Summary
يصف هذا البروتوكول نموذج تبديل ورم العصب الظنبوبي ، والذي يستلزم آفة في العصب الظنبوبي مع تبديل لاحق لنهاية العصب القريب نحو وضع ما قبل الظنبوب أو الجانب تحت الجلد. يتم قياس الاختبار السلوكي لألم الورم العصبي وفرط التألم الأخمصي باستخدام خيوط فون فراي الأحادية.
Abstract
تبديل الورم العصبي الظنبوبي (TNT) هو نموذج للفئران يمكن فيه تقييم الأورام الخيفية في موقع الورم العصبي (العصب الظنبوبي) بشكل مستقل عن الألم الخيفي على السطح الأخمصي للمخلب الخلفي المعصب بواسطة العصب الجداري السليم. نموذج TNT هذا مناسب لاختبار علاجات آلام الورم العصبي ، مثل التفوق المحتمل لبعض العلاجات الجراحية المستخدمة بالفعل في العيادة ، أو لتقييم الأدوية الجديدة وتأثيرها على كل من طرق الألم في نفس الحيوان. في هذا النموذج ، يتم إجراء آفة بعيدة (neurotmesis) في العصب الظنبوبي ، ويتم نقل نهاية العصب القريب وتثبيتها تحت الجلد وقبل الظنبوب لتمكين تقييمات موقع الورم العصبي باستخدام خيوط أحادية Von Frey 15 جم. لتقييم الألم الخيفي على العصب الجدري ، يمكن استخدام خيوط Von Frey الأحادية عبر طريقة أعلى لأسفل في المنطقة الجانبية الأخمصية للمخلب الخلفي. بعد قطع العصب الظنبوبي ، تتطور فرط الحساسية الميكانيكية في موقع الورم العصبي في غضون أسبوع واحد بعد الجراحة وتستمر على الأقل حتى 12 أسبوعا بعد الجراحة. يتطور الألم الخيفي على السطح الأخمصي المعصب في الجدارية في غضون 3 أسابيع بعد الجراحة مقارنة بالطرف المقابل. في الأسبوع 12 ، يتشكل ورم عصبي على الطرف القريب من العصب الظنبوبي المقطوع ، ويشار إليه بتشتت ودوامات المحاور. بالنسبة لجراحة نموذج TNT ، يجب اتباع خطوات جراحية حرجة (دقيقة) متعددة ، وينصح ببعض ممارسات الجراحة تحت التخدير النهائي. بالمقارنة مع نماذج آلام الأعصاب الأخرى ، مثل نموذج إصابة العصب الذي تم تجنيبه ، يمكن اختبار الألم الخيفي فوق موقع الورم العصبي بشكل مستقل من فرط حساسية العصب الجداري في نموذج TNT. ومع ذلك ، يمكن اختبار موقع الورم العصبي فقط في الفئران ، وليس في الفئران. يمكن أن تساعد النصائح والتوجيهات الواردة في هذا البروتوكول مجموعات البحث التي تعمل على الألم على تنفيذ نموذج TNT بنجاح في منشآتها.
Introduction
كل جرح ، يتراوح من التمزقات البسيطة إلى بتر الأطراف بالكامل ، مصحوب بدرجات متفاوتة من إصابة الأعصاب الطرفية. يمكن أن تؤدي إصابة الأعصاب هذه إلى تكوين ورم عصبي ، وهو تشابك غير منظم للألياف العصبية المنبثقة. تصبح الأورام العصبية مؤلمة في 8٪ -30٪ من المرضى ، مما يؤثر بشدة على نوعية حياتهم1،2،3،4،5. بعد بتر الأطراف ، يتطور ألم الورم العصبي في 50٪ من المرضى6،7،8. تشمل الأعراض المبلغ عنها الرقة ، والألم التلقائي ، والألم الخيفي ، وفرط التألم ، وفرط الحساسية الميكانيكية أو الحرارية في المنطقة المعصبة9. عندما لا يتم علاجها بشكل كاف في غضون عام واحد ، يمكن أن يتطور ألم الورم العصبي إلى حالة الألم المزمن ، مما يؤدي إلى عبء مجتمعي مرتفع والتكاليف الطبية المرتبطةبه 10،11،12،13،14. بسبب ضعف فعالية التدخلات الدوائية الحالية ، يفضل علاج ألم الورم العصبي عن طريق الاستئصال الجراحي للورم العصبي المؤلم ، وعلاج العصب بتقنيات جراحية مختلفة ، كما هو موضح في الأدبيات15. من المهم ملاحظة أن تخفيف الألم الكامل أمر نادر الحدوث ، وغالبا ما يزداد الألم سوءا بمرور الوقت ، ولا يستفيد 40٪ من المرضى من الجراحة ، مما يشير إلى أن هناك حاجة إلى علاجات جديدة 1,16.
