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Cancer Research

ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी के माध्यम से मुराइन कोरॉयड में मेलेनोमा का आरोपण और मूल्यांकन

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64632
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2, *1, *1,2
1Ophthalmology Research Laboratory, Kaplan Medical Center, 2Department of Ophthalmology, Kaplan Medical Center, Faculty of Medicine, The Hebrew University of Jerusalem
* These authors contributed equally

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी का उपयोग करके मुराइन कोरॉयड में मेलेनोमा के आरोपण और मूल्यांकन का वर्णन करता है।

Abstract

प्रयोगात्मक कोरॉयडल मेलेनोमा मॉडल स्थापित करना सही स्थानीयकरण पर ट्यूमर को प्रेरित करने की क्षमता के संदर्भ में चुनौतीपूर्ण है। इसके अलावा, विवो में पश्चवर्ती कोरॉइडल मेलेनोमा को देखने में कठिनाइयां वास्तविक समय में ट्यूमर स्थान और विकास मूल्यांकन को सीमित करती हैं। यहां वर्णित दृष्टिकोण एक बहु-चरण उप-कोरॉयडल बी 16एलएस 9 सेल इंजेक्शन प्रक्रिया के माध्यम से चूहों में कोरॉयडल मेलेनोमा स्थापित करने के लिए तकनीकों का अनुकूलन करता है। माउस यूवा के छोटे आयामों में इंजेक्शन लगाने में सटीकता को सक्षम करने के लिए, पूरी प्रक्रिया एक माइक्रोस्कोप के तहत की जाती है। सबसे पहले, आंख के पृष्ठीय-अस्थायी क्षेत्र में एक नेत्रश्लेष्मला पेरिटॉमी का गठन होता है। फिर, उजागर श्वेतपटल के माध्यम से एक सुई डालकर उप-कोरॉयडल स्थान में एक पथ बनाया जाता है। इसके बाद पथ में एक कुंद सुई का सम्मिलन और कोरॉइड में मेलेनोमा कोशिकाओं का इंजेक्शन होता है। इंजेक्शन के तुरंत बाद, ट्यूमर स्थान और प्रगति निर्धारित करने के लिए नॉनइनवेसिव ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) इमेजिंग का उपयोग किया जाता है। रेटिना डिटेचमेंट का मूल्यांकन ट्यूमर साइट और आकार के भविष्यवक्ता के रूप में किया जाता है। प्रस्तुत विधि चूहों में कोरॉयड-स्थानीयकृत मेलेनोमा के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रेरण और ट्यूमर विकास मूल्यांकन की लाइव इमेजिंग को सक्षम बनाती है। जैसे, यह इंट्राओकुलर ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

यूवियल मेलेनोमा (यूएम) वयस्कों में सबसे लगातार इंट्राओकुलर प्राथमिक दुर्दमता है। लगभग 90% ओकुलर मेलेनोमा यूवियल ट्रैक्ट1 के कोरॉयड क्षेत्र में मेलानोसाइट्स से उत्पन्न होते हैं। यूएम रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है, क्योंकि यह अनुमान लगाया गया है कि लगभग 50% रोगी मेटास्टैटिक बीमारी विकसित करते हैं, यकृत मेटास्टेसिस2 की प्रमुख साइट है। प्राथमिक घावों का प्रारंभिक उपचार मेटास्टेस की संभावना को कम कर सकता है, फिर भी कोई प्रभावी उपचार मेटास्टेसगठन को रोकता नहीं है।

यूवियल मेलेनोमा के मानक उपचार में विकिरण चिकित्सा शामिल है, जो ऑप्टिक न्यूरोपैथी, रेटिनोपैथी, सूखी आंख सिंड्रोम और मोतियाबिंद के कारण दृष्टि के नुकसान से जुड़ी है। सर्जिकल रिसेक्शन में आमतौर पर देरी होती है जब तक कि घाव के विकास को पहचाना और विशेषता नहीं दी जाती है। हालांकि, इस तरह की देरी मेटास्टैटिक रोग के विकास की अनुमति दे सकतीहै। कुछ मामलों में, व्यर्थ न्यूक्लियेशन की आवश्यकता होती है। बेशक, यह कट्टरपंथी प्रक्रिया दृष्टि से समझौता करती है और इसके परिणामस्वरूप नाटकीय सौंदर्य गिरावट होती है।

