Summary
यह प्रोटोकॉल टिबियल न्यूरोमा ट्रांसपोज़ेशन मॉडल का वर्णन करता है, जो टिबियल तंत्रिका के घाव को उपचर्म प्रीटिबियल या पार्श्व स्थिति की ओर समीपस्थ तंत्रिका छोर के बाद के संक्रमण के साथ शामिल करता है। वॉन फ्रे मोनोफिलामेंट्स का उपयोग करके न्यूरोमा दर्द और प्लांटर हाइपरलेजेसिया का व्यवहार परीक्षण निर्धारित किया जाता है।
Abstract
टिबियल न्यूरोमा ट्रांसपोज़ेशन (टीएनटी) एक चूहा मॉडल है जिसमें न्यूरोमा साइट (टिबियल तंत्रिका) पर एलोडोनिया का स्वतंत्र रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह टीएनटी मॉडल न्यूरोमा दर्द के लिए उपचारों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त है, जैसे कि कुछ सर्जिकल उपचारों की संभावित श्रेष्ठता जो पहले से ही क्लिनिक में उपयोग की जाती हैं, या नई दवाओं का मूल्यांकन करने और एक ही जानवर में दोनों दर्द के तौर-तरीकों पर उनके प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए। इस मॉडल में, टिबियल तंत्रिका में एक डिस्टल घाव (न्यूरोटमेसिस) बनाया जाता है, और समीपस्थ तंत्रिका छोर को 15 ग्राम वॉन फ्रे मोनोफिलामेंट के साथ न्यूरोमा साइट के आकलन को सक्षम करने के लिए चमड़े के नीचे और प्रीटिबियल रूप से बदल दिया जाता है और तय किया जाता है। सुरल तंत्रिका पर एलोडोनिया का आकलन करने के लिए, वॉन फ्रे मोनोफिलामेंट्स का उपयोग पिछले पंजे के प्लांटर पार्श्व क्षेत्र पर अप-डाउन विधि के माध्यम से किया जा सकता है। टिबियल तंत्रिका को काटने के बाद, सर्जरी के बाद 1 सप्ताह के भीतर न्यूरोमा साइट पर यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता विकसित होती है और सर्जरी के बाद कम से कम 12 सप्ताह तक बनी रहती है। विपरीत अंग की तुलना में सर्जरी के बाद 3 सप्ताह के भीतर सुरल इनरवेट प्लांटर सतह पर एलोडोनिया विकसित होता है। 12 सप्ताह में, एक न्यूरोमा कटे हुए टिबियल तंत्रिका के समीपस्थ छोर पर बनता है, जो फैलाव और अक्षतंतु के घूमने से संकेत मिलता है। टीएनटी मॉडल सर्जरी के लिए, कई महत्वपूर्ण (सूक्ष्म) सर्जिकल चरणों का पालन करने की आवश्यकता होती है, और टर्मिनल संज्ञाहरण के तहत कुछ सर्जरी अभ्यास की सलाह दी जाती है। अन्य न्यूरोपैथिक दर्द मॉडल की तुलना में, जैसे कि बख्शे गए तंत्रिका चोट मॉडल, न्यूरोमा साइट पर एलोडोनिया को टीएनटी मॉडल में सुरल तंत्रिका अतिसंवेदनशीलता से स्वतंत्र रूप से परीक्षण किया जा सकता है। हालांकि, न्यूरोमा साइट का परीक्षण केवल चूहों में किया जा सकता है, चूहों में नहीं। इस प्रोटोकॉल में प्रदान की गई युक्तियां और निर्देश दर्द पर काम करने वाले अनुसंधान समूहों को अपनी सुविधा में टीएनटी मॉडल को सफलतापूर्वक लागू करने में मदद कर सकते हैं।
Introduction
प्रत्येक घाव, साधारण घावों से लेकर पूरे अंग विच्छेदन तक, परिधीय तंत्रिका चोट की अलग-अलग डिग्री के साथ होता है। इस तरह की तंत्रिका चोट के परिणामस्वरूप एक न्यूरोमा का निर्माण हो सकता है, जो अंकुरित तंत्रिका तंतुओं का एक अव्यवस्थित उलझाव है। न्यूरोमा 8% -30% रोगियों में दर्दनाक हो जाता है, जिससे उनके जीवन की गुणवत्ता 1,2,3,4,5 गंभीर रूप से प्रभावित होती है। अंग विच्छेदन के बाद, 6,7,8 के 50% रोगियों में न्यूरोमा दर्द विकसित होता है। रिपोर्ट किए गए लक्षणों में कोमलता, सहज दर्द, एलोडोनिया, हाइपरलेजेसिया औरआंतरिक क्षेत्र में यांत्रिक या थर्मल अतिसंवेदनशीलता शामिल हैं। जब 1 वर्ष के भीतर पर्याप्त रूप से इलाज नहीं किया जाता है, तो न्यूरोमा दर्द एक पुरानी दर्द की स्थिति में आगे बढ़ सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उच्च सामाजिक बोझ और संबंधित चिकित्सा लागत10,11,12,13,14 हो सकती है। वर्तमान औषधीय हस्तक्षेपों की खराब प्रभावकारिता के कारण, न्यूरोमा दर्द को अधिमानतः दर्दनाक न्यूरोमा के सर्जिकल हटाने और विभिन्न शल्य चिकित्सा तकनीकों द्वारा इलाज की जाने वाली तंत्रिका द्वारा इलाज किया जाता है, जैसा कि साहित्य15 में वर्णित है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पूर्ण दर्द से राहत दुर्लभ है, दर्द अक्सर समय के साथ खराब हो जाता है, और 40% रोगियों को सर्जरी से लाभ नहीं होता है, यह दर्शाता है कि नए उपचार की आवश्यकता है 1,16।
