Summary
Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC'ler) yerinde boyayarak tek bir CTC'nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.
Abstract
Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) kanser prognozu, tanısı ve anti-kanser tedavisinde önemlidir. CTC'ler nadir ve heterojen olduğu için CTC sayımı hasta hastalığını belirlemede hayati önem taşır. CTC'ler primer tümörden ayrılır, kan dolaşım sistemine girer ve potansiyel olarak uzak bölgelerde büyür, böylece tümörü metastaz yapar. CTC'ler primer tümöre benzer bilgiler taşıdığından, CTC izolasyonu ve müteakip karakterizasyonu kanserin izlenmesi ve teşhisinde kritik olabilir. Nadir CTC'lerin sayımı, afinite modifikasyonu ve klinik immünofloresan boyaması, gerekli elementleri yüksek hassasiyetle sağladıkları için CTC izolasyonu için güçlü yöntemlerdir. Mikroakışkan çipler, hastalar için ağrısız bir likit biyopsi yöntemi sunar. Bu çalışmada, CTC ayırma, analiz ve erken tanı için gerekli olan bir dizi işlevsellik ve hizmeti içeren, böylece biyomoleküler analiz ve kanser tedavisini kolaylaştıran çok yönlü bir CTC izolasyon platformu olan klinik mikroakışkan çipler için bir protokol listesi sunuyoruz. Program, nadir tümör hücresi sayımı, kırmızı kan hücresi lizizini içeren klinik hasta kan ön işlemesini ve mikroakışkan çipler üzerinde yerinde CTC'lerin izolasyonunu ve tanınmasını içerir. Program, tümör hücrelerinin veya CTC'lerin kesin sayımına izin verir. Ek olarak, program, çok yönlü mikroakışkan çipler ile CTC izolasyonunu ve çipler üzerinde yerinde immünofloresan tanımlamasını ve ardından biyomoleküler analizi içeren bir araç içerir.
Introduction
Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC'ler) kanser prognozu, tanısı ve anti-kanser tedavisinde önemlidir. CTC'ler nadir ve heterojen olduğu için CTC numaralandırması hayati önem taşır. Nadir CTC'lerin sayımı, afinite modifikasyonu ve klinik immünofloresan boyaması, CTC izolasyonu için güçlü tekniklerdir, çünkü gerekli unsurları yüksek duyarlılıkla sunarlar1. Normal kanla karışan nadir sayıda tümör hücresi, gerçek hasta kanını yakından taklit eder, çünkü 2-3 mL gerçek hasta kanı sadece 1-10 CTC içerir. Kritik bir deneysel problemi çözmek için, PBS'ye sokulan veya normal kanla karıştırılan çok sayıda tümör hücresi kullanmak yerine, nadir sayıda tümör hücresinin kullanılması, bir deney yaparken gerçeğe daha yakın olan düşük sayıda kan hücresi sağlar.
Kanser dünyada önde gelen ölüm nedenidir2. CTC'ler, kan ve lenfatik dolaşım sistemlerinde dolaşan orijinal tümörden dökülen tümör hücreleridir3. CTC'ler yeni bir hayatta kalma ortamına taşındıklarında, ikinci bir tümör olarak büyürler. Buna metastaz denir ve kanser hastalarında ölümlerin %90'ından sorumludur4. CTC'ler prognoz, erken tanı ve kanser mekanizmalarının anlaşılması için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, CTC'ler hasta kanında son derece nadir ve heterojendir 5,6.
Mikroakışkan çipler, tümörü istila etmeyen sıvı bir biyopsi sunar. Taşınabilir, düşük maliyetli ve hücre uyumlu bir ölçeğe sahip olma avantajına sahiptirler. CTC'lerin mikroakışkan çiplerle izolasyonu esas olarak iki tipte sınıflandırılır: antijen-antikor bağlanmasınadayanan 7,8,9 afinite tabanlı ve orijinal ve en yaygın kullanılan CTC izolasyon yöntemidir; ve tümör hücreleri ile kan hücreleri10,11,12,13,14,15 arasındaki boyut ve deforme olabilirlik farklılıklarını kullanan fiziksel tabanlı çipler etiketsizdir ve kullanımı kolaydır. Mikroakışkan çiplerin alternatif tekniklere göre avantajı, büyük elips mikrofiltrelerin fiziksel tabanlı yaklaşımının, CTC'leri yüksek yakalama verimliliği ile sıkıca yakalamasıdır. Bunun nedeni, elips mikro direklerin ince hat hattı boşlukları tünelleri halinde düzenlenmesidir. Çizgi-çizgi boşlukları, eşkenar dörtgen mikro direkler gibi mikro direkler tarafından oluşturulan geleneksel nokta-nokta boşluklarından farklıdır. CTC'lerin dalga çipi tabanlı yakalanması, hem fiziksel özellik tabanlı hem de afinite tabanlı izolasyonu birleştirir. Dalga çipi tabanlı yakalama, dairesel mikropostlar üzerinde kaplanmış anti-EpCAM antikoru ile 30 dalga şeklinde diziyi içerir. CTC'ler küçük boşluklar tarafından yakalanır ve büyük boşluklar akış hızını hızlandırmak için kullanılır. Kaçırılan CTC'lerin bir sonraki dizideki küçük boşlukları geçmesi gerekir ve çip16'nın içine entegre edilmiş afinite tabanlı izolasyon tarafından yakalanır.