यूवियल मेलेनोमा का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक मॉडल विकसित करने के लिए समर्पित कई प्रयास किए गए हैं। प्रीक्लिनिकल पशु मॉडल जो इस घातकता के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देते हैं, यूवियल मेलेनोमा के लिए नवीन नैदानिक और चिकित्सीय रणनीतियों की जांच के लिए महत्वपूर्ण हैं। ओकुलर मेलेनोमा के प्रयोगात्मक पशु मॉडल मुख्य रूप से चूहों, चूहों और खरगोशों में ट्यूमर कोशिकाओं के टीकाकरण पर आधारित हैं। माउस मॉडल लागत प्रभावी हैं और उनकी तेजी से प्रजनन दर और मनुष्यों के लिए उच्च जीनोम समानता के कारण मेलेनोमा अध्ययन के लिए व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। म्यूरिन त्वचीय मेलेनोमा सेल लाइन बी 16 का उपयोग आमतौर पर सी 57बीएल 6 चूहों को टीका लगाने और सिंजेनिक ट्यूमर को प्रेरित करने के लिए किया जाता है। यूवियल मेलेनोमा को प्रेरित करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करते समय, ट्यूमर-असर वाली आंखों को आमतौर पर टीकाकरण के 7-14 दिन बाद एन्यूक्लिएट करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, बी 16 एक अत्यधिक आक्रामक मॉडल है। आंख की प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार प्राप्त प्रकृति मेटास्टेसिस का समर्थन करती है, और मेटास्टेस आमतौर पर ट्यूमर सेल टीकाकरण के 3-4 सप्ताह बाद पता लगाया जा सकता है। मूल बी 16 लाइन के उपसंस्कृति अलग-अलग मेटास्टैटिकगुण प्रदर्शित करते हैं। उदाहरण के लिए, क्वींस मेलेनोमा लाइन में उच्च मेटास्टैटिक दर 7,8 है। बी 16एलएस 9 सेल लाइन में डेंड्राइटिक सेल आकृति विज्ञान है और इसे सी 57बीएल /6 चूहों के यकृत मेटास्टेस से प्राप्त किया गया था जिसे पैतृक त्वचीय मेलेनोमा लाइन बी 16 एफ 19 के साथ इंजेक्ट किया गया था। जब आंख के पीछे के डिब्बे में इंजेक्शन दिया जाता है, तो इन कोशिकाओं को इंट्राओकुलर ट्यूमर बनाने के लिए दिखाया गया था, जो हिस्टोलॉजिकल रूप से मानव यूवियल मेलेनोमा से मिलते जुलते हैं और सी 57बीएल / 6 में यकृत-विशिष्ट मेटास्टेस बनाते हैं, लेकिन बाल्ब / सी, चूहों10,11,12 नहीं। आनुवंशिक रूप से, कोशिकाओं को सी-मेट प्रोटो-ऑन्कोजीन की उच्च अभिव्यक्ति की विशेषता है, जो हेपेटोसाइट विकास कारक13 के लिए सेलुलर रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है। इसके विपरीत, बी 16 एफ 10, माता-पिता के बी 16 का 10वां मार्ग, मुख्य रूप से फेफड़ों में मेटास्टेसाइज करता है जब इंट्राओकुलर रूप से14 को टीका लगाया जाता है। B16F10 और B16LS9 दोनों पिगमेंटेड12 हैं।

कई प्रमुख चुनौतियां म्यूरिन यूवियल मेलेनोमा मॉडल की सफलता को सीमित करती हैं। सबसे पहले, ट्यूमर सेल रिफ्लक्स से एक्स्ट्राओकुलर या सबकंजंक्टिवल मेलेनोमा हो सकता है। दूसरा, मेलेनोमा कोशिकाओं के इंट्राओकुलर टीकाकरण के बाद ट्यूमर की वृद्धि अक्सर अत्यधिक परिवर्तनशील होती है, जिससे उपचार और प्रगति का मूल्यांकन करने में कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है। एक और बड़ी कठिनाई विवो में ट्यूमर के विकास का पालन करने की सीमित क्षमता है। जबकि बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग, जैसे कि ल्यूसिफेरस ट्यूमर व्यक्त करना, आमतौर पर ओकुलर ट्यूमर के विकास15,16 की निगरानी के लिए उपयोग किया जाता है, यह ट्यूमर के इंट्राओकुलर स्थान पर जानकारी प्रदान नहीं कर सकता है। इसलिए, ट्यूमर का मूल्यांकन आमतौर पर आंख10,17 के न्यूक्लियेशन के बाद किया जाता है। यह ट्यूमर की प्रगति और उपचार के लिए प्रतिक्रिया को बड़े पैमाने पर चिह्नित करने की क्षमता को बहुत सीमित करता है। यूवियल मेलेनोमा का अध्ययन करने में एक और बड़ी बाधा रंजित चूहों में घावों की निगरानी में कठिनाई है। नए दृष्टिकोण, जो इन कठिनाइयों को दूर करते हैं, पशु मॉडल में यूवियल मेलेनोमा के शोध को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक हैं।

ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (ओसीटी) उच्च रिज़ॉल्यूशन में आंख के विभिन्न वर्गों में गहराई से छवि बनाने के लिए विशिष्ट क्षमताएं प्रदान करता है, जो अल्ट्रासाउंड18,19 सहित अन्य पद्धतियों से अद्वितीय है। ओसीटी इमेजिंग का उपयोग पशु मॉडल में विभिन्न ओकुलर रोगों का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। हाल ही में, ओसीटी इमेजिंग को इंट्राओकुलर ट्यूमरके विकास का मूल्यांकन करने के लिए गैर-आक्रामक साधनों के रूप में प्रदर्शित किया गया था। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मुराइन कोरॉयड में मेलेनोमा कोशिकाओं के आरोपण और सेल टीकाकरण के समय इंट्राओकुलर ट्यूमर स्थानीयकरण और आकार की भविष्यवाणी करने के लिए ओसीटी के उपयोग को दर्शाता है।

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Protocol

प्रोटोकॉल में प्रयोगों को पशु प्रयोग पर इजरायल ी राष्ट्रीय परिषद द्वारा अनुमोदित किया गया था और नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों का उपयोग करने के लिए एआरवीओ वक्तव्य का अनुपालन किया गया था। 8-10 सप्ताह की आयु के मादा सी 57बीएल / 6 चूहों का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए किया गया था और उन्हें 12/12 घंटे के प्रकाश-अंधेरे चक्रों के संपर्क में लाया गया था। जानवरों को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. सेल संस्कृति

  1. आरपीएमआई 1640 माध्यम में कल्चर बी 16एलएस 9 कोशिकाएं, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट, 25 एमएम एचईपीईएस, 1% आवश्यक विटामिन मिश्रण, 200 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 200 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक, 5% सीओ2 के साथ एक ह्यूमिडिफाइड 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में।
  2. 70% -80% संगम पर इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं की कटाई करें।

2. पशु तैयारी

  1. केटामाइन (75 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन) और मेडेटोमिडीन (0.5 मिलीग्राम / किग्रा शरीर के वजन) का एक एनेस्थेटिक मिश्रण तैयार करें। एक ही इंजेक्शन में एनेस्थेटिक मिश्रण इंट्रापरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करके चूहों को एनेस्थेटाइज करें।
  2. दोनों आंखों पर सामयिक नेत्र एनेस्थेटिक ऑक्सीबुप्रोकेन (0.4%) लागू करें।
  3. ट्रॉपिकामाइड (0.5%) को शीर्ष रूप से लागू करके माउस की पुतलियों को पतला करें।

3. उप-कोरॉइडल स्पेस में एक नेत्रश्लेष्मला पेरिटोमी और स्क्लेरल ट्रैक्ट बनाना।

  1. सूखने से बचने के लिए दोनों आंखों पर स्नेहक के रूप में 1.4% हाइड्रॉक्सीइथाइलसेल्यूलोज ( सामग्री की तालिका देखें) लागू करें। दाहिनी आंख पर 0.5% ट्रॉपिकामाइड लागू करें।
  2. एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के तहत माउस की संचालित आंख का निरीक्षण करें ( सामग्री की तालिका देखें)। बाँझ इंट्राओकुलर बल के साथ पलकें खुली रखें।
  3. इंट्राओकुलर बल का उपयोग करके, सुपर-टेम्पोरल लिम्बल कंजंक्टिवा को पकड़ें और एक इन्फ्रा-नाक स्थितिकी ओर खींचें। पूरी प्रक्रिया के दौरान इसे पकड़कर इस स्थिति को सुरक्षित करें (चित्रा 1 ए)।
  4. 30 ग्राम सुई टिप का उपयोग करके, पृष्ठीय-अस्थायी क्षेत्र में एक छोटा (1-2 मिमी) नेत्रश्लेष्मला पेरिटोमी बनाएं, जो लिम्बस के लगभग 1-2 मिमी पीछे है।
    नोट: महीन सुइयों का उपयोग अत्यधिक पंचर को रोक सकता है और ट्यूमर के स्थान की बेहतर परिशुद्धता की अनुमति दे सकता है।
  5. पेरिटॉमी के उद्घाटन से अतिरिक्त टेनन कैप्सूल को हटा दें।
    नोट: टेनन कैप्सूल घने संयोजी ऊतक की एक परत है जो आंख22 के ग्लोब को घेरता है।
  6. इस स्थान पर, श्वेतपटल के माध्यम से प्रवेश करने के लिए सुई की नोक डालें। उप-कोरॉइडल स्पेस में एक पथ बनाने के लिए एक छांटना करें जब तक कि कोरॉइड का भूरा रंग श्वेतपटल के उजागर सफेद पदार्थ के माध्यम से दिखाई न दे (चित्रा 1 बी)।

