuell dimorfism och uppfödningsförhållandena. För att avslöja det lämpliga förfarandet för autoimmun thyroidit i SAT-modellen beskrev denna artikel metoden för induktion av autoimmun thyroidit under olika förhållanden. Dessutom möjliggör det studier av patogenesen och immunologisk utveckling av autoimmun thyroidit i olika stadier av denna sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollet som beskrivs nedan godkändes av de riktlinjer för vård och användning som fastställts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Sichuan University.

1. Förberedelse

  1. Placera alla möss under specifika patogenfria förhållanden under 12 timmars ljus-mörka cykler (börjar klockan 07:00 respektive 19:00). Håll rumstemperaturen vid 22 °C. Byt sängkläder varje vecka. Tillhandahåll tillräckliga mängder standard gnagarchow och vatten.
  2. Vid beredning av stamlösningen av NaI i vatten vägs 2,5 g av föreningen och löses upp i 50 ml sterilt, rent vatten under virveling för att ge en stamlösning på 5%. Förvara stamlösningen i en frys på 4 °C och undvik ljus i upp till 8 veckor.
  3. För att förbereda en arbetslösning av NaI, dra 2,5 ml stamlösning och lös upp den i 250 ml vanligt vatten som dagligt dricksvatten för NOD. H-2h4 möss, för att ge en arbetslösning på 0,05%.

2. Induktion av tyreoidit

  1. SAT-modell
    1. Förbered NOD. H-2h4-möss (8 veckors ålder) för studien genom att hysa alla möss av ett enda kön (ingen sexuell dimorfism) i barriärburar (fem djur per bur) med de utfodringsförhållanden som beskrivs i steg 1.1.
    2. Att inducera autoimmun tyreoidit i NOD. H-2h4 möss, mata alla möss med 0,05% NaI i 8 veckor. Byt NaI-vattnet varje vecka och bedöma mössens status varje vecka, inklusive utseende, vikt, aptit, mental status och rörlighet.
  2. EAT-modell
    1. Förbered BALB/c-mössen (8 veckors ålder) för studien genom att hysa alla möss av ett enda kön (ingen sexuell dimorfism) i barriärburar (fem djur per bur) med de utfodringsförhållanden som beskrivs i steg 1.1. Foder alla möss med 0,05% NaI i 8 veckor.
    2. Under de första 2 veckorna injiceras subkutant en blandning av CFA och Tg (200 μL) en gång i veckan.
    3. Från och med den tredje veckan injiceras subkutant en blandning av IFA och Tg (200 μL) en gång i veckan i 3 veckor.