يساعد نموذج الفئران الموحد لألم الورم العصبي في فهم الآليات التي تدفع ألم الورم العصبي ، وقد يساعد في تحديد علاجات جديدة أو تقييم العلاجات الحالية المستخدمة في العيادة. تم وصف نموذج تبديل الورم العصبي الظنبوبي (TNT) لأول مرة بواسطة Dorsi et al. في 200817 وتم استخدامه من قبل مجموعات بحثية مختلفة18،19،20. الهدف العام من هذه الطريقة هو أن تكون قادرا على اختبار تقنيات العلاج المختلفة لألم الورم العصبي. ميزة النموذج على ، على سبيل المثال ، نموذج إصابة العصب المجنبة (SNI)21 ، هو أنه يسمح باختبار الأورام الخيفية في موقع الورم العصبي. وذلك لأن النموذج يتضمن نقل نهاية العصب القريب للعصب الظنبوبي إلى موضع ما قبل الظنبوب تحت الجلد ، حيث يمكن فحصه باستخدام خيوط فون فراي الأحادية. علاوة على ذلك ، يتطور الألم الخيفي على السطح الأخمصي للمخلب الخلفي المعصب بواسطة العصب الجداري السليم ، والذي يمكن تقييمه بشكل مستقل عن ألم الورم العصبي في نفس الحيوان. هذا مشابه لأعراض ألم الورم العصبي لدى المرضى ، حيث يحدث أحيانا ألم الأعصاب المستمر بعد إزالة ورم عصبي مؤلم بسبب الأعصاب المجاورة22. علاوة على ذلك ، فإن الألم الخيفي على العصب المقطوع المصاب بورم عصبي هو طريقة ألم مختلفة عن الألم الخيفي على العصب المجاور السليم. وبالتالي ، فإن هذا النموذج يسهل تقييم تأثير العلاجات الجديدة على كل من الألم الخيفي الموجود في موقع الورم العصبي وألم الأعصاب الأكثر انتشارا الذي تم اختباره في السطح الأخمصي للمخلب الخلفي. نظرا لأن الجراحة التي يتم إجراؤها لإنشاء نموذج TNT يمكن أن تكون صعبة ، فإن هذه الورقة توضح الإجراء لدعم الباحثين الذين ينفذون النموذج في منشآتهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء هذا البحث وفقا ل IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) والمبادئ التوجيهية للبحوث الحيوانية ، رقم المشروع AVD1150020198824.
1. قياسات خط الأساس فون فراي
- قبل الجراحة ، قم بإجراء قياسات خط الأساس وفقا لإجراء اختبار Von Frey ، الموضح أدناه في القسم 5 والقسم 6.
2. التخدير والتحضير
ملاحظة: أجريت هذه الدراسة على 15 من ذكور فأر Sprague Dawley التي كان عمرها 12 أسبوعا.
- تخدير الحيوانات عن طريق الحث مع 5 ٪ إيزوفلوران والحفاظ على التخدير مع 2 ٪ -3 ٪ إيزوفلوران.
ملاحظة: عادة ما تؤدي الصيانة التي تحتوي على إيزوفلوران بنسبة 2٪ إلى تخدير كاف وتنفس تلقائي ، دون الحاجة إلى التنبيب الرغامي أو التهوية الميكانيكية. - تحقق من ردود أفعال الحيوانات عن طريق قرص القدم بالملاقط. تأكد من أن الحيوان لا يستجيب قبل المتابعة. احلق مجال الجراحة من الركبة إلى الكاحل باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية وضع مرهم العيون على العينين لمنع الجفاف. حقن 0.5 ملغ/ كغ من كاربروفين مسكن تحت الجلد في منطقة البطن.
- ضع الجرذ المخدر على ظهره مع رأسه إما إلى اليسار أو اليمين والساق المراد تشغيلها بالقرب من الجراح. قم بتدوير الطرف الخلفي السفلي بحيث يواجه المليولوس الإنسي لأعلى. ضع الجرذ تحت مجهر جراحي مجسم مع تكبير 6x.
- تطهير المنطقة المحلوقة بثلاث جولات متناوبة من فرك اليود متبوعا بالكحول. ضع ورقة معقمة مع ثقب جراحي على الساق ، بحيث يكون حقل المنطوق فقط مرئيا. تأكد من الحفاظ على هذه الظروف المعقمة أثناء الجراحة.
3. الجراحة
- ضع قطعة قطن صغيرة أسفل الكاحل من أجل الحفاظ على مجال الجراحة أفقيا. حدد موقع الركبة وقم بعمل شق طولي برفق من 1-2 سم باستخدام مشرط على الجانب الإنسي من المخلب الخلفي من منتصف ربلة الساق إلى الكاحل. إذا لزم الأمر ، افتح الجلد وتحت الجلد بشكل أكبر بالمقص الصغير حتى تصبح طبقات العضلات مرئية.