Figure 1
चित्र 1: ट्यूमर सेल टीकाकरण । (ए) सुपर-टेम्पोरल लिम्बल कंजंक्टिवा को इंट्राओकुलर फोर्स का उपयोग करके आयोजित किया जाता है और एक इन्फ्रा-नाक स्थिति की ओर खींचा जाता है। (बी) 30 ग्राम सुई की नोक को श्वेतपटल के माध्यम से प्रवेश करने के लिए डाला जाता है, और उप-कोरॉइडल स्पेस में एक ट्रैक बनाने के लिए छांटा जाता है। (सी) कोशिकाओं से भरी एक सिरिंज और 32 ग्राम सुई के साथ ट्रैक में डाला जाता है, और कोशिकाओं को इंजेक्ट किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. मेलेनोमा कोशिकाओं का टीकाकरण

  1. पीबीएस के 2 μL में 70,000 B16LS9 कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें। यह राशि प्रति आंख अनुमानित है।
  2. कोशिकाओं को एक बाँझ 10 μL ग्लास हैमिल्टन सिरिंज ( सामग्री की तालिका देखें) में लोड करें जो 45 ° कोण पर मुड़ी हुई 32 ग्राम कुंद सुई के साथ लगाया गया है।
  3. चरण 3 में बनाए गए ट्रैक में लगभग 2 मिमी भरी हुई सिरिंज सुई डालें।
  4. सेल निलंबन के 2 μL इंजेक्ट करें।
  5. इंजेक्शन के बाद सुई को 2-3 सेकंड के लिए रखें जब तक कि सभी तरल पदार्थ साफ न हो जाएं।
  6. ट्रैक से रिसाव से बचने के लिए सुई को धीरे से और धीरे-धीरे खींचकर निकालें (चित्रा 1 सी)।
    नोट: इंजेक्शन की गति और बल को समायोजित करना ट्यूमर के विकास के पैटर्न को प्रभावित कर सकता है। यह सुझाव दिया जाता है कि इन मापदंडों को सही बल और लागू गति की पहचान करने के लिए प्रयोग करने वाले व्यक्तियों द्वारा कैलिब्रेट किया जाए। प्रारंभिक प्रयोगों में कुल 70,000 कोशिकाओं का निर्धारण किया गया था। हालांकि, चूंकि सेल कल्चर प्रकारों या बैचों या माउस उपभेदों के बीच भिन्नताएं हो सकती हैं, इसलिए इस संख्या का अंशांकन आवश्यक है।

5. इंजेक्शन के स्थान का आकलन करना

  1. मेलेनोमा सेल टीकाकरण के तुरंत बाद ओसीटी स्कैन द्वारा इंजेक्शन वाली आंख का निरीक्षण करें ताकि रेटिना डिटेचमेंट (आरडी), रेटिना क्षति और / या कोशिकाओं की उपस्थिति की पहचान कीजा सके।
    नोट: आवश्यकतानुसार ट्रॉपिकामाइड, ऑक्सीबुप्रोकेन और एथिलसेल्यूलोज को फिर से लागू करें।
  2. चरण 5.1 से ओसीटी स्कैन के आधार पर, आरडी पैटर्न21 को वर्गीकृत करें: (1) आरडी की स्थानीय आरडी-वन साइट; (2) विट्रस में विट्रस-प्रेक्षण सेल सामग्री में रिसाव; (3) आरडी की विस्तारित आरडी-मल्टीपल साइटें।
  3. ट्यूमर स्थानीयकरण की भविष्यवाणी करें: (1) स्थानीय आरडी-अपेक्षित कोरॉयडल ट्यूमर; (2) विट्रस में विट्रस-अपेक्षित ट्यूमर में रिसाव; (3) विस्तारित आरडी-अपेक्षित चर और छितरी हुई ट्यूमर (चित्रा 2)।
    नोट: केवल स्थानीय आरडी (लगभग 50%) वाले चूहों को ट्यूमर विकसित करने की उम्मीद है जो कोरॉइड तक सीमित हैं।