न्यूरोमा दर्द का एक मानकीकृत चूहा मॉडल न्यूरोमा दर्द को चलाने वाले तंत्र को समझने में सहायता करता है, और नए उपचारों की पहचान करने या क्लिनिक में उपयोग किए जाने वाले मौजूदा लोगों का मूल्यांकन करने में मदद कर सकता है। टिबियल न्यूरोमा ट्रांसपोज़ेशन (टीएनटी) मॉडल को पहली बार 200817 में डोर्सी एट अल द्वारा वर्णित किया गया था और इसका उपयोग विभिन्न शोध समूहों 18,19,20 द्वारा किया गया है। इस पद्धति का समग्र लक्ष्य न्यूरोमा दर्द के लिए विभिन्न उपचार तकनीकों का परीक्षण करने में सक्षम होना है। मॉडल का लाभ, उदाहरण के लिए, बख्शे गए तंत्रिका चोट (एसएनआई) मॉडल21, यह है कि यह न्यूरोमा साइट पर एलोडोनिया का परीक्षण करने की अनुमति देता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि मॉडल में टिबियल तंत्रिका के समीपस्थ तंत्रिका अंत को चमड़े के नीचे प्रीटिबियल स्थिति में स्थानांतरित करना शामिल है, जहां इसे वॉन फ्रे मोनोफिलामेंट्स के साथ जांच की जा सकती है। इसके अलावा, एलोडोनिया बरकरार सुरल तंत्रिका द्वारा आंतरिक हिंद पंजे की प्लांटर सतह पर विकसित होता है, जिसे उसी जानवर में न्यूरोमा दर्द से स्वतंत्र रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। यह रोगियों में न्यूरोमा दर्द के लक्षणों के समान है, जहां दर्दनाक न्यूरोमा को हटाने के बाद लगातार न्यूरोपैथिक दर्द कभी-कभी पड़ोसी नसों के कारण होताहै22. इसके अलावा, न्यूरोमा के साथ एक कटी हुई तंत्रिका पर एलोडोनिया बरकरार पड़ोसी तंत्रिका पर एलोडोनिया की तुलना में एक अलग दर्द पद्धति है। इस प्रकार, यह मॉडल न्यूरोमा साइट पर मौजूद एलोडोनिया और हिंद पंजे की प्लांटर सतह में परीक्षण किए गए अधिक व्यापक न्यूरोपैथिक दर्द दोनों पर नए उपचारों के प्रभाव के आकलन की सुविधा प्रदान करता है। चूंकि टीएनटी मॉडल बनाने के लिए की गई सर्जरी चुनौतीपूर्ण हो सकती है, इसलिए यह पेपर अपनी सुविधा में मॉडल को लागू करने वाले शोधकर्ताओं का समर्थन करने के लिए प्रक्रिया पर विस्तार से बताता है।
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Protocol
यह शोध आईवीडी (इंस्टेंटी वूर डिरेनवेलज़िन यूट्रेक्ट) और पशु अनुसंधान के लिए दिशानिर्देशों, परियोजना संख्या एवीडी 1150020198824 के अनुसार किया गया था।
1. वॉन फ्रे बेसलाइन माप।
- सर्जरी से पहले, वॉन फ्रे परीक्षण प्रक्रिया के अनुसार बेसलाइन माप करें, जो अनुभाग 5 और खंड 6 में नीचे वर्णित है।
2. संज्ञाहरण और तैयारी
नोट: यह अध्ययन 15 पुरुष स्प्राग डॉवले चूहों पर आयोजित किया गया था जो 12 सप्ताह के थे।
- 5% आइसोफ्लुरेन के साथ इंडक्शन द्वारा जानवरों को एनेस्थेटाइज करें और 2% -3% आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थीसिया बनाए रखें।
नोट: 2% आइसोफ्लुरेन के साथ रखरखाव आमतौर पर श्वासनली इंटुबैशन या यांत्रिक वेंटिलेशन की आवश्यकता के बिना पर्याप्त संज्ञाहरण और सहज श्वास के परिणामस्वरूप होता है। - चिमटी से पैर को पिंच करके जानवरों की सजगता की जांच करें। सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले जानवर अनुत्तरदायी है। घुटने से टखने तक ऑपरेटिव क्षेत्र को इलेक्ट्रिक शेवर से शेव करें और सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं। पेट क्षेत्र में 0.5 मिलीग्राम / किग्रा एनाल्जेसिक कार्प्रोफेन को चमड़े के नीचे इंजेक्ट करें।
- एनेस्थेटाइज्ड चूहे को उसकी पीठ पर उसके सिर के साथ बाईं या दाईं ओर रखें और पैर को सर्जन के पास ऑपरेशन किया जाए। निचले पिछले अंग को बाहर निकालें ताकि औसत दर्जे का मॉलोलस ऊपर की ओर हो। चूहे को 6x आवर्धन के साथ स्टीरियो सर्जिकल माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
- आयोडीन आधारित स्क्रब के तीन अलग-अलग राउंड के साथ मुंडा क्षेत्र को कीटाणुरहित करें, इसके बाद अल्कोहल। पैर के ऊपर एक ऑपरेटिव छेद के साथ एक बाँझ चादर रखें, ताकि केवल ऑपरेटिव क्षेत्र दिखाई दे। सर्जरी के दौरान इन बाँझ स्थितियों को बनाए रखना सुनिश्चित करें।
3. सर्जरी