3. Mätningar

  1. Beredning av perifera blodprover
    1. Efter induktionen, bedöva mössen med en volym på 0,01 ml / g bedövning genom intraperitoneal injektion. Bered bedövningsmedlet genom att blanda midazolam (40 μg/100 μL för sedering), medetomidin (7,5 μg/100 μL för sedering) och butorfanoltartrat (50 μg/100 μL för analgesi) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
      OBS: De specifika koncentrationerna av varje komponent i anestesiblandningen är: midazolam 13,33μg / 100μL, medetomidin 2,5μg / 100μL och butorfanol 16,7 μg / 100 μL. För specifika doser som används på möss är doserna: midazolam 4μg / g, medetomidin 0,75μg / g och butorfanol 1,67μg / g. Anestesidjupet bekräftades när musens lemmuskler slappnade av, morrhåren hade inget beröringssvar och det fanns förlust av pedalreflex.
    2. Efter att mössen har bedövats, förbered de perifera blodproverna genom att fixera musen med ena handen och trycka på ögonhuden för att skjuta ut ögongloben. Sätt sedan in kapillärröret i det inre hörnet av ögat och träng in i 30-45 graders vinkel mot näsborrens plan. Applicera tryck medan du försiktigt roterar kapillärröret. Blod kommer att strömma in i röret via kapillärverkan.
    3. Lägg blodet i ett kylskåp på 4 °C i 2 timmar och centrifugera sedan vid 1 000 × g i 10 minuter vid 4 °C för att få provet. För vidare analys, förvara resten av provet vid -80 °C.
  2. Beredning av sköldkörtelvävnadsprover
    1. Avliva djuret humant enligt den institutionella politiken. Dissekera sedan bröstväggen för att exponera hjärtat, skär upp det högra atriumet och infusera saltlösning i vänster kammare med en intravenös infusionsnål fäst vid en 20 ml spruta tills vävnaden blir vit.
    2. Fixa musen på dissektionsbordet med stift. Sterilisera nacken med 75% etanol. Skär musens hud längs halsens medianlinje från toppen av bröstbenet till underkäken med vävnadsax för att helt exponera nackvävnaden.
    3. Observera paret rosa körtlar, de submandibulära körtlarna, under vilka är den främre luftstrupsmuskeln. Separera körtlarna och musklerna med oftalmisk sax och pincett för att exponera luftstrupen och sköldkörtelbrosket.
    4. Separera vävnaden under brosket med hjälp av böjda pincett för att plocka upp brosk och luftstrupe tillsammans. Skär de distala och proximala ändarna av brosket respektive luftstrupen och ta bort sköldkörteln tillsammans med luftstrupen.
    5. Fördjupa körtlarna i 4% paraformaldehyd i 12-24 h. Överför sedan vävnaden till 70% etanol.
    6. Placera de enskilda loberna av sköldkörtelbiopsimaterial i bearbetningskassetterna och dehydrera genom följande seriella alkoholgradient: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, etanol i 40 minuter vardera; 1/2 xylen + 1/2 absolut etanol i 2 timmar; 100% xylen i 1,5 timmar; 100% xylen i 1,5 timmar; 1/2 xylen + 1/2 paraffin i 2 timmar; ugn vid 40 ° C i 40 min; paraffin I i 30 minuter; och paraffin II i 30 min. Bädda in dem i paraffinvaxblock.
    7. Före färgningen avvaxas 5 μm tjocka sköldkörtelvävnadssnitt i xylen (enligt följande) och rehydreras genom följande minskande koncentrationer av etanol: xylen I i 10 minuter; xylen II i 10 minuter; xylen III i 10 minuter; absolut etanol I i 5 minuter; absolut etanol II i 5 minuter; 90% alkohol i 5 minuter; 80% alkohol i 5 minuter; 70% alkohol i 5 minuter; och 50% alkohol i 5 min.
    8. Färga vävnaderna med hematoxylin och eosin (H&E). Färga med hematoxylin i 15 minuter, skölj med kranvatten i 15 minuter, tillsätt 1% saltsyraetanol i 10 s, skölj med rinnande vatten och sedan med 50%, 70% och 80% etanol, vardera i 3 min. Utför 0,5% eosinetanolfärgning i 2 minuter och skölj med rinnande vatten. Placera paraffinsektionerna successivt i 75% etanol i 2 min, 85% etanol i 2 min, absolut etanol i 5 min och xylen i 5 min. Fixa skivorna med neutralt gummi och glasskivor.
    9. För att utvärdera omfattningen av lymfocytisk tyreoidit, poängsätt sköldkörtelsektionerna enligt följande: 0: liten eller ingen lymfocytinfiltration i sköldkörtelvävnaden; 1+: mer än 1/8 av körteln infiltreras i en eller flera foci; 2+: högst 1/4 av körteln infiltreras med lymfocyter; 3+: 1/4-1/2 av körteln infiltreras med lymfocyter; 4+: mer än 1/2 av körteln förstörs.
      OBS: Det rekommenderas att ta bort sköldkörtelbrosket för att hålla hela strukturen av mussköldkörteln, som är för liten för att ta bort från luftstrupen.
  3. Mätning av TPOAb
