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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Generierung eines Mausmodells für spontane Autoimmunthyreoiditis

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64609
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 3, 1
1Thyroid and Parathyroid Surgery Center, West China Hospital of Sichuan University, 2The Laboratory of Thyroid and Parathyroid Disease, West China Hospital of Sichuan University, 3State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, Sichuan University and Collaborative Innovation Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Es wurden mehrere Arten von Tiermodellen der Hashimoto-Thyreoiditis etabliert, ebenso wie die spontane Autoimmunthyreoiditis bei der NOD-Maus. H-2h4-Mäuse sind ein einfaches und zuverlässiges Modell für die HT-Induktion. Dieser Artikel beschreibt diesen Ansatz und bewertet den pathologischen Prozess für ein besseres Verständnis des SAT-Mausmodells.

Abstract

Die Hashimoto-Thyreoiditis (HT) hat sich in den letzten Jahren zur häufigsten Autoimmunerkrankung der Schilddrüse entwickelt. Sie zeichnet sich durch eine Infiltration von Lymphozyten und den Nachweis spezifischer Serum-Autoantikörper aus. Obwohl der mögliche Mechanismus noch nicht geklärt ist, hängt das Risiko einer Hashimoto-Thyreoiditis mit genetischen und umweltbedingten Faktoren zusammen. Derzeit gibt es verschiedene Arten von Modellen der Autoimmunthyreoiditis, darunter die experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT) und die spontane Autoimmunthyreoiditis (SAT).

EAT bei Mäusen ist ein häufiges Modell für HT, das mit Lipopolysaccharid (LPS) in Kombination mit Thyreoglobulin (Tg) immunisiert oder mit einem vollständigen Freund-Adjuvans (CFA) ergänzt wird. Das EAT-Mausmodell ist bei vielen Mäusearten weit verbreitet. Der Krankheitsverlauf ist jedoch eher mit der Tg-Antikörperantwort assoziiert, die in verschiedenen Experimenten variieren kann.

SAT wird auch häufig bei der Untersuchung von HT im NOD verwendet. H-2h4 Maus. Das NOD. Die H2h4-Maus ist ein neuer Stamm, der aus der Kreuzung der nicht-adipösen diabetischen Maus (NOD) mit der B10 gewonnen wurde. A(4R), das für HT mit oder ohne Jodzufuhr signifikant induziert ist. Während der Induktion wird die NOD. Die H-2h4-Maus weist einen hohen TgAb-Spiegel auf, der von einer Lymphozyteninfiltration im Schilddrüsenfollikelgewebe begleitet wird. Für diese Art von Mausmodell gibt es jedoch nur wenige Studien, um den pathologischen Prozess bei der Induktion von Jod umfassend zu bewerten.

In dieser Studie wird ein SAT-Mausmodell für die HT-Forschung etabliert und der pathologische Veränderungsprozess nach einer langen Zeit der Jodinduktion evaluiert. Durch dieses Modell können Forscher die pathologische Entwicklung von HT besser verstehen und neue Behandlungsmethoden für HT untersuchen.

Introduction

Die Hashimoto-Thyreoiditis (HT), auch bekannt als chronische lymphatische Thyreoiditis oder Autoimmunthyreoiditis, wurde erstmals 1912 berichtet1. HT ist gekennzeichnet durch Lymphozyteninfiltration und Schädigung des Schilddrüsenfollikelgewebes. Labortests manifestieren sich hauptsächlich in einem Anstieg schilddrüsenspezifischer Antikörper, einschließlich Anti-Thyreoglobulin-Antikörper (TgAb) und Anti-Schilddrüsenperoxidase-Antikörper (TPOAb)2. Die Inzidenz von HT liegt im Bereich von 0,4 % bis 1,5 % und macht 20 % bis 25 % aller Schilddrüsenerkrankungen aus, und dieser Wert ist in den letzten Jahren gestiegen3. Darüber hinaus wurde in einer Vielzahl von Studien berichtet, dass HT mit der Onkogenese und dem Rezidiv des papillären Schilddrüsenkarzinoms (PTC) assoziiert ist4,5; Die möglichen Mechanismen sind noch umstritten. Die Autoimmunthyreoiditis ist auch ein wichtiger Faktor bei der weiblichen Unfruchtbarkeit6. Daher muss die Pathogenese der HT klar sein, wofür ein stabiles und einfaches Tiermodell unerlässlich ist.

Um die Ätiologie der HT zu untersuchen, wurden in den vorliegenden Studien zwei Haupttypen von Mausmodellen verwendet, darunter die experimentelle Autoimmunthyreoiditis (EAT) und die spontane Autoimmunthyreoiditis (SAT) 7,8. Empfängliche Mäuse wurden mit spezifischen Schilddrüsenantigenen (einschließlich der rohen Schilddrüse, des gereinigten Thyreoglobulins [TG], der Schilddrüsenperoxidase [TPO], der rekombinanten TPO-Ektodomäne und ausgewählter TPO-Peptide) immunisiert, um das EAT-Mausmodell zu etablieren. Darüber hinaus werden die Adjuvantien, darunter Lipopolysaccharid (LPS), vollständiges Freund-Adjuvans (CFA) und andere ungewöhnliche Adjuvantien, auch während der Immunisierung verwendet, um die Immuntoleranz 9,10,11,12,13,14,15,16,17 abzubauen.