- ऑपरेटिव क्षेत्र को क्षैतिज रखने के लिए टखने के नीचे एक छोटा कपास का फाहा रखें। घुटने का पता लगाएं और धीरे-धीरे मध्य-बछड़े से टखने तक पिछले पंजे के मध्यवर्ती हिस्से पर स्केलपेल का उपयोग करके 1-2 सेमी का अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं। यदि आवश्यक हो, तो त्वचा को खोलें और माइक्रो कैंची के साथ आगे सबक्यूटिस करें जब तक कि मांसपेशियों की परतें दिखाई न दें।
- सतही न्यूरोवास्कुलर बंडल को दो या तीन सफेद और एक मोटी बैंगनी / लाल रेखा के रूप में पहचानें, कभी-कभी मामूली शाखाओं के साथ, जो मांसपेशियों की परतों पर स्वतंत्र रूप से आगे बढ़ सकते हैं। इलेक्ट्रोकेटरी ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, ऑपरेटिव क्षेत्र में किसी भी सक्रिय रक्तस्राव या रक्तस्राव को कम करें। न्यूरोवस्कुलर बंडल को नुकसान न पहुंचाने के लिए सावधान रहें।
- 3.2 के सतही न्यूरोवास्कुलर बंडल के ठीक पीछे, गैस्ट्रोकेनेमस मांसपेशियों के बीच प्रावरणी को खोलने के लिए स्पष्ट रूप से विच्छेदन करें। मांसपेशियों की प्रावरणी के बीच, टिबियल तंत्रिका पाई जा सकती है। टिबियल तंत्रिका न्यूरोवास्कुलर बंडल में सतही तंत्रिका के आकार का लगभग तीन गुना है। टिबियल हड्डी को एक अतिरिक्त मील का पत्थर के रूप में उपयोग करें (टिबियल तंत्रिका टिबियल हड्डी के ठीक पीछे स्थित है)।
- टिबियल तंत्रिका और इसके विभाजन की पहचान करें।
नोट: विभाजन आमतौर पर तंत्रिका के ऊपर अनुदैर्ध्य रूप से एक हल्की रेखा के साथ दिखाई देता है। - आसपास के संवहनी बंडलों से मुक्त टिबियल तंत्रिका को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें। टिबियल तंत्रिका को स्पष्ट रूप से स्थानांतरित करके और उजागर ऊतक को काटकर विच्छेदन करें जो टिबियल तंत्रिका को स्थानांतरित करते समय कुछ खिंचाव दिखाता है।
नोट: यदि टिबियल तंत्रिका विच्छेदन के बाद नसों को पार करने से जुड़ी होती है, तो पूरे टिबियल तंत्रिका को उजागर करने के लिए इन नसों को जोड़ा जा सकता है। टिबियल बंडल को स्वयं जमा न करने के लिए सावधान रहें। - टिबियल तंत्रिका को समीपस्थ रूप से उजागर करें जब तक कि यह एक क्रॉसिंग मांसपेशी परत के नीचे गायब न हो जाए। इस बिंदु पर, टिबियल तंत्रिका घुटने की ओर पिछले पंजे में अधिक गहराई से गोता लगाती प्रतीत होती है। टिबियल तंत्रिका को टखने तक बाहर उजागर करें।
नोट: जब टिबियल तंत्रिका को अधिक दूर से उजागर किया जाता है, तो कोलेजन फाइबर (यानी, तंत्रिका तंतुओं की दिशा के लंबवत फाइबर) को पार करने की मात्रा बढ़ जाएगी। टिबियल तंत्रिका को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त लंबाई को सक्षम करने के लिए इन कोलेजन फाइबर को काटने की आवश्यकता होती है।- जब पूरे टिबियल तंत्रिका को उजागर किया जाता है, तो तंत्रिका के निर्जलीकरण से बचने के लिए मांसपेशियों की परतों को वापस रखें। यदि तंत्रिका निर्जलित हो जाती है (यानी, यह अधिक कठोर, सुस्त और झुर्रीदार हो जाती है), और मांसपेशियों की परतों के साथ कवर करना पर्याप्त नहीं है, तो इसे हाइड्रेट करने के लिए नमकीन की बूंदें जोड़ें।
- एक कुंद माइक्रोसर्जरी उपकरण का उपयोग करके, अधिमानतः एक माइक्रो सुई धारक, चमड़े के नीचे की सुरंग बनाने के लिए चमड़े के नीचे की मांसपेशी परत से प्रीटिबियल त्वचा को विच्छेदित करें। ऐसा करने के लिए, त्वचा को पकड़ें और कुंद नोक को त्वचा के समानांतर ऊतक में धक्का दें। सुनिश्चित करें कि सुरंग का अंत न्यूरोमा के परीक्षण के लिए क्षेत्र की आसान पहुंच सुनिश्चित करने के लिए प्रीटिबियल या अधिक पार्श्व रूप से स्थित है।
- आइसोफ्लुरेन को 5% तक बढ़ाएं। टिबियल तंत्रिका पर लौटें और इसे उजागर करें (यानी, चरण 3.6 में वर्णित स्थान पर वापस जाएं)। टखने के पास सबसे दूर के स्तर पर टिबियल तंत्रिका (यानी, दोनों प्लांटर शाखाएं) को काटें। आइसोफ्लुरेन को 2% -3% के सामान्य स्तर तक कम करें।
- माइक्रोस्कोप आवर्धन को 10x या 16x में बदलें। चरण 3.8 में किए गए कट के समीपस्थ टिबियल तंत्रिका के एपिन्यूरियम की पहचान करें, या टिबियल तंत्रिका के अधिक समीपस्थ विभाजन के मामले में, चरण 3.8 में कट के समीप मध्यवर्ती और पार्श्व प्लांटर शाखाओं दोनों के एपिन्यूरियम की पहचान करें।