    OBS: Kinesiska hamsteräggstocksceller (CHO) som stabilt uttrycker mus TPO etablerades i vårt labb. Mus TPO cDNA skars ut av XbaI och NheI. Därefter överfördes cDNA till pcDNA5/FRT. Efter att plasmiden konstruerats framgångsrikt transfekterades den in i CHO-cellerna och valdes med hygromycin B (100 g / ml).
    1. Efter konstruktionen av mTPO-CHO-celler, späd musserumet från steg 3.1.3 (1:50) och inkubera med mTPO-CHO-cellerna i 2 timmar. Efter inkubation, uteslut cellfärgning med propidiumjodid (1 g/ml) och analysera provet med flödescytometri med användning av fluoresceinisotiocyanatkonjugerad, affinitetsrenad getantimus IgG. Screena överlevande encellspopulationer med FSC-A- och SSC-A-kanaler och välj FITC- och PI-taggade celler från encellspopulationerna21.
    2. Inkludera serum från oimmuniserade BALB/c- eller C57BL/6-möss bundna till IgG som negativ kontroll. Inkludera monoklonala musantikroppar mot human TPO22 som positiva kontroller som känner igen mus TPO23. Express TPO-bindningsdata som geometriska medel.
  4. Mätning av TgAb
    OBS: Använd ett ELISA-kit för att upptäcka tyroglobulin genom att följa tillverkarens instruktioner.
    1. Späd standardproverna i mikrocentrifugröret enligt anvisningarna. Ta ut satsen ur kylskåpet och förvara den i rumstemperatur i 30 minuter.
    2. Ställ in standardbrunnar, tomma brunnar och testbrunnar. Tomma brunnar får bara buffert, medan standardbrunnar får standardlösningar. Tillsätt 10 μl prover i testbrunnarna. När du lägger till proverna, försök att inte röra brunnarnas väggar och skaka plattan försiktigt för att flytta proverna till botten av brunnarna.
    3. Inkludera serum från BALB / c-möss immuniserade med Tg, CFA och IFA24 som positiv kontroll och serum från 8 veckor gamla NOD. H-2h4 möss på vanligt vatten som negativ kontroll.
    4. Inkubera proverna i ett 37 °C vattenbad i 30 minuter. Späd tvättbufferten med destillerat vatten i förhållandet 1:30. Ta sedan bort tätningsfilmen, skaka av vätskan inuti enzymplattan och klappa torrt på absorberande papper och tillsätt 350 μL tvättbuffert i 30 sekunder. Upprepa denna procedur fem gånger och klappa sedan brunnarna torra.
    5. Tillsätt 50 μL enzymmärkningsreagens till varje brunn, förutom de tomma brunnarna, och inkubera i ett 37 ° vattenbad i 30 minuter. Ta bort tätningsfilmen, skaka av vätskan inuti enzymplattan och klappa torrt på absorberande papper.
    6. Tillsätt 50 μL framkallare A till varje brunn följt av 50 μl framkallare B och skaka försiktigt brunnarna för att blanda i 5 minuter. Tillsätt 50 μL av termineringslösningen i varje brunn i 15 minuter för att stoppa reaktionen. Mät absorbansen (OD) för varje brunn vid en våglängd på 450 nm med hjälp av en mikroplattläsare. Presentera TgAb-data som optisk densitet (OD) vid 490 nm.
  5. Mätning av T4 och tyreoideastimulerande hormon (TSH)
    Anmärkning: Mät nivåerna T4 och TSH (i alikvoter på 10 μl) med ELISA genom att följa tillverkarens anvisningar.
    1. Späd enzymkonjugatet till 1:11 med analysspädningsmedlet; späd proverna som ska mätas (1:100) med 0,01 M PBS.
    2. Tillsätt 10 μl av standarden och provet till motsvarande brunnar, tillsätt 100 μl enzymkonjugat till varje brunn och inkubera vid rumstemperatur i 1 timme.
    3. Kassera vätskan i brunnarna och rengör den med tvättbuffert tre gånger.
    4. Tillsätt 100 μl 3,3',5,5'-tetrametylbensidin (TMB) och inkubera i rumstemperatur i 15 minuter.
    5. Tillsätt 50 μL stopplösning och blanda försiktigt i 15-20 sekunder.
    6. Bestäm absorbansen (OD) med hjälp av en mikroplattläsare vid våglängden 450 nm och beräkna provkoncentrationen.
    7. Använd statistisk programvara för att utföra t-test eller rangsummatest och plotta resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De histologiska förändringarna var påfallande olika hos kvinnor och män, varaktigheten av jodintag och lösningen av NaI. Som visas i figur 1, ~ 10% av NOD. H-2h4-möss utvecklade SAT även utan jodinduktion vid 24 veckors ålder, och alla möss utvecklade så småningom tyreoidit. När det gavs regelbundet vatten var det ingen signifikant skillnad i de histologiska förändringarna mellan män och kvinnor. Tillsatsen av NaI till dricksvattnet påskyndade utvecklingen av thyroidit. I lösningarna på 0,005%, 0,05% och 0,5% nådde SAT maximal svårighetsgrad i veckorna 16, 8 respektive 8 efter att ha gett NaI-vattnet. När tyreoidit inducerades fortsatte lymfocytinfiltrationen under hela musens liv. Under induktionen verkade honmöss ha en trend i att utveckla svårare tyreoidit än män under samma tillstånd, men det fanns inga signifikanta skillnader i svårighetsgraden av lymfocytisk infiltration, vilket kan begränsas av antalet prover.

