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Immunology and Infection

Generazione di un modello di tiroidite autoimmune spontanea del topo

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Sono stati stabiliti diversi tipi di modelli animali della tiroidite di Hashimoto, così come la tiroidite autoimmune spontanea nel topo NOD. I mouse H-2h4 sono un modello semplice e affidabile per l'induzione HT. Questo articolo descrive questo approccio e valuta il processo patologico per una migliore comprensione del modello murino SAT.

Abstract

Negli ultimi anni, la tiroidite di Hashimoto (HT) è diventata la malattia autoimmune della tiroide più comune. È caratterizzata da infiltrazione linfocitaria e dalla rilevazione di specifici autoanticorpi sierici. Sebbene il potenziale meccanismo non sia ancora chiaro, il rischio di tiroidite di Hashimoto è correlato a fattori genetici e ambientali. Allo stato attuale, ci sono diversi tipi di modelli di tiroidite autoimmune, tra cui tiroidite autoimmune sperimentale (EAT) e tiroidite autoimmune spontanea (SAT).

L'EAT nei topi è un modello comune per HT, che viene immunizzato con lipopolisaccaride (LPS) combinato con tireoglobulina (Tg) o integrato con adiuvante completo di Freund (CFA). Il modello murino EAT è ampiamente affermato in molti tipi di topi. Tuttavia, la progressione della malattia è più probabilmente associata alla risposta anticorpale Tg, che può variare in diversi esperimenti.

SAT è anche ampiamente usato nello studio di HT nel NOD. Mouse H-2H4. Il CENNO. Il topo H2h4 è un nuovo ceppo ottenuto dall'incrocio del topo diabetico non obeso (NOD) con la B10. A(4R), che è significativamente indotto per HT con o senza alimentazione di iodio. Durante l'induzione, il NOD. Il topo H-2h4 ha un alto livello di TgAb accompagnato da infiltrazione di linfociti nel tessuto follicolare tiroideo. Tuttavia, per questo tipo di modello murino, ci sono pochi studi per valutare in modo completo il processo patologico durante l'induzione dello iodio.

In questo studio viene stabilito un modello murino SAT per la ricerca HT e il processo di cambiamento patologico viene valutato dopo un lungo periodo di induzione dello iodio. Attraverso questo modello, i ricercatori possono comprendere meglio lo sviluppo patologico della HT e selezionare nuovi metodi di trattamento per la HT.

Introduction

La tiroidite di Hashimoto (HT), nota anche come tiroidite linfatica cronica o tiroidite autoimmune, è stata segnalata per la prima volta nel 19121. La HT è caratterizzata da infiltrazione linfocitaria e danni al tessuto follicolare tiroideo. I test di laboratorio si manifestano principalmente come aumento degli anticorpi specifici della tiroide, inclusi gli anticorpi anti-tireoglobulina (TgAb) e gli anticorpi anti-perossidasi tiroidea (TPOAb)2. L'incidenza di HT è nell'intervallo 0,4% -1,5%, rappresentando il 20% -25% di tutte le malattie della tiroide, e questo valore è aumentato negli ultimi anni3. Inoltre, un gran numero di studi ha riportato che la HT è associata all'oncogenesi e alla recidiva del carcinoma papillare della tiroide (PTC)4,5; I potenziali meccanismi sono ancora controversi. La tiroidite autoimmune è anche un fattore importante nell'infertilità femminile6. Pertanto, la patogenesi della HT deve essere chiara, per la quale è essenziale un modello animale stabile e semplice.

Per studiare l'eziologia della HT, sono stati impiegati due tipi principali di modelli murini, tra cui la tiroidite autoimmune sperimentale (EAT) e la tiroidite autoimmune spontanea (SAT) nei presenti studi 7,8. I topi sensibili sono stati immunizzati con antigeni tiroidei specifici (tra cui la tiroide grezza, la tireoglobulina purificata [TG], la perossidasi tiroidea [TPO], l'ectodominio TPO ricombinante e peptidi TPO selezionati) per stabilire il modello murino EAT. Inoltre, gli adiuvanti, tra cui lipopolisaccaride (LPS), adiuvante completo di Freund (CFA) e altri adiuvanti insoliti, vengono utilizzati anche durante l'immunizzazione per abbattere la tolleranza immunitaria 9,10,11,12,13,14,15,16,17.