Protokolün amacı, nadir sayıda tümör hücresinin sayımını ve mikroakışkan çiplerle CTC'lerin klinik analizini göstermektir. Protokol, CTC izolasyon adımlarını, az sayıda tümör hücresinin nasıl elde edileceğini, küçük elips filtrelerin, büyük elips filtrelerin ve yamuk filtrelerin klinik fiziksel ayrımını, afinite modifikasyonunu ve zenginleştirmeyi açıklar17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hasta kan örnekleri, Şanghay Tıp Üniversitesi'ne bağlı Longhua Hastanesi tarafından sağlandı.Protokol, Pekin Üniversitesi Üçüncü Hastanesi'nin insan araştırma etik komitesinin yönergelerini takip ediyor. Örneklerin araştırma amaçlı kullanılması için hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Kültürlenmiş tümör hücreleri ile yakalama verimliliğini kontrol etmek için ön deney
- Yakalama verimliliğini belirlemek için MCF-7, MDA-MB-231 ve HeLa tümör hücrelerini kültürleyin. Tümör hücresi süspansiyonunu seyreltin, tümör hücrelerinin sayısını sayın ve 1 mL PBS'de istenen hücre sayısı elde edilene kadar tekrarlayın.
- Hücreleri,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 1 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) başlangıç hücre sayısı ~ 1 x10 5 hücre olan bir hücre kültürü şişesinde kültürleyin. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de %5CO2 atmosferi ile inkübe edin.
- Hücre çizgileri% 95 birleşime kadar yapışkan tek tabakalar olarak büyüdüğünde, bunları Chen ve ark.16'da tarif edildiği gibi% 0.25 tripsin çözeltisi ile 2 dakika boyunca kültür kaplarından ayırın.
- Tümör hücrelerini kalsein ile boyayın. Kültür kabına 3 μL kalsein koyun ve kabı inkübatörde 30 dakika tutun. Ardından, tüm hücreleri tripsin ile sindirin.
- PBS'de kültürlenmiş tümör hücrelerini bir hücre sayma odası ile sayın ve 1 mL PBS başına 100 tümör hücresi elde edilene kadar seyreltin.
NOT: Hücre sayısını tam olarak numaralandırmak için, mikroskopla içindeki tümör hücresi sayısının beş olup olmadığını görmek için elde edilen hücre süspansiyonundan 50 μL alın. 50 μL hücre süspansiyonundaki gerçek tümör hücresi sayısına göre 100 tümör hücresi elde etmek için alınması gereken hücre süspansiyonunun hacmine karar verin.
- 0.5 mL / s, 1 mL / s, 2 mL / s, 3 mL / s, 4 mL / s ve 5 mL / s'lik çeşitli akış hızlarında bir şırınga pompalı bir şırınga kullanarak 1 mL PBS başına 100 tümör hücresi içeren hücre süspansiyonunu mikroakışkan çipe sokun. Çeşitli akış hızları için yakalama verimliliğini elde edin ve optimum akış hızını belirleyin.
- Çip üzerinde yakalanan ve çıkıştan dışarı akan tümör hücrelerinin sayısını sayın. Yakalama verimliliğini aşağıdaki gibi hesaplayın:
Yakalama verimliliği = Yakalanan hücre sayısı/(Yakalanan hücre sayısı + dışarı akan hücre sayısı) × %100 - 10'dan 100'e kadar farklı sayıda tümör hücresi için yakalama verimliliğini elde etmek için tekrarlayın (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
- Çip üzerinde yakalanan ve çıkıştan dışarı akan tümör hücrelerinin sayısını sayın. Yakalama verimliliğini aşağıdaki gibi hesaplayın:
- Nadir sayıda tümör hücresi için mikroakışkan çipi test edin ve doğrulayın. 1 mL PBS içinde seyreltilmiş 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10 tümör hücrelerini aspire etmek için bir mikropipet çektirme ile yapılan içi boş bir iğne kullanarak bu 10 numune süspansiyonunu mikroakışkan çiplere enjekte edin. Çip üzerinde yakalandıktan sonra her numune için tümör hücrelerinin sayısını tespit edin ve numaralandırın.
NOT: İçi boş iğne yaklaşık 3 cm uzunluğunda ve 1 mm dış çapındadır. - Normal kan örneklerine çivilenmiş tümör hücreleri için klinik deney öncesi testler yapın.