Das SAT-Modell ist ein wichtiges Modell, um die spontane Entwicklung einer Autoimmunthyreoiditis zu untersuchen, die auf NOD basiert. H-2h4 Mäuse. Das NOD. Die H-2h4-Maus ist ein neuer Stamm, der aus der Kreuzung von NOD und B10 gewonnen wurde. A(4R)-Mäuse, gefolgt von mehrfachen Rückkreuzungen auf NOD, mit dem Autoimmunthyreoiditis-Suszeptibilitätsgen IAk18,19. NICKEN. H-2h4-Mäuse entwickeln keinen Diabetes, haben aber eine hohe Inzidenz von Autoimmunthyreoiditis und Sjögren-Syndrom (SS)19. Studien haben gezeigt, dass das intrazelluläre Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) im Schilddrüsengewebe von NOD stark exprimiert wird. H-2h4-Mäuse im Alter von 3-4 Wochen. Darüber hinaus wird mit zunehmender Jodzufuhr die Immunogenität des Thyreoglobulinmoleküls erhöht, was die Expression von ICAM-1, das eine wichtige Rolle bei der Infiltration von Monozyten spielt, weiter hochreguliert21. Dieses Modell simuliert den Autoimmunprozess und verifiziert gleichzeitig den Zusammenhang zwischen Joddosis und Schwere der Erkrankung. Die etablierte Methode ist stabil und hat eine hohe Erfolgswahrscheinlichkeit. Das SAT-Modell wird seit vielen Jahren zur Induktion einer Autoimmunthyreoiditis eingesetzt und ist nach wie vor eine effektive Methode, um die Pathogenese der Autoimmunthyreoiditis zu untersuchen. Die derzeitige Bauweise des EAT-Modells ist jedoch komplizierter und teurer; Verschiedene Labore verwenden unterschiedliche Immunisierungsmethoden und Injektionsstellen. Darüber hinaus haben Mäuse mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund unterschiedliche Induktionsraten, die weitere Studien erfordern, um den potenten Mechanismus aufzudecken.

Die Entwicklung einer Thyreoiditis im SAT-Modell ist jedoch mit Natriumjodid, Sexualdimorphismus und den Aufzuchtbedingungen verbunden. Um das geeignete Verfahren der Autoimmunthyreoiditis im SAT-Modell aufzuzeigen, wurde in diesem Artikel die Methode zur Induktion der Autoimmunthyreoiditis unter verschiedenen Bedingungen beschrieben. Darüber hinaus ermöglicht es die Untersuchung der Pathogenese und des immunologischen Verlaufs der Autoimmunthyreoiditis in verschiedenen Stadien dieser Erkrankung.

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Protocol

Das unten beschriebene Protokoll wurde von den Pflege- und Verwendungsrichtlinien genehmigt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Sichuan festgelegt wurden.

1. Vorbereitung

  1. Unterbringung aller Mäuse unter bestimmten erregerfreien Bedingungen unter 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklen (Beginn um 07:00 Uhr bzw. 19:00 Uhr). Halten Sie die Raumtemperatur bei 22 °C. Wechseln Sie die Einstreumaterialien jede Woche. Stellen Sie ausreichende Mengen an Standard-Nagetierfutter und Wasser zur Verfügung.
  2. Bei der Herstellung der Stammlösung von NaI in Wasser werden 2,5 g der Verbindung abgewogen und in 50 ml sterilem, reinem Wasser unter Vortexen aufgelöst, um eine Stammlösung von 5 % zu erhalten. Lagern Sie diese Stammlösung bis zu 8 Wochen in einem Gefrierschrank bei 4 °C unter Vermeidung von Licht.
  3. Um eine Arbeitslösung von NaI herzustellen, entnehmen Sie 2,5 ml Stammlösung und lösen Sie sie in 250 ml normalem Wasser als tägliches Trinkwasser für NOD auf. H-2h4-Mäuse, um eine Arbeitslösung von 0,05 % zu erhalten.

2. Induktion einer Schilddrüsenentzündung

  1. SAT-Modell
    1. Bereiten Sie das NOD vor. H-2h4-Mäuse (im Alter von 8 Wochen) für die Studie, indem alle Mäuse eines Geschlechts (kein Sexualdimorphismus) in Barrierekäfigen (fünf Tiere pro Käfig) mit den in Schritt 1.1 beschriebenen Fütterungsbedingungen untergebracht wurden.
    2. Zur Induktion einer Autoimmunthyreoiditis bei NOD. H-2h4-Mäuse, füttern Sie alle Mäuse 8 Wochen lang mit 0,05% NaI. Wechseln Sie das NaI-Wasser jede Woche und beurteilen Sie wöchentlich den Status der Mäuse, einschließlich Aussehen, Gewicht, Appetit, mentalem Zustand und Mobilität.
  2. EAT-Modell
    1. Bereiten Sie die BALB/c-Mäuse (im Alter von 8 Wochen) auf die Studie vor, indem alle Mäuse eines Geschlechts (kein Sexualdimorphismus) in Barrierekäfigen (fünf Tiere pro Käfig) mit den in Schritt 1.1 beschriebenen Fütterungsbedingungen untergebracht werden. Füttern Sie alle Mäuse 8 Wochen lang mit 0,05% NaI.
    2. Injizieren Sie in den ersten 2 Wochen einmal pro Woche subkutan eine Mischung aus CFA und Tg (200 μl).
    3. Ab der dritten Woche injizieren Sie 3 Wochen lang einmal wöchentlich subkutan eine Mischung aus IFA und Tg (200 μl).