6. आरडी ऊंचाई के आधार पर ट्यूमर के आकार की भविष्यवाणी

  1. विश्लेषण सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके ओसीटी स्कैन में स्थानीय आरडी की ऊंचाई को मापें और निम्नलिखित समूहों के अनुसार वर्गीकृत करें: छोटा = <300 μm; मध्यम = 300-400 μm; बड़ा = >400 μm।
  2. निम्नलिखित मानदंडों के अनुसार इंजेक्शन से 5 दिनों के भीतर ट्यूमर तक पहुंचने की उम्मीद की मात्रा का आकलन करें:
    एक छोटी आरडी ऊंचाई आमतौर पर छोटे आकार के ट्यूमर में देखी जाती है (ट्यूमर की मात्रा 0.0059 मिमी 3 से 0.07मिमी 3 तक 0.027 ± 0.005 मिमी3 की औसत मात्रा के साथ)।
    एक मध्यम आरडी ऊंचाई छोटे और मध्यम आकार के ट्यूमर दोनों में पाई जाती है (ट्यूमर की मात्रा 0.015 मिमी 3 से 0.15मिमी 3 तक 0.056 ± 0.016 मिमी3 की औसत मात्रा के साथ)।
    एक बड़ी आरडी ऊंचाई 0.36 मिमी3 तक ट्यूमर वॉल्यूम की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़ी है।
    नोट: अपेक्षित ट्यूमर आकार की सीमा पिछले परिणामों से प्राप्त की गई थी और छोटे, मध्यम और बड़े ट्यूमर के तीन समूहों में विभाजित की गई थी।

7. पोस्टऑपरेटिव प्रक्रियाएं

  1. ऑप्थेल्मिक ओफ्लोक्सासिन 0.3% शीर्ष पर लागू करें।
  2. एटिपामेज़ोल हाइड्रोक्लोराइड (3 मिलीग्राम / किग्रा) को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करके संज्ञाहरण को उलट दें।
  3. जानवरों के दर्द और पीड़ा को कम करने के लिए 3 दिनों के लिए दिन में दो बार ब्यूप्रेनोर्फिन (0.05 मिलीग्राम / किग्रा शरीर का वजन) इंजेक्ट करें।
  4. मेलेनोमा सेल इंजेक्शन के 5 दिनों के बाद, नीचे दिए गए चरणों का पालन करके ट्यूमर के आकार का मूल्यांकन करें।
    1. चरण 2.1 में वर्णित के रूप में चूहों को एनेस्थेटाइज करें। ट्रॉपिकामाइड (0.5%) लागू करें।
    2. अनुदैर्ध्य और ओसीटी स्कैन द्वारा आंखों की जांच करें और ट्यूमर की मात्रा और स्थानीयकरण को मापने के लिए ओसीटी विभाजन / विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    3. सूत्र24 का उपयोग करके ट्यूमर की मात्रा की गणना करें: V = a*b*c*6/π (a, b, और c = क्रमशः लंबाई, चौड़ाई और ऊंचाई)।
    4. चरण 7.4.1-7.4.3 में वर्णित के रूप में हर 2-3 दिनों में ट्यूमर के आकार की जांच करें।
      नोट: विभिन्न माउस उपभेदों या सेल लाइनों का उपयोग करते समय प्रक्रिया को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

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Representative Results

बी 16एलएस 9 कोशिकाओं के इंजेक्शन के तुरंत बाद ओसीटी के माध्यम से आंखों की जांच की गई। इंजेक्शन के बाद स्थानीय रेटिना डिटेचमेंट देखा गया। चूहों ने आरडी के तीन पैटर्न प्रदर्शित किए: फोकल (चित्रा 2, ऊपरी पैनल), विट्रस में रिसाव (चित्रा 2, मध्य पैनल), और विस्तारित आरडी (चित्रा 2, निचला पैनल)। इंजेक्शन से नुकसान के कारण विस्तारित आरडी की संभावना है। इंजेक्शन के तुरंत बाद आरडी के पैटर्न और इंजेक्शन के 5-7 दिनों के बाद ट्यूमर के स्थानीयकरण के बीच एक संबंध था। जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, फोकल आरडी ट्यूमर सेल विकास से जुड़ा था जो कोरॉयड तक सीमित था। हालांकि, फोकल आरडी प्रदर्शित करने वाले जानवरों में इंजेक्शन के बाद विट्रस में कोशिकाओं के अवलोकन ने कोरॉइड के अलावा विट्रल गुहा में ट्यूमर के विकास का संकेत दिया। अंत में, जब इंजेक्शन के बाद कई साइटों पर विस्तारित आरडी, या आरडी देखा गया, तो ट्यूमर 5 दिनों के बाद कोरॉइड और विट्रस में फैल गए। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ओसीटी द्वारा ट्यूमर का लक्षण वर्णन हिस्टोलॉजिकल परीक्षा21 के साथ पूरी तरह से सहसंबद्ध है।