Il modello SAT è un modello importante per studiare lo sviluppo spontaneo della tiroidite autoimmune, che si basa sul NOD. Topi H-2h4. Il CENNO. Il topo H-2h4 è un nuovo ceppo ottenuto dall'incrocio di NOD e B10. Topi A(4R), seguiti da più backcross a NOD, con il gene di suscettibilità alla tiroidite autoimmune IAk18,19. ANNUIRE. I topi H-2h4 non sviluppano il diabete, ma hanno un'alta incidenza di tiroidite autoimmune e sindrome di Sjogren (SS)19. Gli studi hanno scoperto che la molecola di adesione intracellulare-1 (ICAM-1) è altamente espressa nel tessuto tiroideo di NOD. Topi H-2h4 a 3-4 settimane di età. Inoltre, con l'aumento dell'assunzione di iodio, l'immunogenicità della molecola di tireoglobulina è potenziata, che regola ulteriormente l'espressione di ICAM-1, che svolge un ruolo importante nel processo di infiltrazione dei monociti21. Questo modello simula il processo autoimmune verificando la relazione tra dose di iodio e gravità della malattia. Il metodo stabilito è stabile, con un'alta probabilità di successo. Il modello SAT è stato applicato per indurre tiroidite autoimmune per molti anni e continua ad essere un metodo efficace per studiare la patogenesi della tiroidite autoimmune. Tuttavia, l'attuale metodo di costruzione del modello EAT è più complicato e costoso; Diversi laboratori utilizzano diversi metodi di immunizzazione e siti di iniezione. Inoltre, topi con diversi background genetici hanno diversi tassi di induzione, che necessitano di ulteriori studi per rivelare il potente meccanismo.

Tuttavia, lo sviluppo della tiroidite nel modello SAT è associato allo ioduro di sodio, al dimorfismo sessuale e alle condizioni di allevamento. Per rivelare la procedura appropriata di tiroidite autoimmune nel modello SAT, questo articolo ha descritto il metodo di induzione della tiroidite autoimmune in diverse condizioni. Inoltre, consente lo studio della patogenesi e del progresso immunologico della tiroidite autoimmune in diversi stadi di questa malattia.

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Protocol

Il protocollo descritto di seguito è stato approvato dalle linee guida per la cura e l'uso stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Sichuan.

1. Preparazione

  1. Ospitare tutti i topi in specifiche condizioni prive di agenti patogeni in cicli luce-buio di 12 ore (a partire rispettivamente dalle 07:00 e dalle 19:00). Mantenere la temperatura ambiente a 22 °C. Cambia i materiali della biancheria da letto ogni settimana. Fornire quantità adeguate di chow e acqua standard per roditori.
  2. Quando si prepara la soluzione madre di NaI in acqua, pesare 2,5 g del composto e scioglierlo in 50 ml di acqua sterile e pura sotto vortice per ottenere una soluzione madre del 5%. Conservare questa soluzione madre in un congelatore a 4 °C, evitando la luce, per un massimo di 8 settimane.
  3. Per preparare una soluzione di lavoro di NaI, prelevare 2,5 ml di soluzione madre e scioglierla in 250 ml di acqua normale come acqua potabile giornaliera per NOD. Topi H-2h4, per dare una soluzione di lavoro dello 0,05%.

2. Induzione della tiroidite

  1. Modello SAT
    1. Preparare il NOD. Topi H-2h4 (8 settimane di età) per lo studio ospitando tutti i topi di un singolo sesso (nessun dimorfismo sessuale) in gabbie di barriera (cinque animali per gabbia) con le condizioni di alimentazione descritte nella fase 1.1.
    2. Per indurre tiroidite autoimmune in NOD. Topi H-2h4, nutrire tutti i topi con lo 0,05% di NaI per 8 settimane. Cambia l'acqua NaI ogni settimana e valuta lo stato dei topi su base settimanale, incluso aspetto, peso, appetito, stato mentale e mobilità.
  2. Modello EAT
    1. Preparare i topi BALB/c (8 settimane di età) per lo studio ospitando tutti i topi di un solo sesso (senza dimorfismo sessuale) in gabbie barriera (cinque animali per gabbia) con le condizioni di alimentazione descritte nella fase 1.1. Nutrire tutti i topi con lo 0,05% di NaI per 8 settimane.
    2. Durante le prime 2 settimane, iniettare per via sottocutanea una miscela di CFA e Tg (200 μL) una volta alla settimana.
    3. Dalla terza settimana in poi, iniettare per via sottocutanea una miscela di IFA e Tg (200 μL) una volta alla settimana per 3 settimane.