3. Messungen

  1. Aufbereitung von peripheren Blutproben
    1. Nach der Induktion werden die Mäuse mit einem Volumen von 0,01 ml/g Anästhetikum durch intraperitoneale Injektion anästhesiert. Bereiten Sie das Anästhetikum vor, indem Sie Midazolam (40 μg/100 μl für die Sedierung), Medetomidin (7,5 μg/100 μl für die Sedierung) und Butorphanoltartrat (50 μg/100 μl für die Analgesie) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mischen.
      Anmerkungen: Die spezifischen Konzentrationen jeder Komponente in der Anästhesiemischung sind: Midazolam 13,33 μg/100 μl, Medetomidin 2,5 μg/100 μl und Butorphanol 16,7 μg/100 μl. Für spezifische Dosierungen, die bei Mäusen verwendet werden, betragen die Dosen: Midazolam 4 μg/g, Medetomidin 0,75 μg/g und Butorphanol 1,67 μg/g. Die Anästhesietiefe wurde bestätigt, wenn sich die Gliedmaßenmuskeln der Maus entspannten, die Schnurrhaare keine Berührungsreaktion zeigten und der Pedalreflex verloren ging.
    2. Nachdem die Mäuse betäubt wurden, bereiten Sie die peripheren Blutproben vor, indem Sie die Maus mit einer Hand fixieren und auf die Augenhaut drücken, um den Augapfel hervorzustehen. Führen Sie dann den Kapillarschlauch in den inneren Augenwinkel ein und dringen Sie in einem Winkel von 30-45 Grad in die Ebene des Nasenlochs ein. Üben Sie Druck aus, während Sie das Kapillarrohr vorsichtig drehen. Das Blut fließt durch Kapillarwirkung in den Schlauch.
    3. Geben Sie das Blut für 2 h in einen 4 °C warmen Kühlschrank und zentrifugieren Sie dann bei 1.000 × g für 10 min bei 4 °C, um die Probe zu erhalten. Zur weiteren Analyse ist die restliche Probe bei -80 °C zu lagern.
  2. Aufbereitung von Schilddrüsengewebeproben
    1. Humane Einschläferung des Tieres gemäß den institutionellen Richtlinien. Präparieren Sie dann die Brustwand, um das Herz freizulegen, schneiden Sie den rechten Vorhof auf und infundieren Sie Kochsalzlösung in den linken Ventrikel mit einer intravenösen Infusionsnadel, die an einer 20-ml-Spritze befestigt ist, bis das Gewebe weiß wird.
    2. Befestigen Sie die Maus mit Stecknadeln auf dem Seziertisch. Sterilisieren Sie den Hals mit 75%igem Ethanol. Schneiden Sie die Haut der Maus entlang der Mittellinie des Halses von der Oberseite des Brustbeins bis zum Unterkiefer mit einer Gewebeschere, um das Halsgewebe vollständig freizulegen.
    3. Beobachten Sie das Paar rosafarbener Drüsen, die Unterkieferdrüsen, unter denen sich der vordere Luftröhrenmuskel befindet. Trennen Sie die Drüsen und Muskeln mit einer Augenschere und einer Pinzette, um die Luftröhre und den Schilddrüsenknorpel freizulegen.
    4. Trennen Sie das Gewebe unter dem Knorpel und nehmen Sie Knorpel und Luftröhre mit einer gebogenen Pinzette zusammen auf. Schneiden Sie die distalen und proximalen Enden des Knorpels bzw. der Luftröhre ab und entfernen Sie die Schilddrüse zusammen mit der Luftröhre.
    5. Tauchen Sie die Drüsen für 12-24 Stunden in 4%iges Paraformaldehyd. Übertragen Sie dann das Gewebe auf 70% Ethanol.
    6. Legen Sie die einzelnen Lappen des Schilddrüsenbiopsiematerials in die Verarbeitungskassetten und dehydrieren Sie sie durch den folgenden seriellen Alkoholgradienten: 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, 100 %, Ethanol für jeweils 40 Minuten; 1/2 Xylol + 1/2 absolutes Ethanol für 2 h; 100% Xylol für 1,5 h; 100% Xylol für 1,5 h; 1/2 Xylol + 1/2 Paraffin für 2 h; Backofen bei 40 ° C für 40 min; Paraffin I für 30 min; und Paraffin II für 30 min. Betten Sie sie in Paraffinwachsblöcke ein.
    7. Vor der Färbung 5 μm dicke Schilddrüsengewebeschnitte in Xylol entwachsen (wie folgt) und durch folgende abnehmende Ethanolkonzentrationen rehydrieren: Xylol I für 10 min; Xylol II für 10 min; Xylol III für 10 min; absolutes Ethanol I für 5 min; absolutes Ethanol II für 5 min; 90% Alkohol für 5 Minuten; 80% Alkohol für 5 min; 70% Alkohol für 5 Minuten; und 50% Alkohol für 5 min.
    8. Färben Sie das Gewebe mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). 15 min mit Hämatoxylin färben, 15 min mit Leitungswasser abspülen, 10 s lang 1 % Salzsäure-Ethanol hinzufügen, unter fließendem Wasser abspülen und dann mit 50 %, 70 % und 80 % Ethanol jeweils 3 min lang abspülen. 2 Minuten lang eine 0,5%ige Eosin-Ethanol-Färbung durchführen und unter fließendem Wasser abspülen. Legen Sie die Paraffinabschnitte nacheinander für 2 min in 75%iges Ethanol, 2 min in 85%iges Ethanol, 5 min in absolutes Ethanol und 5 min in Xylol. Fixieren Sie die Scheiben mit neutralem Gummi und Glasobjektträgern.
    9. Um das Ausmaß der lymphozytären Thyreoiditis zu beurteilen, bewerten Sie die Schilddrüsenschnitte wie folgt: 0: geringe oder keine Lymphozyteninfiltration im Schilddrüsengewebe; 1+: mehr als 1/8 der Drüse ist in einen oder mehrere Herde infiltriert; 2+: nicht mehr als 1/4 der Drüse ist mit Lymphozyten infiltriert; 3+: 1/4-1/2 der Drüse ist mit Lymphozyten infiltriert; 4+: Mehr als 1/2 der Drüse wird zerstört.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, den Schilddrüsenknorpel zu entfernen, um die gesamte Struktur der Mausschilddrüse zu erhalten, die zu klein ist, um sie aus der Luftröhre zu entfernen.