När det gavs regelbundet vatten utan ytterligare jod steg inte nivån av TgAb signifikant vid 16 veckors ålder, och ingen signifikant skillnad hittades mellan män och kvinnor. TgAb-nivåer i NOD. H-2h4-möss började stiga vid 24 veckor, utan skillnad mellan könen, och TgAb-nivåerna fortsatte att stiga fram till 72 veckor (figur 2A). Med tillsats av NaI till dricksvatten började nivåerna av TgAb stiga vid veckorna 16, 8 och 8 med lösningar av 0,005%, 0,05% respektive 0,5% NaI. Nivåerna av TgAb visade dock ingen skillnad mellan män och kvinnor i någon av lösningarna (figur 2B-D). Oavsett om NaI-vatten gavs eller inte, nådde nivåerna av TgAb sin högsta vid 72 veckors ålder (eller 64 veckor efter att NaI-vatten först gavs).

Det fanns en längre fördröjning i detekterbarheten av TPOAb-nivåer jämfört med TgAb. Dessa antikroppar detekterades sällan i NOD. H-2h4 möss med vanligt vatten vid 24 veckors ålder. När de matades med vanligt vatten uppvisade honor mycket högre TPOAb-nivåer än män vid 72 veckor (figur 2E). Samma trend av intersexskillnad uppstod också i NOD. H-2h4-möss under 16, 8 och 8 veckor när de fick NaI-vatten på 0,005%, 0,05% respektive 0,5% (figur 2F-H) Anmärkningsvärt, men när koncentrationen av NaI var över 0,05% under induktionen, nådde nivåerna av TPOAb sin högsta vid 64 veckor efter att NaI-vatten först gavs, och det fanns ingen skillnad mellan män och kvinnor (figur 2G, H).

Dessutom serum TSH-nivåer i manlig NOD. H-2h4-möss var signifikant högre än hos honor i olika utfodringsstadier, oavsett om NAI-vatten gavs eller inte. När det ges regelbundet vatten, TSH-nivåerna av NOD. H-2h4-möss började öka vid 24 års ålder och en liknande tendens observerades i joddietgrupperna med koncentrationerna 0,005%, 0,05% och 0,5% vid 16, 8 respektive 8 veckor efter att jod gavs separat. TSH-nivåerna fortsatte att stiga under hela induktionsperioden och nådde en topp vid 64 veckor. Dessutom fanns det en signifikant skillnad i TSH-nivåer mellan män och kvinnor i resten av NOD. H-2h4 möss (figur 3A-D). NICKA. H-2h4-möss upplevde inte struma eller hypotyreos efter jodintag. Oavsett om jodmedel administrerades fanns det ingen könsrelaterad skillnad i T4-nivåer i NOD. H-2H4 möss. Men när induktionstiden ökade hade nivåerna av T4 en tendens att minska hos båda könen i jodvattengrupperna (ingen signifikant skillnad) (figur 3E-H).