- Tümör hücrelerini kalsein ile boyayın ve ardından 5 μL PBS'de 100 tümör hücresini numaralandırın. Bu hücreleri 1 mL tam normal kan örneğine dökün. Bu hücreleri çipe yerleştirin ve çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını yeşil immünofloresan ile numaralandırın. Yukarıda açıklandığı gibi çip üzerinde in vivo numaralandırma gerçekleştirin ve yakalamadan sonra yakalama verimliliğini hesaplayın.
- 10'dan 90'a kadar dokuz ek tümör hücresi sayısı konsantrasyonu için adım 1.4.1'i tekrarlayın (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
- Adım 1.3'te açıklandığı gibi 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10 tümör hücrelerini boyamadan numaralandırın, 1 mL tam normal kana dökün, bu örnekleri mikroakışkan çipe ekleyin ve çip üzerindeki tümör hücrelerini yakalayın.
- Çipi Hoechst, CK-FITC ve CD45-PE ile boyayın. 20-30 μL PBS'ye 3-5 μL floresan boya koyun ve ardından bu çözeltiyi bir şırınga ile mikroakışkan çipe verin. Yakalama verimliliğini belirlemek için çip üzerinde yakalanan tümör hücrelerinin sayısını hem mavi hem de yeşil immünofloresan ile numaralandırın.
- Anti-EpCAM'in afiniteye dayalı yakalanması için mikroakışkan çipin modifikasyonunu gerçekleştirin.
NOT: Dalga çipi hem afinite tabanlı hem de fiziksel özellik tabanlı izolasyonu birleştirdiğinden, çipi ajanlarla değiştirin.- Çipin yüzeyini 45 dakika boyunca oda sıcaklığında etanol içinde 100 μL% 4 (h / h) 3-merkaptopropil trimetoksisilan ile değiştirin. Çipin iç yapısını, özellikle üst yüzeyin ve alt tabaka camının yapışmasını tahrip etmesi ihtimaline karşı bu çözeltiyi çipe dikkatli ve yavaş bir şekilde sokun.
NOT: Talaş yüzeyi merkaptosilan kullanılarak modifiye edilmiştir. Çip üzerinde meydana gelen etkileşimler kimyasal bağlarla belirlenir. Antijen ile modifiye edilmiş antikorun bağlanmasını gerçekleştirmek için kimyasal bağlar kurulur. Birbirine bağlanan kimyasal bağlar oluşturmak için çipin içinde çeşitli reaktifler modifiye edilir. Modifiye edilecek son reaktif, bir anti-epitelyal adezyon molekülüdür (anti-EpCAM). EpCAM'in tümör hücresi yüzey antijeni, CTC'lerin yakalanmasını gerçekleştirmek için çip içindeki anti-EpCAM ile birleşir. - Etanol 3x ile yıkayın. Çip üzerine 100 μL birleştirme maddesi N-y-maleimidobütiriloksi süksinimid ester (GMBS, 1 μM) ekleyin ve 30 dakika etkileşime girmesine izin verin.
- PBS 3x ile yıkayın. Yıkamak için çipe 1 mL PBS vermek için bir şırınga kullanın.
- Çipi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 30-40 μL 10 μg / mL nötravidin ile muamele edin, bu da hücrelerin GMBS'ye immobilizasyonuna yol açar ve ardından fazla avidini çıkarmak için PBS ile yıkayın.
- Çipi, %1 (a/h) BSA ile 100 μL PBS'de 10 μg/mL konsantrasyonda 3 μL anti-biyotinillenmiş EpCAM antikoru ile değiştirin. Bunu bir gecede saklayın.
- Çipin yüzeyini 45 dakika boyunca oda sıcaklığında etanol içinde 100 μL% 4 (h / h) 3-merkaptopropil trimetoksisilan ile değiştirin. Çipin iç yapısını, özellikle üst yüzeyin ve alt tabaka camının yapışmasını tahrip etmesi ihtimaline karşı bu çözeltiyi çipe dikkatli ve yavaş bir şekilde sokun.
2. Dolaşımdaki tümör hücrelerini (CTC'ler) numaralandırmak için çip üzerinde klinik deney
- Kırmızı kan hücreleri lizis (RBCL) solüsyonu kullanarak klinik kanser hastası kan örneklerini önceden işleyin veya bir şırınga kullanarak 2-3 mL kan örneğini doğrudan mikroakışkan çipe verin.
- Yaklaşık 30 dakika süren ön işlem gerçekleştirin. Antikoagülan tüplerde tam kan örnekleri toplayın. 2-3 mL kana 6-9 mL RBS lizis çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 5-8 dakika boyunca 111 x g'da santrifüjleyin ve kırmızı berrak sıvının üst tabakasını atın.