3. Misurazioni

  1. Preparazione di campioni di sangue periferico
    1. Dopo l'induzione, anestetizzare i topi con un volume di 0,01 mL/g di anestetico mediante iniezione intraperitoneale. Preparare l'anestetico mescolando midazolam (40 μg/100 μL per sedazione), medetomidina (7,5 μg/100 μL per sedazione) e tartrato di butorfanolo (50 μg/100 μL per analgesia) in soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
      NOTA: Le concentrazioni specifiche di ciascun componente nella miscela di anestesia sono: midazolam 13,33μg/100μL, medetomidina 2,5μg/100μL e butorfanolo 16,7μg/100μL. Per dosaggi specifici utilizzati nei topi, le dosi sono: midazolam 4μg / g, medetomidina 0,75μg / g e butorfanolo 1,67μg / g. La profondità dell'anestesia è stata confermata quando i muscoli degli arti del topo si sono rilassati, i baffi non hanno avuto risposta al tocco e c'è stata perdita del riflesso del pedale.
    2. Dopo che i topi sono stati anestetizzati, preparare i campioni di sangue periferico, fissando il topo con una mano e premendo la pelle dell'occhio per sporgere il bulbo oculare. Quindi, inserire il tubo capillare nell'angolo interno dell'occhio e penetrare con un angolo di 30-45 gradi rispetto al piano della narice. Applicare pressione ruotando delicatamente il tubo capillare. Il sangue fluirà nel tubo attraverso l'azione capillare.
    3. Mettere il sangue in frigorifero a 4 °C per 2 ore e poi centrifugare a 1.000 × g per 10 minuti a 4 °C per ottenere il campione. Per ulteriori analisi, conservare il resto del campione a -80 °C.
  2. Preparazione di campioni di tessuto tiroideo
    1. Eutanasia umana dell'animale secondo le politiche istituzionali. Quindi, sezionare la parete toracica per esporre il cuore, tagliare l'atrio destro e infondere soluzione salina nel ventricolo sinistro con un ago per infusione endovenosa collegato a una siringa da 20 ml fino a quando il tessuto diventa bianco.
    2. Fissare il mouse sul tavolo di dissezione con i perni. Sterilizzare il collo con etanolo al 75%. Tagliare la pelle del topo lungo la linea mediana del collo dalla parte superiore dello sterno alla mascella inferiore con forbici di tessuto per esporre completamente il tessuto del collo.
    3. Osservare la coppia di ghiandole rosa, le ghiandole sottomandibolari, sotto le quali si trova il muscolo trachea anteriore. Separare le ghiandole e il muscolo con forbici oftalmiche e pinze per esporre la trachea e la cartilagine tiroidea.
    4. Separare il tessuto sotto la cartilagine, usando una pinza curva per raccogliere la cartilagine e la trachea insieme. Tagliare le estremità distale e prossimale della cartilagine e della trachea, rispettivamente, e rimuovere la ghiandola tiroidea insieme alla trachea.
    5. Immergere le ghiandole in paraformaldeide al 4% per 12-24 ore. Quindi, trasferire il tessuto al 70% di etanolo.
    6. Posizionare i singoli lobi del materiale per biopsia tiroidea nelle cassette di lavorazione e disidratare attraverso il seguente gradiente alcolico seriale: 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%, etanolo per 40 minuti ciascuno; 1/2 xilene + 1/2 etanolo assoluto per 2 ore; 100% xilene per 1,5 ore; 100% xilene per 1,5 ore; 1/2 xilene + 1/2 paraffina per 2 ore; forno a 40 ° C per 40 min; paraffina I per 30 min; e paraffina II per 30 min. Incorporali in blocchi di cera di paraffina.
    7. Prima della colorazione, decerare sezioni di tessuto tiroideo spesse 5 μm in xilene (come segue) e reidratare attraverso le seguenti concentrazioni decrescenti di etanolo: xilene I per 10 minuti; xilene II per 10 min; xilene III per 10 min; etanolo assoluto I per 5 min; etanolo assoluto II per 5 min; 90% di alcol per 5 min; 80% di alcol per 5 min; 70% di alcol per 5 min; e 50% di alcol per 5 min.
    8. Colorare i tessuti con ematossilina ed eosina (H & E). Colorare con ematossilina per 15 minuti, risciacquare con acqua di rubinetto per 15 minuti, aggiungere etanolo acido cloridrico all'1% per 10 s, risciacquare con acqua corrente e quindi con etanolo al 50%, 70% e 80%, ciascuno per 3 min. Eseguire la colorazione con etanolo allo 0,5% di eosina per 2 minuti e risciacquare con acqua corrente. Posizionare le sezioni di paraffina successivamente in etanolo al 75% per 2 minuti, etanolo all'85% per 2 minuti, etanolo assoluto per 5 minuti e xilene per 5 minuti. Fissare le fette con gomma neutra e vetrini.
    9. Per valutare l'entità della tiroidite linfocitica, valutare le sezioni tiroidee come segue: 0: poca o nessuna infiltrazione di linfociti nel tessuto tiroideo; 1+: più di 1/8 della ghiandola è infiltrata in uno o più fuochi; 2+: non più di 1/4 della ghiandola è infiltrata con i linfociti; 3+: 1/4-1/2 della ghiandola è infiltrato con i linfociti; 4+: più di 1/2 della ghiandola viene distrutta.