Sexuell dimorfism i den patologiska processen och TPOAb-nivåer hittades i avkomman till NOD. H-2h4 möss, men inte TgAb. I likhet med andra studier25,26 ökade TPOAb-nivåerna signifikant hos modellmöss efter att ha fått dietjodid i 2-4 månader, och det fanns en könsrelaterad skillnad. Dessutom var TSH-nivåerna högre hos manliga än kvinnliga NOD. H-2h4-möss med eller utan kostjodidtillskott, vilket liknar andra musstammar. Denna skillnad kvarstod under djurens liv, som kanske inte har påverkats av nivåerna av TPOAb eller TgAb.När de utsattes för 0,05% NaI utvecklade de flesta mössen tyreoidit på 8 veckor, vilket hade en liknande effekt med 0,5% NaI. Medan 0,005% NaI hade en liknande effekt på NOD. H-2h4-möss som matas med vanligt vatten, koncentrationen av 0,05% NaI (efter 8 veckors induktion) kan vara det föredragna tillståndet för att inducera autoimmun tyreoidit. T4-nivåer i NOD. H-2h4-möss hade inga könsrelaterade skillnader och påverkades inte av jodmedel, vilket överensstämmer med andra studier27,28. Detta kan bero på sjukdomens relativt korta starttid och mössens kompensatoriska sköldkörtelfunktion, vilket resulterar i ett fenomen som liknar subklinisk hypotyreos hos mössen. Vi spekulerar i att mössens TSH-axel så småningom skulle dekompenseras och producera skillnader över tiden.

Figure 1
Figur 1: Patologiska förändringar och lymfocytinfiltration inflammatoriska poäng av sköldkörteln i NOD. H-2h4 möss med/utan joddieten. (A,C,E,G) Patologiska förändringar i sköldkörteln under joddieten på 0%, 0,005%, 0,05% och 0,5% genom HE-färgning; 200x förstoring, N = 10/grupp. (B,D,F,G) Sköldkörtelinflammation bestämdes enligt lymfocytinfiltrationsområdet; gradering av graden av lymfocytinfiltration: 0: nästan ingen lymfocytinfiltration; 1+: mer än en åttondel av körteln invaderas; 2+: en fjärdedel av körteln invaderas; 3+: en fjärdedel till hälften av körteln invaderas; 4+: mer än hälften av körteln förstörs. N = 10/grupp. Signifikanta skillnader: *p < 0,05; **p < 0,01. Förkortningar: F = kvinna; M = hane; NW = N veckor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Autoantikroppar i NOD. H-2h4 möss på vanligt och jodidinnehållande vatten. (AD) Autoantikroppar mot Tg i NOD. H-2h4-möss på vanligt vatten (i åldern 8, 16, 24 och 72 veckor separat) och jodidvatten-0,005%, 0,05% och 0,5% (vid 0, 8, 16 och 64 veckor efter att jodvattnet började). (E-H) Autoantikroppar mot TPO i NOD. H-2h4-möss på vanligt vatten (i åldern 8, 16, 24 och 72 veckor separat) och jodidvatten-0,005%, 0,05% och 0,5% (vid 0, 8, 16 och 64 veckor efter att jodvattnet började). Värden för TgAb rapporteras som ELISA optisk densitet (OD) 490 nm (medelvärde ± standardfel för medelvärdet SEM) och värden för TPOAb rapporteras som det geometriska medelvärdet i flödescytometri. N = 8/grupp. Betydande skillnader: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Förkortningar: Tg = tyroglobulin; TgAb = autoantikroppar mot Tg; TPO = sköldkörtelperoxidas; TPOAb = autoantikroppar mot TPO; F = kvinna; M = hane; NW = N veckor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: TSH- och T4-nivåer i NOD. H-2h4 möss på vanligt och jodidinnehållande vatten. (AD) TSH och (E-H) T4-nivåer på vanligt vatten (vid 8, 16, 24 och 72 veckors ålder separat) och jodidvatten-0,005%, 0,05% och 0,5% (vid 0, 8, 16 och 64 veckor efter att jodvattnet började). TSH-värden mättes med radioimmunanalys (mU / L, medelvärde ± standardfel för medelvärdet SEM). N = 8/grupp. Betydande skillnader: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; *p < 0,0001. Förkortningar: TSH = sköldkörtelstimulerande hormon; F = kvinna; M = hane; NW = N veckor. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