- Çip üzerindeki hücreleri aşağıda açıklandığı gibi yakalayın, boyayın, tanıyın ve numaralandırın.
- Çip üzerindeki hücreleri adım 1'de açıklandığı gibi yakalayın.Hoechst, CK-FITC ve CD45-PE kullanılarak yakalanan CTC'ler için çipi boyayın. CK-FITC, tümör hücreleri için spesifik bir boyadır ve CD45-PE, beyaz kan hücreleri içindir.
- 20 μL PBS'ye 3 μL CK-FITC ekleyin. Bunu şırıngaya yerleştirin ve seyreltilmiş CK-FITC'yi çipin üzerine pompalayın. 30 dakika lekelenmesine izin verin. Çipi yıkamak için çipin üzerine 300 μL PBS verin.
- 20 μL PBS'ye 3 μL CD45-PE ekleyin. Bunu şırıngaya yerleştirin ve seyreltilmiş CD45-PE'yi çipin üzerine pompalayın. 30 dakika bekletin. Çipi yıkamak için çipin üzerine 300 μL PBS verin.
- CTC'leri 20x veya 40x büyütmede ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu ile tanımlayın. CTC'ler hem mavi hem de yeşil floresan yayar ve beyaz kan hücreleri (WBC'ler) hem mavi hem de kırmızı floresan yayar. Hem mavi hem de yeşil floresanslı CTC'leri ve hem mavi hem de kırmızı floresanlı WBC'leri tanımlayın.
- İmmünofloresan görüntülerden, çip üzerinde yakalanan CTC'lerin sayısını numaralandırın. CTC'leri Hoechst+/CK-FITC+/CD45− ve WBC'leri Hoechst+/CK-FITC−/CD45+ olarak numaralandırın.
- Çip üzerinde yakalanan CTC'leri girişten toplamak için şırıngadan mikroakışkan çip üzerine ters yönde PBS ile yıkayarak yakalanan CTC'leri zenginleştirin. 1 mL PBS'li bir şırınga kullanın, çip üzerinde yakalanan CTC'leri 2-3 dakika içinde zenginleştirmek için prizden sokun, girişten toplayın. Her yıkama adımı için 1 mL PBS kullanın ve 3 kez tekrarlayın.
- Mikroakışkan çipte yakalanan tümör hücrelerini veya CTC'leri aşağıda tarif edildiği gibi boyayın.
- Kalsein kullanarak boyayın. 20 μL PBS'ye 5 μL kalsein ekleyin, hücreleri 30 dakika boyayın, daha sonra tümör hücrelerini elde etmek için oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 111 x g'de santrifüjleyin ve 1 mL PBS'de süspanse edin.
- Hücresel çekirdeği tanımlamak için, büyük elips mikrofiltreler için 1 mL/s ve yamuk olanlar için 1,5 mL/s'lik optimum akış hızında çipe 20 μL DAPI çözeltisi (20 μL PBS'de 10 μL DAPI reaktifi) ekleyin. Çip ile 30 dakika reaksiyona girmek için 20 μL anti-sitokeratin stok çözeltisinden (20 μL PBS'de 3 μL anti-sitokeratin antikor) geçirin.
- Çip üzerinde yakalanan WBC'leri boyayın. CTC'ler çip üzerinde yakalandıktan sonra, çipe 25 μL anti-CD45 antikor çözeltisi (20 μL PBS içinde 5 μL anti-CD45 çözeltisi) ekleyin ve 30 dakika lekelenmesine izin verin. PBS ile yıkayın ve epitel hücrelerini hem mavi hem de yeşil floresan ile tanımlayın.
- Aşağıda açıklandığı gibi floresan mikroskobu ile immünofloresan tanımlaması yapın.
- Bir floresan mikroskobu kullanın ve numuneyi mavi lazerle uyarın. Çekirdek hücreleri olan mavi floresan yayan hücreleri bulun. Şu büyütme oranlarından birini kullanın: 10x, 20x veya 40x. Tümör hücresi için açık bir alan bulun. Mavi lazer kaynağı için, 420-485 nm'lik bir uyarma plakası dalga boyu ve 515 nm'lik bir emisyon plakası dalga boyu kullanın.
- Numuneleri hareket ettirmeden başka bir lazer kaynağı kullanın. Floresan mikroskobunu döndürün ve numuneyi yeşil lazerle uyarın. Tümör hücrelerinin göstergesi olan yeşil floresan yayan hücreleri bulun. Bu yeşil lazer kaynağı ile aynı alanın görüntülerini aynı büyütme ile çekin. Hem mavi hem de yeşil floresan yayan hücreler tümör hücreleri olarak tanınır. Yeşil lazer kaynağı için, 460-550 nm'lik bir uyarma plakası dalga boyu ve 590 nm'lik bir emisyon plakası dalga boyu kullanın
- Numuneleri hareket ettirmeden başka bir lazer kaynağı kullanın. Floresan mikroskobunu döndürün ve numuneyi kırmızı lazerle uyarın. Kırmızı floresan yayan hücreleri bulun. Bu kırmızı lazer kaynağı ile aynı alanın görüntülerini aynı büyütme ile çekin. Hem mavi hem de kırmızı floresan yayan hücreler beyaz kan hücreleri olarak tanınır.