      NOTA: Si consiglia di rimuovere la cartilagine tiroidea per mantenere l'intera struttura della tiroide del topo, che è troppo piccola per essere rimossa dalla trachea.
  3. Misurazione di TPOAb
    NOTA: Le cellule ovariche di criceto cinese (CHO) che esprimono stabilmente il TPO del topo sono state stabilite nel nostro laboratorio. Il cDNA TPO di topo è stato asportato da XbaI e NheI. Quindi, il cDNA è stato trasferito a pcDNA5 / FRT. Dopo che il plasmide è stato costruito con successo, è stato trasfettato nelle cellule CHO e selezionato con igromicina B (100 g / ml).
    1. Dopo la costruzione delle cellule mTPO-CHO, diluire i sieri di topo dal punto 3.1.3 (1:50) e incubare con le cellule mTPO-CHO per 2 ore. Dopo l'incubazione, escludere la colorazione cellulare con ioduro di propidio (1 g/ml) e analizzare il campione mediante citometria a flusso utilizzando IgG anti-topo di capra coniugate con fluoresceina isotiocianato, purificate per affinità. Screening delle popolazioni monocellulari sopravvissute mediante i canali FSC-A e SSC-A e selezionare le cellule marcate FITC e PI dalle popolazioni monocellulari21.
    2. Includere il siero di topi BALB/c o C57BL/6 non immunizzati legati a IgG come controllo negativo. Includere anticorpi monoclonali di topo contro il TPO22 umano come controlli positivi che riconoscono il TPO23 del topo. Esprimere i dati di legame TPO come mezzi geometrici.
  4. Misurazione del TgAb
    NOTA: Utilizzare un kit ELISA per rilevare la tireoglobulina seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Diluire i campioni standard nella provetta della microcentrifuga secondo le istruzioni. Estrarre il kit dal frigorifero e tenerlo a temperatura ambiente per 30 minuti.
    2. Impostare i pozzi standard, i pozzi vuoti e i pozzi di prova. I pozzi vuoti ottengono solo buffer, mentre i pozzi standard ottengono soluzioni standard. Aggiungere 10 μL di campioni nei pozzetti di prova. Quando aggiungi i campioni, cerca di non toccare le pareti dei pozzetti e scuoti delicatamente la piastra per spostare i campioni sul fondo dei pozzi.
    3. Includere il siero di topi BALB / c immunizzati con Tg, CFA e IFA24 come controllo positivo e il siero di NOD di 8 settimane. Topi H-2h4 su acqua normale come controllo negativo.
    4. Incubare i campioni a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti. Diluire il tampone di lavaggio con acqua distillata in rapporto 1:30. Quindi, rimuovere la pellicola sigillante, scuotere il liquido all'interno della piastra enzimatica e asciugare tamponando su carta assorbente e aggiungere 350 μL di tampone di lavaggio per 30 s. Ripetere questa procedura cinque volte e poi tamponare i pozzetti asciutti.
    5. Aggiungere 50 μL di reagente di marcatura enzimatica a ciascun pozzetto, ad eccezione dei pozzetti vuoti, e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° per 30 minuti. Rimuovere la pellicola sigillante, scuotere il liquido all'interno della piastra enzimatica e asciugare tamponando su carta assorbente.
    6. Aggiungere 50 μL di sviluppatore A a ciascun pozzetto seguito da 50 μL di sviluppatore B e agitare delicatamente i pozzetti per mescolare per 5 minuti. Aggiungere 50 μL della soluzione di terminazione in ciascun pozzetto per 15 minuti per interrompere la reazione. Misurare l'assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a una lunghezza d'onda di 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Presentare i dati TgAb come densità ottica (OD) a 490 nm.
  5. Misurazione del T4 e dell'ormone stimolante la tiroide (TSH)
    NOTA: Misurare i livelli di T4 e TSH (in aliquote da 10 μL) mediante ELISA seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Diluire l'enzima coniugato a 1:11 con il diluente del dosaggio; diluire i campioni da misurare (1:100) utilizzando 0,01 M PBS.
    2. Aggiungere 10 μL dello standard e del campione ai pozzetti corrispondenti, aggiungere 100 μL di enzima coniugato a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
    3. Scartare il liquido nei pozzetti e pulirlo con tampone di lavaggio tre volte.
    4. Aggiungere 100 μL di 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB) e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
    5. Aggiungere 50 μL di soluzione di arresto e mescolare delicatamente per 15-20 s.
    6. Determinare l'assorbanza (OD) utilizzando un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di 450 nm e calcolare la concentrazione del campione.
    7. Utilizzare un software statistico per eseguire il test t o il test della somma dei ranghi e tracciare i risultati.