नोट: एपिन्यूरियम भीतर तंत्रिका तंतुओं की तुलना में सफेद और दृढ़ है, जो अधिक पीले और नरम हैं। - ध्यान से 8-0 रखें समीपस्थ तंत्रिका छोर के एपिन्यूरियम के माध्यम से नायलॉन सीवन (सामग्री की तालिका देखें) चिमटी के साथ एपिन्यूरियम को सावधानीपूर्वक पकड़कर और लगभग 0.5 मिमी के काटने के साथ तंत्रिका और एपिन्यूरियम के बीच सुई डालकर। सीवन को खींचें और चरण 3.7 में बनाई गई चमड़े के नीचे की सुरंग के अंत में सुई के साथ काटने का प्रयास करें। एक गाँठ बनाएं, जो तंत्रिका को चमड़े के नीचे की सुरंग में पार्श्व रूप से बदल देगा।
नोट: यदि दोनों प्लांटर शाखाएं एक सामान्य एपिन्यूरियम साझा करती हैं, तो एक सीवन पर्याप्त होना चाहिए। यदि दोनों प्लांटर शाखाओं का अपना एपिन्यूरियम है, तो प्रत्येक एपिन्यूरियम को व्यक्तिगत रूप से लगाया जाना चाहिए। त्वचा के माध्यम से सीवन रखने से बचें; केवल इसे चमड़े के नीचे ठीक करें। - गहरे रंग (अधिमानतः एक नीले या काले 4-0 सीवन) के साथ एक मोटी सीवन रखें, जो त्वचा को भेदने के बजाय स्थिर तंत्रिका छोर पर फ्लश करें। सुनिश्चित करें कि सीवन त्वचा के बाहर से दिखाई दे रहा है। जांचें कि पंजे और मांसपेशियों को हिलाने के बाद तंत्रिका जगह पर रहती है या नहीं। 8-0 की तुलना में 4-0 पर थोड़ा लंबा सीवन अंत के साथ सीवन के अंत को काट दें। टांका।
- माइक्रोस्कोप के आवर्धन को वापस 6x में बदलें। 8-0 का उपयोग करके इंट्राएपिडर्मल सीवन के साथ त्वचा को बंद करें। रूई के फाहे का उपयोग करके 0.9% एनएसीएल के साथ त्वचा को धीरे-धीरे साफ करें।
4. पोस्ट-सर्जिकल उपचार
- चूहे को एक आरामदायक स्थिति में पेपर तौलिया के नीचे एक साफ पिंजरे में रखें। यदि कमरा ठंडा है, तो पिंजरे के एक हिस्से के नीचे एक हीट पैड रखें (केवल पिंजरे के एक हिस्से के नीचे क्योंकि जानवर को जरूरत पड़ने पर गर्मी से बचने में सक्षम होना चाहिए)। भोजन और पानी तक आसान पहुंच सुनिश्चित करें।
- शल्य चिकित्सा के बाद चूहे को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह उरोस्थि की स्थिरता बनाए रखने के लिए पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले। चूहे को अन्य जानवरों की कंपनी में वापस किया जा सकता है जब वह सर्जरी के बाद संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक हो गया हो। यह आमतौर पर 1 घंटे के बाद होता है और जब चूहा अपने सामान्य चलने के पैटर्न और व्यवहार को प्रदर्शित करता है।
- सर्जरी के बाद 24 घंटे और 48 घंटे में, शल्य चिकित्सा के बाद के दर्द का इलाज करने के लिए चमड़े के नीचे (पेट क्षेत्र) 0.5 मिलीग्राम / किग्रा कार्प्रोफेन की खुराक दें।
5. वॉन फ्रे पिछले पंजे के प्लांटर पक्ष का परीक्षण करता है।
नोट: वॉन फ्रे परीक्षण (चरण 5 और 6) सर्जरी से पहले (बेसलाइन माप के लिए), और सर्जरी के 3 दिन बाद से किया जाता है।
- चूहों को बेसलाइन माप से 1 सप्ताह पहले, या सर्जरी से 2 सप्ताह पहले जाल तार तल पिंजरों में रखें, ताकि परीक्षण वातावरण के अनुकूलन को सुनिश्चित किया जा सके।
- सर्जरी से कम से कम 1 सप्ताह पहले बेसलाइन उपायों के साथ शुरू करें। सुनिश्चित करें कि अलग-अलग दिनों में तीन स्वतंत्र आधारभूत माप किए जाते हैं।
- सत्यापित करें कि चूहे जाल वायर्ड बॉटम पिंजरों में शांत हैं। पिछले पंजे की प्लांटर सतह के लंबवत लघुगणकीय पैमाने के साथ वॉन फ्रे मोनोफिलामेंट्स की एक श्रृंखला लागू करें।
- सुरल तंत्रिका (अतिसंवेदनशीलता) को उत्तेजित करने के लिए, बालों की सीमा के करीब पार्श्व पक्ष पर मोनोफिलामेंट लागू करें। फुटपैड को छूने से बचें क्योंकि ये अधिक संवेदनशील होते हैं।
- टिबियल तंत्रिका (हाइपोसेंसिटिविटी) को उत्तेजित करने के लिए, पिछले पंजे की प्लांटर सतह के बीच में मोनोफिलामेंट लागू करें। यदि मोनोफिलामेंट को सबसे औसत दर्जे के क्षेत्र में लागू किया जाता है, तो यह सेफेनोस तंत्रिका को भी उत्तेजित कर सकता है, जो ऊरु तंत्रिका की एक शाखा है (चित्रा 1)। फुटपैड को छूने से बचें।
- 4 जी मोनोफिलामेंट से शुरू करें। मोनोफिलामेंट पर पर्याप्त बल लागू करें ताकि बाल झुक रहे हों और 3 सेकंड तक पकड़ सकें, और फिर मोनोफिलामेंट पर जानवर की प्रतिक्रियाओं की जांच करें। एक सकारात्मक प्रतिक्रिया अचानक पंजे की वापसी, अचानक हिचकना, अचानक पंजा चाटना या मुखरता है। कुछ मामलों में, चूहा चलता है और मोनोफिलामेंट को खोजने / हमला करने की कोशिश करता है।