HT uppstår på grund av en autoimmun systemstörning orsakad av lymfocyter som infiltrerar sköldkörteln, vilket ytterligare försämrar sköldkörtelfunktionen, samtidigt som sköldkörtelspecifika antikroppar produceras. Serumnivåerna av TSH, TgAb och TPOAb hos HT-patienter är signifikant förhöjda27. För närvarande används två huvudtyper av murina modeller i stor utsträckning för att studera etiologin för autoimmun tyreoidit: EAT och SAT29. EAT-möss immuniseras mestadels med hjälp av proteiner och adjuvans för att skapa en onormal immunmiljö in vivo. Detta tillvägagångssätt har använts i många år och fortsätter att vara effektivt30,31. Dessutom inkluderar nya metoder för att inducera tyreoidit injektion av dendriska celler (DC) pulserade med Tg32, uttrycket av Tg eller TPO in vivo av adenovirala vektorer eller plasmider31, transplantation av sköldkörteln hos allogen möss och injektion av LPS. Den framgångsrika konstruktionen av tyreoiditmodellen är emellertid vanligtvis mer begränsad av den genetiska bakgrunden till den experimentella murina modellen, syngena antigener och cellbiologiteknik. Dessutom kan specifika adjuvans inducera en mer komplex immunmiljö, vilket gör det svårt att undersöka den immunologiska processen för autoimmun tyreoidit. Därför tror vi att SAT av NOD. H-2h4-möss kan bättre illustrera patogenesen av Hashimotos tyreoidit jämfört med EAT-modellen. Specifikt är immunisering med potenta adjuvans och tyroglobulin inte nödvändig för SAT33. För att påskynda utvecklingen av SAT tillsätts jod till dricksvattnet i NOD. H-2H4 möss. Även om den resulterande tyreoidit inte delar samma mekanism genom vilken tyreoidit uppträder hos människor, är jod verkligen en viktig påverkande faktor för tyreoidit. Vidare kan jodmedel i denna modell snabbt inducera thyroidit i NOD. H-2h4 möss och NOD. H-2H4 möss som inte får jod kan så småningom utveckla tyreoidit samt. Eftersom det experimentella protokollet i de flesta laboratorier är annorlunda utförde vi en mer omfattande utvärdering av NOD. H-2h4 möss under induktion av tyreoidit.

Under modellkonstruktionen behöver vissa punkter noggrann uppmärksamhet. Att tillsätta dricksvatten regelbundet och utvärdera mössens allmänna tillstånd undviker oavsiktliga musdöd. Det rekommenderas att inte hålla mer än fem möss per bur under induktionen för att ge tillräckligt med NaI-matning till varje mus. Antalet möss kan dock också ändras enligt den specifika institutionens regler och föreskrifter för djur. Eftersom sexuell dimorfism finns i vårt laboratorium föreslås enkönade möss för experimentet (för experiment med speciella krav för detektering av sköldkörtelspecifika antikroppar rekommenderas kvinnliga). Det föreslås att välja 8 veckor gamla möss, eftersom 10% av mössen utvecklar spontan tyreoidit vid 16 veckors ålder och alla möss utvecklar thyroidit så småningom utan NaI-vatten. Sköldkörtelskadorna kvarstår under mössens livstid och nästa generation utvecklar tyreoidit när den föds. För bevarande av möss rekommenderas därför att använda 8 veckor gamla möss. Det är viktigt att notera att TPOAb är mer lämplig som detektionsindikator än TgAb vid användning av NOD. H-2h4 möss för att efterlikna tyreoidit. Vid mätning av nivåerna av TPOAb måste dock induktionstiden vara mer fördröjd än TgAb.