Figure 2
चित्रा 2: उप-कोरॉयडल सेल इंजेक्शन के बाद ट्यूमर के विकास की ओसीटी-आधारित भविष्यवाणी। पीबीएस के 2 μL में कुल 7 × 104 B16LS9 कोशिकाओं को माउस आंखों के उप-कोरॉयड स्थान में इंजेक्ट किया गया था। सेल इंजेक्शन (बाएं) के तुरंत बाद ओसीटी और फंडस इमेजिंग द्वारा इंजेक्शन साइट की कल्पना की गई थी। डैश्ड लाइनें फोकल आरडी (ऊपर), विट्रस (मध्य) पर सेल सामग्री और विस्तारित आरडी (नीचे) का पता लगाने को दर्शाती हैं। दाईं ओर, धराशायी रेखाएं इंजेक्शन के 5 दिन बाद ट्यूमर द्रव्यमान का संकेत देती हैं। यह आंकड़ा ज़क्स एट अल .21 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इस मॉडल में प्रेरित ट्यूमर के आकार की सीमा को छोटे, मध्यम और बड़े में विभाजित किया जा सकता है (चित्रा 3)। इंजेक्शन के बाद आरडी की ऊंचाई इंजेक्शन के 5 दिनों के बाद ट्यूमर के आकार से जुड़ी थी, जैसा कि क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर ओसीटी स्कैन (चित्रा 4) द्वारा मापा गया था। ट्यूमर के आकार से जुड़ी आरडी ऊंचाइयों को तालिका 1 में दिखाया गया है।

Figure 3
चित्र 3: ट्यूमर के आकार का निर्धारण। टीकाकरण के 5-7 दिनों के बाद ओसीटी स्कैन (बाएं) और फंडस (दाएं) के वास्तविक समय कैमरा दृश्य द्वारा ट्यूमर के विकास का मूल्यांकन किया गया था। दिखाए गए छोटे, मध्यम और बड़े ट्यूमर की प्रतिनिधि छवियां हैं। यह आंकड़ा ज़क्स एट अल .21 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ओसीटी लाइव इमेजिंग के आधार पर ट्यूमर के आकार का वर्गीकरण। ट्यूमर को 7 × 104 बी 16एलएस 9 कोशिकाओं के उप-कोरॉयडल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था। ट्यूमर के विकास का मूल्यांकन लाइव ओसीटी इमेजिंग में तुरंत और इंजेक्शन के 5 दिन बाद किया गया था। (ए) इंजेक्शन के बाद आरडी ऊंचाई का एक प्रतिनिधि ओसीटी माप (दिन 0, बाएं, पीली रेखा ऊंचाई इंगित करती है), क्षैतिज ओसीटी स्कैन में ट्यूमर की ऊंचाई और चौड़ाई (दिन 5, मध्य, पीली रेखाएं ऊंचाई और चौड़ाई इंगित करती हैं), और एक एच एंड ई-सना आंख अनुभाग (दाएं)। इनसेट: आरडी क्षेत्र की फंडस छवि। (बी) प्रेरित ट्यूमर आकार की सीमा को तीन समूहों में विभाजित किया गया था। चूहों के ट्यूमर की मात्रा माप जो सेल इंजेक्शन के तुरंत बाद छोटे (एस, एन = 15), मध्यम (एम, एन = 9), या बड़े (एल, एन = 7) आरडी प्रस्तुत करते हैं। * पी < 0.05. यह आंकड़ा ज़क्स एट अल .21 से अनुकूलित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

आरडी ऊंचाई ट्यूमर की मात्रा
<300 μm (छोटा) 0.0059 मिमी 3 से 0.07 मिमी 3 (मतलब 0.027 ± 0.005 मिमी3)
300-400 μm (मध्यम) 0.015 मिमी 3 से 0.15 मिमी 3 (मतलब 0.056 ± 0.016 मिमी3)
> 400 μm (बड़ा) 0.05 मिमी 3 से 0.36 मिमी 3 (मतलब 0.017 ± 0.06 मिमी3)