- अप-डाउन विधि23 के माध्यम से उत्तेजना की प्रतिक्रिया के आधार पर अगला मोनोफिलामेंट चुनें। उदाहरण के लिए, यदि चूहा प्रतिक्रिया करता है, तो 2 जी मोनोफिलामेंट के साथ आगे उत्तेजित करें; यदि चूहा जवाब नहीं देता है, तो 6 जी मोनोफिलामेंट के साथ उत्तेजित करें, और इसी तरह। कुल मिलाकर, प्रतिक्रिया के आधार पर 5-10 उत्तेजनाओं को लागू करें।
6. वॉन फ्रे न्यूरोमा साइट का परीक्षण
- बेसलाइन उपायों से पहले या सर्जरी से 2 सप्ताह पहले कम से कम 5-7 दिनों के लिए रोजाना जानवरों को संभालें। सुनिश्चित करें कि जानवरों को चरण 6.2 में वर्णित के रूप में रखा गया है, ताकि वे स्थिति के साथ सहज हों।
- चूहों को अपनी नाक से कोहनी की तह की ओर इशारा करके पकड़ें। यदि चूहे को दाहिने हाथ में पकड़ा जाता है, तो उनके बाएं पिछले पंजे को दाएं अंगूठे और तर्जनी उंगली (पहला वेब स्पेस) के बीच स्वतंत्र रूप से लटकना चाहिए। यदि चूहे को बाएं हाथ में पकड़ा जाता है, तो उनके दाहिने पिछले पंजे को बाएं अंगूठे और तर्जनी उंगली के बीच स्वतंत्र रूप से लटकना चाहिए।
- सर्जरी से कम से कम 1 सप्ताह पहले बेसलाइन उपायों के साथ शुरू करें। सुनिश्चित करें कि अलग-अलग दिनों में तीन स्वतंत्र आधारभूत माप किए जाते हैं।
- सत्यापित करें कि पकड़े जाने के दौरान चूहे शांत और आरामदायक हैं। बेसलाइन पर, 15 ग्राम मोनोफिलामेंट को उजागर पिछले पंजे की प्रीटिबियल सतह पर धीरे से रखें। सर्जरी के बाद, 15 ग्राम मोनोफिलामेंट को दृश्यमान सीवन पर रखें (उदाहरण के लिए, न्यूरोमा के स्थान पर)। मोनोफिलामेंट पर पर्याप्त बल लागू करें ताकि बाल झुक रहे हों और 1 सेकंड तक पकड़ सकें।
- प्रत्येक उत्तेजना की प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करें। प्रतिक्रिया विकल्पों में कोई प्रतिक्रिया नहीं, धीमी वापसी, त्वरित वापसी और मुखरता शामिल है। प्रतिक्रिया को बिना किसी प्रतिक्रिया के 0 अंक और धीमी वापसी, त्वरित वापसी या मुखरता के लिए एक बिंदु के रूप में रिकॉर्ड करें।
- मोनोफिलामेंट के पांच अनुप्रयोगों के पांच समूहों को दोहराएं, प्रत्येक एप्लिकेशन के बीच 2-3 सेकंड और पांच समूहों के बीच 2-3 मिनट या उससे अधिक। कुल मिलाकर, प्रत्येक हिंद पंजे में रिकॉर्ड की गई प्रतिक्रियाओं के साथ मोनोफिलामेंट के 25 अनुप्रयोग होने चाहिए।
7. हिस्टोलॉजी और तैयारी के लिए नमूना वसूली
नोट: हिस्टोलॉजिकल परीक्षा प्रारंभिक सर्जरी के 12 सप्ताह बाद की जाती है।
- संज्ञाहरण को प्रेरित करें और चरण 2.2, 2.3 और 2.4 में वर्णित जानवरों को तैयार करें।
- प्रारंभिक सर्जरी द्वारा किए गए निशान पर स्केलपेल का उपयोग करके धीरे से 2-3 सेमी का चीरा लगाएं, लेकिन सावधान रहें कि बहुत गहरा न काटें क्योंकि तंत्रिका सतही रूप से रखी गई है।
- न्यूरोमा की स्थिति निर्धारित करें, आसपास के निशान ऊतक से मुक्त न्यूरोमा और तंत्रिका को सावधानीपूर्वक विच्छेदित करें, और कटे हुए न्यूरोमा को फिक्सेटिव में रखें। न्यूरोमा आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए, ऊतक अधिमानतः पैराफिन या एपॉक्सी राल में अनुदैर्ध्य रूप से एम्बेडेड होता है जैसा कि टॉर्क एट अल .18 द्वारा वर्णित है।
- ऊतक की कटाई के बाद, कार्डियक पंचर या डिकैपिटेशन के माध्यम से टर्मिनल एनेस्थीसिया (5% आइसोफ्लुरेन) के तहत चूहों को इच्छामृत्यु दें।
नोट: चूहों को मारने से पहले न्यूरोमा की कटाई करने की सलाह दी जाती है, क्योंकि तब विवो में न्यूरोमा को उसके आसपास के ऊतक से अलग करना आसान होता है।
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Representative Results
न्यूरोमा साइट पर मूल्यांकन ने 15 ग्राम वॉन फ्रे मोनोफिलामेंट के आवेदन के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि दिखाई। बेसलाइन पर, चूहों ने आमतौर पर 15 ग्राम मोनोफिलामेंट के 25 अनुप्रयोगों में से 10% -15% (± 13%) का जवाब दिया। टीएनटी सर्जरी के 1 सप्ताह बाद प्रतिक्रिया दर बढ़कर 45% -50% (± 24%) हो गई। विपरीत पक्ष पर, सर्जरी के बाद प्रतिक्रियाओं की संख्या बेसलाइन (चित्रा 2 ए) के समान थी। लगभग 20% चूहों ने एक दर्दनाक न्यूरोमा विकसित नहीं किया; बेसलाइन (चित्रा 2 बी) की तुलना में प्रतिक्रिया दर में वृद्धि नहीं हुई। यह मानव स्थिति के बराबर है, जहां सभी रोगियों (विच्छेदन के बाद 50%) न्यूरोमा के गठन के बाद दर्द विकसित नहीं करते हैं। सभी चूहों ने सर्जरी के 12 सप्ताह बाद सही और ट्रांसपोज़्ड टिबियल तंत्रिका स्टंप के अंत में एक न्यूरोमा विकसित किया (चित्रा 3)। इस न्यूरोमा को कोलेजन जमाव के भीतर घूमते हुए अक्षतंतु और माइक्रोफैसिकल्स की विशेषता थी।