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Representative Results

I cambiamenti istologici erano sorprendentemente diversi nelle femmine e nei maschi, la durata dell'assunzione di iodio e la soluzione di NaI. Come mostrato nella Figura 1, ~10% di NOD. I topi H-2h4 hanno sviluppato SAT anche senza induzione di iodio all'età di 24 settimane e tutti i topi alla fine hanno sviluppato tiroidite. Quando veniva somministrata acqua normale, non c'era alcuna differenza significativa nei cambiamenti istologici tra maschi e femmine. L'aggiunta di NaI all'acqua potabile ha accelerato lo sviluppo della tiroidite. Nelle soluzioni di 0,005%, 0,05% e 0,5%, SAT ha raggiunto la massima gravità nelle settimane 16, 8 e 8, rispettivamente, dopo aver somministrato acqua NaI. Una volta indotta la tiroidite, l'infiltrazione dei linfociti è continuata per tutta la vita del topo. Durante l'induzione, i topi femmina sembravano avere una tendenza a sviluppare tiroidite più grave rispetto ai maschi nella stessa condizione, ma non c'erano differenze significative nella gravità dell'infiltrazione linfocitaria, che potrebbe essere limitata dal numero di campioni.

Quando è stata somministrata acqua regolare senza iodio aggiuntivo, il livello di TgAb non è aumentato significativamente all'età di 16 settimane e non è stata riscontrata alcuna differenza significativa tra maschi e femmine. Livelli di TgAb in NOD. I topi H-2h4 hanno iniziato a salire a 24 settimane, senza differenze tra i sessi, e i livelli di TgAb hanno continuato a salire fino a 72 settimane (Figura 2A). Con l'aggiunta di NaI all'acqua potabile, i livelli di TgAb hanno iniziato a salire alle settimane 16, 8 e 8 con soluzioni di 0,005%, 0,05% e 0,5% di NaI, rispettivamente. Tuttavia, i livelli di TgAb non hanno mostrato alcuna differenza tra maschi e femmine in nessuna delle soluzioni (Figura 2B-D). Indipendentemente dal fatto che sia stata somministrata acqua NaI, i livelli di TgAb hanno raggiunto il loro massimo all'età di 72 settimane (o 64 settimane dopo che l'acqua NaI è stata somministrata per la prima volta).