तालिका 1: ट्यूमर के आकार के साथ संबंधित आरडी ऊंचाइयां।

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Discussion

यूवियल मेलेनोमा एक विनाशकारी बीमारी है जिसके लिए नए चिकित्सीय दृष्टिकोण की बहुत आवश्यकता है। हालांकि, यूवियल मेलेनोमा और संभावित उपचार पर शोध यूवियल मेलेनोमा पशु मॉडल 1,25 की तकनीकी चुनौतियों से सीमित है। ओकुलर ट्यूमर, जो कैंसर कोशिकाओं के इंट्राओकुलर इंजेक्शन से प्रेरित होते हैं, स्थानीयकरण और आकार दोनों में अत्यधिक परिवर्तनशील होते हैं, संभवतः माउस आंख के छोटे आयामों के कारण। इस तरह की परिवर्तनशीलता ट्यूमर की प्रगति के व्यापक मूल्यांकन के लिए एक बाधा है। यहां वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण लाइव ओसीटी इमेजिंग21 के आधार पर उप-कोरॉयडल बी 16एलएस 9 मेलेनोमा सेल इंजेक्शन के तुरंत बाद इंट्राओकुलर ट्यूमर स्थानीयकरण और अनुमानित आकार का आकलन करने की अनुमति देता है। वर्षों से, लाइव इमेजिंग तकनीकों के विकास ने प्रयोगों के दौरान ट्यूमर की प्रगति का पालन करने की अनुमति देकर कैंसर अनुसंधान में लाभ प्रदान किया, न केवल पूर्व-परिभाषित समापन बिंदुओं पर। इस तरह के तरीकों में, उदाहरण के लिए, रिपोर्टर कोशिकाओं का उपयोग करके बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग शामिल है, जो जीवित जानवरों में ट्यूमर और मेटास्टेस के स्थान की निगरानी को सक्षम बनाता है, जिसमें ओकुलर ट्यूमर16 की पहचान करना शामिल है। एक और परिष्कृत विधि फोटोएकॉस्टिक इमेजिंग है, जो कोशिकाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को सक्षम करती है और स्वस्थ कोशिकाओं से मेलेनोमा कोशिकाओं को अलग करती है। हालांकि, ओसीटी का विशिष्ट लाभ ट्यूमर के इंट्राओकुलर स्थान की पहचान करने और जीवित जानवरों में उनके आकार का मूल्यांकन करने की क्षमता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल में उप-कोरॉइडल स्पेस में एक पेरिटॉमी और एक पथ बनाकर मेलेनोमा कोशिकाओं के इंट्राओकुलर टीकाकरण को दर्शाया गया है, इसके बाद पथ और सेल इंजेक्शन की नोक पर एक कुंद सुई का कोमल सम्मिलन होता है। यह अत्यधिक पंचर को समाप्त करता है और सेल टीकाकरण के स्थान को निर्देशित करता है। इंजेक्शन रेटिना डिटेचमेंट को प्रेरित करता है, जो विकसित होने वाले ट्यूमर के स्थानीयकरण और आकार को दर्शाता है। हमारे अवलोकन ों से पता चलता है कि स्थानीय आरडी की स्थिति में बनने वाले ट्यूमर फोकल होते हैं, और उनका आकार इंजेक्शन के बाद आरडी की ऊंचाई से मेल खाता है। इसके विपरीत, कई आरडी, या इंजेक्शन के बाद विट्रियस में कोशिकाओं का पता लगाना, आमतौर पर छितरी हुई ट्यूमर21 में परिणाम देता है।

यह प्रशंसनीय है कि फोकल आरडी दर्शाता है कि इंजेक्शन ने एक निश्चित स्थान पर अधिकांश कोशिकाओं को कॉम्पैक्ट किया, जिससे स्थानीयकृत ट्यूमर के गठन की अनुमति मिलती है। दूसरी ओर, कई आरडी साइटों का अर्थ है कि इंजेक्शन रेटिना में कई स्थानों पर पहुंच गया, जिससे संभावना बढ़ गई कि ट्यूमर कोशिकाओं को कई साइटों में प्रत्यारोपित किया गया था और बिखरे हुए ट्यूमर का गठन किया गया था।