टिबियल तंत्रिका के ट्रांससेक्शन ने पिछले पंजे के प्लांटर साइड के बीच में यांत्रिक संवेदनशीलता को कम कर दिया, जो टिबियल तंत्रिका (चित्रा 1) द्वारा आंतरिक था। सर्जरी के 1 सप्ताह बाद हाइपोसेंसिटिविटी मौजूद थी, सर्जरी के 3 सप्ताह बाद से विपरीत पक्ष और बेसलाइन से काफी अलग थी, और सर्जरी के बाद कम से कम 12 सप्ताह तक बनी रही (चित्रा 4)। बरकरार सुरल तंत्रिका द्वारा आंतरिक हिंद पंजे के प्लांटर साइड के पार्श्व भाग में, चूहों ने यांत्रिक अतिसंवेदनशीलता विकसित की जो सर्जरी के 1 सप्ताह बाद विपरीत पक्ष और आधार रेखा से काफी अलग थी (चित्रा 4)। यह अतिसंवेदनशीलता सर्जरी के बाद कम से कम 12 सप्ताह तक बनी रही। विपरीत पंजे पर, यांत्रिक संवेदनशीलता उन क्षेत्रों में बेसलाइन की तुलना में प्रभावित नहीं हुई थी जो या तो सुरल या टिबियल तंत्रिका (चित्रा 4) द्वारा आंतरिक थे।
चित्रा 1: पिछले पंजे के प्लांटर साइड पर तंत्रिका वितरण। लाल = सुरल तंत्रिका वितरण (पार्श्व); बैंगनी = टिबियल तंत्रिका वितरण (मध्य); हरा = सफेनोस तंत्रिका वितरण (मध्यम)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: न्यूरोमा साइट के वॉन फ्रे। टिबियल तंत्रिका को सही तरीके से तैयार किया गया था और न्यूरोमा साइट पर यांत्रिक संवेदनशीलता के पाठ्यक्रम का मूल्यांकन कुल 25 अनुप्रयोगों के साथ पांच अनुप्रयोगों के पांच समूहों में लागू 15 ग्राम मोनोफिलामेंट के साथ किया गया था। एक प्रतिक्रिया को एक अंक के रूप में स्कोर किया जाता है। (ए) न्यूरोमा साइट ने बेसलाइन और विपरीत पक्ष की तुलना में सर्जरी के 1 सप्ताह बाद काफी अधिक प्रतिक्रिया दिखाई। एन = 15; त्रुटि पट्टियाँ: माध्य की मानक त्रुटि (एसईएम); कई तुलनाओं और टुकी परीक्षण के साथ मिश्रित मॉडल विश्लेषण। * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001 (बी) मानव साइट के व्यक्तिगत मूल्य प्रतिक्रिया में विविधता दिखाते हैं। तीन चूहों (20%) में अपेक्षाकृत उच्च बेसलाइन स्कोर था, और तीन चूहों (20%) ने प्रीटिबियल संवेदनशीलता में कोई बदलाव नहीं दिखाया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: न्यूरोमा की आकृति विज्ञान। 12 सप्ताह के न्यूरोमा की हिस्टोलॉजिकल छवियां। (ए) हेमटोक्सिलिन-ईओसिन धुंधला, (बी) मैसन का ट्राइक्रोम धुंधला, और (सी) न्यूरोफिलामेंट धुंधला। हरा तीर = टिबियल तंत्रिका न्यूरोमा के समीपस्थ है। नारंगी तीर = न्यूरोमा, अक्षतंतु के घूमने और फैसिकल्स के प्रसार द्वारा पहचाना जाता है। स्केल बार = 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: प्लांटर हिंद पंजे (टिबियल और सुरल तंत्रिका) के वॉन फ्रे। टिबियल तंत्रिका को सही तरीके से किया गया था और यांत्रिक संवेदनशीलता के पाठ्यक्रम का मूल्यांकन वॉन फ्रे द्वारा पिछले पंजे की प्लांटर सतह पर परीक्षण द्वारा किया गया था। टिबियल तंत्रिका द्वारा संचालित बाएं पंजे के मध्य भाग में हाइपोसेंसिटिविटी दिखाई दी। तंत्रिका द्वारा संचालित निचले हिस्से के पार्श्व भाग ने अतिसंवेदनशीलता दिखाई। बेसलाइन की तुलना में प्लांटर के मध्य और पार्श्व भागों ने संवेदनशीलता में कोई बदलाव नहीं दिखाया। एन = 15; त्रुटि पट्टियाँ: माध्य की मानक त्रुटि (एसईएम); कई तुलनाओं और टुकी परीक्षण के साथ मिश्रित मॉडल विश्लेषण। * = p < 0.05, ** = p < 0.01, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
टीएनटी मॉडल में टिबियल तंत्रिका को काटना और इसे पार्श्व और चमड़े के नीचे एक प्रीटिबियल स्थान पर स्थानांतरित करना शामिल है ताकि न्यूरोमा की संवेदनशीलता परीक्षण को सक्षम किया जा सके, इसके अलावा सुरल तंत्रिका पर प्लांटर हाइपरलेजेसिया भी शामिल है। टीएनटी मॉडल में, यह महत्वपूर्ण है कि न्यूरोमा की जगह शोधकर्ताओं को दिखाई देती है। इसलिए, एक अल्बिनो चूहे के तनाव को प्राथमिकता दी जाती है क्योंकि चमड़े के नीचे के सीवन त्वचा के माध्यम से आसानी से दिखाई देते हैं और सीवन का रंग अधिमानतः गहरा नीला या काला होना चाहिए।