- Yukarıdaki lazer kaynaklarının her birini kullanarak elde etmek için görüntüyü kaydedin. Farklı renkli ışıklarla aynı alanın birkaç görüntüsünü çekin.
- Uyarma plakası dalga boyu 330-400 nm ve emisyon plakası dalga boyu 425 nm olan ultraviyole ışık kullanın. Uyarma plakası dalga boyu 395-415 nm ve emisyon plakası dalga boyu 455 nm olan mor ışık kullanın.
- Yakalama verimliliğini adım 1.2.1'deki gibi hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm kurulum bir şırınga pompası, bir şırınga ve bir mikroakışkan çip içerir. Şırıngadaki hücre süspansiyonu, şırınga pompasına bağlanır ve hücre süspansiyonu, hücreleri yakalamak için mikroakışkan çipe sokulur. Kullanılan tüm mikroakışkan çipler için yakalama verimliliği yaklaşık% 90 veya üzerindeydi. Dalga çipi için çeşitli boşluklara sahip mikro yapılar tasarladık. Küçük boşluklar CTC'leri yakalamak için kullanılır ve büyük boşluklar akış hızını hızlandırmak için kullanılır. Hücre süspansiyonu büyük boşluk alanlarında hızla akar. Kaçırılan CTC'ler, sonraki dizi16'daki küçük boşluklar tarafından yakalanma eğilimindedir. Elips yongaları için, yakalamayı geliştirmek için ince bir tünel oluşturmak üzere nokta noktası boşlukları yerine çizgi çizgisi boşlukları tasarladık. Bu nedenle, yüksek yakalama verimliliği elde edildi1. Canlılığı korumak için kenarlardan ve köşelerden kaçınmak için elips bir yapı tasarladık. Yamuk filtreler, gömülü yamuk ve dairesel mikropost bariyerlere sahip iki dairesel spiral kanala sahiptir. Yamuk filtreler için, MCF-7, MDA-MB-231 ve HeLa için yakalama verimlilikleri sırasıyla %94, %95 ve %93 idi18.
Şekil 1 , tüm tümör hücrelerinin dalga çipi tarafından yakalandığını göstermektedir. Tüm tümör hücreleri, dalga mikropost dizisi etrafında yoğunlaştığından, bu, yakalanan tümör hücrelerinin sayısı ile gösterildiği gibi, bu mikroakışkan çip için yüksek yakalama verimliliğini gösterir. Bu nedenle, bu kurulum nadir tümör hücrelerini yakalamayı çok daha kolay hale getirir; Gerçekten de çip, çok sayıda tümör hücresinin yanı sıra nadir sayıda tümör hücresini yakalamak için üretilmiştir. Örneğin, çip 10.000 tümör hücresini yakalayacak kadar katı veya tekrarlanabilirse, çipin 10-100 hücreyi yakalaması kolaydır. Video 1 , ön deney için ne kadar nadir sayıda tümör hücresinin elde edildiğini göstermektedir. PBS'de kalsein ile boyanmış seyreltilmiş tümör hücreleri içeren bir kültür kabından 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10 tümör hücrelerini aspire etmek için bir mikropipet çektirmesi kullanılarak yapılan içi boş bir iğne kullanıldı. Hücreler, içi boş iğneye bağlı silika jel tüpü tarafından emildi. İçi boş iğneye yeşil immünofloresan olan bir tümör hücresi emildi. İçi boş tüpe üfleme, içi boş iğnenin içindeki tümör hücresinin bir mikrosantrifüj tüpüneboşaltılmasına yol açtı 1. Bu, nadir tümör hücrelerini elde etme prosedürüdür. Şekil 2 , küçük elips mikrofiltreler kullanılarak yakalanan bir mide kanseri hastasından alınan CTC'leri göstermektedir. Şekil 3 , yamuk mikrofiltreler kullanılarak yakalanan ve hem mavi hem de yeşil floresan yayan bir kolorektal kanser hastasından alınan CTC'leri göstermektedir. Şekil 4 , yakalandıktan sonra çip üzerinde büyüyen ve anti-kanser ilacı ile tedavi edilmeye hazır olan tümör hücrelerini göstermektedir. Bu bulgular, büyük elips mikrofiltrelerin hücre canlılığı üzerinde herhangi bir olumsuz etkisi olmadığını göstermektedir.