- حدد الحزمة الوعائية العصبية السطحية على أنها خطان أو ثلاثة خطوط بيضاء وخط أرجواني / أحمر أكثر سمكا ، وأحيانا مع فروع ثانوية ، يمكن أن تتحرك بحرية فوق طبقات العضلات. باستخدام الكي الكهربائي (انظر جدول المواد) ، تخثر أي نزيف نشط أو ناز في مجال المنطوق. احرص على عدم إتلاف الحزمة الوعائية العصبية.
- تشريح بصراحة لفتح اللفافة بين عضلات الساق ، فقط خلف الحزمة الوعائية العصبية السطحية من 3.2. بين لفافة العضلات ، يمكن العثور على العصب الظنبوبي. يبلغ حجم العصب الظنبوبي حوالي ثلاثة أضعاف حجم العصب السطحي في الحزمة الوعائية العصبية. استخدم عظم الظنبوب كمعلم إضافي (يقع العصب الظنبوبي خلف عظم الظنبوب).
- التعرف على العصب الظنبوبي وتشعبه.
ملاحظة: عادة ما يكون التشعب مرئيا بخط أخف طوليا فوق العصب. - تشريح بعناية العصب الظنبوبي خالية من حزم الأوعية الدموية المحيطة. قم بإجراء التشريح عن طريق تحريك العصب الظنبوبي بصراحة وقطع الأنسجة المكشوفة التي تظهر بعض التمدد أثناء تحريك العصب الظنبوبي.
ملاحظة: إذا تم ربط العصب الظنبوبي بالأوردة المتقاطعة بعد التشريح ، فيمكن تخثر هذه الأوردة من أجل كشف العصب الظنبوبي بأكمله. احرص على عدم تخثر حزمة الظنبوب نفسها. - كشف العصب الظنبوبي عن قرب حتى يختفي تحت طبقة العضلات المتقاطعة. في هذه المرحلة ، يبدو أن العصب الظنبوبي يغوص بعمق أكبر في المخلب الخلفي باتجاه الركبة. كشف العصب الظنبوبي بعيدا حتى الكاحل.
ملاحظة: عندما يتعرض العصب الظنبوبي بشكل بعيد ، ستزداد كمية ألياف الكولاجين المتقاطعة (أي الألياف المتعامدة مع اتجاه الألياف العصبية). يجب قطع ألياف الكولاجين هذه لتمكين الطول الكافي لنقل العصب الظنبوبي.- عندما يتعرض العصب الظنبوبي بأكمله ، ضع طبقات العضلات مرة أخرى لتجنب جفاف العصب. إذا كان العصب يجف (أي يصبح أكثر صلابة ومملة وتجعدا) ، ولا يكفي تغطيته بطبقات العضلات ، أضف قطرات من المحلول الملحي لترطيبه.
- باستخدام أداة الجراحة المجهرية الحادة ، ويفضل أن يكون حامل إبرة دقيقة ، قم بتشريح الجلد قبل الظنبوب من طبقة العضلات تحت الجلد من أجل إنشاء نفق تحت الجلد. للقيام بذلك ، ارفع الجلد وادفع الطرف الحاد إلى الأنسجة ، بالتوازي مع الجلد. تأكد من أن نهاية النفق تقع قبل الظنبوب أو بشكل جانبي لضمان سهولة الوصول إلى المنطقة لاختبار الورم العصبي.
- زيادة الأيزوفلوران إلى 5٪. العودة إلى العصب الظنبوبي وفضحه (أي العودة إلى المكان الموضح في الخطوة 3.6). قطع العصب الظنبوبي (أي كلا الفرعين الأخمصيين) في المستوى البعيد بالقرب من الكاحل. خفض الأيزوفلوران إلى المستوى الطبيعي من 2٪ -3٪.
- قم بتغيير تكبير المجهر إلى 10x أو 16x. حدد العصب فوق العصبي الظنبوبي القريب من القطع الذي تم إجراؤه في الخطوة 3.8 ، أو في حالة التشعب الأقرب للعصب الظنبوبي ، حدد العصب فوق العصبي لكل من الفروع الأخمصية الإنسية والجانبية القريبة من القطع في الخطوة 3.8.