Sammanfattningsvis beskriver detta dokument upprättandet av en SAT-modell med NOD. H-2h4-möss och utforskningen av påverkan av olika faktorer på denna modell. Även om det inte perfekt simulerar patogenesen och mekanismen för autoimmun sköldkörtelsjukdom, NOD. H-2h4 mus är en stabil djurmodell med stor potential inom autoimmun sköldkörtelsjukdom. Med tanke på att detta är en enkel djurmodell att konstruera och är mycket reproducerbar, hoppas man att denna metod kommer att bidra till att förbättra tillämpningarna av SAT-murina modeller i olika forskningsinstitutioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Samtliga författare förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Mus monoklonala antikroppar mot human TPO (används som positiva kontroller) tillhandahölls av Dr. P. Carayon och Dr. J. Ruf (Marseille, Frankrike). Författarna tackar alla deltagare i denna studie och medlemmarna i vår forskargrupp. Detta arbete stöddes delvis av bidrag från Postdoctoral Sustentation Fund of West China Hospital, Sichuan University, China (2020HXBH057) och Sichuanprovinsens Science and Technology Support Program (projekt nr 2021YFS0166)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ralli, M., et al. Hashimoto's thyroiditis: An update on pathogenic mechanisms, diagnostic protocols, therapeutic strategies, and potential malignant transformation. Autoimmunity Reviews. 19 (10), 102649 (2020).
  2. Zhang, Q. Y., et al. Lymphocyte infiltration and thyrocyte destruction are driven by stromal and immune cell components in Hashimoto's thyroiditis. Nature Communications. 13 (1), 775 (2022).
  3. Ruggeri, R. M., et al. Autoimmune comorbidities in Hashimoto's thyroiditis: different patterns of association in adulthood and childhood/adolescence. European Journal of Endocrinology. 176 (2), 133-141 (2017).
  4. Resende de Paiva, C., Grønhøj, C., Feldt-Rasmussen, U., von Buchwald, C. Association between Hashimoto's thyroiditis and thyroid cancer in 64,628 patients. Frontiers in Oncology. 7, 53 (2017).
  5. Ehlers, M., Schott, M. Hashimoto's thyroiditis and papillary thyroid cancer: are they immunologically linked. Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (12), 656-664 (2014).
  6. Medenica, S., et al. The role of cell and gene therapies in the treatment of infertility in patients with thyroid autoimmunity. International Journal of Endocrinology. 2022, 4842316 (2022).
  7. Rose, N. R. The genetics of autoimmune thyroiditis: the first decade. Journal of Autoimmunity. 37 (2), 88-94 (2011).
  8. Kolypetri, P., King, J., Larijani, M., Carayanniotis, G. Genes and environment as predisposing factors in autoimmunity: acceleration of spontaneous thyroiditis by dietary iodide in NOD.H2(h4) mice. International Reviews of Immunology. 34 (6), 542-556 (2015).
  9. Terplan, K. L., Witebsky, E., Rose, N. R., Paine, J. R., Egan, R. W. Experimental thyroiditis in rabbits, guinea pigs and dogs, following immunization with thyroid extracts of their own and of heterologous species. The American Journal of Pathology. 36 (2), 213-239 (1960).
  10. Alexopoulos, H., Dalakas, M. C. The immunobiology of autoimmune encephalitides. Journal of Autoimmunity. 104, 102339 (2019).
  11. Noviello, C. M., Kreye, J., Teng, J., Prüss, H., Hibbs, R. E. Structural mechanisms of GABA receptor autoimmune encephalitis. Cell. 185 (14), 2469-2477 (2022).
  12. Pudifin, D. J., Duursma, J., Brain, P. Experimental autoimmune thyroiditis in the vervet monkey. Clinical and Experimental Immunology. 29 (2), 256-260 (1977).
  13. Esquivel, P. S., Rose, N. R., Kong, Y. C. Induction of autoimmunity in good and poor responder mice with mouse thyroglobulin and lipopolysaccharide. The Journal of Experimental Medicine. 145 (5), 1250-1263 (1977).
  14. Kong, Y. C., et al. HLA-DRB1 polymorphism determines susceptibility to autoimmune thyroiditis in transgenic mice: definitive association with HLA-DRB1*0301 (DR3) gene. The Journal of Experimental Medicine. 184 (3), 1167-1172 (1996).