  3. Messung von TPOAb
    HINWEIS: Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), die TPO der Maus stabil exprimieren, wurden in unserem Labor etabliert. Die TPO-cDNA der Maus wurde mittels XbaI und NheI exzidiert. Anschließend wurde die cDNA auf pcDNA5/FRT übertragen. Nachdem das Plasmid erfolgreich konstruiert wurde, wurde es in die CHO-Zellen transfiziert und mit Hygromycin B (100 g/ml) selektiert.
    1. Nach dem Aufbau der mTPO-CHO-Zellen werden die Mausseren aus Schritt 3.1.3 (1:50) verdünnt und mit den mTPO-CHO-Zellen 2 h inkubiert. Nach der Inkubation wird eine Zellfärbung mit Propidiumiodid (1 g/ml) ausgeschlossen und die Probe durchflusszytometrisch mit Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertem, affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-Maus-IgG analysiert. Screenen Sie überlebende Einzelzellpopulationen anhand von FSC-A- und SSC-A-Kanälen und wählen Sie FITC- und PI-markierte Zellen aus den Einzelzellpopulationenaus 21.
    2. Als Negativkontrolle ist das Serum von nicht immunisierten BALB/c- oder C57BL/6-Mäusen, die an IgG gebunden sind, einzubeziehen. Monoklonale Mausantikörper gegen humanes TPO22 als Positivkontrollen einschließen, die TPO23 der Maus erkennen. Drücken Sie TPO-Bindungsdaten als geometrische Mittel aus.
  4. Messung von TgAb
    HINWEIS: Verwenden Sie ein ELISA-Kit zum Nachweis von Thyreoglobulin, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
    1. Verdünnen Sie die Standardproben im Mikrozentrifugenröhrchen gemäß den Anweisungen. Nehmen Sie das Kit aus dem Kühlschrank und bewahren Sie es 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf.
    2. Legen Sie die Standard-Wells, Blank-Wells und Test-Wells fest. Leerbohrungen erhalten nur einen Puffer, während Standardbohrungen Standardlösungen erhalten. Geben Sie 10 μl Proben in die Testvertiefungen. Versuchen Sie beim Hinzufügen der Proben, die Wände der Vertiefungen nicht zu berühren, und schütteln Sie die Platte vorsichtig, um die Proben auf den Boden der Vertiefungen zu bewegen.
    3. Als Positivkontrolle sollten Serum von BALB/c-Mäusen verwendet werden, die mit Tg, CFA und IFA24 immunisiert wurden, sowie Serum von 8 Wochen altem NOD verwendet werden. H-2h4 Mäuse auf normalem Wasser als Negativkontrolle.
    4. Inkubieren Sie die Proben im 37 °C warmen Wasserbad für 30 min. Verdünnen Sie den Waschpuffer im Verhältnis 1:30 mit destilliertem Wasser. Entfernen Sie dann die Siegelfolie, schütteln Sie die Flüssigkeit in der Enzymplatte ab und tupfen Sie sie auf saugfähigem Papier trocken und fügen Sie 30 s lang 350 μl Waschpuffer hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal und tupfen Sie dann die Vertiefungen trocken.
    5. Geben Sie 50 μl Enzymmarkierungsreagenz in jede Vertiefung, mit Ausnahme der leeren Vertiefungen, und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang in einem 37 ° -Wasserbad. Entfernen Sie die Siegelfolie, schütteln Sie die Flüssigkeit in der Enzymplatte ab und tupfen Sie sie auf saugfähigem Papier trocken.
    6. Geben Sie 50 μl Entwickler A in jede Vertiefung, gefolgt von 50 μl Entwickler B, und schütteln Sie die Vertiefungen vorsichtig, um sie 5 Minuten lang zu mischen. Geben Sie 50 μl der Terminationslösung für 15 Minuten in jede Vertiefung, um die Reaktion zu stoppen. Messen Sie die Absorption (OD) jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Präsentieren Sie die TgAb-Daten als optische Dichte (OD) bei 490 nm.
  5. Messung von T4 und schilddrüsenstimulierendem Hormon (TSH)
    Anmerkungen: Messen Sie die T4- und TSH-Werte (in 10 μl Aliquoten) mit ELISA, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
    1. Verdünnen Sie das Enzymkonjugat im Verhältnis 1:11 mit dem Assay-Verdünnungsmittel. Verdünnen Sie die zu messenden Proben (1:100) mit 0,01 M PBS.
    2. Geben Sie 10 μl des Standards und der Probe in die entsprechenden Vertiefungen, geben Sie 100 μl Enzymkonjugat in jede Vertiefung und inkubieren Sie sie 1 h lang bei Raumtemperatur.
    3. Entsorgen Sie die Flüssigkeit in den Vertiefungen und reinigen Sie sie dreimal mit Waschpuffer.
    4. 100 μl 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) zugeben und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    5. Fügen Sie 50 μl Stopplösung hinzu und mischen Sie vorsichtig für 15-20 s.
    6. Bestimmen Sie die Absorption (OD) mit einem Mikroplatten-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm und berechnen Sie die Probenkonzentration.
    7. Verwenden Sie statistische Software, um einen t-Test oder Rangsummentest durchzuführen, und stellen Sie die Ergebnisse dar.