ملاحظة: يكون epineurium أكثر بياضا وثباتا مقارنة بالألياف العصبية الموجودة بداخله ، والتي تكون أكثر صفراء وناعمة. - ضع بعناية 8-0 خياطة النايلون (انظر جدول المواد) من خلال epineurium من نهاية العصب القريب عن طريق عقد epineurium بعناية مع ملاقط ووضع الإبرة بين العصب و epineurium مع لدغة من حوالي 0.5 ملم. اسحب الخيط من خلال وخذ لدغة بالإبرة تحت الجلد في نهاية النفق تحت الجلد المصنوع في الخطوة 3.7. اصنع عقدة ، والتي ستنقل العصب بشكل جانبي إلى النفق تحت الجلد.
ملاحظة: إذا كان كلا الفرعين الأخمصيين يشتركان في عصبة عصبية مشتركة ، فيجب أن تكفي خياطة واحدة. إذا كان كلا الفرعين الأخمصيين لهما عصبة خاصة بهما ، فيجب تثبيت كل عصبة على حدة. تجنب وضع خياطة من خلال الجلد; فقط إصلاحه تحت الجلد. - ضع خياطة أكثر سمكا بلون غامق (يفضل أن يكون خياطة زرقاء أو سوداء 4-0) تتدفق إلى نهاية العصب المثبت ، ولا تخترق الجلد. تأكد من أن الخيط مرئي من خارج الجلد. تحقق مما إذا كان العصب يبقى في مكانه بعد تحريك المخلب والعضلات. قطع نهايات خياطة مع نهاية خياطة أطول قليلا على 4-0 من على 8-0 خياطه.
- قم بتغيير تكبير المجهر مرة أخرى إلى 6x. أغلق الجلد بخيوط داخل البشرة باستخدام 8-0 خياطة وتنظيف البشرة بلطف مع 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم باستخدام مسحة القطن.
4. العلاج بعد الجراحة
- ضع الفئران في قفص نظيف تحت منشفة ورقية في وضع مريح. إذا كانت الغرفة باردة ، ضع وسادة حرارة أسفل جزء من القفص (فقط تحت جزء من القفص حيث يجب أن يكون الحيوان قادرا على الهروب من الحرارة عند الحاجة). ضمان سهولة الوصول إلى الطعام والماء.
- لا تترك الفئران بعد الجراحة دون مراقبة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. يمكن إعادة الفئران إلى شركة الحيوانات الأخرى عندما يتعافى تماما من التخدير بعد الجراحة. هذا عادة ما يكون بعد 1 ساعة وعندما يظهر الجرذ نمط المشي الطبيعي والسلوك.
- بعد 24 ساعة و48 ساعة من الجراحة، يتم تطبيق جرعة 0.5 ملغ/كغ من كاربروفين تحت الجلد (منطقة البطن) لعلاج آلام ما بعد الجراحة.
5. اختبار فون فراي للجانب الأخمصي من الكفوف الخلفية
ملاحظة: يتم إجراء اختبار Von Frey (الخطوة 5 و 6) قبل الجراحة (لقياس خط الأساس) ، ومن 3 أيام بعد الجراحة.
- ضع الفئران في أقفاص سفلية سلكية شبكية قبل 1 أسبوع من قياس خط الأساس ، أو قبل أسبوعين من الجراحة ، لضمان التأقلم مع بيئة الاختبار.
- ابدأ بمقاييس خط الأساس قبل 1 أسبوع على الأقل من الجراحة. تأكد من إجراء ثلاثة قياسات أساسية مستقلة في أيام منفصلة.
- تحقق من أن الفئران هادئة في الأقفاص السفلية السلكية الشبكية. ضع سلسلة من خيوط Von Frey الأحادية بمقياس لوغاريتمي عمودي على السطح الأخمصي للمخلب الخلفي.
- من أجل تحفيز العصب الجداري (فرط الحساسية) ، ضع الشعيرات الأحادية على الجانب الجانبي بالقرب من حدود الشعر. تجنب لمس وسادات القدم لأنها أكثر حساسية.
- لتحفيز العصب الظنبوبي (نقص الحساسية) ، ضع الشعيرات الأحادية في منتصف السطح الأخمصي للمخلب الخلفي. إذا تم تطبيق الشعيرات الأحادية في المنطقة الإنسية ، فقد يحفز ذلك أيضا العصب الصافن ، وهو فرع من العصب الفخذي (الشكل 1). تجنب لمس وسادات القدم.
- ابدأ بحيدة 4 جم. ضع قوة كافية على الشعيرات الأحادية بحيث ينحني الشعر ويمسك لمدة 3 ثوان ، ثم تحقق من استجابات الحيوان على الشعيرات الأحادية. الاستجابة الإيجابية هي الانسحاب المفاجئ للمخلب ، أو الخفقان المفاجئ ، أو لعق المخلب المفاجئ ، أو النطق. في بعض الحالات ، يتحرك الجرذ ويحاول العثور على / مهاجمة الشعيرات الأحادية.