C'è stato un ritardo maggiore nella rilevabilità dei livelli di TPOAb rispetto a TgAb. Questi anticorpi sono stati raramente rilevati nel NOD. Topi H-2h4 con acqua normale all'età di 24 settimane. Quando alimentate con acqua normale, le femmine hanno mostrato livelli di TPOAb molto più alti rispetto ai maschi a 72 settimane (Figura 2E). La stessa tendenza alla differenza intersessuale stava emergendo anche in NOD. Topi H-2H4 durante la durata di 16, 8 e 8 settimane quando hanno ricevuto acqua NaI rispettivamente dello 0,005%, 0,05% e 0,5% (Figura 2F-H) Sorprendentemente, tuttavia, quando la concentrazione di NaI era superiore allo 0,05% durante l'induzione, i livelli di TPOAb hanno raggiunto il loro massimo a 64 settimane dopo che l'acqua NaI è stata somministrata per la prima volta e non vi è stata alcuna differenza tra maschi e femmine (Figura 2G, H).

Inoltre, i livelli sierici di TSH nel NOD maschile. I topi H-2h4 erano significativamente più alti di quelli delle femmine in diverse fasi di alimentazione, indipendentemente dal fatto che l'acqua NAI fosse stata somministrata o meno. Quando viene somministrata acqua normale, i livelli di TSH di NOD. I topi H-2h4 hanno iniziato ad aumentare all'età di 24 settimane e una tendenza simile è stata osservata nei gruppi di dieta di iodio con concentrazioni di 0,005%, 0,05% e 0,5% a 16, 8 e 8 settimane, rispettivamente, dopo che lo iodio è stato somministrato separatamente. I livelli di TSH hanno continuato ad aumentare durante tutto il periodo di induzione, raggiungendo il picco a 64 settimane. Inoltre, c'era una differenza significativa nei livelli di TSH tra maschi e femmine nel resto del NOD. Topi H-2h4 (Figura 3A-D). ANNUIRE. I topi H-2H4 non hanno sperimentato gozzo o ipotiroidismo dopo l'ingestione di iodio. Indipendentemente dal fatto che siano stati somministrati agenti di iodio, non c'era alcuna differenza legata al sesso nei livelli di T4 in NOD. Topi H-2h4. Tuttavia, con l'aumentare della durata dell'induzione, i livelli di T4 avevano la tendenza a diminuire in entrambi i sessi nei gruppi di acqua di iodio (nessuna differenza significativa) (Figura 3E-H).

Dimorfismo sessuale nel processo patologico e livelli di TPOAb sono stati trovati nella progenie di NOD. Topi H-2h4, ma non TgAb. Analogamente ad altri studi25,26, i livelli di TPOAb sono aumentati significativamente nei topi modello dopo aver ricevuto ioduro dietetico per 2-4 mesi e c'era una differenza correlata al sesso. Inoltre, i livelli di TSH erano più alti nel NOD maschile rispetto a quello femminile. Topi H-2h4 con o senza integrazione di ioduro dietetico, che è simile ad altri ceppi di topo. Questa differenza è rimasta per tutta la vita degli animali, che potrebbero non essere influenzati dai livelli di TPOAb o TgAb.Quando esposti allo 0,05% di NaI, la maggior parte dei topi ha sviluppato tiroidite in 8 settimane, che ha avuto un effetto simile con lo 0,5% di NaI. Mentre lo 0,005% di NaI ha avuto un effetto simile sul NOD. Topi H-2h4 alimentati con acqua normale, la concentrazione dello 0,05% di NaI (dopo 8 settimane di induzione) potrebbe essere la condizione preferibile per indurre tiroidite autoimmune. Livelli di T4 in NOD. I topi H-2H4 non avevano differenze legate al sesso e non erano influenzati da agenti di iodio, il che è coerente con altri studi27,28. Ciò può essere dovuto al tempo di insorgenza relativamente breve della malattia e alla funzione tiroidea compensatoria dei topi, con conseguente fenomeno simile all'ipotiroidismo subclinico nei topi. Ipotizziamo che l'asse TSH dei topi finirebbe per scompensarsi e produrre differenze nel tempo.