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Representative Results

Die histologischen Veränderungen unterschieden sich auffallend bei Frauen und Männern, in der Dauer der Jodaufnahme und in der Lösung von NaI. Wie in Abbildung 1 dargestellt, ~10 % von NOD. H-2h4-Mäuse entwickelten SAT auch ohne Jodinduktion im Alter von 24 Wochen, und alle Mäuse entwickelten schließlich eine Thyreoiditis. Bei regelmäßiger Wässerung gab es keinen signifikanten Unterschied in den histologischen Veränderungen zwischen Männchen und Weibchen. Die Zugabe von NaI zum Trinkwasser beschleunigte die Entwicklung einer Schilddrüsenentzündung. In den Lösungen von 0,005 %, 0,05 % und 0,5 % erreichte SAT in den Wochen 16, 8 bzw. 8 nach Verabreichung des NaI-Wassers den maximalen Schweregrad. Sobald eine Thyreoiditis induziert war, setzte sich die Infiltration der Lymphozyten während des gesamten Lebens der Maus fort. Während der Induktion schienen weibliche Mäuse tendenziell eine schwerere Thyreoiditis zu entwickeln als männliche Mäuse unter der gleichen Bedingung, aber es gab keine signifikanten Unterschiede in der Schwere der lymphozytären Infiltration, die durch die Anzahl der Proben begrenzt sein könnte.

Bei regelmäßiger Gabe von Wasser ohne zusätzliches Jod stieg der TgAb-Spiegel im Alter von 16 Wochen nicht signifikant an, und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen Männern und Frauen festgestellt. TgAb-Werte in NOD. H-2h4-Mäuse begannen nach 24 Wochen zu steigen, ohne dass sich die Geschlechter unterschieden, und die TgAb-Spiegel stiegen bis zur 72. Woche weiter an (Abbildung 2A). Mit der Zugabe von NaI zum Trinkwasser begannen die TgAb-Spiegel in den Wochen 16, 8 und 8 mit Lösungen von 0,005 %, 0,05 % bzw. 0,5 % NaI zu steigen. Die TgAb-Spiegel zeigten jedoch in keiner der Lösungen einen Unterschied zwischen Männern und Frauen (Abbildung 2B-D). Unabhängig davon, ob NaI-Wasser verabreicht wurde, erreichten die TgAb-Spiegel ihren höchsten Wert im Alter von 72 Wochen (oder 64 Wochen nach der ersten Verabreichung von NaI-Wasser).

Es gab eine längere Verzögerung bei der Nachweisbarkeit von TPOAb-Konzentrationen im Vergleich zu TgAb. Diese Antikörper wurden bei NOD nur selten nachgewiesen. H-2h4 Mäuse mit normalem Wasser im Alter von 24 Wochen. Bei normaler Fütterung mit Wasser wiesen Weibchen nach 72 Wochen deutlich höhere TPOAb-Werte auf als Männchen (Abbildung 2E). Der gleiche Trend der intersexuellen Differenz zeichnete sich auch in NOD ab. H-2h4-Mäuse während der Dauer von 16, 8 und 8 Wochen, wenn ihnen NaI-Wasser von 0,005 %, 0,05 % bzw. 0,5 % verabreicht wurde (Abbildung 2F-H) Bemerkenswert ist jedoch, dass die TPOAb-Konzentrationen 64 Wochen nach der ersten Verabreichung von NaI-Wasser ihren höchsten Wert erreichten, wenn die NaI-Konzentration während der Induktion über 0,05 % lag, und es gab keinen Unterschied zwischen Männchen und Weibchen (Abbildung 2G, H).