Şekil 5 , mikroakışkan çipte yakalanan kolorektal CTC'lerin klinik immünofloresan analizini göstermektedir. Bunlar parlak alanda görülür ve Hoechst, CK-FITC ve CD45-PE boyama ile boyanır. CTC'ler DAPI+/CK+/CD45− ve WBC'ler DAPI+/CK−/CD45+ olarak tanımlandı. Şekil 6 , yakalandıktan sonra büyük elips çip üzerinde kültürlenen kolorektal tümör hücrelerini göstermektedir. Şekil 7 , büyük elips mikrofiltrelerde yakalanan kolorektal tümör hücrelerini göstermektedir. Klinik olarak, hasta kanındaki CTC'ler dalga çipleri, yamuk mikrofiltreler ve büyük elips mikrofiltreler tarafından yakalandı, bu da bu üç çipin CTC'leri yakalamada başarılı olduğunu gösteriyor. Potansiyel olarak, CTC izolasyon ürünleri gibi CTC ürünlerinde yüksek verimlilikle uygulanabilirler.
Şekil 1: Dalga çipi yakalama. MCF-7'nin tüm tümör hücreleri, herhangi bir hücre eksik olmadan dalga çipinin dizisi etrafında yakalandı. Dizi dışında başka herhangi bir alanda tümör hücresi bulunmadığından, bu çipin yüksek yakalama verimliliğini gösterir. Çok sayıda tümör hücresi yakalandı. Bu nedenle, nadir tümör hücreleri de kolayca yakalanabilir. MCF-7'nin tümör hücreleri dalga çipi ile yakalandı ve (A) Hoechst ile boyandı ve (B) kalsein ile boyandı. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Küçük elips mikrofiltreler tarafından yakalanan CTC'ler için klinik örnek. Küçük elips mikrofiltreler tarafından yakalanan bir mide kanseri hastasının klinik CTC'leri. CTC'ler parlak alanda ve hem mavi hem de yeşil floresan ile tanımlandı. (A)'daki mavi daire, çipin içinde yakalanan bir mide kanseri hastasının CTC'sini gösterir. Çekilen görüntülerden, başka hiçbir alanda başka hücre olmadığı görülebilir, bu da bu çip için yakalama saflığının yüksek olduğunu gösterir. MCF-7'nin tümör hücreleri küçük elips mikrofiltreler tarafından yakalandı ve (A) parlak alanda, (B) Hoechst ile boyanmış ve (C) CK-FITC ile boyanmış olarak görüldü. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yamuk mikrofiltreler tarafından yakalanan CTC'lerin klinik örneği. Kolorektal kanserli bir hastadan alınan klinik CTC'ler yamuk mikrofiltreler ile yakalandı. Bu görüntülerde, altı CTC'nin yakalandığı görülebilir, bu da küçük alanda yakalama verimliliğinin yüksek olduğunu gösterir. Ek olarak, yakalama saflığının bu çip için son derece yüksek olduğunu gösteren başka hiçbir hücre ortaya çıkmadı. MCF-7'nin tümör hücreleri yamuk mikrofiltreler ile yakalandı ve (A) parlak alanda, (B) Hoechst ile boyanmış ve (C) CK-FITC ile boyanmış olarak görüldü. Ölçek çubuğu: 20 μm Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Büyük elips mikrofiltreler tarafından yakalanan CTC'lerin kültürü. MCF-7'nin tümör hücreleri, büyük elips mikropost dizisinin önünde büyük elips mikrofiltreler tarafından yakalandı. Diziden hiçbir tümör hücresi geçmedi, bu da bu çip için yüksek yakalama verimliliğini gösteriyor. Yakalandıktan sonra, tümör hücreleri 24-48 saat boyunca büyüdü. Bu, büyük elips mikro filtreler için hem yakalama verimliliğinin hem de canlılığın çok yüksek olduğunu gösterir. MCF-7'nin kültürlenmiş tümör hücreleri, büyük elips mikrofiltreler tarafından yakalandı ve yakalandıktan sonra (A) 0 saat, (B) yakalandıktan 24 saat sonra ve (C) yakalandıktan 48 saat sonra görüldü. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yamuk mikrofiltreler tarafından CTC yakalama için kullanılan bir klinik numune örneği. Kolorektal kanserli bir hastadan alınan klinik CTC'ler yamuk mikrofiltreler ile yakalandı. Bu görüntülerde, yüksek yakalama verimliliğine işaret eden iki CTC'nin yakalandığı görülebilir. Çipte eritrosit kalıntıları dışında başka bir hücre bozukluğu yoktu. Bu nedenle, CTC yakalamanın klinik ön işlemesi için, kırmızı kan hücresi lizizini kullanmamak daha iyidir. Kolorektal kanserin CTC'leri yamuk mikrofiltreler tarafından yakalandı ve (A) parlak alanda, (B) Hoechst ile boyanmış, (C) CK-FITC ile boyanmış ve (D) birleştirilmiş