Figure 1
Figura 1: Cambiamenti patologici e punteggi infiammatori di infiltrazione linfocitaria delle ghiandole tiroidee in NOD. Topi H-2H4 con / senza la dieta dello iodio. (A,C,E,G) Cambiamenti patologici della ghiandola tiroidea sotto la dieta dello iodio dello 0%, 0,005%, 0,05% e 0,5% mediante colorazione HE; Ingrandimento 200x, N = 10/gruppo. (B,D,F,G) L'infiammazione della tiroide è stata determinata in base all'area di infiltrazione dei linfociti; classificazione del grado di infiltrazione linfocitaria: 0: quasi nessuna infiltrazione linfocitaria; 1+: più di un ottavo della ghiandola è invaso; 2+: un quarto della ghiandola è invaso; 3+: da un quarto a metà della ghiandola è invasa; 4+: più della metà della ghiandola viene distrutta. N = 10/gruppo. Differenze significative: *p < 0,05; **p < 0,01. Abbreviazioni: F = femmina; M = maschio; NW = N settimane. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Autoanticorpi in NOD. Topi H-2H4 su acqua normale e contenente ioduro. (A-D) Autoanticorpi contro Tg in NOD. Topi H-2H4 in acqua normale (all'età di 8, 16, 24 e 72 settimane separatamente) e acqua di ioduro-0,005%, 0,05% e 0,5% (a 0, 8, 16 e 64 settimane dopo l'inizio dell'acqua di iodio). (E-H) Autoanticorpi contro TPO in NOD. Topi H-2H4 in acqua normale (all'età di 8, 16, 24 e 72 settimane separatamente) e acqua di ioduro-0,005%, 0,05% e 0,5% (a 0, 8, 16 e 64 settimane dopo l'inizio dell'acqua di iodio). I valori per TgAb sono riportati come densità ottica ELISA (OD) 490 nm (errore medio ± standard del SEM medio) e i valori per TPOAb sono riportati come media geometrica nella citometria a flusso. N = 8/gruppo. Differenze significative: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Abbreviazioni: Tg = tireoglobulina; TgAb = autoanticorpi contro Tg; TPO = perossidasi tiroidea; TPOAb = autoanticorpi contro TPO; F = femmina; M = maschio; NW = N settimane. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Livelli di TSH e T4 in NOD. Topi H-2H4 su acqua normale e contenente ioduro. (A-D) TSH e (E-H) T4 livelli su acqua normale (all'età di 8, 16, 24 e 72 settimane separatamente) e acqua di ioduro-0,005%, 0,05% e 0,5% (a 0, 8, 16 e 64 settimane dopo l'inizio dell'acqua di iodio). I valori di TSH sono stati misurati mediante saggio radioimmunologico (mU/L, errore medio ± standard del SEM medio). N = 8/gruppo. Differenze significative: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001; *p < 0,0001. Abbreviazioni: TSH = ormone stimolante la tiroide; F = femmina; M = maschio; NW = N settimane. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