Darüber hinaus ist der TSH-Serumspiegel beim männlichen NOD zu beobachten. H-2h4-Mäuse waren signifikant höher als die von Weibchen in verschiedenen Fütterungsstadien, unabhängig davon, ob NAI Wasser verabreicht wurde oder nicht. Bei regelmäßiger Verabreichung von Wasser steigt der TSH-Gehalt von NOD. H-2h4-Mäuse begannen im Alter von 24 Wochen zu wachsen, und eine ähnliche Tendenz wurde in den Jod-Diätgruppen mit den Konzentrationen von 0,005 %, 0,05 % bzw. 0,5 % nach 16, 8 bzw. 8 Wochen nach separater Jodgabe beobachtet. Der TSH-Spiegel stieg während der gesamten Einführungsphase weiter an und erreichte nach 64 Wochen einen Höchststand. Darüber hinaus gab es einen signifikanten Unterschied in den TSH-Werten zwischen Männern und Frauen im Rest der NOD. H-2h4-Mäuse (Abbildung 3A-D). NICKEN. H-2h4-Mäuse hatten nach der Jodaufnahme keinen Kropf oder eine Schilddrüsenunterfunktion. Unabhängig davon, ob Jodwirkstoffe verabreicht wurden, gab es keinen geschlechtsspezifischen Unterschied in den T4-Spiegeln bei NOD. H-2h4 Mäuse. Mit zunehmender Dauer der Induktion nahmen die T4-Spiegel jedoch bei beiden Geschlechtern in den Jodwassergruppen tendenziell ab (kein signifikanter Unterschied) (Abbildung 3E-H).

Sexualdimorphismus im pathologischen Prozess und TPOAb-Spiegel wurden bei den Nachkommen von NOD gefunden. H-2h4-Mäuse, aber nicht TgAb. Ähnlich wie in anderen Studien25,26 waren die TPOAb-Spiegel bei Modellmäusen signifikant erhöht, nachdem sie 2-4 Monate lang Jodid über die Nahrung erhalten hatten, und es gab einen geschlechtsspezifischen Unterschied. Darüber hinaus waren die TSH-Werte bei männlichen NOD höher als bei weiblichen. H-2H4-Mäuse mit oder ohne Jodid-Supplementierung, die anderen Mausstämmen ähnelt. Dieser Unterschied blieb während des gesamten Lebens der Tiere bestehen, die möglicherweise nicht durch die Konzentrationen von TPOAb oder TgAb beeinflusst wurden.Bei einer Exposition bei 0,05 % NaI entwickelten die meisten Mäuse innerhalb von 8 Wochen eine Thyreoiditis, die mit 0,5 % NaI einen ähnlichen Effekt hatte. Während 0,005 % NaI einen ähnlichen Effekt auf NOD hatten. Bei H-2h4-Mäusen, die mit normalem Wasser gefüttert wurden, könnte die Konzentration von 0,05 % NaI (nach 8 Wochen Induktion) die bevorzugte Bedingung sein, um eine Autoimmunthyreoiditis zu induzieren. T4-Stufen in NOD. H-2h4-Mäuse wiesen keine geschlechtsspezifischen Unterschiede auf und wurden nicht durch Jodwirkstoffe beeinflusst, was mit anderen Studien übereinstimmt27,28. Dies könnte auf die relativ kurze Erkrankungszeit und die kompensatorische Schilddrüsenfunktion der Mäuse zurückzuführen sein, was bei den Mäusen zu einem Phänomen führt, das der subklinischen Hypothyreose ähnelt. Wir spekulieren, dass die TSH-Achse der Mäuse irgendwann dekompensiert wird und im Laufe der Zeit Unterschiede hervorruft.

Figure 1
Abbildung 1: Pathologische Veränderungen und Lymphozyteninfiltration der Schilddrüsen bei NOD. H-2h4 Mäuse mit/ohne Joddiät. (A,C,E,G) Pathologische Veränderungen der Schilddrüse unter Joddiät von 0 %, 0,005 %, 0,05 % und 0,5 % durch HE-Färbung; 200-fache Vergrößerung, N = 10/Gruppe. (B,D,F,G) Die Schilddrüsenentzündung wurde anhand des Lymphozyteninfiltrationsgebiets bestimmt; Einstufung des Grades der Lymphozyteninfiltration: 0: fast keine Lymphozyteninfiltration; 1+: mehr als ein Achtel der Drüse ist befallen; 2+: ein Viertel der Drüse ist befallen; 3+: ein Viertel bis die Hälfte der Drüse wird befallen; 4+: Mehr als die Hälfte der Drüse ist zerstört. N = 10/Gruppe. Signifikante Unterschiede: *p < 0,05; **p < 0,01. Abkürzungen: F = weiblich; M = männlich; NW = N Wochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Autoantikörper in NOD. H-2h4-Mäuse auf normalem und jodidhaltigem Wasser. (A-D) Autoantikörper gegen Tg in NOD. H-2h4-Mäuse mit normalem Wasser (im Alter von 8, 16, 24 und 72 Wochen getrennt) und Jodidwasser - 0,005 %, 0,05 % und 0,5 % (0, 8, 16 und 64 Wochen nach Beginn des Jodwassers). (E-H) Autoantikörper gegen TPO in NOD. H-2h4-Mäuse mit normalem Wasser (im Alter von 8, 16, 24 und 72 Wochen getrennt) und Jodidwasser - 0,005 %, 0,05 % und 0,5 % (0, 8, 16 und 64 Wochen nach Beginn des Jodwassers). Die Werte für TgAb werden als ELISA, optische Dichte (OD) 490 nm (Mittelwert ± Standardfehler des mittleren REM) und Werte für TPOAb als geometrisches Mittel in der Durchflusszytometrie angegeben. N = 8/Gruppe. Signifikante Unterschiede: *p < 0,05; **p < 0,01; p < 0,001. Abkürzungen: Tg = Thyreoglobulin; TgAb = Autoantikörper gegen Tg; TPO = Schilddrüsenperoxidase; TPOAb = Autoantikörper gegen TPO; F = weiblich; M = männlich; NW = N Wochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: TSH- und T4-Werte in NOD. H-2h4-Mäuse auf normalem und jodidhaltigem Wasser. (A-D) TSH- und (E-H) T4-Spiegel bei normalem Wasser (im Alter von 8, 16, 24 und 72 Wochen getrennt) und Jodidwasser - 0,005 %, 0,05 % und 0,5 % (0, 8, 16 und 64 Wochen nach Beginn des Jodwassers). Die TSH-Werte wurden mittels Radioimmunoassay (mU/L, Mittelwert ± Standardfehler des mittleren REM) gemessen. N = 8/Gruppe. Signifikante Unterschiede: *p < 0,05; **p < 0,01; S. < 0,001; *p < 0,0001. Abkürzungen: TSH = schilddrüsenstimulierendes Hormon; F = weiblich; M = männlich; NW = N Wochen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