- اختر الشعيرات الأحادية التالية بناء على الاستجابة للمثير عبر الطريقة23 لأعلى لأسفل. على سبيل المثال ، إذا استجاب الجرذ ، حفز بعد ذلك مع حيدة 2 غرام ؛ إذا لم يستجب الجرذ ، حفز مع حيدة 6 غرام ، وهلم جرا. في المجموع ، تطبيق 5-10 محفزات اعتمادا على رد الفعل.
6. اختبار فون فراي لموقع الورم العصبي
- التعامل مع الحيوانات يوميا لمدة لا تقل عن 5-7 أيام قبل التدابير الأساسية أو 2 أسابيع قبل الجراحة. تأكد من احتجاز الحيوانات كما هو موضح في الخطوة 6.2 ، بحيث تكون مريحة مع الوضع.
- امسك الفئران مع توجيه أنفها نحو طية الكوع. إذا تم وضع الجرذ في اليد اليمنى ، فيجب أن يتدلى مخلبه الخلفي الأيسر بحرية بين الإبهام الأيمن والسبابة (مساحة الويب الأولى). إذا تم وضع الجرذ في اليد اليسرى ، فيجب أن يتدلى مخلبه الخلفي الأيمن بحرية بين الإبهام الأيسر والسبابة.
- ابدأ بمقاييس خط الأساس قبل 1 أسبوع على الأقل من الجراحة. تأكد من إجراء ثلاثة قياسات أساسية مستقلة في أيام منفصلة.
- تحقق من أن الفئران هادئة ومريحة أثناء احتجازها. عند خط الأساس ، ضع الشعيرات الأحادية 15 جم برفق على السطح الظنبوبي للمخلب الخلفي المكشوف. بعد الجراحة ، ضع حيدة 15 جم على الخيط المرئي (على سبيل المثال ، في موقع الورم العصبي). ضع قوة كافية على الشعيرات الأحادية بحيث ينحني الشعر ويمسك لمدة 1 ثانية.
- سجل رد الفعل على كل مثير. تتضمن خيارات رد الفعل عدم وجود رد فعل ، والانسحاب البطيء ، والانسحاب السريع ، والنطق. سجل الاستجابة على أنها 0 نقطة لعدم وجود رد فعل ونقطة واحدة للسحب البطيء أو السحب السريع أو النطق.
- كرر خمس مجموعات من خمسة تطبيقات للخيوط الأحادية ، مع 2-3 ثوان بين كل تطبيق و 2-3 دقائق أو أكثر بين المجموعات الخمس. في المجموع ، يجب أن يكون لكل مخلب خلفي 25 تطبيقا للخيوط الأحادية مع استجابات مسجلة.
7. استعادة العينات للأنسجة والتحضير
ملاحظة: يتم إجراء الفحص النسيجي بعد 12 أسبوعا من الجراحة الأولية.
- حث على التخدير وإعداد الحيوانات كما هو موضح في الخطوات 2.2 و 2.3 و 2.4.
- قم بعمل شق برفق من 2-3 سم باستخدام مشرط فوق الندبة التي تم إجراؤها بواسطة الجراحة الأولية ، ولكن احرص على عدم قطع عميق جدا حيث يتم وضع العصب بشكل سطحي.
- تحديد موضع الورم العصبي ، وتشريح بعناية الورم العصبي والعصب خالية من الأنسجة الندبية المحيطة ، ووضع الورم العصبي المحصود في المثبت. لتقييم مورفولوجيا الورم العصبي ، يفضل أن يكون النسيج مضمنا طوليا في البارافين أو راتنجات الايبوكسي كما وصفه Tork et al.18.
- بعد حصاد الأنسجة ، القتل الرحيم للفئران تحت التخدير النهائي (5 ٪ إيزوفلوران) عن طريق ثقب القلب أو قطع الرأس.
ملاحظة: ينصح أولا بحصاد الورم العصبي قبل قتل الفئران ، لأنه من الأسهل بعد ذلك التمييز بين الورم العصبي والأنسجة المحيطة به في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أظهر التقييم في موقع الورم العصبي زيادة الحساسية لتطبيق خيوط 15 g von Frey الأحادية. عند خط الأساس ، استجابت الفئران عادة ل 10٪ -15٪ (± 13٪) من 25 تطبيقا لخيوط أحادية 15 جم. ارتفع معدل الاستجابة إلى 45٪ -50٪ (± 24٪) 1 أسبوع بعد جراحة TNT. على الجانب المقابل، كان عدد الاستجابات بعد الجراحة مشابها لتلك الموجودة عند خط الأساس (الشكل 2 أ). حوالي 20 ٪ من الفئران لم تتطور ورم عصبي مؤلم. ولم يزد معدل الاستجابة مقارنة بخط الأساس (الشكل 2 باء). هذا مشابه للحالة البشرية ، حيث لا يصاب جميع المرضى (50٪ بعد البتر) بالألم بعد تكوين ورم عصبي. أصيبت جميع الفئران بورم عصبي في نهاية جذع العصب الظنبوبي المتقاطع والمنقول بعد 12 أسبوعا من الجراحة (الشكل 3). تميز هذا الورم العصبي بدوامات محاور عصبية و microfascicles داخل ترسبات الكولاجين.