görüntülerde görüldü. Ölçek çubuğu: 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Büyük elips çip tarafından yakalanan kültürlenmiş CTC'lerin örneği. Büyük elips mikropost dizisinin önünde ve büyük elips mikrofiltrelerin arkasında MCF-7 hücrelerinin tümör hücre kültürleri. Yeşil floresan yayan kalsein ile boyanan tümör hücreleri istenildiği gibi büyüdü, bu da bu çip için hücre canlılığının çok yüksek olduğunu gösterdi. Toplamda, büyük elips mikro direkler tarafından düzenlenen her dizi için çeşitli boşluklara sahip 15 dizi vardı. MCF-7 tümör hücreleri, bir dizide (A) ve başka bir dizide (B) yakalandıktan sonra büyük elips çip üzerinde kültürlendi. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Büyük elips mikrofiltreler tarafından CTC yakalama için kullanılan bir klinik numune örneği. Kolorektal kanserli bir hastadan alınan klinik CTC'ler büyük elips mikrofiltreler tarafından yakalandı. Görüntülerden RBC kontaminasyonu olduğu görülebilir. Bu, tüm hasta kan örneğinin seyreltilmesi gerektiğini ve yakalandıktan sonra çipin yıkanması gerektiğini gösterir. Klinik kolorektal kanser hastası kan örneklerinin CTC'leri büyük elips çipinde yakalandı ve (A) parlak alanda, (B) Hoechst ile boyanmış ve (C) CK-FITC ile boyanmış olarak görüldü. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanserin prognozu ve erken tanısı kanser tedavisi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir1. Mikroakışkan çiplerle CTC izolasyonu, invazyon olmadan sıvı biyopsi imkanı sunar. Bununla birlikte, CTC'ler kanda son derece nadir ve heterojendir1, bu da CTC'leri izole etmeyi zorlaştırır. CTC'ler, kaynaklandıkları orijinal tümör kaynaklarına benzer özelliklere sahiptir. Bu nedenle, CTC'ler kanser metastazında hayati bir rol oynar1.
Önerilen protokol, mikroakışkan çip ile CTC izolasyonunun tam bir analizine izin verir. Protokol, CTC izolasyonu ile ilgili tüm önemli prosedürleri içerir. Örneğin, bu protokol, titizlikle kaydedilen ve farklı paketler halinde düzenlenen RBCL analizlerini, nadir tümör hücresi edinimini, optimal akış hızı tayini, yakalama verimliliğini, klinik karakterizasyonu ve sayımı içerir. Operasyonların dikkatli bir şekilde yönetilmesi, klinik hasta numunesinin işlenmesini kolaylaştırır. Protokol, klinik hasta örneklerinin ön işlenmesine ve işlenmesine izin verir ve klinisyenler için hayati hizmetler sunar.
CTC izolasyonu için, nadir tümör hücrelerinin ön işlemesinin gerçekleştirilmesi son derece zordur. Bu zorluk, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10 tümör hücresini istenildiği gibi emmek için bir iğne çektirmesinden çekilen içi boş bir iğne kullanılarak çözüldü. Daha sonra, bir hasta kan örneğini taklit ederek, normal kana karıştırılan istenen sayıda tümör hücresi ile gerçeğe yakın bir klinik hasta kan örneği hazırlandı. Bu yapay hasta kan örnekleri ile gerçeğe yakın bir deney yapıldı. Bu yöntem, genellikle ön deneyler için CTC izolasyonunda karşılaşılan zor bir sorunu çözmüştür. Bu yaklaşımın uygulanması kolay değildir ve başka bir yerde hiç rapor edilmemiştir; Bununla birlikte, gerçek bir klinik deney yapmadan önce yararlı bir yaklaşımdır.
Mikroakışkan çiplerle CTC izolasyonu üç tipte sınıflandırılır: afinite tabanlı, fiziksel tabanlı ve immünmanyetik tabanlı. Afiniteye dayalı izolasyon için mikroakışkan çipin değiştirilmesi gerekir. Anti-EpCAM ile modifikasyon için özel modifikasyon prosedürleri dahil edilmiştir. CTC'ler Hoechst, CK-FITC ve CD45-PE ile immünofloresan boyama ile tanımlandı. Birçok tümör hücresi EpCAM eksprese ettiğinden, anti-EpCAM hasta kanındaki CTC'leri yakalamak için önemli bir antikordur. Bununla birlikte, anti-EpCAM çok pahalıdır; Bu nedenle, bu sorunu çözmek için birçok aptamer geliştirilmiştir. Basit, kullanımı kolay ve etkili oldukları için CTC'leri yakalamak için esas olarak küçük elips mikro filtreler ve yamuk mikro filtreler gibi fiziksel tabanlı mikroakışkan çipler kullanıyoruz.