इंजेक्शन के बाद स्थानीयकरण और अनुमानित ट्यूमर के आकार का मूल्यांकन करना ट्यूमर की प्रगति का आकलन करते समय विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जैसे कि विशिष्ट कारकों या संभावित उपचारों के प्रभाव की जांच करना। प्रारंभिक निर्धारण एक समरूप अध्ययन समूह को शामिल करने की अनुमति दे सकता है, मॉडल की प्रजनन क्षमता को बढ़ा सकता है, जिससे अध्ययन की सटीकता में सुधार होता है, और मूल्यवान समय और लागत की बचत होती है। इसके अलावा, चूंकि इंट्राओकुलर ट्यूमर की ओसीटी इमेजिंग जीवित जानवरों में ट्यूमर के स्थान और आकार दोनों पर सटीक जानकारी प्रदान करती है, चूहों को दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए निगरानी की जा सकती है, उदाहरण के लिए, मेटास्टेस का मूल्यांकन करने के लिए। मेलेनोमा के माउस मॉडल में एक और कठिनाई यह है कि माउस पिग्मेंटेशन, जैसे कि सी 57बीएल / 6 चूहों में, अक्सर पिगमेंटेड ट्यूमर के विश्लेषण को प्रतिबंधित करता है। इसलिए, ओसीटी इमेजिंग का एक और लाभ यह है कि यह रंजकता से स्वतंत्र है और इसे रंजित चूहों या घावों पर लागू किया जा सकता है।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि माउस तनाव, सेल लाइन, या इंजेक्शन तकनीक जैसे विभिन्न पैरामीटर, ट्यूमर दीक्षा और विकास को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, विशिष्ट उपभेदों या कोशिकाओं के लिए मॉडल के अनुकूलन की सलाह दी जाती है। यह भी माना जाना चाहिए कि माध्यमिक मोतियाबिंद समय1 के साथ विकसित हो सकता है, ओसीटी का उपयोग करने की क्षमता को सीमित करता है। हालांकि यह यहां वर्णित छोटी समय सीमा में होने की संभावना नहीं है, किसी को मोतियाबिंद आंखों के बहिष्करण की अनुमति देने के लिए लंबे प्रयोग ों का प्रदर्शन करते समय समूह के आकार को बढ़ाने पर विचार करना चाहिए।

सारांश में, वर्णित प्रोटोकॉल बी 16एलएस 9 मेलेनोमा के एक सामान्य मॉडल का उपयोग करता है, जिसका मूल्यांकन लाइव ओसीटी इमेजिंग द्वारा किया जाता है, ताकि जीवित जानवरों में कोरॉयडल ट्यूमर के मूल्यांकन के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल विकसित किया जा सके। इस दृष्टिकोण का उपयोग भविष्य के अध्ययनों के लिए किया जा सकता है जो यूवियल मेलेनोमा, नए प्रयोगात्मक मॉडल और संभावित नए उपचारों के अंतर्निहित तंत्र की जांच कर रहे हैं।

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Disclosures

मार्कोविच ए.एल.: स्टेबा बायोटेक (पी), येडा वीज़मैन (पी), आईयोन मेडिकल (सी, पी), मोर इसुम (पी)। (सी) = सलाहकार; (पी) = पेटेंट। अन्य सभी लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एरी मार्कोविच के लिए इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ), इज़राइल से अनुदान 1304/20 द्वारा समर्थित किया गया था। हम हिस्टोलॉजी विश्लेषण के लिए पैथोलॉजी विभाग, कपलान मेडिकल सेंटर, रेहोवोट, इज़राइल से शहर ईश-शालोम और एडी योसिपोविच को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 μL glass syringe (Hamilton Co., Bonaduz, Switzerland) Hamilton 721711
30 G needles BD Microbalance 2025-01
Atipamezole hydrochloride Orion Phrma
B16LS9 cells from Hans Grossniklaus USA
Buprenorphine  richter pharma 102047
C57BL/6 female mice Envigo
Essential vitamin mixture satorius 01-025-1A
Fetal bovine serum rhenium 10270106
HEPES satorius 03-025-1B
Hydroxyethylcellulose 1.4% eye drops Fisher Pharmaceutical 390862
InSight OCT segmentation software  Phoenix Micron, Inc 
Ketamine bremer pharma GMBH (medimarket) 17889
L-glutamine satorius 03-020-1B
Medetomidine  zoetis (vetmarket) 102532
Ofloxacin 0.3% eye drops allergan E92170
Optical coherence tomography  Phoenix Micron, Inc 
Oxybuprocaine 0.4% Fisher Pharmaceutical 393050
Penicillin-streptomycin-amphoteracin satorius 03-033-1B
Phosphate buffered saline (PBS)  satorius 02-023-1a
RPMI cell media satorius 01-104-1A
Sodium pyruvate satorius 03-042-1B
Surgical microscope Zeiss OPMI-6 CFC
Tropicamide 0.5% Fisher Pharmaceutical 390723

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References

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ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी के <em>माध्यम से</em> मुराइन कोरॉयड में मेलेनोमा का आरोपण और मूल्यांकन
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Gaber, D., Aharoni-Simon, M., Zaks,… More

Gaber, D., Aharoni-Simon, M., Zaks, O., Ben-Yaakov, K., Rotfogel, Z., Leiba, H., Eisenberg-Lerner, A., Marcovich, A. L. Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (190), e64632, doi:10.3791/64632 (2022).

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