يقلل استئصال العصب الظنبوبي من الحساسية الميكانيكية في منتصف الجانب الأخمصي من المخلب الخلفي ، معصب بواسطة العصب الظنبوبي (الشكل 1). كان نقص الحساسية موجودا في أسبوع واحد بعد الجراحة ، وكان مختلفا بشكل كبير عن الجانب المقابل وخط الأساس من 3 أسابيع بعد الجراحة ، وظل حتى 12 أسبوعا على الأقل بعد الجراحة (الشكل 4). في الجزء الجانبي من الجانب الأخمصي من المخلب الخلفي المعصب بواسطة العصب الجداري السليم ، طورت الفئران فرط الحساسية الميكانيكية التي كانت مختلفة بشكل كبير عن الجانب المقابل وخط الأساس من 1 أسبوع بعد الجراحة (الشكل 4). استمر فرط الحساسية هذا لمدة 12 أسبوعا على الأقل بعد الجراحة. في المخلب المقابل ، لم تتأثر الحساسية الميكانيكية مقارنة بخط الأساس في المناطق المعصبة إما بواسطة العصب الجداري أو الظنبوبي (الشكل 4).
الشكل 1: توزيع العصب على الجانب الأخمصي من المخلب الخلفي. الأحمر = توزيع العصب الجداري (الجانبي) ؛ الأرجواني = توزيع العصب الظنبوبي (الأوسط) ؛ الأخضر = توزيع العصب الصافن (الإنسي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: فون فراي من موقع الورم العصبي. تم نقل العصب الظنبوبي وتم تقييم مسار الحساسية الميكانيكية على موقع الورم العصبي باستخدام خيوط أحادية 15 جم مطبقة في خمس مجموعات من خمسة تطبيقات لكل منها ، مع ما مجموعه 25 تطبيقا. يتم تسجيل الاستجابة كنقطة واحدة. (أ) أظهر موقع الورم العصبي استجابة أعلى بكثير بعد 1 أسبوع من الجراحة مقارنة بخط الأساس والجانب المقابل. ن = 15 ؛ أشرطة الخطأ: الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) ؛ تحليل نموذج مختلط مع مقارنات متعددة واختبار Tukey. * = ع < 0.05 ، ** = ع < 0.01 ، *** = ع < 0.001. (ب) تظهر القيم الفردية للموقع المماثل تنوعا في التفاعل. كان لدى ثلاثة فئران (20٪) درجة أساسية عالية نسبيا ، ولم تظهر ثلاثة فئران (20٪) أي تغييرات في حساسية ما قبل الظنبوب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مورفولوجيا الورم العصبي. صور نسيجية لورم عصبي عمره 12 أسبوعا. أ: تلطيخ الهيماتوكسيلين-إيزين، ب: تلطيخ ماسون ثلاثي الألوان، ج: تلطيخ الخيوط العصبية. السهم الأخضر = العصب الظنبوبي القريب من الورم العصبي. السهم البرتقالي = ورم عصبي ، يتم تحديده من خلال دوامات المحاور العصبية وانتشار الكراسات. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: فون فراي من المخلب الخلفي الأخمصي (العصب الظنبوبي والجداري). تم نقل العصب الظنبوبي وتم تقييم مسار الحساسية الميكانيكية من خلال اختبار فون فراي على السطح الأخمصي للمخلب الخلفي. أظهر الجزء الأوسط من المخلب الخلفي المماثل الذي يعمل بواسطة العصب الظنبوبي نقص الحساسية. أظهر الجزء الجانبي من المخلب الخلفي المماثل الذي يعمل بواسطة العصب الجداري فرط الحساسية. لم تظهر الأجزاء الوسطى والجانبية من المخلب الخلفي المقابل لأخمصي أي تغييرات في الحساسية مقارنة بخط الأساس. ن = 15 ؛ أشرطة الخطأ: الخطأ القياسي للمتوسط (SEM) ؛ تحليل نموذج مختلط مع مقارنات متعددة واختبار Tukey. * = ع < 0.05 ، ** = ع < 0.01 ، *** = ع < 0.001 ، **** = ع < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
يتضمن نموذج TNT قطع العصب الظنبوبي ونقله بشكل جانبي وتحت الجلد إلى موقع ما قبل الظنبوب لتمكين اختبار حساسية الورم العصبي ، بالإضافة إلى فرط التألم الأخمصي على العصب الجداري. في نموذج TNT ، من المهم أن يكون مكان الورم العصبي مرئيا للباحثين. لذلك ، يفضل سلالة الفئران البيضاء لأن الغرز تحت الجلد يمكن رؤيتها بسهولة من خلال الجلد ويفضل أن يكون لون الخيط أزرق داكن أو أسود.