जब सर्जरी आयोजित की जाती है और टिबियल तंत्रिका को उजागर किया जाता है, तो टिबियल तंत्रिका के विभाजन के स्थान (जैसे, समीपस्थ या डिस्टल) में भिन्नता होती है। यदि चूहों में समीपस्थ विभाजन होता है, तो यह संभव है कि केवल एक टिबियल तंत्रिका (चित्रा 5 बी) के बजाय टखने (चित्रा 5 ए) के समीपस्थ दो तंत्रिकाएं (औसत दर्जे की और पार्श्व प्लांटर तंत्रिका) पाई जा सकती हैं। यह महत्वपूर्ण है कि दोनों शाखाओं को काट दिया जाए और बदल दिया जाए ताकि सुरल तंत्रिका पर प्लांटर हाइपरलेजेसिया को प्रेरित किया जा सके। कोई केवल एक प्लांटर तंत्रिका को बदलने का विकल्प चुन सकता है; हालांकि, इस स्तर पर पार्श्व और औसत दर्जे के प्लांटर तंत्रिका के बीच अंतर आसानी से नहीं किया जाता है और परिणामों को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, दोनों नसों को बदलने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, कुछ चूहों में टिबियल तंत्रिका का अधिक दूरस्थ विभाजन हो सकता है, और केवल एक प्लांटर तंत्रिका को स्थानांतरित करना असंभव हो सकता है।
चित्रा 5: टिबियल तंत्रिका का समीपस्थ और डिस्टल विभाजन। टिबियल तंत्रिका के द्विभाजन (*) के स्तर में शारीरिक भिन्नता। (ए) टिबियल तंत्रिका का समीपस्थ विभाजन; (बी) टिबियल तंत्रिका का डिस्टल विभाजन। संक्षेप: एमपीएन = मेडियल प्लांटर तंत्रिका, एलपीएन = पार्श्व प्लांटर तंत्रिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
डोर्सी एट अल.17 द्वारा मूल पेपर में, समीपस्थ टिबियल तंत्रिका छोर के चारों ओर एक लिगेचर रखा जाता है और तंत्रिका को इस लिगेचर सीवन के माध्यम से बदल दिया जाता है और तय किया जाता है। चूंकि तंत्रिका के चारों ओर झुकाव कसना दर्दको प्रेरित कर सकता है, इस विधि में वर्णित एक विकल्प एपिन्यूरिनल सीवन का उपयोग करके तंत्रिका को ठीक करना है। यदि टिबियल तंत्रिका को काटा और प्रतिस्थापित किया जाता है, तो यह महत्वपूर्ण है कि तंत्रिका को चमड़े के नीचे ठीक करने के लिए सीवन को एपिन्यूरियम के माध्यम से रखा जाता है, न कि स्वयं तंत्रिका फैसिकल्स के माध्यम से, क्योंकि यह दर्द के उपायों को भी प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, किसी को त्वचा के माध्यम से सीवन रखने से बचना चाहिए, क्योंकि चूहे किसी भी दिखाई देने वाली सीवन को कुतरते हैं, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरोमा का विस्थापन होता है और इस प्रकार दर्द के उपायों के गैर-विश्वसनीय परिणाम होते हैं।
जब त्वचा बंद हो जाती है, तो कुतरने से बचने के लिए इंट्रा-एपिडर्मल सीवन का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण होता है जिसके परिणामस्वरूप एक खुला घाव होगा। इसके अलावा, टिबियल तंत्रिका को स्थानांतरित करने के बाद, यह त्वचा के नीचे एक अधिक सतही परत में स्थित होगा। सतही रूप से रखी गई तंत्रिका के साथ संयोजन में एक खुला घाव अवांछनीय है।
वॉन फ्रे माप न्यूरोमा साइट पर न्यूरोमा दर्द का परीक्षण करने और पिछले पंजे के पार्श्व पक्ष पर सुरल तंत्रिका पर प्लांटर हाइपरलेजेसिया का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। सीवन के गहरे रंग के कारण सर्जरी के बाद न्यूरोमा साइट दिखाई देती है। सुरल तंत्रिका अतिसंवेदनशीलता का परीक्षण करने के लिए, एक स्थान चुना जाना चाहिए जहां वॉन फ्रे मोनोफिलामेंट लागू होता है। यह पार्श्व खाद्य पैड के समीपस्थ या डिस्टल हो सकता है, लेकिन सर्जरी के बाद के हफ्तों में बेसलाइन माप और माप के दौरान लगभग एक ही स्थान होना चाहिए।
विधि का समस्या निवारण
यदि चूहे बेसलाइन माप के दौरान पहले से ही प्रीटिबियल क्षेत्र पर लागू सभी उत्तेजनाओं पर प्रतिक्रिया करते हैं, तो सुनिश्चित करें कि वे शांत और आराम से हैं, और यह कि वे परीक्षण क्षेत्र के लिए ठीक से अनुकूलित हैं। बेसलाइन माप को दोहराएं जब तक कि चूहे उत्तेजनाओं पर कम प्रतिक्रिया न करें। इसके अलावा, माप करते समय कोई इत्र नहीं पहनना बेहतर होता है। आदर्श रूप से, चूहे प्रीटिबियल उत्तेजना पर प्रतिक्रिया नहीं करते हैं जब सर्जरी से पहले 15 ग्राम मोनोफिलामेंट लागू किया जाता है। हालांकि, अगर चूहे शांत हैं, और 50% -100% चूहे अभी भी 15 ग्राम मोनोफिलामेंट पर प्रतिक्रिया करते हैं, तो इसे एक मोनोफिलामेंट में बदलें जिसमें बेसलाइन के दौरान 10% -20% प्रतिक्रिया दर हो। हालांकि, यदि मोनोफिलामेंट बदल जाता है, तो यह जांचने के लिए पहले एक पायलट प्रयोग करने की सलाह दी जाती है कि क्या टीएनटी चूहे मोनोफिलामेंट की इस कम ताकत पर प्रतिक्रिया करते हैं। टीएनटी मॉडल के प्रारंभिक पेपर में, न्यूरोमा साइट को पर्सपेक्स बॉक्स17 के निचले भाग में एक उद्घाटन के माध्यम से मोनोफिलामेंट को लागू करके मापा गया था। पायलट प्रयोगों में, चूहों को पिंजरे के नीचे से लागू होने पर प्रत्येक उत्तेजना पर प्रतिक्रिया करने के लिए पाया गया और मोनोफिलामेंट पर हमला करने की प्रवृत्ति थी। जब शोधकर्ता द्वारा बारीकी से रखा गया, तो चूहे शांत अवस्था में थे, जिसके परिणामस्वरूप बेसलाइन माप के दौरान मोनोफिलामेंट पर कम प्रतिक्रिया दर थी।
यदि समीपस्थ टिबियल तंत्रिका छोर चमड़े के नीचे की सुरंग में पर्याप्त दूर तक नहीं पहुंच सकता है, तो टिबियल तंत्रिका के पाठ्यक्रम का अधिक समीपस्थ पालन करें और तंत्रिका के चारों ओर किसी भी कोलेजनस और फैटी ऊतक को हटा दें। किसी भी मामूली तंत्रिका शाखाओं या वाहिकाओं को काट दें जो तंत्रिका को अपने आसपास तय रखते हैं। यह तंत्रिका को गति की एक विस्तृत श्रृंखला देगा जिसे अधिक पार्श्व रूप से बदल दिया जाएगा। ध्यान दें कि डोर्सी एट अल .17 द्वारा मूल पेपर में, तंत्रिका को अधिक पार्श्व रूप से बदल दिया गया था। पायलट प्रयोगों में, पार्श्व स्थिति तक पहुंचना असंभव पाया गया था। इसलिए, यह विधि न्यूरोमा साइट की प्रीटिबियल स्थिति का वर्णन करती है।
विधि की सीमाएँ
टीएनटी मॉडल की एक सीमा यह है कि सर्जरी में कई (सूक्ष्म) सर्जिकल चरणों का पालन करना शामिल है। एक और सीमा यह है कि टीएनटी मॉडल आसानी से चूहों में अनुवादित नहीं होता है। अनुभव से, चूहे 0.008 ग्राम मोनोफिलामेंट के आवेदन के साथ भी प्रीटिबियल क्षेत्र में लागू उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशील होते हैं।
मौजूदा/वैकल्पिक विधियों के संबंध में विधि का महत्व
टीएनटी मॉडल में, न्यूरोमा दर्द को सुरल तंत्रिका पर प्लांटर हाइपरलेजेसिया से स्वतंत्र रूप से परीक्षण किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध को एसएनआई मॉडल जैसे अन्य न्यूरोपैथिक दर्द मॉडल में भी प्रेरित किया जाता है, लेकिन यहां, न्यूरोमा दर्द का स्वतंत्र रूप से परीक्षण नहीं किया जा सकताहै। इसके अलावा, एसएनआई मॉडल में टिबियल और पेरोनेल तंत्रिका दोनों को काट दिया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मोटर फ़ंक्शन का अधिक नुकसान होता है जिसके परिणामस्वरूप पंजे21 की आंतरिक मांसपेशियां लकवाग्रस्त हो जाती हैं। क्योंकि टीएनटी मॉडल में केवल टिबियल तंत्रिका को डिस्टल स्तर पर काटा जाता है, पैरों की आंतरिक मांसपेशियां मोटर फ़ंक्शन का केवल नगण्य नुकसान दिखाती हैं।
विधि के संभावित अनुप्रयोग
पिछले शोध से पहले ही पता चला है कि टीएनटी मॉडल का उपयोग न्यूरोमा उपचार18,19,20 के लिए विभिन्न दर्द दवा, तंत्रिका कैप, या अन्य सर्जिकल उपकरणों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, दर्द में रुचि रखने वाले सभी शोध समूहों को टीएनटी मॉडल का उपयोग करने से संभावित लाभ हो सकता है, क्योंकि एक ही जानवर में दो अलग-अलग दर्द के तौर-तरीकों का परीक्षण किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों ने बताया कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है। हालांकि इस शोध कार्य को आंशिक रूप से एक्सोजेन द्वारा वित्तपोषित किया गया था, लेकिन कंपनी का अध्ययन के निष्पादन और परिणामों पर कोई प्रभाव नहीं था।
Acknowledgments
हम माइक्रोसर्जरी के दौरान सहायता के लिए सबाइन वर्सटीग और कॉमन एनिमल लेबोरेटरी (जेमेन्सचैपेलिज्क डायरेन लेबोरेट्रीयम) से अंजा वैन डेर सर और ट्रूडी ओस्टरवेल्ड-रोमिन को माइक्रोस्कोप और सर्जिकल रूम तैयार करने और जानवरों की देखभाल करने में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं।
इस शोध को एक्सोजेन द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
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