HT tritt aufgrund einer Störung des Autoimmunsystems auf, die durch Lymphozyten verursacht wird, die in die Schilddrüse eindringen, die Schilddrüsenfunktion weiter beeinträchtigen und gleichzeitig schilddrüsenspezifische Antikörper produzieren. Die Serum-TSH-, TgAb- und TPOAb-Spiegel bei HT-Patienten sind signifikant erhöht27. Gegenwärtig werden zwei Haupttypen von Mausmodellen verwendet, um die Ätiologie der Autoimmunthyreoiditis zu untersuchen: EAT und SAT29. EAT-Mäuse werden meist mit Proteinen und Adjuvantien immunisiert, um in vivo eine abnormale Immunumgebung zu schaffen. Dieser Ansatz wird seit vielen Jahren verwendet und ist nach wie vor wirksam30,31. Darüber hinaus umfassen neue Ansätze zur Induktion einer Thyreoiditis die Injektion von dendrischen Zellen (DCs), die mit Tg32 gepulst werden, die Expression von Tg oder TPO in vivo durch adenovirale Vektoren oder Plasmide31, die Transplantation der Schilddrüse allogener Mäuse und die Injektion von LPS. Die erfolgreiche Konstruktion des Thyreoiditis-Modells wird jedoch in der Regel durch den genetischen Hintergrund des experimentellen Mausmodells, syngene Antigene und zellbiologische Technologien eingeschränkt. Darüber hinaus können spezifische Adjuvantien ein komplexeres Immunmilieu induzieren, was es schwierig macht, den immunologischen Prozess der Autoimmunthyreoiditis zu untersuchen. Daher glauben wir, dass der SAT von NOD. H-2h4-Mäuse können die Pathogenese der Hashimoto-Thyreoiditis im Vergleich zum EAT-Modell besser veranschaulichen. Insbesondere ist eine Immunisierung mit potenten Adjuvantien und Thyreoglobulin bei SAT33 nicht erforderlich. Um den Fortschritt von SAT zu beschleunigen, wird dem Trinkwasser von NOD Jod zugesetzt. H-2h4 Mäuse. Obwohl die daraus resultierende Thyreoiditis nicht den gleichen Mechanismus aufweist wie die Thyreoiditis beim Menschen, ist Jod tatsächlich ein wichtiger Einflussfaktor der Thyreoiditis. Darüber hinaus können Jodwirkstoffe in diesem Modell bei NOD schnell eine Thyreoiditis induzieren. H-2h4-Mäuse und NOD. H-2H4-Mäuse, die kein Jod erhalten, können schließlich auch eine Thyreoiditis entwickeln. Da das experimentelle Protokoll in den meisten Labors unterschiedlich ist, haben wir eine umfassendere Bewertung des NOD durchgeführt. H-2h4-Mäuse während der Induktion einer Thyreoiditis.

Im Prozess des Modellbaus müssen einige Punkte sorgfältig beachtet werden. Durch regelmäßiges Nachfüllen von Trinkwasser und die Beurteilung des Allgemeinzustands der Mäuse wird ein versehentlicher Mäusetod vermieden. Es wird empfohlen, während der Induktion nicht mehr als fünf Mäuse pro Käfig zu halten, um jeder Maus genügend NaI-Futter zu bieten. Die Anzahl der Mäuse kann sich jedoch auch gemäß den Regeln und Vorschriften der jeweiligen Einrichtung für Tiere ändern. Da in unserem Labor ein Sexualdimorphismus festgestellt wird, werden für das Experiment eingeschlechtliche Mäuse vorgeschlagen (für Experimente mit besonderen Anforderungen an den Nachweis schilddrüsenspezifischer Antikörper werden weibliche Mäuse empfohlen). Es wird empfohlen, 8 Wochen alte Mäuse auszuwählen, da 10% der Mäuse bis zum Alter von 16 Wochen eine spontane Thyreoiditis entwickeln und alle Mäuse schließlich ohne NaI-Wasser eine Thyreoiditis entwickeln. Die Schilddrüsenläsionen bleiben während der gesamten Lebenszeit der Mäuse bestehen und die nächste Generation entwickelt bei der Geburt eine Schilddrüsenentzündung. Daher wird für die Konservierung von Mäusen empfohlen, 8 Wochen alte Mäuse zu verwenden. Es ist wichtig zu beachten, dass TPOAb bei Verwendung von NOD besser als Erkennungsindikator als TgAb geeignet ist. H-2h4-Mäuse zur Nachahmung einer Schilddrüsenentzündung. Bei der Messung des TPOAb-Spiegels muss die Dauer der Induktion jedoch länger verzögert werden als bei TgAb.

Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit die Etablierung eines SAT-Modells mit NOD. H-2h4-Mäuse und die Erforschung des Einflusses verschiedener Faktoren auf dieses Modell. Obwohl es die Pathogenese und den Mechanismus der Autoimmunerkrankung der Schilddrüse nicht perfekt simuliert, ist die NOD. Die H-2h4-Maus ist ein stabiles Tiermodell mit großem Potenzial auf dem Gebiet der autoimmunen Schilddrüsenerkrankungen. Da es sich um ein einfach zu konstruierendes Tiermodell handelt, das sehr gut reproduzierbar ist, hofft man, dass diese Methode dazu beitragen wird, die Anwendung von SAT-Mausmodellen in verschiedenen Forschungseinrichtungen zu verbessern.

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Disclosures

Alle Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Acknowledgments

Monoklonale Antikörper der Maus gegen humanes TPO (als Positivkontrollen) wurden von Dr. P. Carayon und Dr. J. Ruf (Marseille, Frankreich) zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken allen Teilnehmern dieser Studie und den Mitgliedern unseres Forschungsteams. Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des Postdoctoral Sustentation Fund des West China Hospital, Sichuan University, China (2020HXBH057) und des Sichuan Province Science and Technology Support Program (Projektnummer 2021YFS0166) unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Butorphanol tartrate Supelco L-044 
Dexmedetomidine hydrochloride  Sigma-Aldrich 145108-58-3
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) well Sigma-Aldrich M9410-1CS
Ethanol macklin 64-17-5 
Freund’s Adjuvant, Complete  Sigma-Aldrich F5881 
Freund’s Adjuvant, Incomplete  Sigma-Aldrich F5506
Goat anti-Mouse IgG  invitrogen SA5-10275 
Midazolam solution  Supelco M-908 
Mouse/rat thyroxine (T4) ELISA Calbiotech DKO045
Paraformaldehyde macklin 30525-89-4 
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
Sodium Iodine Sigma-Aldrich  7681-82-5
Thyroglobulin Sigma-Aldrich  T1126
Thyroglobulin  ELISA Kit Thermo Scientific EHTGX5
TSH ELISA Calbiotech DKO200
Xylene macklin 1330-20-7

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Tags

Widerruf Heft 193

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model
Posted by JoVE Editors on 06/05/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. The Protocol section was updated.

Step 3.1.1 of the Protocol was updated from:

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).

to

After the induction, anesthetize the mice with a volume of 0.01 mL/g anesthetic by intraperitoneal injection. Prepare the anesthetic by mixing midazolam (40 µg/100 µL for sedation), medetomidine (7.5 µg/100 µL for sedation), and butorphanol tartrate (50 µg/100 µL for analgesia) in phosphate-buffered saline (PBS).
NOTE: The specific concentrations of each component in the anesthesia mixture are: midazolam 13.33µg/100µL, medetomidine 2.5µg/100µL, and butorphanol 16.7µg/100µL. For specific dosages used in mice, the doses are: midazolam 4µg/g, medetomidine 0.75µg/g, and butorphanol 1.67µg/g. Anesthesia depth was confirmed when the mouse's limb muscles relaxed, the whiskers had no touch response, and there was loss of  pedal reflex.

Step 3.1.2 of the Protocol was updated from:

After the mice are anesthetized, cut off their whiskers with ophthalmic scissors to prevent blood from flowing down the whiskers and causing hemolysis. Fix the mouse with one hand and press the skin of the eye to make the eyeball protrude. Quickly remove the eyeball and draw 1 mL of blood into the microcentrifuge tube via a capillary tube.

to

After the mice are anesthetized, prepare the peripheral blood samples, by fixing the mouse with one hand and pressing the eye skin to protrude the eyeball. Then, insert the capillary tube into the inner corner of the eye and penetrate at a 30-45 degree angle to the plane of the nostril. Apply pressure while gently rotating the capillary tube. Blood will flow into the tube via capillary action.

Step 3.2.1 of the Protocol was updated from:

Dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

to

Humanely euthanize the animal according to the institutional policies. Then, dissect the chest wall to expose the heart, cut open the right atrium, and infuse saline into the left ventricle by an intravenous infusion needle attached to a 20 mL syringe until the tissue turns white.

Generierung eines Mausmodells für spontane Autoimmunthyreoiditis
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Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y.,… More

Qian, Y., He, L., Su, A., Hu, Y., Zhu, J. Generation of a Mouse Spontaneous Autoimmune Thyroiditis Model. J. Vis. Exp. (193), e64609, doi:10.3791/64609 (2023).

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