عندما يتم إجراء الجراحة ويتعرض العصب الظنبوبي ، يكون هناك اختلاف في المكان (على سبيل المثال ، القريب أو البعيد) لتشعب العصب الظنبوبي. إذا كان لدى الفئران تشعب قريب ، فمن الممكن العثور على عصبين (العصب الأخمصي الإنسي والجانبي) بالقرب من الكاحل (الشكل 5 أ) ، بدلا من عصب ظنبوب واحد فقط (الشكل 5 ب). من المهم أن يتم قطع كلا الفرعين ونقلهما من أجل إحداث فرط التألم الأخمصي على العصب الجداري. يمكن للمرء أن يختار تبديل العصب الأخمصي واحد فقط. ومع ذلك ، فإن التمييز بين العصب الأخمصي الجانبي والإنسي ليس من السهل على هذا المستوى ويمكن أن يؤثر على النتائج. لذلك ، ينصح بتبديل كلا الأعصاب. علاوة على ذلك ، قد يكون لدى بعض الفئران تشعب بعيد للعصب الظنبوبي ، وقد يكون من المستحيل نقل عصب أخمصي واحد فقط.
الشكل 5: التشعب القريب والبعيد للعصب الظنبوبي. الاختلاف التشريحي في مستوى التشعب (*) للعصب الظنبوبي. أ: التشعب القريب للعصب الظنبوبي؛ ب: التشعب البعيد للعصب الظنبوبي. الاختصارات: MPN = العصب الأخمصي الإنسي ، LPN = العصب الأخمصي الجانبي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الورقة الأصلية التي كتبها Dorsi et al.17 ، يتم وضع رباط حول نهاية العصب الظنبوبي القريب ويتم نقل العصب وتثبيته عبر خياطة الرباط هذه. نظرا لأن الرباط حول العصب يمكن أن يسبب ألم الانقباض24 ، فإن البديل الموصوف في هذه الطريقة هو إصلاح العصب باستخدام الغرز فوق العصبية. إذا تم قطع العصب الظنبوبي ونقله ، فمن المهم أن يتم وضع الخيط لإصلاح العصب تحت الجلد من خلال العصب وليس الكراسات العصبية نفسها ، لأن هذا يمكن أن يؤثر على تدابير الألم أيضا. بالإضافة إلى ذلك ، يجب على المرء تجنب وضع الخيط عبر الجلد ، حيث تميل الفئران إلى نخر أي خيوط مرئية ، مما يؤدي إلى إزاحة الورم العصبي وبالتالي نتائج غير موثوقة لمقاييس الألم.
عندما يكون الجلد مغلقا ، من المهم أيضا استخدام الغرز داخل البشرة لتجنب القضم الذي سيؤدي إلى جرح مفتوح. علاوة على ذلك ، بعد نقل العصب الظنبوبي ، سيتم وضعه في طبقة أكثر سطحية تحت الجلد مباشرة. الجرح المفتوح مع العصب السطحي غير مرغوب فيه.