La HT si verifica a causa di un disturbo del sistema autoimmune causato da linfociti che si infiltrano nella ghiandola tiroidea, compromettendo ulteriormente la funzione tiroidea, mentre producono anticorpi specifici della tiroide. I livelli sierici di TSH, TgAb e TPOAb nei pazienti con HT sono significativamente elevati27. Allo stato attuale, due tipi principali di modelli murini sono ampiamente utilizzati per studiare l'eziologia della tiroidite autoimmune: EAT e SAT29. I topi EAT sono per lo più immunizzati usando proteine e adiuvanti per creare un ambiente immunitario anormale in vivo. Questo approccio è stato utilizzato per molti anni e continua ad essere efficace30,31. Inoltre, nuovi approcci per indurre tiroidite includono l'iniezione di cellule dendriche (DC) pulsate con Tg32, l'espressione di Tg o TPO in vivo da parte di vettori adenovirali o plasmidi31, il trapianto della ghiandola tiroidea di topi allogenici e l'iniezione di LPS. Tuttavia, la costruzione di successo del modello di tiroidite è solitamente più limitata dal background genetico del modello murino sperimentale, dagli antigeni singeneici e dalle tecnologie di biologia cellulare. Inoltre, adiuvanti specifici possono indurre un ambiente immunitario più complesso, rendendo difficile studiare il processo immunologico della tiroidite autoimmune. Pertanto, riteniamo che il SAT di NOD. I topi H-2h4 possono illustrare meglio la patogenesi della tiroidite di Hashimoto rispetto al modello EAT. In particolare, l'immunizzazione con potenti adiuvanti e tireoglobulina non è necessaria per SAT33. Per accelerare il progresso del SAT, lo iodio viene aggiunto all'acqua potabile di NOD. Topi H-2h4. Sebbene la tiroidite risultante non condivida lo stesso meccanismo con cui si verifica la tiroidite negli esseri umani, lo iodio è davvero un importante fattore di influenza della tiroidite. Inoltre, in questo modello, gli agenti di iodio possono indurre rapidamente tiroidite in NOD. Topi H-2h4 e NOD. I topi H-2H4 che non ricevono iodio possono eventualmente sviluppare tiroidite pure. Poiché il protocollo sperimentale nella maggior parte dei laboratori è diverso, abbiamo eseguito una valutazione più completa al NOD. Topi H-2h4 durante l'induzione della tiroidite.

Nel processo di costruzione del modello, alcuni punti richiedono un'attenta attenzione. L'aggiunta regolare di acqua potabile e la valutazione delle condizioni generali dei topi evitano morti accidentali di topo. Si raccomanda di tenere non più di cinque topi per gabbia durante l'induzione per fornire abbastanza NaI a ciascun topo. Tuttavia, il numero di topi può anche cambiare seguendo le regole e i regolamenti specifici dell'istituzione per gli animali. Poiché il dimorfismo sessuale si trova nel nostro laboratorio, i topi dello stesso sesso sono suggeriti per l'esperimento (per gli esperimenti con requisiti speciali per la rilevazione di anticorpi specifici della tiroide, si raccomandano le femmine). Si suggerisce di selezionare topi di 8 settimane, poiché il 10% dei topi sviluppa tiroidite spontanea all'età di 16 settimane e tutti i topi sviluppano tiroidite alla fine senza acqua NaI. Le lesioni tiroidee persistono per tutta la vita dei topi e la generazione successiva sviluppa tiroidite quando nasce. Pertanto, per la conservazione dei topi, si consiglia di utilizzare topi di 8 settimane. È importante notare che TPOAb è più adatto come indicatore di rilevamento rispetto a TgAb quando si utilizza NOD. Topi H-2h4 per imitare la tiroidite. Tuttavia, quando si misurano i livelli di TPOAb, la durata dell'induzione deve essere più ritardata rispetto a TgAb.

In conclusione, questo documento descrive l'istituzione di un modello SAT con NOD. I topi H-2h4 e l'esplorazione dell'influenza di diversi fattori su questo modello. Sebbene non simuli perfettamente la patogenesi e il meccanismo della malattia autoimmune della tiroide, il NOD. Il topo H-2h4 è un modello animale stabile con un grande potenziale nel campo della malattia autoimmune della tiroide. Dato che questo è un modello animale facile da costruire ed è altamente riproducibile, si spera che questo metodo contribuirà a migliorare le applicazioni dei modelli murini SAT in diversi istituti di ricerca.

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Disclosures

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Acknowledgments

Gli anticorpi monoclonali di topo contro il TPO umano (usati come controlli positivi) sono stati forniti dal Dr. P. Carayon e dal Dr. J. Ruf (Marsiglia, Francia). Gli autori ringraziano tutti i partecipanti a questo studio e i membri del nostro team di ricerca. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da sovvenzioni del Fondo di sostegno post-dottorato dell'ospedale della Cina occidentale, dell'Università del Sichuan, Cina (2020HXBH057) e del Programma di supporto scientifico e tecnologico della provincia del Sichuan (progetto n. 2021YFS0166)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

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Tags

Ritrattazione numero 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Generazione di un modello di tiroidite autoimmune spontanea del topo
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Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

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