Bu tekniğin alternatif tekniklere göre avantajı, büyük elips mikrofiltrelerin fiziksel tabanlı çipinin, CTC'leri yüksek yakalama verimliliğiyle sıkıca yakalamasıdır. Bunun nedeni, hat-hat boşluklarının ince tünellerinin olmasıdır. Dalga çipleri, hem fiziksel özellik tabanlı hem de afinite tabanlı izolasyonu birleştirerek CTC'leri yakalar. CTC'ler küçük boşluklar tarafından yakalanır ve büyük boşluklar akış hızını hızlandırmak için kullanılabilir. Kaçırılan CTC'lerin aşağıdaki dizilerdeki küçük boşluklardan geçmesi gerekir ve ayrıca benzeşim tabanlı izolasyon tarafından yakalanır.
Protokol, özellikle klinik deneyler için CTC izolasyonundaki birkaç önemli sorunu çözmüştür. Bununla birlikte, nanopartiküllerin ve nanoyapıların rolü ve aptamer modifikasyonu gibi CTC izolasyonuna her ayrıntılı adımı dahil etmek imkansızdır. Bu hususlar aynı zamanda CTC izolasyonunda da önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, yakalama verimliliğini artırmak gibi sorunları çözmede kritik öneme sahip değildirler. Bunun yerine, bu yönler CTC izolasyonunu yeni içeriklerle zenginleştirir.
Bu çalışma, tasarlanan mikroakışkan çip ile CTC'lerin klinik izolasyonuna odaklanmaktadır. Kullanılan mikroakışkan çiplerin çoğu, büyük elips filtreler ve küçük elips filtreler gibi esas olarak fiziksel tabanlıdır. Dalga çipleri, hem afinite tabanlı hem de fiziksel tabanlı çip özelliklerininbirleştirilmesiyle yapılır 1. Büyük elips filtrelerin mikro direkleri, bu çalışmada yakalama saflığını artırmak için daha kısa olacak şekilde tasarlanmıştır. Küçük elips filtreler, farklı diziler için çeşitli mikro direk boyutlarıyla tasarlanarak da geliştirilebilir. Dalga çipleri, yakalamayı geliştirmek için daha fazla dizi eklenerek daha iyi tasarlanabilir.
Büyük elips filtreler, yüksek yakalama verimliliği sağlayan hat hattı tünelleri oluşturmak için uzun eliptik mikro direklerle düzenlenir. Bununla birlikte, bu yakalamanın sınırlaması, yakalama saflığının yeterince yüksek olmaması veya yüksek yakalama saflığının kolayca elde edilememesidir. Dalga çipi için, CTC'leri yakalamak için küçük boşluklar kullanılır ve kaçırılan CTC'ler aşağıdaki diziler tarafından yakalanır. Büyük boşluklar, akış hızını hızlandırmak ve RBC'lerden kaynaklanan rahatsızlığı ortadan kaldırmak için kullanılır, böylece yakalama saflığını iyileştirir; Bununla birlikte, yakalama verimliliği %90'ın üzerinde sağlamdır ve tekrarlanabilir.
Mikroakışkan çipler ile CTC izolasyonunda klinik validasyon önemlidir. Bu çalışma, büyük elips filtreler, küçük elips filtreler ve dalga çipleri ile kolorektal hastalardan CTC'lerin klinik izolasyonunu sunmaktadır. Tasarlanan mikroakışkan çiplerin amacı, CTC'leri klinik olarak numaralandırmaktır. Diğer bazı sistem veya platformların mevcut yöntemleri için yakalama etkinliği düşüktür veya yakalama etkinliği, yöntemin klinik uygulamalarda etkin bir şekilde kullanılması için yeterince yüksek değildir.
Yüksek yakalama verimliliğine sahip olan bu üç mikroakışkan çipin klinik performanslarına dayanarak, özellikle modifikasyondan sonra CTC ürünlerinde potansiyel olarak uygulanabilirler. Protokolümüzün gücü, gerçek klinik örnekleri taklit etmek için nadir sayıda tümör hücresinin sayımını göstermesidir. Ek olarak, klinik deneysel prosedür uygulanabilir ve pratiktir. Bu yöntem, CTC'leri tam hasta kanından ayırabilir. Bu nedenle, yöntem klinik uygulamalar için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu araştırma çalışması, Çin Anhui Doğa Bilimleri Vakfı (1908085MF197, 1908085QB66), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21904003), Tianjin Eğitim Komisyonu Bilimsel Araştırma Projesi (2018KJ154), Anhui Eyaleti Yüksek Öğretim Kurumları İl Doğa Bilimleri Araştırma Programı (KJ2020A0239) ve Şanghay Çok Boyutlu Bilgi İşleme Anahtar Laboratuvarı, Doğu Çin Çok Boyutlu Bilgi Anahtar Laboratuvarı tarafından desteklenmiştir İşleme, Doğu Çin Normal Üniversitesi (MIP20221).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
References
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- World Health Organization Cancer report. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