يمكن إجراء قياسات فون فراي لاختبار ألم الورم العصبي في موقع الورم العصبي واختبار فرط التألم الأخمصي على العصب الجداري ، على الجانب الجانبي من المخلب الخلفي. يكون موقع الورم العصبي مرئيا بعد الجراحة بسبب اللون الداكن للخياطة. لاختبار فرط حساسية العصب الجداري ، يجب اختيار موقع واحد حيث يتم تطبيق خيوط Von Frey الأحادية. يمكن أن يكون هذا قريبا أو بعيدا عن فوطة الطعام الجانبية ، ولكن يجب أن يكون في نفس المكان تقريبا أثناء القياسات والقياسات الأساسية في الأسابيع التالية للجراحة.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها من الطريقة
إذا تفاعلت الفئران مع جميع المحفزات المطبقة على منطقة ما قبل الظنبوب بالفعل أثناء قياسات خط الأساس ، فتأكد من أنها هادئة ومريحة ، وأنها تتأقلم بشكل صحيح مع منطقة الاختبار. كرر القياس الأساسي حتى تتفاعل الفئران بشكل أقل مع المحفزات. بالإضافة إلى ذلك ، يفضل عدم ارتداء أي عطر أثناء إجراء القياسات. من الناحية المثالية ، لا تتفاعل الفئران مع التحفيز pretibial عندما يتم تطبيق حيدة 15 غرام قبل الجراحة. ومع ذلك ، إذا كانت الفئران هادئة ، ولا يزال 50٪ -100٪ من الفئران يتفاعلون مع الشعيرات الأحادية التي يبلغ وزنها 15 جراما ، فقم بتغييرها إلى خيوط أحادية لها معدل استجابة يتراوح بين 10٪ و 20٪ أثناء خط الأساس. ومع ذلك ، إذا تم تغيير الشعيرات الأحادية ، ينصح أولا بإجراء تجربة تجريبية لاختبار ما إذا كانت فئران TNT تتفاعل مع هذه القوة المنخفضة للخيوط الأحادية. في الورقة الأولية لنموذج TNT ، تم قياس موقع الورم العصبي عن طريق تطبيق الشعيرات الأحادية من خلال فتحة في الجزء السفلي من مربعPerspex 17. في التجارب التجريبية ، وجد أن الفئران تتفاعل مع كل حافز عند تطبيقها عبر قاع القفص وتميل إلى مهاجمة الشعيرات الأحادية. عندما تمسك بها الباحث عن كثب ، كانت الفئران في حالة هدوء ، مما أدى إلى انخفاض معدل الاستجابة على الشعيرات الأحادية أثناء قياس خط الأساس.
إذا لم تتمكن نهاية العصب الظنبوبي القريب من الوصول إلى مسافة كافية في النفق تحت الجلد ، فاتبع مسار العصب الظنبوبي الأكثر قربا وقم بإزالة أي أنسجة كولاجينية ودهنية حول العصب. قطع أي فروع عصبية ثانوية أو أوعية تحافظ على العصب مثبتا في محيطه. هذا سيعطي العصب نطاقا أوسع من الحركة ليتم نقله بشكل جانبي. لاحظ أنه في الورقة الأصلية التي كتبها Dorsi et al.17 ، تم نقل العصب بشكل جانبي. في التجارب التجريبية ، وجد أنه من المستحيل الوصول إلى الوضع الجانبي. لذلك ، تصف هذه الطريقة موضع pretibial لموقع الورم العصبي.
حدود الطريقة
يتمثل أحد قيود نموذج TNT في أن الجراحة تتضمن خطوات جراحية متعددة (دقيقة) يجب اتباعها. قيد آخر هو أن نموذج TNT لا يترجم بسهولة إلى الفئران. من التجربة ، تميل الفئران إلى أن تكون حساسة إلى حد ما للمنبهات المطبقة في منطقة ما قبل الظنبوب ، حتى مع تطبيق حيدة 0.008 غرام.
أهمية الطريقة فيما يتعلق بالطرق الحالية / البديلة
في نموذج TNT ، يمكن اختبار ألم الورم العصبي بشكل مستقل عن فرط التألم الأخمصي على العصب الجداري. يحدث هذا الأخير أيضا في نماذج آلام الأعصاب الأخرى مثل نموذج SNI ، ولكن هنا ، لا يمكن اختبار ألم الورم العصبي بشكل مستقل21. بالإضافة إلى ذلك ، يتم قطع كل من العصب الظنبوبي والشظوي في نموذج SNI ، مما يؤدي إلى مزيد من فقدان الوظيفة الحركية مما يؤدي إلى شلل العضلات الداخلية للمخلب21. نظرا لأن العصب الظنبوبي فقط يتم قطعه على مستوى بعيد في نموذج TNT ، فإن العضلات الداخلية للقدمين لا تظهر سوى فقدان ضئيل للوظيفة الحركية.
التطبيقات المحتملة للطريقة
أظهرت الأبحاث السابقة بالفعل أنه يمكن استخدام نموذج TNT لاختبار العديد من أدوية الألم أو أغطية الأعصاب أو الأدوات الجراحية الأخرى لعلاج الورم العصبي18،19،20. ومع ذلك ، يمكن لجميع المجموعات البحثية المهتمة بالألم أن تستفيد من استخدام نموذج TNT ، حيث يمكن اختبار طريقتين مختلفتين للألم في نفس الحيوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أفاد المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح. على الرغم من أن هذا العمل البحثي تم تمويله جزئيا من قبل Axogen ، إلا أن الشركة لم يكن لها أي تأثير على تنفيذ الدراسة وعلى النتائج.
Acknowledgments
نود أن نشكر سابين فيرستيج على المساعدة أثناء الجراحة المجهرية وأنجا فان دير سار وترودي أوسترفيلد-رومين من مختبر الحيوانات المشتركة (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) لمساعدتهم في إعداد المجهر وغرفة الجراحة ورعاية الحيوانات.
تم تمويل هذا البحث من قبل Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