  15. Kotani, T., Umeki, K., Hirai, K., Ohtakia, S. Experimental murine thyroiditis induced by porcine thyroid peroxidase and its transfer by the antigen-specific T cell line. Clinical and Experimental Immunology. 80 (1), 11-18 (1990).
  16. Ng, H. P., Banga, J. P., Kung, A. W. C. Development of a murine model of autoimmune thyroiditis induced with homologous mouse thyroid peroxidase. Endocrinology. 145 (2), 809-816 (2004).
  17. Ng, H. P., Kung, A. W. C. Induction of autoimmune thyroiditis and hypothyroidism by immunization of immunoactive T cell epitope of thyroid peroxidase. Endocrinology. 147 (6), 3085-3092 (2006).
  18. Ellis, J. S., Braley-Mullen, H. Mechanisms by which B cells and regulatory T Cells influence development of murine organ-specific autoimmune diseases. Journal of Clinical Medicine. 6 (2), 13 (2017).
  19. Fang, Y., Yu, S., Braley-Mullen, H. Contrasting roles of IFN-gamma in murine models of autoimmune thyroid diseases. Thyroid. 17 (10), 989-994 (2007).
  20. Fang, Y., Zhao, L., Yan, F. Chemokines as novel therapeutic targets in autoimmune thyroiditis. Recent Patents on DNA & Gene Sequences. 4 (1), 52-57 (2010).
  21. Chen, C. R., et al. Antibodies to thyroid peroxidase arise spontaneously with age in NOD.H-2h4 mice and appear after thyroglobulin antibodies. Endocrinology. 151 (9), 4583-4593 (2010).
  22. Ruf, J., et al. Relationship between immunological structure and biochemical properties of human thyroid peroxidase. Endocrinology. 125 (3), 1211-1218 (1989).
  23. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., Chong, G., Rapoport, B. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword'. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  24. McLachlan, S. M., Aliesky, H. A., Chen, C. R., et al. Breaking tolerance in transgenic mice expressing the human TSH receptor A-subunit: thyroiditis, epitope spreading and adjuvant as a 'double edged sword’[J]. PLoS One. 7 (9), e43517 (2012).
  25. Hutchings, P. R., et al. Both CD4(+) T cells and CD8(+) T cells are required for iodine accelerated thyroiditis in NOD mice. Cellular Immunology. 192 (2), 113-121 (1999).
  26. Xue, H., et al. Dynamic changes of CD4+CD25 + regulatory T cells in NOD.H-2h4 mice with iodine-induced autoimmune thyroiditis. Biological Trace Element Research. 143 (1), 292-301 (2011).
  27. Hou, X., et al. Effect of halofuginone on the pathogenesis of autoimmune thyroid disease in different mice models. Endocrine, Metabolic & Immune Disorders Drug Targets. 17 (2), 141-148 (2017).
  28. McLachlan, S. M., et al. Dissociation between iodide-induced thyroiditis and antibody-mediated hyperthyroidism in NOD.H-2h4 mice. Endocrinology. 146 (1), 294-300 (2005).
  29. Danailova, Y., et al. Nutritional management of thyroiditis of hashimoto. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 5144 (2022).
  30. Carayanniotis, G. Molecular parameters linking thyroglobulin iodination with autoimmune thyroiditis. Hormones. 10 (1), 27-35 (2011).
  31. Verginis, P., Li, H. S., Carayanniotis, G. Tolerogenic semimature dendritic cells suppress experimental autoimmune thyroiditis by activation of thyroglobulin-specific CD4+CD25+ T cells. Journal of Immunology. 174 (11), 7433-7439 (2005).
  32. Flynn, J. C., et al. Superiority of thyroid peroxidase DNA over protein immunization in replicating human thyroid autoimmunity in HLA-DRB1*0301 (DR3) transgenic mice. Clinical and Experimental Immunology. 137 (3), 503-512 (2004).
  33. Akeno, N., et al. IFN-α mediates the development of autoimmunity both by direct tissue toxicity and through immune cell recruitment mechanisms. Journal of Immunology. 186 (8), 4693-4706 (2011).

Tags

Indragning utgåva 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Generering av en mus spontan autoimmun tyreoidit modell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter